WO2011105570A1 - 生体試料中の癌細胞の存否を判定する方法、判定用分子マーカーおよびキット - Google Patents

生体試料中の癌細胞の存否を判定する方法、判定用分子マーカーおよびキット Download PDF

Info

Publication number
WO2011105570A1
WO2011105570A1 PCT/JP2011/054363 JP2011054363W WO2011105570A1 WO 2011105570 A1 WO2011105570 A1 WO 2011105570A1 JP 2011054363 W JP2011054363 W JP 2011054363W WO 2011105570 A1 WO2011105570 A1 WO 2011105570A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
base sequence
cpg
cpg sites
sequence
Prior art date
Application number
PCT/JP2011/054363
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
綾子 酒井
慶彦 田島
昌裕 梶田
Original Assignee
シスメックス株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by シスメックス株式会社 filed Critical シスメックス株式会社
Priority to JP2012501890A priority Critical patent/JPWO2011105570A1/ja
Priority to EP11747526.9A priority patent/EP2540839B1/en
Publication of WO2011105570A1 publication Critical patent/WO2011105570A1/ja
Priority to US13/594,526 priority patent/US20130130242A1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for determining the presence or absence of cancer cells in a biological sample. More specifically, the present invention relates to a method for analyzing the methylation state of a CpG site having a predetermined base sequence for DNA extracted from a biological sample and determining the presence or absence of cancer cells in the biological sample based on the analysis result. The present invention also relates to a molecular marker for determination and a kit used in the method.
  • C cytosine
  • CG island a region rich in CpG sequences
  • transcription of the gene is suppressed. This phenomenon is also called “gene silencing”.
  • the CpG island is not methylated, the transcription factor can bind to the promoter, so that the gene can be transcribed.
  • DNA methylation is one of the gene expression control mechanisms. Therefore, DNA methylation involves early embryogenesis, tissue-specific gene expression, gene imprinting, X-chromosome inactivation, chromosome stabilization, and DNA replication timing, which are characteristic of mammals. Plays an important role in various physiological and pathological phenomena.
  • Patent Document 1 describes that genes such as NPTX2, SARP2, and CLDN5 are not methylated in normal pancreatic cells, but are methylated in pancreatic cancer cells. A method for detecting pancreatic cancer by analyzing the phenotype is described.
  • Patent Document 2 describes a method for detecting a breast proliferative disease, which is a type of breast cancer, by analyzing the methylation status of genes such as BRCA2 and PCDH7.
  • the present invention provides a method for analyzing the methylation state of DNA extracted from a biological sample using a novel molecular marker capable of determining the presence or absence of cancer cells and determining the presence or absence of cancer cells based on the analysis results
  • the purpose is to do.
  • Another object of the present invention is to provide molecular markers and kits for determination that can be used in the method.
  • the present inventors have analyzed the methylation status of genomic DNA of cancer tissues and cancer cell lines, and identified gene regions where DNA methylation is specifically observed in cancer tissues and cancer cell lines. Then, the present inventors analyze the methylation state of a predetermined base sequence in these gene regions, and by using the obtained analysis results, a sample containing cancer cells and a sample not containing cancer cells Has been found to be distinguishable with high accuracy, and the present invention has been completed.
  • Extracting DNA from a biological sample collected from a subject Analyzing the methylation state of at least one CpG site present in at least one base sequence selected from the base sequences of SEQ ID NOs: 1 to 14 for the DNA obtained in the extraction step;
  • a method for determining the presence or absence of cancer cells in a biological sample comprising the step of determining the presence or absence of cancer cells in the biological sample based on the analysis result obtained in the analysis step.
  • a molecular marker for determining the presence or absence of cancer cells using methylation status analysis wherein at least one CpG site present in the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 14 is selected.
  • An unmethylated cytosine converting agent that converts unmethylated cytosine contained in DNA extracted from a biological sample collected from a subject into another base;
  • a biological sample comprising a primer set for confirming the methylation state of at least one CpG site present in at least one base sequence selected from the base sequences of SEQ ID NOs: 1 to 14 by a methylation-specific PCR method
  • a kit for determining the presence or absence of cancer cells therein is provided.
  • the DNA extracted from the biological sample collected from the subject is methylated as the molecular marker for determination of the present invention.
  • the presence or absence of cancer cells in the sample can be determined by analyzing the crystallization state.
  • the present invention can provide molecular markers and kits for determination that can be used in the method.
  • 5 is a table showing the methylation state of the 1st to 54th CpG sites counted from the 5 ′ end of the base sequence of SEQ ID NO: 1 in DNA obtained from 4 samples of pancreatic cancer tissue and 5 samples of normal pancreatic tissue.
  • 7 is a table showing the methylation state of the 1st to 79th CpG sites counted from the 5 ′ end of the base sequence of SEQ ID NO: 2 in DNA obtained from 5 samples of pancreatic cancer tissue and 5 samples of normal pancreatic tissue.
  • 3 is a table showing the methylation status of the 1st to 12th CpG sites counted from the 5 ′ end of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 in DNA obtained from 5 samples of pancreatic cancer tissue and 4 samples of normal pancreatic tissue.
  • 3 is a bar graph showing the frequency of methylation of CpG sites present in each base sequence of SEQ ID NOs: 1 to 3. It is a bar graph which shows the fluorescence intensity of the band of the PCR product obtained by amplifying the base sequence of SEQ ID NO: 15 by the methylation specific PCR (MSP) method for DNA obtained from pancreatic cancer tissue and normal tissue.
  • MSP methylation specific PCR
  • 5 is a table showing the methylation status of the 1st to 52nd CpG sites counted from the 5 ′ end of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 in 6 samples of breast cancer cell line MCF7 and 5 samples of normal breast epithelial cell line HMEC.
  • 4 is a table showing the methylation status of the 1st to 39th CpG sites counted from the 5 ′ end of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 in 4 samples of MCF7 cells and 4 samples of HMEC cells.
  • 10 is a table showing methylation states of the 1st to 23rd CpG sites counted from the 5 ′ end of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 in 6 samples of MCF7 cells and 6 samples of HMEC cells.
  • 10 is a table showing the methylation state of the 1st to 10th CpG sites counted from the 5 ′ end of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 in 5 samples of MCF7 cells and 5 samples of HMEC cells.
  • 2 is a table showing the methylation status of the 1st to 23rd CpG sites counted from the 5 ′ end of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 in 4 samples of MCF7 cells and 4 samples of HMEC cells.
  • 3 is a table showing the methylation status of the 1st to 32nd CpG sites counted from the 5 ′ end of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 in 6 samples of MCF7 cells and 6 samples of HMEC cells.
  • 20 is a table showing methylation states of the 1st to 19th CpG sites counted from the 5 ′ end of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 in 5 samples of MCF7 cells and 4 samples of HMEC cells.
  • 20 is a table showing methylation states of 1st to 24th CpG sites counted from the 5 ′ end of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14 in 4 samples of MCF7 cells and 4 samples of HMEC cells.
  • 7 is a bar graph showing the frequency of methylation of CpG sites present in the respective base sequences of SEQ ID NOs: 7 to 14. It is a bar graph which shows the fluorescence intensity of the band of the PCR product obtained by amplifying the base sequence of sequence number 20 by MSP method about DNA obtained from MCF7 cell and HMEC cell.
  • the base sequences of SEQ ID NOs: 17-19, 21, 22, and 25-27 are amplified by MSP method, and the obtained reaction solution is photographed by agarose electrophoresis is there.
  • DNA obtained from MCF7 cells normal heart tissue, normal kidney tissue, normal liver tissue, normal lung tissue and normal peripheral blood leukocytes, the base sequences of SEQ ID NOs: 20 to 27 were amplified by MSP method, and the resulting reaction solution was obtained. It is the photograph when agarose electrophoresis is carried out.
  • CpG site means a site of a sequence in which cytosine (C) and guanine (G) in a base sequence are adjacent in this order in the 5 ′ to 3 ′ direction.
  • the letter “p” in CpG represents a phosphodiester bond between cytosine and guanine.
  • analyzing the methylation state means analyzing the presence or absence of methylation of a CpG site present in the base sequence to be analyzed, or the frequency of methylation of the CpG site present in the base sequence.
  • the base sequence to be analyzed here is not particularly limited as long as it is a region including at least one CpG site in at least one base sequence selected from the base sequences of SEQ ID NOS: 1 to 14.
  • the above “presence / absence of methylation” means whether or not the cytosine residue at the CpG site present in the base sequence to be analyzed is methylated.
  • “Methylation frequency” means the ratio of the number of methylated CpG sites to the number of all CpG sites present in the base sequence to be analyzed.
  • the nucleotide sequence to be analyzed is specified from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 14 Then, it is possible to grasp in advance the number of CpG sites present there. Therefore, the number of methylated CpG sites in the base sequence to be analyzed can also be used as the methylation frequency.
  • DNA is first extracted from a biological sample collected from a subject.
  • the biological sample is not particularly limited as long as it is a sample containing DNA of a subject, but preferably a sample containing genomic DNA, for example, a clinical specimen can be used.
  • clinical specimens include blood, serum, plasma, lymph, urine, nipple discharge, tissues and cells collected by surgery or biopsy.
  • Extraction of DNA from a biological sample can be performed by a known extraction method.
  • a biological sample and a treatment solution containing a surfactant eg, sodium cholate, sodium dodecyl sulfate
  • a surfactant eg, sodium cholate, sodium dodecyl sulfate
  • physical treatment stirring, homogenization,
  • the DNA contained in the biological sample to release into the mixed solution.
  • the obtained supernatant may be purified by a known method.
  • the extraction and purification of DNA from a biological sample can also be performed using a commercially available kit.
  • the extraction step preferably further includes a step of fragmenting the extracted DNA. If DNA is fragmented to an appropriate length by such a process, the methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP) method and the unmethylated cytosine conversion treatment described later can be performed efficiently.
  • DNA fragmentation can be performed by ultrasonic treatment, alkali treatment, restriction enzyme treatment, or the like. For example, when alkaline treatment is performed using sodium hydroxide, the sodium hydroxide solution is added to the DNA solution to a final concentration of 0.1 to 1.0 N, and the DNA is incubated by incubation at 10 to 40 ° C. for 5 to 15 minutes. It can be fragmented.
  • a restriction enzyme treatment is performed, the restriction enzyme can be appropriately selected based on the DNA base sequence, and for example, MseI or BamHI can be used.
  • the methylation state of at least one CpG site present in at least one base sequence selected from the base sequences of SEQ ID NOs: 1 to 14 is analyzed for DNA extracted from a biological sample.
  • the base sequences of SEQ ID NOs: 1 to 14 are all regions of human genomic DNA. More specifically, each of these base sequences is a part of the gene region shown in Table 1 below or a base sequence region in the vicinity thereof. These base sequences are known per se, for example, a database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) provided by the National Center for Biological Information (NCBI) of the National Library of Medicine. / gene /) and other known databases.
  • the CpG site to be analyzed is preferably selected from the following: 1, 3-7, 9-26 and 28-54th CpG sites from the 5 ′ end of the base sequence of SEQ ID NO: 1, 1 to 11, 13 to 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 38, 40 to 44, 46 to 49, 51 to 57 from the 5 ′ end of the base sequence of SEQ ID NO: 2, 59-66, 68, 70-73, 75, 76, 78 and 79th CpG site, 1st to 10th and 12th CpG sites from the 5 ′ end of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, 1st to 3rd CpG site from the 5 ′ end of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, 1st to 4th CpG site from the 5 ′ end of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5, 1st and 2nd CpG sites from the 5 ′ end of the nucleotide sequence of SEQ
  • the analysis step may be a step of analyzing the presence or absence of methylation of the CpG site present in the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 14.
  • the number of CpG sites to be analyzed may be one, but it is preferable to analyze the presence or absence of methylation of a plurality of CpG sites in order to improve the determination accuracy in the subsequent determination step.
  • a plurality of CpG sites may be selected from one base sequence, or may be selected from each of a plurality of base sequences.
  • the analysis step may be a step of analyzing the frequency of methylation of CpG sites existing in the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 14.
  • the base sequence to be analyzed may include only one CpG site, but in order to improve the determination accuracy in the subsequent determination process, the base sequence including a plurality of CpG sites is the target of analysis. It is preferable.
  • the base sequence to be analyzed may be any one of the base sequences of SEQ ID NOS: 1 to 14, but is preferably a plurality of base sequences.
  • Various methods are known as methods for analyzing the methylation state.
  • which analysis method is used is not particularly limited, but a step of distinguishing methylated DNA from unmethylated DNA, a step of amplifying DNA, methylated DNA and / or unmethylated A step of detecting DNA.
  • Examples of the step of distinguishing methylated DNA from unmethylated DNA include a step of performing methylation sensitive restriction enzyme treatment, MeDIP method, unmethylated cytosine conversion treatment, and the like.
  • Examples of the step of amplifying DNA include steps of performing PCR amplification method, quantitative PCR amplification method, IVT (in vitro transcription) amplification method, SPIA (trademark) amplification method and the like.
  • Examples of the process for detecting methylated DNA and / or unmethylated DNA include a process for performing electrophoresis, sequence analysis, microarray analysis, mass spectrometry, Southern hybridization, and the like.
  • the MeDIP method is a method of concentrating methylated DNA contained in a biological sample by immunoprecipitation using an anti-methylated cytosine antibody, an anti-methylated cytidine antibody, or an antibody that specifically recognizes a methylated DNA-binding protein. .
  • the methylated DNA contained in the DNA obtained in the extraction step is concentrated by the MeDIP method, and the methylated state of the concentrated methylated DNA is analyzed. Good.
  • methylated DNA concentrated by the MeDIP method is amplified by the IVT amplification method, and the methylated state of the obtained amplification product can be analyzed using a microarray. Such an analysis method is called the MeDIP on chip method.
  • Unmethylated cytosine conversion treatment is a reaction between a DNA extracted from a biological sample and an unmethylated cytosine converting agent to convert the unmethylated cytosine in the DNA to another base (uracil, thymine, adenine or guanine). It is a process to convert to.
  • the unmethylated cytosine converting agent is a substance that can react with DNA to convert unmethylated cytosine in the DNA into another base (uracil, thymine, adenine or guanine).
  • an unmethylated cytosine converting agent for example, bisulfite such as sodium sulfite, potassium salt, calcium salt, magnesium salt of bisulfite is preferably used.
  • the amount of bisulfite added is not particularly limited as long as it can sufficiently convert unmethylated cytosine in DNA.
  • the final concentration in the sample is 1M or more, It is preferably 1 to 15 M, more preferably 3 to 10 M.
  • the incubation conditions (temperature and time) after adding bisulfite to a biological sample can be set as appropriate according to the amount of bisulfite added. For example, when bisulfite is added at a final concentration of 6M, Incubate at -80 ° C for 10-90 minutes.
  • the DNA methylation state can be analyzed by sequencing the DNA after bisulfite treatment and detecting the difference from the original base sequence. This method is called the bisulfite sequencing method.
  • the methylation state of DNA can also be analyzed by performing PCR amplification on the DNA after bisulfite treatment using a primer set described later and confirming the presence or absence of a PCR product.
  • Such an analysis method is called a methylation specific PCR (MSP) method.
  • the above MSP method can amplify a base sequence in which cytosine at the CpG site to be analyzed is methylated (that is, cytosine is not converted to uracil), but cytosine at the CpG site is not methylated ( That is, a primer set that cannot amplify the base sequence in which the cytosine is converted to uracil is used.
  • a primer set that cannot amplify the base sequence in which the cytosine is converted to uracil is used.
  • the CpG site to be analyzed is methylated due to the presence of the PCR product.
  • the MSP method cannot be used to amplify a base sequence in which cytosine at the CpG site to be analyzed is not converted to uracil, but a primer set that can amplify a base sequence in which cytosine at the CpG site is converted to uracil should be used. You can also. In this case, it can be seen that the CpG site to be analyzed is methylated due to the absence of the PCR product.
  • Each primer included in the above primer set can be appropriately designed by those skilled in the art according to the base sequence including the CpG site to be analyzed, but contains the cytosine of the CpG site to be analyzed at or near the 3 ′ end of the primer. It is preferable to design as follows.
  • the methylation state can also be analyzed using a microarray.
  • the analysis microarray can be prepared by fixing one or more nucleic acid probes complementary to the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 14 on the substrate.
  • Such a microarray can be produced by a method known in the art.
  • DNA extracted from a biological sample is preferably labeled with a labeling substance known in the art. Therefore, it is preferable that the method of the present invention further includes a step of labeling the extracted DNA. Since this labeling step can label all DNA in the biological sample, it is advantageous to be performed after the DNA amplification step.
  • labeling substances include fluorescent substances, haptens such as biotin, radioactive substances, and the like.
  • the fluorescent substance include Cy3, Cy5, Alexa Fluor (trademark), FITC, and the like.
  • the signal may be an appropriate signal depending on the type of microarray.
  • the signal may be an electrical signal generated when a DNA fragment hybridized with each probe of the microarray is present, or when the DNA to be analyzed is labeled as described above, a labeling substance Signals such as fluorescence and luminescence generated from The signal can be detected by a scanner provided in a normal microarray measurement apparatus. Examples of the scanner include GeneChip (registered trademark) Scanner 3000 7G (Affymetrix).
  • the presence / absence of cancer cells in a biological sample is determined based on the analysis result obtained in the analysis step.
  • this determination step it can be determined that cancer cells are present in the biological sample collected from the subject when a result that there is a methylated CpG site is obtained in the analysis step.
  • a result that there is no methylated CpG site it can be determined that cancer cells are not present in the biological sample.
  • said determination may be performed from the analysis result of one CpG site
  • the above determination step it can be determined that cancer cells are present in the biological sample collected from the subject when a result that the frequency of methylation is higher than a predetermined threshold is obtained in the analysis step.
  • a result that the frequency of methylation is lower than a predetermined threshold it can be determined that there are no cancer cells in the biological sample collected from the subject.
  • the threshold value can be set as follows. First, methylation frequency is analyzed for a biological sample (normal tissue or normal cell) that has been confirmed in advance to contain no cancer cells, and DNA extracted from a biological sample containing cancer cells.
  • a threshold is set from a range that is higher than the methylation frequency of the biological sample not containing cancer cells and lower than that of the biological sample containing cancer cells.
  • a threshold value is set as a value capable of distinguishing a biological sample not containing cancer cells and a biological sample containing cancer cells with high accuracy.
  • a molecular marker for determining the presence or absence of cancer cells used in the above-described method of the present invention is also one aspect of the present invention.
  • the molecular marker of the present invention is selected from at least one CpG site present in the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1-14.
  • the molecular marker of the present invention is preferably selected from the following CpG sites: 1, 3-7, 9-26 and 28-54th CpG sites from the 5 ′ end of the base sequence of SEQ ID NO: 1, 1 to 11, 13 to 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 38, 40 to 44, 46 to 49, 51 to 57 from the 5 ′ end of the base sequence of SEQ ID NO: 2, 59-66, 68, 70-73, 75, 76, 78 and 79th CpG site, 1st to 10th and 12th CpG sites from the 5 ′ end of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, 1st to 3rd CpG site from the 5 ′ end of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, 1st to 4th CpG site from the 5 ′ end of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5, 1st and 2nd CpG sites from the 5 ′ end of the nucleotide sequence of SEQ
  • kits for determining the presence or absence of cancer cells in a biological sample for carrying out the above-described method of the present invention is also one aspect of the present invention.
  • the kit of the present invention comprises an unmethylated cytosine converting agent and a primer set for confirming the methylation state of at least one CpG site present in the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 14 by methylation-specific PCR. .
  • the unmethylated cytosine converting agent contained in the kit of the present invention reacts with DNA extracted from a biological sample collected from a subject, and converts the unmethylated cytosine in the DNA to another base (uracil, thymine, adenine or guanine). Although it will not specifically limit if it is a substance which can be converted into (), Bisulphite is preferable.
  • the unmethylated cytosine converting agent may be in the form of a solution or in the form of a solid that can be dissolved in a suitable solvent at the time of use.
  • the CpG site confirmed by the MSP method is preferably selected from the following: 1, 3-7, 9-26 and 28-54th CpG sites from the 5 ′ end of the base sequence of SEQ ID NO: 1, 1 to 11, 13 to 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 38, 40 to 44, 46 to 49, 51 to 57 from the 5 ′ end of the base sequence of SEQ ID NO: 2, 59-66, 68, 70-73, 75, 76, 78 and 79th CpG site, 1st to 10th and 12th CpG sites from the 5 ′ end of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, 1st to 3rd CpG site from the 5 ′ end of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, 1st to 4th CpG site from the 5 ′ end of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5, 1st and 2nd CpG sites from the 5 ′ end of the nucleo
  • the CpG site identified by the MSP method is selected from: 9, 10, and 28 to 30th CpG sites from the 5 ′ end of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 4th to 7th CpG site from the 5 ′ end of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, 6th and 9th CpG sites from the 5 ′ end of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, 3, 4, 11 and 12th CpG sites from the 5 ′ end of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7.
  • the primer set included in the kit of the present invention is preferably selected from the following: A primer set which is the base sequence of SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29; A primer set which is the base sequence of SEQ ID NO: 30 and SEQ ID NO: 31, A primer set which is the base sequence of SEQ ID NO: 32 and SEQ ID NO: 33; A primer set which is the base sequence of SEQ ID NO: 34 and SEQ ID NO: 35; A primer set which is the base sequence of SEQ ID NO: 36 and SEQ ID NO: 37; A primer set which is the base sequence of SEQ ID NO: 38 and SEQ ID NO: 39; A primer set which is the base sequence of SEQ ID NO: 40 and SEQ ID NO: 41, A primer set which is the base sequence of SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 43, A primer set which is the base sequence of SEQ ID NO: 44 and SEQ ID NO: 45; A primer set which is the base sequence of SEQ ID NO: 46 and SEQ ID NO: 47; A primer set which is the
  • the above primer set is suitably used when the method of the present invention is performed by analyzing the presence or absence of methylation of the CpG site present in the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1 to 14 by the MSP method.
  • Example 1 Identification of Novel Markers from Pancreatic Cancer Tissue Genomic DNA By analyzing the genomic DNA of human pancreatic cancer tissue and human normal pancreatic tissue using a microarray, it is specifically methylated to the genomic DNA of pancreatic cancer tissue We searched for gene regions where In addition, the specific operation procedure in Example 1 was performed according to description of the manual attached to the used kit and reagents.
  • Genomic DNA was extracted from human pancreatic cancer tissue and human normal pancreatic tissue as biological samples. Each extracted genomic DNA (4 ⁇ g) was reacted with a restriction enzyme MseI (NEB) at 37 ° C. overnight to fragment into 300 to 1000 bp. Next, these were denatured by heating at 95 ° C. for 10 minutes, and then rapidly cooled to 4 ° C. to obtain single-stranded DNA fragments. The obtained single-stranded DNA fragment was diluted with a dilution buffer (302 ⁇ l) of Chromatin Immunoprecipitation assay kit (Upstate biotechnology).
  • MseI restriction enzyme
  • Protein G Sepharose beads (68 ⁇ l: GE Healthcare) were added to each of the obtained dilutions, and the mixture was rotated at 4 ° C. for 1 hour, and then centrifuged to remove proteins that nonspecifically bind to the beads. Excluded (hereinafter also referred to as pre-clear treatment). Then, after collecting each supernatant, they were divided into two equal parts, transferred to separate tubes, and anti-methylated cytosine antibody BI-MECY-0500 (10 ⁇ g: Eurogentec) was added to one, The antibody was not added and used as a specimen sample and a control sample (Input), respectively.
  • pre-clear treatment anti-methylated cytosine antibody BI-MECY-0500
  • biotinylated cRNA was obtained from each sample by performing biotin labeling by IVT amplification using the obtained double-stranded DNA as a template. The concentration of the obtained cRNA was confirmed by measuring the absorbance (260 nm and 280 nm). CRNA from each sample was fragmented by GeneChip (registered trademark) Sample Cleanup Module (Affymetrix) to obtain specimen samples and control samples for microarray analysis.
  • GeneChip registered trademark
  • Sample Cleanup Module Affymetrix
  • Microarray analysis (1) Contact between sample and microarray Each sample for microarray analysis described above is brought into contact with GeneChip (registered trademark) Human Promoter 1.0R Array (Affymetrix) as a microarray to perform hybridization with the probe. It was. One microarray of the same type was used for each specimen sample and control sample. Staining, washing and scanning (signal measurement) after contact with the microarray were performed according to the manual provided by Affymetrix.
  • GeneChip registered trademark Human Promoter 1.0R Array
  • the obtained microarray data was analyzed according to the following procedure.
  • a general computer including an input unit such as a central processing unit, a storage unit, a keyboard, and an output unit such as a display was used.
  • the base sequence of all probes arranged in the microarray, the base sequence of genomic DNA, and the signal measurement value obtained above were input to the computer.
  • the base sequence of the DNA fragment obtained by dividing the base sequence of the genomic DNA with the recognition sequence “TACC” of the restriction enzyme MseI was obtained.
  • the base sequence of a DNA fragment having a length of 300 bp or more and not including the “CG” sequence in the sequence was extracted from the obtained base sequence.
  • fragment sequence a DNA fragment of 300 bp or more not containing the “CG” sequence (hereinafter also referred to as “fragment sequence”) was obtained.
  • fragment sequence Probes not including the “CG” sequence were extracted from all the probes arranged in the microarray. Among the extracted probes, a probe complementary to the above fragment sequence was used as a correction probe.
  • Signal measurement values obtained from the correction probe were extracted from the input signal measurement values, and their statistical representative values (mode values) were calculated. This value was used as the background value. This procedure was performed for each of the specimen sample and the control sample.
  • the obtained significance probability was visualized using IGB (Integrated Genome Browser; IGB) which is a standard browser.
  • conversion value 20 or more, it is specific to the genomic DNA of pancreatic cancer tissue. It is considered that a gene region containing a CpG site that was methylated could be detected significantly.
  • a region represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 15 to 19 was identified as a gene region in which methylation was specifically observed in the genomic DNA of pancreatic cancer tissue.
  • the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 15 to 19 are gene regions of HOXA9, KCNQ1DN, RAPSN, FZD9 and CDH22 or a part of the nucleotide sequence region in the vicinity thereof, and SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4 and This region includes 5 and 6 nucleotide sequences.
  • Table 2 below summarizes the correspondence between the above SEQ ID NOs: 15 to 19, each nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 1 to 6 and each gene.
  • Example 2 Analysis of methylation state by bisulfite sequence method
  • genomic DNA 2 ⁇ g
  • human pancreatic cancer tissue and normal human pancreatic tissue used in Example 1 300 ⁇ l of 0.3 N sodium hydroxide aqueous solution was added, and incubated at 37 ° C. for 10 minutes to obtain genomic DNA.
  • Primer sequence and reaction conditions (primer sequence for amplifying the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15) F: 5'-TAGTTAGGGATAAAGTGTGAGTGTTA-3 '(SEQ ID NO: 54) R: 5′-CAACTTATTAAATAACTATACTTCCCC-3 ′ (SEQ ID NO: 55) (Reaction conditions) 1 cycle at 95 ° C for 4 minutes 30 seconds 40 cycles of 95 seconds at 30 ° C, 15 seconds at 55 ° C and 30 seconds at 72 ° C, 1 cycle of 7 minutes at 72 ° C Maintain at 4 ° C.
  • Each obtained PCR product was incorporated into pCR (registered trademark) 2.1 vector of TA cloning kit (Invitrogen).
  • Each of the obtained plasmid constructs was transformed into competent cells (TOP10; Invitrogen), and plasmids were extracted and purified from these transformants using the GenElute Plasmid Miniprep kit (SIGMA).
  • the base sequence of the PCR product contained in each of the obtained plasmids was subjected to sequence analysis using Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer (Applied Biosystems). After sequence analysis, the methylation state of the CpG site in the base sequence of the above SEQ ID NO was analyzed.
  • the methylation state of the CpG site present in the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 3 included in each of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 15 to 17 is shown as a table in FIGS. 1 to 3 based on the above sequence results. It was. In the tables shown in these figures, “ ⁇ ” represents a methylated CpG site, “ ⁇ ” represents an unmethylated CpG site, and “ ⁇ ” represents an unanalyzed CpG site. “PT” and “PN” mean pancreatic cancer tissue and normal pancreatic tissue, respectively.
  • the number shown in the row of the CpG site is a number indicating the position of the CpG site counted from the 5 ′ end of each base sequence of SEQ ID NOs: 1 to 3.
  • the CpG site with “*” or “**” attached to the number is a CpG site that tends to be methylated in the pancreatic cancer tissue sample as compared with the normal pancreatic tissue sample.
  • the CpG site tends to be methylated in pancreatic cancer tissue and tends not to be methylated in normal pancreatic cell tissue. I understand. Based on these results, the frequency of methylation in each base sequence of SEQ ID NOs: 1 to 3 was analyzed. For example, in the case of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, the frequency of pancreatic cancer tissue (PT) methylation is the number of methylated CpG sites “ ⁇ ” in all clones (clone 1 to 4). Divided by the sum of the number of methylated CpG sites “ ⁇ ” and the number of unmethylated CpG sites “ ⁇ ”.
  • the frequency of methylation of normal pancreatic tissue was also the same as described above, and the number of methylated CpG sites “ ⁇ ” in all clones (clone 1 to 5) was compared with the methylated CpG in all clones. It is a value calculated as a percentage by dividing by the sum of the number of sites “ ⁇ ” and the number of CpG sites “ ⁇ ” that are not methylated.
  • the frequency of methylation in each base sequence thus obtained is shown as a bar graph in FIG. The graph represents the average value of a sample group of pancreatic cancer tissue and a sample group of normal pancreatic tissue.
  • the threshold for distinguishing between samples containing cancer cells and samples not containing cancer cells is, for example, in the range of 20 to 60%. You can see that you can choose. From this, in the DNA extracted from the biological sample collected from the subject, when the frequency of methylation of the CpG site in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 2, and / or 3 is higher than the above threshold value, It was suggested that it can be determined that cancer cells are present.
  • the molecular marker for determination of the present invention is preferably a CpG site that tends to be methylated in cancer tissue and not methylated in normal tissue. Therefore, when determining the presence or absence of cancer cells in a sample based on the frequency of methylation of CpG sites in the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 3, the CpG site as a molecular marker for determination is shown in FIGS. It is possible to make a determination with higher accuracy by selecting a CpG site to which “**” or “**” is added, more preferably a CpG site to which “**” is added.
  • a primer capable of amplifying a CpG site preferably selected from a CpG site marked with “*” or “**”, more preferably a CpG site marked with “**”, it is more accurate. A determination can be made.
  • Example 3 Analysis of methylation status by methylation-specific PCR (MSP) method
  • MSP methylation-specific PCR
  • the methylation status of CpG sites present in the gene regions of SEQ ID NOs: 15 to 19 identified in Example 1 was examined by MSP method.
  • Bisulfite treatment For human pancreatic cancer tissue, human normal pancreatic tissue, human normal heart tissue, human normal kidney tissue, human normal liver tissue, human normal lung tissue, and genomic DNA from leukocytes in human normal peripheral blood (2 ⁇ g each) In the same manner as in Example 2, bisulfite treatment was performed. DNA contained in the solution after the bisulfite treatment was purified using a Qiaquick PCR purification kit (QIAGEN) to obtain a sample for analysis.
  • QIAGEN Qiaquick PCR purification kit
  • MSP Method The MSP method was performed using the DNA in the obtained analysis sample as a template and the following primer set. In this MSP method, a PCR product is obtained when a methylated CpG site is present in the template DNA.
  • the CpG site to be analyzed by MSP in this example is a CpG site marked with “**” in FIGS.
  • Primer sequence and reaction conditions (primer sequence for amplifying the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15) F: 5′-CGTGGGTTTTAGTTAGGAGC-3 ′ (SEQ ID NO: 28) R: 5'- ATCCAAAACGACGATATTTAACG-3 '(SEQ ID NO: 29)
  • reaction conditions 1 cycle at 95 ° C for 9 minutes and 30 seconds, 35 cycles of 95 ° C for 30 seconds, 54 ° C for 15 seconds and 72 ° C for 30 seconds, Maintain at 4 ° C.
  • Example 4 Analysis of Methylation State by MSP Method in Other Tissues It was examined whether methylated CpG sites could be detected from DNA from cancer tissues other than pancreatic cancer tissue by MSP method.
  • Bisulfite treatment Bisulfite treatment was performed in the same manner as in Example 2 on genomic DNA (2 ⁇ g each) from human breast cancer tissue, human normal breast tissue, human colon cancer tissue, and human normal colon tissue. DNA contained in the solution after the bisulfite treatment was purified using a Qiaquick PCR purification kit (QIAGEN) to obtain a sample for analysis.
  • QIAGEN Qiaquick PCR purification kit
  • MSP Method Using the DNA in the obtained sample for analysis as a template, the MSP method was performed using the primer sets of the base sequences of SEQ ID NOs: 28 and 29, and 34 and 35 described above. The MSP method was performed in the same manner as in Example 3. After the completion of PCR, each reaction solution was electrophoresed on a 2% agarose gel in the same manner as in Example 3, and the fluorescence intensity of the band appearing on the gel was quantified. The results are shown in FIGS. In these figures, “-” is a negative control without template, “PN1” and “PN2” are normal breast tissue, “BT1” and “BT2” are breast cancer tissue, “CN” is normal colon tissue, “CT1” And “CT2” means colon cancer tissue.
  • Example 5 Search for molecular markers for determination from breast cancer cell lines By analyzing the genomic DNA of breast cancer cell lines and normal mammary epithelial cells using a microarray, methylation was specifically performed on the genomic DNA of breast cancer-derived cell lines. A search was made for the recognized gene region. In addition, the specific operation procedure in Example 5 was performed according to the description of the manual attached to the used kit and reagents.
  • Microarray analysis (1) Contact between sample and microarray In the same manner as in Example 1, each sample for microarray analysis was brought into contact with GeneChip (registered trademark) Human Promoter 1.0R Array (Affymetrix), Hybridization was performed. One microarray of the same type was used for each specimen sample and control sample.
  • GeneChip registered trademark
  • Human Promoter 1.0R Array Affymetrix
  • Example 2 Analysis of microarray data
  • the obtained microarray data was analyzed by the same procedure as in Example 1.
  • a region represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 20 to 27 was identified as a gene region in which methylation was specifically observed in the genomic DNA of a breast cancer cell line.
  • the base sequences of SEQ ID NOs: 20 to 27 are part of the gene region of LBX2, PAX9, ADD3, CCDC61, ZIC4, CGB7, TOX, and TNNI3 or the vicinity thereof, respectively, and SEQ ID NO: 7 , 8, 9, 10, 11, 12, 13, and 14.
  • Table 3 below shows the correspondence between SEQ ID NOs: 20 to 27 and the nucleotide sequences and genes of SEQ ID NOs: 7 to 14.
  • Example 6 Analysis of methylation status by bisulfite sequencing method
  • genomic DNA of breast cancer cell lines and normal breast cell epithelial lines the CpG site of the gene region represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 20 to 27 identified in Example 5 is Whether it was methylated or not was examined by the bisulfite sequencing method.
  • QIAGEN Qiaquick PCR purification kit
  • Primer sequence and reaction conditions (primer sequence for amplifying the base sequence of SEQ ID NO: 20) F: 5′-GGAAGAGGTTTAAGTGGATTTTTTT-3 ′ (SEQ ID NO: 60) R: 5'-TTTTTCTTTCCAAACCCAACCTA-3 '(SEQ ID NO: 61) (Reaction conditions) 1 cycle at 95 ° C for 4 minutes 30 seconds 40 cycles of 95 ° C for 30 seconds, 62 ° C for 15 seconds and 72 ° C for 30 seconds, 1 cycle of 7 minutes at 72 ° C Maintain at 4 ° C.
  • plasmid constructs containing the obtained PCR products were prepared in the same manner as in Example 2, and sequence analysis was performed on these. After sequence analysis, the methylation state of the CpG site in the base sequence of the above SEQ ID NO was analyzed.
  • the methylation states of CpG sites present in the base sequences of SEQ ID NOs: 7 to 14 included in the base sequences of SEQ ID NOs: 20 to 27 are shown as a table in FIG. It was.
  • “ ⁇ ” represents a methylated CpG site
  • “ ⁇ ” represents an unmethylated CpG site
  • “ ⁇ ” represents an unanalyzed CpG site.
  • the numbers shown in the rows of the CpG sites are numbers indicating the positions of the CpG sites counted from the 5 ′ end of each base sequence of SEQ ID NOs: 7 to 14.
  • the CpG site with “*” or “**” attached to the number is a CpG site that tends to be methylated in the MCF7 cell sample as compared to the HMEC cell sample.
  • the threshold value for distinguishing between samples containing cancer cells and samples not containing cancer cells is, for example, in the range of 15 to 35%. You can see that you can choose. From this, in the DNA extracted from the biological sample collected from the subject, the frequency of methylation of the CpG site in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, and / or 14 is as described above. When it was higher than the threshold value, it was suggested that it can be determined that cancer cells are present in the biological sample.
  • the molecular marker for determination of the present invention is preferably a CpG site that tends to be methylated in cancer cell lines and not methylated in normal cell lines. Therefore, when determining the presence or absence of cancer cells in a sample based on the frequency of methylation of CpG sites in the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 7 to 14, CpG sites as molecular markers for determination are shown in FIGS. It is possible to make a determination with higher accuracy by selecting a CpG site to which “**” or “**” is added, more preferably a CpG site to which “**” is added.
  • a primer capable of amplifying a CpG site preferably selected from a CpG site marked with “*” or “**”, more preferably a CpG site marked with “**”, it is more accurate. A determination can be made.
  • Example 7 Analysis of methylation state by MSP method
  • MSP mammary epithelial cell lines
  • the methylation state of CpG sites present in the gene region of SEQ ID NOs: 20 to 27 identified in Example 5 was determined by MSP. Investigated by law. 1.
  • Bisulfite treatment Bisulfite treatment was performed in the same manner as in Example 2 on genomic DNA (2 ⁇ g each) from breast cancer cell line MCF7 and normal breast epithelial cell line HMEC. DNA contained in the solution after the bisulfite treatment was purified using a Qiaquick PCR purification kit (QIAGEN) to obtain a sample for analysis.
  • QIAGEN Qiaquick PCR purification kit
  • MSP Method The MSP method was performed using the DNA in the obtained analysis sample as a template and the following primer set.
  • the CpG site to be analyzed by MSP in this example is a CpG site marked with “**” in FIGS.
  • the PCR reaction solution was prepared in the same manner as in Example 3. Primer sequences and reaction conditions are shown below.
  • each reaction solution was electrophoresed on a 2% agarose gel in the same manner as in Example 3, and the fluorescence intensity of the band appearing on the gel was quantified.
  • ⁇ means a negative control without template.
  • MSP method for each of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 20 to 27 significantly higher intensity bands were detected in MCF7 cells than in HMEC cells (see FIGS. 21 to 28).
  • Example 8 Analysis of methylation status of genomic DNA of breast cancer tissue and normal mammary gland tissue by MSP method
  • the genomic DNA of breast cancer tissue as well as breast cancer cell lines is represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 20 to 27 by MSP method. It was investigated whether or not a methylated CpG site present in the gene region could be detected.
  • Bisulfite treatment Bisulfite treatment was performed in the same manner as in Example 2 on genomic DNA (2 ⁇ g each) from human breast cancer tissue and human normal mammary gland tissue. DNA contained in the solution after the bisulfite treatment was purified using a Qiaquick PCR purification kit (QIAGEN) to obtain a sample for analysis.
  • QIAGEN Qiaquick PCR purification kit
  • MSP Method Using the DNA in the obtained analysis sample as a template, the MSP method was performed using the primer set having the base sequences of SEQ ID NOs: 38 to 53 described above.
  • the PCR reaction solution was prepared in the same manner as in Example 3, and the MSP reaction conditions using each primer set were the same as in Example 7.
  • each reaction solution was electrophoresed on a 2% agarose gel in the same manner as in Example 3, and the fluorescence intensity of the band appearing on the gel was quantified.
  • Example 9 Analysis of methylation status of genomic DNA of colon cancer tissue and normal colon tissue by MSP method Regarding genomic DNA of colon cancer tissue and normal colon tissue, the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 17-19, 21, 22, and 25-27 The methylation state of the CpG site present in the gene region indicated by was examined by the MSP method.
  • Bisulfite treatment Bisulfite treatment was performed in the same manner as in Example 2 on genomic DNA of human colon cancer tissue and human normal colon tissue (2 ⁇ g each: BioChain). DNA contained in the solution after the bisulfite treatment was purified using a Qiaquick PCR purification kit (QIAGEN) to obtain a sample for analysis.
  • QIAGEN Qiaquick PCR purification kit
  • MSP method Using the DNA in the obtained analysis sample as a template, MSP was performed using the primer sets shown in SEQ ID NOs: 32-37, 40-43 and 48-53.
  • the PCR reaction solution is prepared as follows. (I) Preparation of PCR reaction solution The following reagents were mixed to prepare 25 ⁇ l of a reaction solution. 2 x FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) (ROCHE) 12.5 ⁇ l F primer (10 ⁇ M) 1.0 ⁇ l R primer (10 ⁇ M) 1.0 ⁇ l Sample for analysis (template) 1.0 ⁇ l Distilled water 9.5 ⁇ l Total 25.0 ⁇ l
  • reaction conditions for MSP using each of the above primer sets are as follows. (Reaction conditions for MSP using a primer set (SEQ ID NO: 32 and 33) for amplifying the base sequence of SEQ ID NO: 17) 1 cycle at 95 ° C for 9 minutes and 30 seconds, 40 cycles of 95 ° C for 30 seconds, 62 ° C for 15 seconds and 72 ° C for 30 seconds, Maintain at 4 ° C.
  • reaction conditions for MSP using a primer set (SEQ ID NOs: 34 and 35) for amplifying the base sequence of SEQ ID NO: 18) 1 cycle at 95 ° C for 9 minutes and 30 seconds, 40 cycles of 95 ° C for 30 seconds, 58 ° C for 15 seconds and 72 ° C for 30 seconds, Maintain at 4 ° C.
  • reaction conditions for MSP using a primer set (SEQ ID NO: 36 and 37) for amplifying the base sequence of SEQ ID NO: 19) 1 cycle at 95 ° C for 9 minutes and 30 seconds, 35 cycles of 95 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 15 seconds and 72 ° C for 30 seconds, Maintain at 4 ° C.
  • reaction conditions for MSP using a primer set (SEQ ID NO: 40 and 41) for amplifying the base sequence of SEQ ID NO: 21) 1 cycle at 95 ° C for 9 minutes and 30 seconds, 40 cycles of 95 ° C for 30 seconds, 62 ° C for 15 seconds and 72 ° C for 30 seconds, Maintain at 4 ° C.
  • reaction conditions for MSP using a primer set (SEQ ID NOs: 42 and 43) for amplifying the base sequence of SEQ ID NO: 22) 1 cycle at 95 ° C for 9 minutes and 30 seconds, 40 cycles of 95 ° C for 30 seconds, 61 ° C for 15 seconds and 72 ° C for 30 seconds, Maintain at 4 ° C.
  • reaction conditions for MSP using a primer set (SEQ ID NO: 48 and 49) for amplifying the base sequence of SEQ ID NO: 25) 1 cycle at 95 ° C for 9 minutes and 30 seconds, 35 cycles of 95 ° C for 30 seconds, 61 ° C for 15 seconds and 72 ° C for 30 seconds, Maintain at 4 ° C.
  • reaction conditions for MSP using a primer set (SEQ ID NO: 50 and 51) for amplifying the base sequence of SEQ ID NO: 26) 1 cycle at 95 ° C for 9 minutes and 30 seconds, 35 cycles of 95 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 15 seconds and 72 ° C for 30 seconds, Maintain at 4 ° C.
  • reaction conditions for MSP using a primer set (SEQ ID NO: 52 and 53) for amplifying the base sequence of SEQ ID NO: 27) 1 cycle at 95 ° C for 9 minutes and 30 seconds, 40 cycles of 95 ° C for 30 seconds, 53 ° C for 15 seconds and 72 ° C for 30 seconds, Maintain at 4 ° C.
  • each reaction solution was electrophoresed on a 2% agarose gel to confirm the presence or absence of a PCR product band.
  • CN means normal colon tissue
  • CT colon cancer tissue
  • Example 10 Analysis of methylation status of genomic DNA of various normal tissues by MSP method
  • the methylation status of the CpG site present in the gene region represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 20 to 27 is determined by MSP. Investigated by law.
  • 1. Bisulfite treatment Same as in Example 2 for genomic DNA from leukocytes in human normal heart tissue, human normal kidney tissue, human normal liver tissue, human normal lung tissue and human normal peripheral blood (2 ⁇ g each: BioChain) Then, bisulfite treatment was performed. DNA contained in the solution after the bisulfite treatment was purified using a Qiaquick PCR purification kit (QIAGEN) to obtain a sample for analysis. Further, genomic DNA from breast cancer cell line MCF7 was treated in the same manner as genomic DNA from the above normal tissue to obtain a positive control sample.
  • QIAGEN Qiaquick PCR purification kit
  • MSP Method MSP was performed using the primer sets shown in SEQ ID NOs: 38 to 53 described above, using the DNA in the obtained analysis sample and positive control sample as a template.
  • the PCR reaction solution was prepared in the same manner as in Example 9.
  • the reaction conditions for MSP using each of the above primer sets are as follows. (Reaction conditions for MSP using a primer set (SEQ ID NO: 38 and 39) for amplifying the base sequence of SEQ ID NO: 20) 1 cycle at 95 ° C for 9 minutes and 30 seconds, 40 cycles of 95 ° C for 30 seconds, 62 ° C for 15 seconds and 72 ° C for 30 seconds, Maintain at 4 ° C.
  • reaction conditions for MSP using a primer set (SEQ ID NO: 40 and 41) for amplifying the base sequence of SEQ ID NO: 21) 1 cycle at 95 ° C for 9 minutes and 30 seconds, 40 cycles of 95 ° C for 30 seconds, 62 ° C for 15 seconds and 72 ° C for 30 seconds, Maintain at 4 ° C.
  • reaction conditions for MSP using a primer set (SEQ ID NOs: 42 and 43) for amplifying the base sequence of SEQ ID NO: 22) 1 cycle at 95 ° C for 9 minutes and 30 seconds, 40 cycles of 95 ° C for 30 seconds, 61 ° C for 15 seconds and 72 ° C for 30 seconds, Maintain at 4 ° C.
  • reaction conditions for MSP using a primer set (SEQ ID NO: 44 and 45) for amplifying the base sequence of SEQ ID NO: 23) 1 cycle at 95 ° C for 9 minutes and 30 seconds, 35 cycles of 95 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 15 seconds and 72 ° C for 30 seconds, Maintain at 4 ° C.
  • reaction conditions for MSP using a primer set (SEQ ID NO: 46 and 47) for amplifying the base sequence of SEQ ID NO: 24) 1 cycle at 95 ° C for 9 minutes and 30 seconds, 40 cycles of 95 seconds at 30 ° C, 15 seconds at 50 ° C and 30 seconds at 72 ° C, Maintain at 4 ° C.
  • reaction conditions for MSP using a primer set (SEQ ID NO: 48 and 49) for amplifying the base sequence of SEQ ID NO: 25) 1 cycle at 95 ° C for 9 minutes and 30 seconds, 35 cycles of 95 ° C for 30 seconds, 61 ° C for 15 seconds and 72 ° C for 30 seconds, Maintain at 4 ° C.
  • reaction conditions for MSP using a primer set (SEQ ID NO: 50 and 51) for amplifying the base sequence of SEQ ID NO: 26) 1 cycle at 95 ° C for 9 minutes and 30 seconds, 35 cycles of 95 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 15 seconds and 72 ° C for 30 seconds, Maintain at 4 ° C.
  • reaction conditions for MSP using a primer set (SEQ ID NO: 52 and 53) for amplifying the base sequence of SEQ ID NO: 27) 1 cycle at 95 ° C for 9 minutes and 30 seconds, 40 cycles of 95 ° C for 30 seconds, 53 ° C for 15 seconds and 72 ° C for 30 seconds, Maintain at 4 ° C.
  • MCF7 breast cancer cell line MCF7
  • H normal heart tissue
  • K normal kidney tissue
  • Li normal liver tissue
  • Li normal lung tissue
  • Phe normal Peripheral blood leukocytes.
  • FIG. 38 shows that no band was detected in any normal tissue by the MSP method for the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 20 to 27 using the above primer set set.
  • the above MSP reaction conditions are conditions under which a band is sufficiently detected when a positive control sample prepared from the genomic DNA of MCF7 cells is used as a template.
  • PCR products were not obtained in various normal tissues.
  • methylation of CpG sites present in the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 20 to 27, that is, the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 7 to 14, is not detected in the analysis of genomic DNA of each normal tissue by the MSP method. Therefore, it was suggested that it can be determined that cancer cells are not present in various normal tissues by analyzing the presence or absence of methylation of the CpG site present in the molecular marker for determination of the present invention.

Abstract

　本発明は、癌細胞の存否を判定可能な新規分子マーカーを用いて、生体試料から抽出したDNAのメチル化状態を解析し、その解析結果に基づいて、生体試料中の癌細胞の存否を判定する方法に関する。

Description

生体試料中の癌細胞の存否を判定する方法、判定用分子マーカーおよびキット
　本発明は、生体試料中の癌細胞の存否を判定する方法に関する。より詳細には、生体試料から抽出したDNAについて、所定の塩基配列のCpG部位のメチル化状態を解析し、その解析結果に基づいて、生体試料中の癌細胞の存否を判定する方法に関する。
　また、本発明は、その方法に用いられる判定用分子マーカーおよびキットに関する。
　高等真核生物の染色体DNAでは、DNAを構成する塩基のうちC（シトシン）の５位がメチル化されることが知られている。このようなDNAのメチル化は、遺伝子発現の制御機構として機能している。例えば、ある遺伝子のプロモーター領域に存在する、CpG配列に富む領域（「CpGアイランド」または「CG島」とも呼ばれる）がメチル化されている場合、その遺伝子の転写は抑制される。この現象は、「遺伝子のサイレンシング」とも呼ばれる。これに対して、CpGアイランドがメチル化されていない場合、転写因子がプロモーターに結合できるので、遺伝子の転写が可能となる。
　このように、DNAのメチル化は、遺伝子発現の制御機構の１つである。そのため、DNAのメチル化は、初期胚発生、組織特異的な遺伝子の発現、哺乳動物に特徴的な現象である遺伝子刷り込みやX染色体の不活性化、染色体の安定化、DNA複製のタイミングなど、様々な生理的および病理的な現象に重要な役割を果たしている。
　さらに近年、DNAのメチル化の異常、すなわち、DNAのメチル化による遺伝子のサイレンシングが、癌などの疾患の発生や進行に関与することが明らかになってきている。それゆえ、種々の遺伝子についてDNAのメチル化状態を解析することにより、癌などの疾患を診断する試みがなされている。例えば、特許文献１には、NPTX2、SARP2、CLDN5などの遺伝子が、正常膵臓細胞ではメチル化されていないが、膵臓癌細胞ではメチル化されていることが記載されており、これらの遺伝子のメチル化状態を解析することにより、膵臓癌を検出する方法が記載されている。また、特許文献２には、BRCA2、PCDH7などの遺伝子のメチル化状態を解析することにより、乳癌の一種である乳房増殖性疾患を検出する方法が記載されている。
　このように、種々の癌について異常メチル化される遺伝子が多数報告されている。しかしながら、それらの中で癌を検出するための分子マーカーとして用い得るものは少数に過ぎない。
　そのため、遺伝子のメチル化解析を利用した癌細胞の検出方法に有用な新規分子マーカーのさらなる開発が望まれている。
特表２００７－５２４３６９号公報 特表２００８－５０６４０７号公報
　本発明は、癌細胞の存否を判定可能な新規分子マーカーを用いて、生体試料から抽出したDNAのメチル化状態を解析し、その解析結果に基づいて、癌細胞の存否を判定する方法を提供することを目的とする。
　また、本発明は、その方法に用い得る判定用分子マーカーおよびキットを提供することを目的とする。
　本発明者らは、癌組織および癌細胞株のゲノムDNAのメチル化状態を解析して、DNAのメチル化が、癌組織および癌細胞株に特異的に認められる遺伝子領域を同定した。そして、本発明者らは、これらの遺伝子領域中の所定の塩基配列についてメチル化状態を解析し、得られた解析結果を利用することにより、癌細胞を含む試料と癌細胞を含まない試料とを、高精度に区別できることを見出して、本発明を完成した。
　すなわち、本発明によれば、
　被験者から採取した生体試料からDNAを抽出する工程と、
　抽出工程で得られたDNAについて、配列番号１～１４の塩基配列から選択される少なくとも１つの塩基配列に存在する少なくとも１つのCpG部位のメチル化状態を解析する工程と、
　解析工程で得られた解析結果に基づいて、生体試料中の癌細胞の存否を判定する工程と
を含む、生体試料中の癌細胞の存否を判定する方法が提供される。
　また、本発明によれば、配列番号１～１４の塩基配列に存在するCpG部位から少なくとも１つ選択される、メチル化状態の解析を用いた癌細胞の存否の判定用分子マーカーが提供される。
　さらに、本発明によれば、
　被験者から採取した生体試料から抽出したDNAに含まれる非メチル化シトシンを他の塩基に変換する非メチル化シトシン変換剤と、
　配列番号１～１４の塩基配列から選択される少なくとも１つの塩基配列に存在する少なくとも１つのCpG部位のメチル化状態を、メチル化特異的PCR法により確認するためのプライマーセットと
を含む、生体試料中の癌細胞の存否の判定用キットが提供される。
　本発明の生体試料中の癌細胞の存否を判定する方法（以下、本発明の方法ともいう）によれば、被験者から採取した生体試料から抽出したDNAについて、本発明の判定用分子マーカーのメチル化状態を解析することにより、該試料中の癌細胞の存否を判定できる。
　また、本発明は、その方法に用い得る判定用分子マーカーおよびキットを提供することができる。
膵臓癌組織の４サンプルおよび正常膵臓組織の５サンプルから得たDNAにおける、配列番号１の塩基配列の5'末端から数えて1～54番目のCpG部位のメチル化状態を示す表である。 膵臓癌組織の５サンプルおよび正常膵臓組織の５サンプルから得たDNAにおける、配列番号２の塩基配列の5'末端から数えて1～79番目のCpG部位のメチル化状態を示す表である。 膵臓癌組織の５サンプルおよび正常膵臓組織の４サンプルから得たDNAにおける、配列番号３の塩基配列の5'末端から数えて1～12番目のCpG部位のメチル化状態を示す表である。 配列番号１～３の各塩基配列に存在するCpG部位のメチル化の頻度を示す棒グラフである。 膵臓癌組織および正常組織から得たDNAについて、配列番号１５の塩基配列をメチル化特異的PCR（MSP）法により増幅して得られたPCR産物のバンドの蛍光強度を示す棒グラフである。 膵臓癌組織および正常組織から得たDNAについて、配列番号１６の塩基配列をMSP法により増幅して得られたPCR産物のバンドの蛍光強度を示す棒グラフである。 膵臓癌組織および正常膵臓組織から得たDNAについて、配列番号１７の塩基配列をMSP法により増幅して得られたPCR産物のバンドの蛍光強度を示す棒グラフである。 膵臓癌組織および正常組織から得たDNAについて、配列番号１８の塩基配列をMSP法により増幅して得られたPCR産物のバンドの蛍光強度を示す棒グラフである。 膵臓癌組織および正常組織から得たDNAについて、配列番号１９の塩基配列をMSP法により増幅して得られたPCR産物のバンドの蛍光強度を示す棒グラフである。 大腸組織および乳腺組織から得たDNAについて、配列番号１５の塩基配列をMSP法により増幅して得られたPCR産物のバンドの蛍光強度を示す棒グラフである。 乳腺組織から得たDNAについて、配列番号１８の塩基配列をMSP法により増幅して得られたPCR産物のバンドの蛍光強度を示す棒グラフである。 乳癌細胞株MCF7の６サンプルおよび正常乳腺上皮細胞株HMECの５サンプルにおける、配列番号７の塩基配列の5'末端から数えて1～52番目のCpG部位のメチル化状態を示す表である。 MCF7細胞の４サンプルおよびHMEC細胞の４サンプルにおける、配列番号８の塩基配列の5'末端から数えて1～39番目のCpG部位のメチル化状態を示す表である。 MCF7細胞の６サンプルおよびHMEC細胞の６サンプルにおける、配列番号９の塩基配列の5'末端から数えて1～23番目のCpG部位のメチル化状態を示す表である。 MCF7細胞の５サンプルおよびHMEC細胞の５サンプルにおける、配列番号１０の塩基配列の5'末端から数えて1～10番目のCpG部位のメチル化状態を示す表である。 MCF7細胞の４サンプルおよびHMEC細胞の４サンプルにおける、配列番号１１の塩基配列の5'末端から数えて1～23番目のCpG部位のメチル化状態を示す表である。 MCF7細胞の６サンプルおよびHMEC細胞の６サンプルにおける、配列番号１２の塩基配列の5'末端から数えて1～32番目のCpG部位のメチル化状態を示す表である。 MCF7細胞の５サンプルおよびHMEC細胞の４サンプルにおける、配列番号１３の塩基配列の5'末端から数えて1～19番目のCpG部位のメチル化状態を示す表である。 MCF7細胞の４サンプルおよびHMEC細胞の４サンプルにおける、配列番号１４の塩基配列の5'末端から数えて1～24番目のCpG部位のメチル化状態を示す表である。 配列番号７～１４の各塩基配列に存在するCpG部位のメチル化の頻度を示す棒グラフである。 MCF7細胞およびHMEC細胞から得たDNAについて、配列番号２０の塩基配列をMSP法により増幅して得られたPCR産物のバンドの蛍光強度を示す棒グラフである。 MCF7細胞およびHMEC細胞から得たDNAについて、配列番号２１の塩基配列をMSP法により増幅して得られたPCR産物のバンドの蛍光強度を示す棒グラフである。 MCF7細胞およびHMEC細胞から得たDNAについて、配列番号２２の塩基配列をMSP法により増幅して得られたPCR産物のバンドの蛍光強度を示す棒グラフである。 MCF7細胞およびHMEC細胞から得たDNAについて、配列番号２３の塩基配列をMSP法により増幅して得られたPCR産物のバンドの蛍光強度を示す棒グラフである。 MCF7細胞およびHMEC細胞から得たDNAについて、配列番号２４の塩基配列をMSP法により増幅して得られたPCR産物のバンドの蛍光強度を示す棒グラフである。 MCF7細胞およびHMEC細胞から得たDNAについて、配列番号２５の塩基配列をMSP法により増幅して得られたPCR産物のバンドの蛍光強度を示す棒グラフである。 MCF7細胞およびHMEC細胞から得たDNAについて、配列番号２６の塩基配列をMSP法により増幅して得られたPCR産物のバンドの蛍光強度を示す棒グラフである。 MCF7細胞およびHMEC細胞から得たDNAについて、配列番号２７の塩基配列をMSP法により増幅して得られたPCR産物のバンドの蛍光強度を示す棒グラフである。 乳癌組織および正常乳腺組織から得たDNAについて、配列番号２０の塩基配列をMSP法により増幅して得られたPCR産物のバンドの蛍光強度を示す棒グラフである。 乳癌組織および正常乳腺組織から得たDNAについて、配列番号２１の塩基配列をMSP法により増幅して得られたPCR産物のバンドの蛍光強度を示す棒グラフである。 乳癌組織および正常乳腺組織から得たDNAについて、配列番号２２の塩基配列をMSP法により増幅して得られたPCR産物のバンドの蛍光強度を示す棒グラフである。 乳癌組織および正常乳腺組織から得たDNAについて、配列番号２３の塩基配列をMSP法により増幅して得られたPCR産物のバンドの蛍光強度を示す棒グラフである。 乳癌組織および正常乳腺組織から得たDNAについて、配列番号２４の塩基配列をMSP法により増幅して得られたPCR産物のバンドの蛍光強度を示す棒グラフである。 乳癌組織および正常乳腺組織から得たDNAについて、配列番号２５の塩基配列をMSP法により増幅して得られたPCR産物のバンドの蛍光強度を示す棒グラフである。 乳癌組織および正常乳腺組織から得たDNAについて、配列番号２６の塩基配列をMSP法により増幅して得られたPCR産物のバンドの蛍光強度を示す棒グラフである。 乳癌組織および正常乳腺組織から得たDNAについて、配列番号２７の塩基配列をMSP法により増幅して得られたPCR産物のバンドの蛍光強度を示す棒グラフである。 大腸癌組織および正常大腸組織から得たDNAについて、配列番号１７～１９、２１、２２および２５～２７の塩基配列をMSP法により増幅し、得られた反応液をアガロース電気泳動したときの写真である。 MCF7細胞、正常心臓組織、正常腎臓組織、正常肝臓組織、正常肺組織および正常抹消血中白血球から得たDNAについて、配列番号２０～２７の塩基配列をMSP法により増幅し、得られた反応液をアガロース電気泳動したときの写真である。
　本明細書において、「CpG部位」とは、塩基配列中のシトシン（C）とグアニン（G）とが5'から3'への方向にこの順序で隣り合った配列の部位を意味する。なお、CpGの「p」の文字は、シトシンとグアニンとの間のホスホジエステル結合を表わす。
　本明細書において、「メチル化状態を解析する」とは、解析対象の塩基配列に存在するCpG部位のメチル化の有無、または該塩基配列に存在するCpG部位のメチル化の頻度を解析することを意味する。なお、ここでいう解析対象の塩基配列は、配列番号１～１４の塩基配列から選択される少なくとも１つの塩基配列のうち、少なくとも１つのCpG部位を含む領域であれば特に限定されない。
　上記の「メチル化の有無」は、解析対象の塩基配列に存在するCpG部位のシトシン残基がメチル化されているか否かを意味する。
　また、「メチル化の頻度」は、解析対象の塩基配列に存在する全てのCpG部位の数に対する、メチル化されたCpG部位の数の割合を意味する。なお、本発明においては、配列番号１～１４の各塩基配列に存在するCpG部位の位置および数は既知であるので、配列番号１～１４の各塩基配列の中から解析対象の塩基配列を特定すれば、そこに存在するCpG部位の数も予め把握することが可能である。したがって、解析対象の塩基配列におけるメチル化されたCpG部位の数自体もメチル化の頻度として利用できる。
　本発明の方法では、まず被験者から採取した生体試料からＤＮＡを抽出する。
　この抽出工程において、上記の生体試料は、被験者のDNAを含む試料であれば特に限定されないが、好ましくはゲノムDNAを含む試料、例えば臨床検体を用い得る。臨床検体として具体的には、血液、血清、血漿、リンパ液、尿、乳頭分泌液、手術や生検により採取した組織および細胞などが挙げられる。
　生体試料からのDNAの抽出は、公知の抽出方法により行うことができる。例えば、生体試料と、細胞や組織を可溶化する界面活性剤（例えばコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウムなど）を含む処理液とを混合し、得られた混合液に物理的処理（撹拌、ホモジナイズ、超音波破砕など）を施して、生体試料に含まれるDNAを該混合液中に遊離させることによって行うことができる。この場合、該溶液を遠心分離して細胞破片を沈殿させた後、DNAを含む上清を回収し、この上清を次の解析工程に用いることが好ましい。さらに、得られた上清を、公知の方法により精製してもよい。なお、生体試料からのDNAの抽出および精製は、市販のキットを用いて行うこともできる。
　上記の抽出工程は、抽出したDNAを断片化する工程をさらに含むことが好ましい。そのような工程により、DNAを適当な長さに断片化しておけば、後述するメチル化DNA免疫沈降（MeDIP）法および非メチル化シトシン変換処理を効率よく行うことができる。
　DNAの断片化は、超音波処理、アルカリ処理、制限酵素処理などにより行うことができる。例えば、水酸化ナトリウムを用いてアルカリ処理を行なう場合は、DNA溶液に水酸化ナトリウム溶液を終濃度0.1～1.0 Ｎとなるよう添加し、10～40℃で5～15分間インキュベーションすることによりDNAを断片化できる。また、制限酵素処理を行う場合、制限酵素はDNAの塩基配列に基づいて適宜選択でき、例えばMseIやBamHIなどを用い得る。
　次いで、本発明の方法では、生体試料から抽出したDNAについて、配列番号１～１４の塩基配列から選択される少なくとも１つの塩基配列に存在する少なくとも１つのCpG部位のメチル化状態を解析する。
　上記の配列番号１～１４の塩基配列は、いずれもヒトゲノムDNAの一領域である。より具体的には、これらの塩基配列はそれぞれ、以下の表１に示される遺伝子領域またはその付近の塩基配列領域の一部である。なお、これらの塩基配列自体は公知であり、例えば米国国立医学図書館の国立生物情報センター（National Center for Biotechnology Information：NCBI）により提供されるデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）などの公知のデータベースから知ることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　この解析工程では、解析対象のCpG部位は、以下に示すものから選択されることが好ましい：
　配列番号１の塩基配列の5'末端側から1、3～7、9～26および28～54番目のCpG部位、
　配列番号２の塩基配列の5'末端側から1～11、13～23、25、26、28、29、31、32、34、35、38、40～44、46～49、51～57、59～66、68、70～73、75、76、78および79番目のCpG部位、
　配列番号３の塩基配列の5'末端側から1～10および12番目のCpG部位、
　配列番号４の塩基配列の5'末端側から1～3番目のCpG部位、
　配列番号５の塩基配列の5'末端側から1～4番目のCpG部位、
　配列番号６の塩基配列の5'末端側から1および2番目のCpG部位、
　配列番号７の塩基配列の5'末端側から1～7および9～52番目のCpG部位、
　配列番号８の塩基配列の5'末端側から1～16、18～25および27～39番目のCpG部位、
　配列番号９の塩基配列の5'末端側から1、2、4、7～11および13～23番目のCpG部位、
　配列番号１０の塩基配列の5'末端側から1～6、8および10番目のCpG部位、
　配列番号１１の塩基配列の5'末端側から1～3、5～11、13、15～19および21～23番目のCpG部位、
　配列番号１２の塩基配列の5'末端側から1～6、8、10～22、25～28および32番目のCpG部位、
　配列番号１３の塩基配列の5'末端側から1～3、7～13、15および19番目のCpG部位、ならびに
　配列番号１４の塩基配列の5'末端側から1～4、14～16、18、19、21および22番目のCpG
部位。
　上記の解析工程は、配列番号１～１４の塩基配列に存在するCpG部位のメチル化の有無を解析する工程であってもよい。
　この場合、解析対象のCpG部位は１つであってもよいが、後の判定工程での判定精度を向上させるため、複数のCpG部位のメチル化の有無を解析することが好ましい。なお、複数のCpG部位は、１つの塩基配列中から選択してもよく、複数の塩基配列のそれぞれの中から選択してもよい。
　また、上記の解析工程は、配列番号１～１４の塩基配列に存在するCpG部位のメチル化の頻度を解析する工程であってもよい。
　この場合、解析対象の塩基配列はCpG部位を１つしか含んでいなくてもよいが、後の判定工程での判定精度を向上させるため、複数のCpG部位を含む塩基配列を解析対象とすることが好ましい。また、解析対象の塩基配列は、上記の配列番号１～１４の塩基配列のうちのいずれか１つであってもよいが、好ましくは複数の塩基配列である。
　メチル化状態を解析する方法としては、種々の方法が公知である。本発明の方法では、いずれの解析方法を用いるかは特に限定されないが、メチル化DNAと非メチル化DNAとを区別する工程と、DNAを増幅する工程と、メチル化DNAおよび／または非メチル化DNAを検出する工程とを含むことが好ましい。
　メチル化DNAと非メチル化DNAとを区別する工程としては、メチル化感受性制限酵素処理、MeDIP法、非メチル化シトシン変換処理などを行う工程が挙げられる。
　DNAを増幅する工程としては、PCR増幅法、定量的PCR増幅法、IVT（in vitro transcription）増幅法、SPIA（商標）増幅法などを行う工程が挙げられる。
　メチル化DNAおよび／または非メチル化DNAを検出する工程としては、電気泳動法、シークエンス解析法、マイクロアレイ解析法、質量分析法、サザンハイブリダイゼーションなどを行う工程が挙げられる。
　MeDIP法とは、抗メチル化シトシン抗体もしくは抗メチル化シチジン抗体、またはメチル化DNA結合タンパク質を特異的に認識する抗体を用いる免疫沈降により、生体試料に含まれるメチル化DNAを濃縮する方法である。本発明の方法の解析工程では、上記の抽出工程で得られたDNAに含まれるメチル化DNAをMeDIP法により濃縮し、この濃縮されたメチル化DNAのメチル化状態を解析する工程であってもよい。
　また、MeDIP法により濃縮したメチル化DNAを、IVT増幅法などにより増幅し、得られた増幅産物について、マイクロアレイを用いてメチル化状態を解析できる。このような解析方法は、MeDIP on chip法と呼ばれる。
　非メチル化シトシン変換処理とは、生体試料から抽出したDNAと非メチル化シトシン変換剤とを反応させることにより、該DNA中の非メチル化シトシンを他の塩基（ウラシル、チミン、アデニンまたはグアニン）に変換する処理のことである。
　ここで、非メチル化シトシン変換剤とは、DNAと反応して該DNA中の非メチル化シトシンを他の塩基（ウラシル、チミン、アデニンまたはグアニン）に変換できる物質である。このような非メチル化シトシン変換剤としては、例えば亜硫酸水素のナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの亜硫酸水素塩（バイサルファイト）が好適に用いられる。
　バイサルファイトを用いる処理では、DNA中の非メチル化シトシンは、脱アミノ化反応によりウラシルに変換されるが、メチル化シトシンには、このような塩基の変換が起こらない。
　したがって、DNAのメチル化状態の違いは、バイサルファイトを用いる非メチル化シトシン変換処理によって、塩基配列の違い（CおよびU）に変換される。なお、バイサルファイトによる非メチル化シトシン変換処理は、バイサルファイト処理と呼ばれる。
　バイサルファイト処理を行なう場合、バイサルファイトの添加量（濃度）は、DNA中の非メチル化シトシンを十分に変換できる程度であれば特に限定されないが、例えば、試料中の終濃度として1 M以上、好ましくは1～15 M、より好ましくは3～10 Mである。また、生体試料にバイサルファイトを添加した後のインキュベーションの条件（温度および時間）は、バイサルファイトの添加量に応じて適宜設定できるが、例えば、バイサルファイトを終濃度6 Mで添加した場合、50～80℃で10～90分間インキュベーションする。
　DNAのメチル化状態は、バイサルファイト処理後のDNAをシークエンス解析して、本来の塩基配列との違いを検出することにより解析できる。この方法は、バイサルファイトシークエンス法と呼ばれる。
　また、DNAのメチル化状態は、バイサルファイト処理後のDNAを、後述するプライマーセットを用いてPCR増幅を行い、PCR産物の有無を確認することによっても解析することができる。このような解析方法は、メチル化特異的PCR（MSP）法と呼ばれる。
　上記のMSP法には、解析対象のCpG部位のシトシンがメチル化されている（すなわち、シトシンがウラシルに変換されていない）塩基配列は増幅できるが、CpG部位のシトシンがメチル化されていない（すなわち、該シトシンがウラシルに変換されている）塩基配列は増幅できないプライマーセットを用いる。このようなプライマーセットを用いるMSP法では、PCR産物が存在することにより、解析対象のCpG部位がメチル化されていることがわかる。
　また、MSP法は、解析対象のCpG部位のシトシンがウラシルに変換されていない塩基配列は増幅できないが、CpG部位のシトシンがウラシルに変換されている塩基配列は増幅できるプライマーセットを用いて行なうこともできる。この場合、PCR産物が存在しないことにより、解析対象のCpG部位がメチル化されていることがわかる。
　上記のプライマーセットに含まれる各プライマーは、解析対象のCpG部位を含む塩基配列に応じて当業者が適宜設計できるが、プライマーの3'末端またはその付近に、解析対象のCpG部位のシトシンを含むように設計することが好ましい。
　本発明の方法の解析工程においては、マイクロアレイを用いてメチル化状態を解析することもできる。この場合、解析用マイクロアレイは、配列番号１～１４の塩基配列に相補的な核酸プローブ１種以上を、基板上に固定して作製できる。なお、このようなマイクロアレイは、当該技術において公知の方法により作製できる。
　マイクロアレイによる解析では、生体試料から抽出したDNAは、当該技術において公知の標識物質により標識されていることが好ましい。よって、本発明の方法は、抽出したDNAを標識する工程をさらに含むことが好ましい。この標識工程は、生体試料中の全てのDNAを標識できるので、上記のDNA増幅工程の後に行われるのが有利である。なお、標識物質としては、蛍光物質、ビオチンなどのハプテン、放射性物質などが挙げられる。また、蛍光物質としては、Cy3、Cy5、Alexa Fluor（商標）、FITCなどが挙げられる。
　このようにDNAを標識することにより、マイクロアレイ上のプローブからのシグナルの測定が容易になる。なお、DNAをこれらの標識物質で標識する方法は、当該技術において公知である。
　上記のシグナルは、マイクロアレイの種類に応じて適切なシグナルであり得る。例えば、シグナルは、マイクロアレイの各プローブとハイブリダイズしたDNA断片が存在する場合に発生する電気的シグナルであってもよいし、上記のように解析対象のDNAが標識されている場合は、標識物質から生じる蛍光、発光などのシグナルであってもよい。
　シグナルの検出は、通常のマイクロアレイ測定装置に備えられたスキャナーにより行うことができる。スキャナーとしては、例えば、GeneChip（登録商標）Scanner3000 7G（Affymetrix社）などが挙げられる。
　本発明の方法では、上記の解析工程で得られた解析結果に基づいて、生体試料中の癌細胞の存否を判定する。
　この判定工程では、解析工程においてメチル化されたCpG部位が有るという結果が得られた場合に、被験者から採取した生体試料中に癌細胞が存在すると判定し得る。反対に、メチル化されたCpG部位が無いという結果が得られた場合に、該生体試料中に癌細胞が存在しないと判定し得る。
　なお、上記の判定は、１つのCpG部位の解析結果から行ってもよいが、判定精度を向上させるために、複数のCpG部位の解析結果から判定することが好ましい。
　また、上記の判定工程では、解析工程においてメチル化の頻度が所定の閾値より高いという結果が得られた場合に、被験者から採取した生体試料中に癌細胞が存在すると判定し得る。反対に、メチル化の頻度が所定の閾値より低いという結果が得られた場合に、被験者から採取した生体試料中に癌細胞が存在しないと判定し得る。
　なお、上記の閾値は、次のようにして設定できる。まず、癌細胞を含まないことが予め確認されている生体試料（正常組織または正常細胞）、および癌細胞を含む生体試料から抽出したDNAについて、メチル化の頻度を解析する。次いで、得られた解析結果に基づいて、癌細胞を含まない生体試料のメチル化の頻度よりも高く、癌細胞を含む生体試料のそれよりも低い範囲から、閾値を設定する。好ましくは、癌細胞を含まない生体試料と癌細胞を含む生体試料とを高精度に区別し得る値を、閾値として設定する。
　上記の本発明の方法に用いる癌細胞の存否の判定用分子マーカー（以下、「本発明の分子マーカー」ともいう）も、本発明の１つである。
　本発明の分子マーカーは、配列番号１～１４の塩基配列に存在するCpG部位から少なくとも１つ選択される。
　また、本発明の分子マーカーは、以下に示すCpG部位から選択されることが好ましい：
　配列番号１の塩基配列の5'末端側から1、3～7、9～26および28～54番目のCpG部位、
　配列番号２の塩基配列の5'末端側から1～11、13～23、25、26、28、29、31、32、34、35、38、40～44、46～49、51～57、59～66、68、70～73、75、76、78および79番目のCpG部位、
　配列番号３の塩基配列の5'末端側から1～10および12番目のCpG部位、
　配列番号４の塩基配列の5'末端側から1～3番目のCpG部位、
　配列番号５の塩基配列の5'末端側から1～4番目のCpG部位、
　配列番号６の塩基配列の5'末端側から1および2番目のCpG部位、
　配列番号７の塩基配列の5'末端側から1～7および9～52番目のCpG部位、
　配列番号８の塩基配列の5'末端側から1～16、18～25および27～39番目のCpG部位、
　配列番号９の塩基配列の5'末端側から1、2、4、7～11および13～23番目のCpG部位、
　配列番号１０の塩基配列の5'末端側から1～6、8および10番目のCpG部位、
　配列番号１１の塩基配列の5'末端側から1～3、5～11、13、15～19および21～23番目のCpG部位、
　配列番号１２の塩基配列の5'末端側から1～6、8、10～22、25～28および32番目のCpG部位、
　配列番号１３の塩基配列の5'末端側から1～3、7～13、15および19番目のCpG部位、ならびに
　配列番号１４の塩基配列の5'末端側から1～4、14～16、18、19、21および22番目のCpG
部位。
　また、上記の本発明の方法を実行するための生体試料中の癌細胞の存否の判定用キット（以下、「本発明のキット」ともいう）も本発明の１つである。
　本発明のキットは、非メチル化シトシン変換剤と、配列番号１～１４の塩基配列に存在する少なくとも１つのCpG部位のメチル化状態をメチル化特異的PCRにより確認するためのプライマーセットとを含む。
　本発明のキットに含まれる非メチル化シトシン変換剤は、被験者から採取した生体試料から抽出したDNAと反応して、該DNA中の非メチル化シトシンを他の塩基（ウラシル、チミン、アデニンまたはグアニン）に変換できる物質であれば特に限定されないが、好ましくはバイサルファイトである。なお、非メチル化シトシン変換剤は、溶液の形態にあってもよく、用時に適切な溶媒に溶解して液体にし得る固体の形態にあってもよい。
　本発明のキットを用いる場合、MSP法により確認されるCpG部位は、以下に示すものから選択されることが好ましい：
　配列番号１の塩基配列の5'末端側から1、3～7、9～26および28～54番目のCpG部位、
　配列番号２の塩基配列の5'末端側から1～11、13～23、25、26、28、29、31、32、34、35、38、40～44、46～49、51～57、59～66、68、70～73、75、76、78および79番目のCpG部位、
　配列番号３の塩基配列の5'末端側から1～10および12番目のCpG部位、
　配列番号４の塩基配列の5'末端側から1～3番目のCpG部位、
　配列番号５の塩基配列の5'末端側から1～4番目のCpG部位、
　配列番号６の塩基配列の5'末端側から1および2番目のCpG部位、
　配列番号７の塩基配列の5'末端側から1～7および9～52番目のCpG部位、
　配列番号８の塩基配列の5'末端側から1～16、18～25および27～39番目のCpG部位、
　配列番号９の塩基配列の5'末端側から1、2、4、7～11および13～23番目のCpG部位、
　配列番号１０の塩基配列の5'末端側から1～6、8および10番目のCpG部位、
　配列番号１１の塩基配列の5'末端側から1～3、5～11、13、15～19および21～23番目のCpG部位、
　配列番号１２の塩基配列の5'末端側から1～6、8、10～22、25～28および32番目のCpG部位、
　配列番号１３の塩基配列の5'末端側から1～3、7～13、15および19番目のCpG部位、ならびに
　配列番号１４の塩基配列の5'末端側から1～4、14～16、18、19、21および22番目のCpG
部位。
　より好ましくは、MSP法により確認されるCpG部位は、以下に示すものから選択される：
　配列番号１の塩基配列の5'末端側から9、10および28～30番目のCpG部位、
　配列番号２の塩基配列の5'末端側から4～7番目のCpG部位、
　配列番号３の塩基配列の5'末端側から6および9番目のCpG部位、
　配列番号７の塩基配列の5'末端側から3、4、11および12番目のCpG部位。
　配列番号８の塩基配列の5'末端側から8、9および14～16番目のCpG部位、
　配列番号９の塩基配列の5'末端側から15、16および22番目のCpG部位、
　配列番号１０の塩基配列の5'末端側から2および6番目のCpG部位、
　配列番号１１の塩基配列の5'末端側から1～3および10番目のCpG部位、
　配列番号１２の塩基配列の5'末端側から10、11および16～19番目のCpG部位、
　配列番号１３の塩基配列の5'末端側から7、8および15番目のCpG部位、ならびに
　配列番号１４の塩基配列の5'末端側から1、2および4番目のCpG部位。
　本発明のキットに含まれるプライマーセットは、以下から選択されることが好ましい：
　配列番号２８および配列番号２９の塩基配列であるプライマーセット、
　配列番号３０および配列番号３１の塩基配列であるプライマーセット、
　配列番号３２および配列番号３３の塩基配列であるプライマーセット、
　配列番号３４および配列番号３５の塩基配列であるプライマーセット、
　配列番号３６および配列番号３７の塩基配列であるプライマーセット、
　配列番号３８および配列番号３９の塩基配列であるプライマーセット、
　配列番号４０および配列番号４１の塩基配列であるプライマーセット、
　配列番号４２および配列番号４３の塩基配列であるプライマーセット、
　配列番号４４および配列番号４５の塩基配列であるプライマーセット、
　配列番号４６および配列番号４７の塩基配列であるプライマーセット、
　配列番号４８および配列番号４９の塩基配列であるプライマーセット、
　配列番号５０および配列番号５１の塩基配列であるプライマーセット、ならびに
　配列番号５２および配列番号５３の塩基配列であるプライマーセット。
　上記のプライマーセットは、配列番号１～１４の塩基配列に存在するCpG部位のメチル化の有無をMSP法で解析することにより、本発明の方法を行なう場合に好適に用いられる。
　以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１　　膵臓癌組織のゲノムDNAからの新規マーカーの同定
　ヒト膵臓癌組織およびヒト正常膵臓組織のゲノムDNAを、マイクロアレイを用いて解析することにより、膵臓癌組織のゲノムDNAに特異的にメチル化が認められる遺伝子領域の探索を行った。
　なお、実施例１での具体的な操作手順は、使用したキットおよび試薬類に添付のマニュアルの記載に従って行った。
１．MeDIP法によるメチル化DNAの調製
　ヒト膵臓癌組織およびヒト正常膵臓組織を生体試料として用いて、これらからゲノムDNAを抽出した。抽出した各ゲノムDNA（４μg）を、制限酵素MseI（NEB社）と37℃で一晩反応させて、300～1000 bpに断片化した。次いで、これらを95℃で10分間加熱して変性させた後、４℃まで急冷して、一本鎖DNA断片を得た。
　得られた一本鎖DNA断片をChromatin Immunoprecipitationアッセイキット（Upstate biotechnology社）の希釈用緩衝液（302μl）で希釈した。次いで、得られた各希釈液にProteinG Sepharoseビーズ（68μl：GE Healthcare社）を添加し、４℃で１時間ローテーションした後、遠心分離することにより、該ビーズに非特異的に結合するタンパク質などを除いた（以下、プレクリアー処理ともいう）。そして、各上清を回収した後、これらをそれぞれ二等分して別々のチューブに移して、一方に抗メチル化シトシン抗体BI-MECY-0500（10μg：Eurogentec社）を添加し、他方には該抗体を添加せず、それぞれ検体試料および対照試料（Input）とした。そして、各検体試料を４℃で一晩ローテーションした後、ProteinG Sepharose ビーズ（68μl：GE Healthcare社）を添加し、さらに４℃で１時間ローテーションした。その後、これらを遠心分離して、上清を除いてビーズを回収した。得られたビーズを上記のキットの洗浄用緩衝液で洗浄した後、該ビーズに溶出用緩衝液（250μl）を加えて、一本鎖DNA断片を溶出した。
　得られたDNA溶液をプロテイナーゼK（Sigma社）と反応させた後、Qiaquick PCR purificationキット（QIAGEN社）を用いて精製した。
　なお、各検体試料においてメチル化DNAが特異的に濃縮されていることを、定量的PCR法により確認した。
２．試料中の核酸の増幅および標識
　上記のヒト膵臓癌組織およびヒト正常膵臓組織のそれぞれから得た検体試料および対照試料について、CIP（Calf intestine phosphatase）（New England Biolab社）を用いて、DNAの脱リン酸化処理を行った。次いで、Terminal transferase（ROCHE社）を用いてDNAの3'末端にdATPを付加し、MinElute purificationキット（QIAGEN社）を用いてDNAを精製した。そして、GeneChip（登録商標）One-Cycle Traget Labelingキット（Affymetrix社）を用いて、各試料中の一本鎖DNA断片から二本鎖DNAを得た。さらに、得られた二本鎖DNAを鋳型としてIVT増幅によるビオチン標識をして、各試料からビオチン化cRNAを得た。得られたcRNAの濃度を、吸光度（260 nmおよび280 nm）を測定することにより確認した。
　各試料からのcRNAを、GeneChip（登録商標）Sample Cleanup Module（Affymetrix社）により断片化して、マイクロアレイ解析用の検体試料および対照試料を得た。
３．マイクロアレイ解析
（１）試料とマイクロアレイとの接触
　上記のマイクロアレイ解析用の各試料を、マイクロアレイとしてのGeneChip（登録商標）Human Promoter 1.0R Array（Affymetrix社）に接触させて、プローブとのハイブリダイゼーションを行った。各検体試料および対照試料について、同種のマイクロアレイを１つずつ用いた。なお、マイクロアレイとの接触後の染色、洗浄およびスキャン（シグナルの測定）は、Affymetrix社から提供されるマニュアルに従って行った。
（２）マイクロアレイデータの解析
　得られたマイクロアレイのデータを、以下の手順に従って解析した。なお、この解析では、中央処理装置、記憶部、キーボードなどの入力部およびディスプレイなどの出力部を備える一般的なコンピュータを用いた。
　（手順１）コンピュータに、上記のマイクロアレイに配置されている全プローブの塩基配列、ゲノムDNAの塩基配列および上記で得られたシグナル測定値を入力した。
　（手順２）ゲノムDNAの塩基配列を、制限酵素MseIの認識配列“TACC”で区切ったDNA断片の塩基配列を取得した。次いで、取得した塩基配列から、その長さが300 bp以上で、且つその配列中に“CG”配列を含まないDNA断片の塩基配列を抽出した。このようにして、“CG”配列を含まない300 bp以上のDNA断片の塩基配列（以下、「断片配列」ともいう）を取得した。
　（手順３）マイクロアレイに配置されている全プローブから、“CG”配列を含まないプローブを抽出した。そして、抽出されたプローブのうち、上記の断片配列と相補的なプローブを補正用プローブとした。
　（手順４）入力したシグナル測定値から、上記の補正用プローブから得られたシグナル測定値を抽出し、それらの統計的代表値（最頻値）を算出した。この値をバックグラウンド値とした。なお、この手順は、検体試料および対照試料のそれぞれについて行った。
　（手順５）入力した各シグナル測定値から上記のバックグラウンド値を差し引き、得られた値を各プローブの補正値とした。なお、補正値が負の場合、その値はゼロとした。なお、この手順も、検体試料および対照試料のそれぞれについて行った。
　（手順６）検体試料の補正値と対照試料の補正値とについて、ウィルコクソンの符号順位検定を行って、有意確率を算出した。
　得られた有意確率を、標準ブラウザーであるIGB（Integrated Genome Browser；IGB社）を用いて可視化した。なお、IGBで表示される有意確率は、（変換値）= -10 log10（有意確率）の式で変換されており、その変換値が20以上の場合に、膵臓癌組織のゲノムDNAに特異的にメチル化されたCpG部位を含む遺伝子領域を有意に検出できたと考えられる。
　その結果、膵臓癌組織のゲノムDNAに特異的にメチル化が認められる遺伝子領域として、配列番号１５～１９の塩基配列で示される領域を同定した。なお、配列番号１５～１９の塩基配列は、それぞれHOXA9、KCNQ1DN、RAPSN、FZD9およびCDH22の遺伝子領域またはその付近の塩基配列領域の一部であり、またそれぞれ配列番号１、２、３、４および５、ならびに６の塩基配列を包含する領域である。
　上記の配列番号１５～１９と、配列番号１～６の各塩基配列および各遺伝子との対応を、以下の表２にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例２　　バイサルファイトシークエンス法によるメチル化状態の解析
　膵臓癌組織およびヒト正常膵臓組織のゲノムDNAにおいて、実施例１で同定した配列番号１５～１７の塩基配列で示される遺伝子領域中のCpG部位がメチル化されているか否かを、バイサルファイトシークエンス法により調べた。
１．バイサルファイト処理
　実施例１で用いたヒト膵臓癌組織およびヒト正常膵臓組織から抽出したゲノムDNA（2μg）に、0.3 N水酸化ナトリウム水溶液を300μl添加し、37℃で10分間インキュベーションして、ゲノムDNAを変性させた。次いで、各DNA溶液に10 M亜硫酸水素ナトリウム溶液を300μl添加し、80℃で40分間インキュベーションすることにより、バイサルファイト処理を行った。そして、Qiaquick PCR purificationキット（QIAGEN社）を用いて、バイサルファイト処理後の各溶液からDNAを精製して、解析用試料を得た。
２．シークエンス解析
　得られた解析用試料中のDNAをテンプレートとして、下記のプライマーセットを用いてPCR法を行った。
　（i）PCR反応液の調製
　下記の試薬を混合して、15μlの反応液を調製した。
　　10×Ex Taq（登録商標）buffer（タカラバイオ株式会社）  1.5μl
　　dNTP mix（2.5 mM）                                    1.2μl
　　Fプライマー（10μM）                                  0.6μl
　　Rプライマー（10μM）                                  0.6μl
　　解析用試料（テンプレート）                            1.0μl
　　Ex Taq（登録商標）polymerase（タカラバイオ株式会社） 0.12μl
　　蒸留水                                               9.98μl
　　合計                                                 15.0μl
　（ii）プライマーの配列および反応条件
（配列番号１５の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- TAGTTAGGGATAAAGTGTGAGTGTTA -3'（配列番号５４）
R：5'- CAACTTATTAAATAACTATACTTCCCC -3'（配列番号５５）
（反応条件）
　　95℃で4分30秒を1サイクル、
　　95℃で30秒、55℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
　　72℃で7分を1サイクル、
　　4℃で維持。
（配列番号１６の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- GGGATATTTGTTTTTTATATTTAATAAAGT -3'（配列番号５６）
R：5'- ACCTCACAATAAAACTACTACAACC -3'（配列番号５７）
（反応条件）
　　95℃で4分30秒を1サイクル、
　　95℃で30秒、56℃で15秒および72℃で40秒を40サイクル、
　　72℃で7分を1サイクル、
　　4℃で維持。
（配列番号１７の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- AGGTATTTATGGGGTAGGAATTATA -3'（配列番号５８）
R：5'- AAATCACTTAACTAAAATCCCACTA -3'（配列番号５９）
（反応条件）
　　95℃で4分30秒を1サイクル、
　　95℃で30秒、56℃で15秒および72℃で40秒を40サイクル、
　　72℃で7分を1サイクル、
　　4℃で維持。
　得られた各PCR産物を、TA cloningキット（Invitrogen社）のpCR（登録商標）2.1ベクターに組み込んだ。得られた各プラスミド構築物をコンピテントセル（TOP10；Invitrogen社）に形質転換し、これらの形質転換体からプラスミドをGenElute Plasmid Miniprepキット（SIGMA社）を用いて抽出および精製した。得られた各プラスミドに含まれる上記のPCR産物の塩基配列を、Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer（Applied Biosystems社製）を用いてシークエンス解析を行った。
　シークエンス解析後、上記の配列番号の塩基配列におけるCpG部位のメチル化状態を解析した。
　配列番号１５～１７の塩基配列のそれぞれに包含される配列番号１～３の塩基配列中に存在するCpG部位のメチル化状態を、上記のシークエンス結果に基づいて、図１～３に表として示した。これらの図に示される表において、「●」はメチル化CpG部位、「○」は非メチル化CpG部位、「－」は解析不能のCpG部位を表わす。また、「PT」および「PN」は、それぞれ膵臓癌組織および正常膵臓組織を意味する。
　各図の表において、CpG部位の行に示される数字は、配列番号１～３の各塩基配列の5'末端から数えたCpG部位の位置を示す番号である。また、該番号に「＊」または「＊＊」が付されたCpG部位は、正常膵臓組織サンプルと比較して膵臓癌組織サンプルにおいてメチル化傾向にあるCpG部位である。
　図１～３より、配列番号１～３のいずれの塩基配列においても、CpG部位は、膵臓癌組織ではメチル化されている傾向にあり、正常膵臓細胞組織ではメチル化されていない傾向にあることがわかる。
　これらの結果に基づいて、配列番号１～３の各塩基配列におけるメチル化の頻度を解析した。例えば、配列番号１の塩基配列の場合では、膵臓癌組織（PT）のメチル化の頻度は、全クローン（clone１～４）中のメチル化されたCpG部位「●」の数を、全クローン中のメチル化されたCpG部位「●」の数とメチル化されていないCpG部位「○」の数との和で除して、パーセンテージとして算出した値である。また、正常膵臓組織（PN）のメチル化の頻度も上記と同様に、全クローン（clone１～５）中のメチル化されたCpG部位「●」の数を、全クローン中のメチル化されたCpG部位「●」の数とメチル化されていないCpG部位「○」の数との和で除して、パーセンテージとして算出した値である。
　このようにして得られた各塩基配列におけるメチル化の頻度を、図４に棒グラフとして示した。なお、該グラフは、膵臓癌組織のサンプル群および正常膵臓組織のサンプル群の平均値を表す。
　図４より、配列番号１～３の各塩基配列に存在する全CpG部位を解析対象とした場合、癌細胞を含む試料と含まない試料とを区別する閾値は、例えば20～60％の範囲から選択できることがわかる。
　このことから、被験者から採取した生体試料から抽出したDNAにおいて、配列番号１、２および／または３の塩基配列中のCpG部位のメチル化の頻度が上記の閾値より高い場合、該生体試料中に癌細胞が存在すると判定し得ることが示唆された。
　本発明の判定用分子マーカーとしては、癌組織ではメチル化されている傾向にあり、且つ正常組織ではメチル化されていない傾向にあるCpG部位が好適である。
　したがって、配列番号１～３の塩基配列中のCpG部位のメチル化の頻度に基づいて試料中の癌細胞の存否を判定する場合、判定用分子マーカーとしてのCpG部位は、図１～３において、好ましくは「＊」または「＊＊」が付されたCpG部位、より好ましくは「＊＊」が付されたCpG部位から選択することによって、より精度の高い判定を行い得る。
　また、メチル化特異的PCRにより、配列番号１～３の塩基配列中のCpG部位のメチル化の有無を解析した結果に基づいて試料中の癌細胞の存否を判定する場合、図１～３において、好ましくは「＊」または「＊＊」が付されたCpG部位、より好ましくは「＊＊」が付されたCpG部位から選択されるCpG部位を増幅できるプライマーを用いることによって、より精度の高い判定を行い得る。
実施例３　　メチル化特異的PCR（MSP）法によるメチル化状態の解析
　実施例１で同定した配列番号１５～１９の遺伝子領域に存在するCpG部位のメチル化状態をMSP法によって調べた。
１．バイサルファイト処理
　ヒト膵臓癌組織、ヒト正常膵臓組織、ヒト正常心臓組織、ヒト正常腎臓組織、ヒト正常肝臓組織、ヒト正常肺組織およびヒト正常末梢血中の白血球からのゲノムDNA（各２μg）に対して、実施例２と同様にして、バイサルファイト処理を行った。バイサルファイト処理後の溶液に含まれるDNAを、Qiaquick PCR purification キット（QIAGEN社）を用いて精製し、解析用試料を得た。
２．MSP法
　得られた解析用試料中のDNAをテンプレートとして、下記のプライマーセットを用いてMSP法を行った。このMSP法においては、テンプレートのDNA中にメチル化されたCpG部位が存在する場合にPCR産物が得られる。なお、本実施例のMSPでの解析対象であるCpG部位は、図１～３の「＊＊」が付されたCpG部位である。
　（i）PCR反応液の調製
　下記の試薬を混合して、25μlの反応液を調製した。
　　2×FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)(ROCHE社)12.5μl
　　Fプライマー（10μM）                                   1.0μl
　　Rプライマー（10μM）                                   1.0μl
　　解析用試料（テンプレート）                             1.0μl
　　蒸留水                                                 9.5μl
　　合計                                                  25.0μl
　なお、上記の組成において、テンプレートに代えて蒸留水を添加したサンプルおよびテンプレートを含まないサンプルを、陰性対照として用いた。
　（ii）プライマーの配列および反応条件
（配列番号１５の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- CGTGGGTTTTAGTTAGGAGC -3'（配列番号２８）
R：5'- ATCCAAAACGACGATATTTAACG -3'（配列番号２９）
　このプライマーセットは、配列番号１５の塩基配列の5'末端から数えて9、10および28～30番目（配列番号１の塩基配列においても同じ位置）のCpG部位を解析対象とする。
（反応条件）
　　95℃で9分30秒を1サイクル、
　　95℃で30秒、54℃で15秒および72℃で30秒を35サイクル、
　　4℃で維持。
（配列番号１６の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- CGTTTCGTTCGTATTTATAATAGACG -3'（配列番号３０）
R：5'- AAAACCCATTCTTCCTAACTCCG -3'（配列番号３１）
　このプライマーセットは、配列番号１６の塩基配列の5'末端から数えて7～10および20番目（配列番号２の塩基配列の5'末端から数えて4～7および17番目）のCpG部位を解析対象とする。
（反応条件）
　　95℃で9分30秒を1サイクル、
　　95℃で30秒、61℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
　　4℃で維持。
（配列番号１７の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- TGAGGAATGTTAGTAGTAAGGTTACGT -3'（配列番号３２）
R：5'- CCTATATACTCAAAAAAACCACGTC -3'（配列番号３３）
　このプライマーセットは、配列番号１７の塩基配列の5'末端から数えて9および12番目（配列番号３の塩基配列の5'末端から数えて6および9番目）のCpG部位を解析対象とする。
（反応条件）
　　95℃で9分30秒を1サイクル、
　　95℃で30秒、62℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
　　4℃で維持。
（配列番号１８の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- GTTGGGTTATACGTCGTAGGGC -3'（配列番号３４）
R：5'- GACAAACGAAAATAAACGTCGAA -3'（配列番号３５）
　このプライマーセットは、配列番号１８の塩基配列の5'末端から数えて21～23および36～39番目（配列番号４の塩基配列の5'末端から数えて1～3番目および配列番号５の塩基配列の5'末端から数えて1～4番目）のCpG部位を解析対象とする。
（反応条件）
　　95℃で9分30秒を1サイクル、
　　95℃で30秒、57℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
　　4℃で維持。
（配列番号１９の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- GATAGTTTTAGAGTCGGGGAAGC -3'（配列番号３６）
R：5'- CCTAATCCTAACAAAATCTACCGAC -3'（配列番号３７）
　このプライマーセットは、配列番号１９の塩基配列の5'末端から数えて74および75番目（配列番号６の塩基配列の5'末端から数えて1および2番目）のCpG部位を解析対象とする。
（反応条件）
　　95℃で9分30秒を1サイクル、
　　95℃で30秒、60℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
　　4℃で維持。
　PCR終了後、各反応液を２％アガロースゲルに電気泳動し、ゲルに現れたバンドからPCR産物の存在を確認した。そして、ゲルの写真を撮影し、得られた写真をQuantity One（Bio-Rad社）のソフトウェアを用いて解析して、バンドの蛍光強度を定量化した。これらの結果を図５～９に示す。これらの図において、「－」はテンプレートを含まない陰性対照、「PN」は正常膵臓組織、「PT」は膵臓癌組織を意味する。
　配列番号１５および１６の塩基配列についてのMSP法では、各正常組織（膵臓、心臓、腎臓、肝臓、肺および末梢血の白血球）ではほとんどバンドは検出されなかったが、膵臓癌組織では顕著に高い強度のバンドが検出された（図５および６）。
　配列番号１７の塩基配列についてのMSP法では、正常膵臓組織よりも膵臓癌組織において、顕著に高い強度のバンドが検出された（図７）。
　配列番号１８および１９の塩基配列についてのMSP法では、各正常組織（膵臓、心臓、腎臓、肝臓および末梢血の白血球）ではほとんどバンドは検出されなかったが、膵臓癌組織では顕著に高い強度のバンドが検出された（図８および９）。
　上記のとおり、配列番号１５～１９の塩基配列についてのMSP法において、膵臓癌組織に特異的に多くのPCR産物が得られた。これは、各組織のゲノムDNAについて、配列番号１５～１９の塩基配列、すなわち配列番号１、２、３、４および５、ならびに６の塩基配列中のメチル化CpGの有無をMSP法で解析することにより、膵臓癌組織と正常膵臓組織とを区別できたことを示す。
　したがって、被験者から採取した生体試料から抽出したDNAについて、本発明の判定用分子マーカーである配列番号１、２、３、４、５および／または６の塩基配列に存在するCpG部位のメチル化の有無をMSP法で解析することにより、該生体試料中の癌細胞の存否を判定し得ることが示唆された。
実施例４　　他の組織におけるMSP法によるメチル化状態の解析
　MSP法により、膵臓癌組織以外の癌組織からのDNAについても、メチル化CpG部位を検出できるか否かを検討した。
１．バイサルファイト処理
　ヒト乳癌組織、ヒト正常乳腺組織、ヒト大腸癌組織およびヒト正常大腸組織からのゲノムDNA（各2μg）に対して、実施例２と同様にして、バイサルファイト処理を行った。バイサルファイト処理後の溶液に含まれるDNAを、Qiaquick PCR purificationキット（QIAGEN社）を用いて精製し、解析用試料を得た。
２．MSP法
　得られた解析用試料中のDNAをテンプレートとして、上記の配列番号２８および２９、ならびに３４および３５の塩基配列のプライマーセットを用いてMSP法を行った。なお、MSP法は、実施例３と同様にして行った。
　PCR終了後、実施例３と同様に、各反応液を2％アガロースゲルに電気泳動し、ゲルに現れたバンドの蛍光強度を定量化した。この結果を図１０および１１に示す。これらの図において、「－」はテンプレートを含まない陰性対照、「PN1」および「PN2」は正常乳腺組織、「BT1」および「BT2」は乳癌組織、「CN」は正常大腸組織、「CT1」および「CT2」は大腸癌組織を意味する。
　配列番号２８および２９の塩基配列のプライマーセットを用いた、配列番号１５の塩基配列についてのMSP法では、正常乳腺組織および正常大腸組織において、ほとんどバンドは検出されなかったが、乳癌組織および大腸癌組織で顕著に高い強度のバンドが検出された（図１０）。
　配列番号３４および３５の塩基配列のプライマーセットを用いた、配列番号１８の塩基配列についてのMSP法では、正常乳腺組織よりも乳癌組織において、顕著に高い強度のバンドが検出された（図１１）。
　上記のとおり、配列番号１５および１８の塩基配列についてのMSP法において、乳癌組織および大腸癌組織に特異的に多くのPCR産物が得られた。これは、各組織のゲノムDNAについて、配列番号１５および１８の塩基配列、すなわち配列番号１、ならびに４および５の塩基配列中のメチル化CpGの有無をMSP法で解析することにより、癌組織と正常組織とを区別できたことを示す。
　したがって、膵臓癌組織から同定された本発明の判定用分子マーカーに存在するCpG部位のメチル化の有無をMSP法で解析することによって、膵臓組織とは異なる組織についても癌細胞の存否を判定し得ることが示唆された。
実施例５　　乳癌細胞株からの判定用分子マーカーの探索
　乳癌細胞株および正常乳腺上皮細胞のゲノムDNAを、マイクロアレイを用いて解析することにより、乳癌由来細胞株のゲノムDNAに特異的にメチル化が認められる遺伝子領域の探索を行った。
　なお、実施例５での具体的な操作手順は、使用したキットおよび試薬類に添付のマニュアルの記載に従って行った。
１．MeDIP on chip法によるメチル化遺伝子の探索
（１）MeDIP法によるメチル化ＤＮＡの調製
　乳癌細胞株であるMCF7、MB-MDA231およびSK-BR-3、ならびに正常乳腺上皮細胞株であるHMECを生体試料として用いたこと以外は実施例１と同様にして、ゲノムDNAを抽出し、そして一本鎖DNA断片を得た。
　得られた一本鎖DNA断片を、実施例１と同様にして希釈した後、ProteinG Sepharoseビーズ（68μl：GE Healthcare社）を添加した。そして、実施例１と同様にしてプレクリアー処理を行った。各上清を回収した後、これらをそれぞれ二等分して別々のチューブに移して、一方に抗メチル化シトシン抗体BI-MECY-0500（10μg：Eurogentec社）を添加し、他方に正常マウスIgG抗体（４μg：Santa Cruz社）を添加して、それぞれ検体試料および対照試料とした。そして、これらの検体試料および対照試料を、実施例１と同様に免疫沈降して、一本鎖DNA断片を溶出した。
　得られたDNA溶液をプロテイナーゼK（Sigma社）と反応させた後、Qiaquick PCR purificationキット（QIAGEN社）を用いて精製した。
　なお、上記の検体試料においてメチル化DNAが特異的に濃縮されていることを、定量的PCR法により確認した。
２．試料中の核酸の増幅および標識
　上記のMCF-7細胞、MB-MDA231細胞およびSK-BR-3細胞、ならびにHMEC細胞のそれぞれから得た検体試料および対照試料中のDNAを、WT-Ovation（商標）Pico RNA Amplification System Version 1.0（NuGEN社）を用いて増幅した。次いで、各試料の吸光度（260 nmおよび280 nm）を測定して増幅した核酸の濃度を確認した。
　そして、上記で増幅した検体試料および対照試料に含まれる核酸を、FL-Ovation（商標）cDNA Biotin Module V2（NuGEN社）を用いて断片化およびビオチン標識を行った。各試料から得られた核酸を、マイクロアレイ解析用の検体試料および対照試料とした。
３．マイクロアレイ解析
（１）試料とマイクロアレイとの接触
　上記のマイクロアレイ解析用の各試料を、実施例１と同様にして、GeneChip（登録商標）Human Promoter 1.0R Array（Affymetrix社）に接触させて、プローブとのハイブリダイゼーションを行った。各検体試料および対照試料について、同種のマイクロアレイを１つずつ用いた。
（２）マイクロアレイデータの解析
　得られたマイクロアレイのデータを、実施例１と同様の手順により解析した。その結果、乳癌細胞株のゲノムDNAに特異的にメチル化が認められる遺伝子領域として、配列番号２０～２７の塩基配列で示される領域を同定した。なお、配列番号２０～２７の塩基配列は、それぞれLBX2、PAX9、ADD3、CCDC61、ZIC4、CGB7、TOX、およびTNNI3の遺伝子領域またはその付近の塩基配列領域の一部であり、またそれぞれ配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３および１４の塩基配列を包含する領域である。
　上記の配列番号２０～２７と、配列番号７～１４の各塩基配列および各遺伝子との対応を、以下の表３にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
実施例６　　バイサルファイトシークエンス法によるメチル化状態の解析
　乳癌細胞株および正常乳腺細胞上皮株のゲノムDNAについて、実施例５で同定した配列番号２０～２７の塩基配列で示される遺伝子領域のCpG部位がメチル化されているか否かをバイサルファイトシークエンス法により調べた。
１．バイサルファイト処理
　実施例５で用いた乳癌細胞株MCF7および正常乳腺細胞上皮株HMECから抽出したゲノムDNA（２μg）に、実施例２と同様にして、バイサルファイト処理を行った。そして、Qiaquick PCR purificationキット（QIAGEN社）を用いて、バイサルファイト処理後の各溶液からDNAを精製して、解析用試料を得た。
２．シークエンス解析
　得られた解析用試料中のDNAをテンプレートとして、下記のプライマーセットを用いてPCR法を行った。
　（i）PCR反応液の調製
　実施例２と同じ試薬類を用いて、上記の15μlの反応液を調製した。
　（ii）プライマーの配列および反応条件
（配列番号２０の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- GGAAGAGGTTTAAGTGGATTTTTTT -3'（配列番号６０）
R：5'- TTTTCTTTCCAAACCCAACCTA -3'（配列番号６１）
（反応条件）
　　95℃で4分30秒を1サイクル、
　　95℃で30秒、62℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
　　72℃で7分を1サイクル、
　　4℃で維持。
（配列番号２１の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- AGTTAGGATTGTGTAATATTAGTTTT -3'（配列番号６２）
R：5'- CACTATACAACCATCAACTACAAC -3'（配列番号６３）
（反応条件）
　　95℃で4分30秒を1サイクル、
　　95℃で30秒、55.5℃で15秒および72℃で40秒を40サイクル、
　　72℃で7分を1サイクル、
　　4℃で維持。
（配列番号２２の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- GTATATTTTTAGGGAGGAGGGGGG -3'（配列番号６４）
R：5'- CAACCCCTACTTCACCTCCACATA -3'（配列番号６５）
（反応条件）
　　95℃で4分30秒を1サイクル、
　　95℃で30秒、65.1℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
　　72℃で7分を1サイクル、
　　4℃で維持。
（配列番号２３の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- TTATTAGGATGAGTTATTGGTTATTT -3'（配列番号６６）
R：5'- ACCTCCCTAACCCCAACTAC -3'（配列番号６７）
（反応条件）
　　95℃で4分30秒を1サイクル、
　　95℃で30秒、56.8℃で15秒および72℃で40秒を40サイクル、
　　72℃で7分を1サイクル、
　　4℃で維持。
（配列番号２４の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- GTTTGGGTAGTTTATTGGTT -3'（配列番号６８）
R：5'- CTAAAAATTTCTCAACTCCTAACTC -3'（配列番号６９）
（反応条件）
　　95℃で4分30秒を1サイクル、
　　95℃で30秒、55.7℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
　　72℃で7分を1サイクル、
　　4℃で維持。
（配列番号２５の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- GAGGTGATATTAAGGATTTTTGGGT -3'（配列番号７０）
R：5'- TACAACTCAACTCCAATAACCACAC -3'（配列番号７１）
（反応条件）
　　95℃で4分30秒を1サイクル、
　　95℃で30秒、61.5℃で15秒および72℃で40秒を40サイクル、
　　72℃で7分を1サイクル、
　　4℃で維持。
（配列番号２６の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- AATAAGATTTGTTTAGTTTTATTGTTAAAA -3'（配列番号７２）
R：5'- TCTACCTAATACTCACAACCCCTACA -3'（配列番号７３）
（反応条件）
　　95℃で4分30秒を1サイクル、
　　95℃で30秒、60℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
　　72℃で7分を1サイクル、
　　4℃で維持。
（配列番号２７の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- GTAGTAGTAGAGTTTGTAGAGGGGTG -3'（配列番号７４）
R：5'- ATAAAAAATACCTATCCAAAAAAAA -3'（配列番号７５）
（反応条件）
　　95℃で4分30秒を1サイクル、
　　95℃で30秒、50.9℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
　　72℃で7分を1サイクル、
　　4℃で維持。
　PCR終了後、実施例２と同様にして、得られた各PCR産物を含むプラスミド構築物を作製し、これらについてシークエンス解析を行った。
　シークエンス解析後、上記の配列番号の塩基配列におけるCpG部位のメチル化状態を解析した。
　配列番号２０～２７の塩基配列のそれぞれに包含される配列番号７～１４の塩基配列中に存在するCpG部位のメチル化状態を、上記のシークエンス結果に基づいて、図１２～１９に表として示した。これらの図に示す表において、「●」はメチル化CpG部位、「○」は非メチル化CpG部位、「－」は解析不能のCpG部位を表わす。
　各図の表において、CpG部位の行に示される数字は、配列番号７～１４の各塩基配列の5'末端から数えたCpG部位の位置を示す番号である。また、該番号に「＊」または「＊＊」が付されたCpG部位は、HMEC細胞のサンプルと比較してMCF7細胞のサンプルにおいてメチル化されている傾向にあるCpG部位である。
　図１２～１９より、配列番号７～１４のいずれの塩基配列においても、CpG部位は、MCF7細胞ではメチル化されている傾向にあり、HMEC細胞ではメチル化されていない傾向にあることがわかる。
　これらの結果に基づいて、配列番号７～１４の各塩基配列におけるメチル化の頻度を解析した。メチル化の頻度は、実施例２と同様にして算出した。
　得られたメチル化の頻度を、図２０に棒グラフとして示した。なお、該グラフは、MCF7細胞のサンプル群およびHMEC細胞のサンプル群の平均値を表す。
　図２０より、配列番号７～１４の各塩基配列に存在する全CpG部位を解析対象とした場合、癌細胞を含む試料と含まない試料とを区別する閾値は、例えば15～35％の範囲から選択できることがわかる。
　このことから、被験者から採取した生体試料から抽出したDNAにおいて、配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３および／または１４の塩基配列中のCpG部位のメチル化の頻度が上記の閾値より高い場合、該生体試料中に癌細胞が存在すると判定し得ることが示唆された。
　本発明の判定用分子マーカーとしては、癌細胞株ではメチル化されている傾向にあり、且つ正常細胞株ではメチル化されていない傾向にあるCpG部位が好適である。
　したがって、配列番号７～１４の塩基配列中のCpG部位のメチル化の頻度に基づいて試料中の癌細胞の存否を判定する場合、判定用分子マーカーとしてのCpG部位は、図１２～１９において、好ましくは「＊」または「＊＊」が付されたCpG部位、より好ましくは「＊＊」が付されたCpG部位から選択することによって、より精度の高い判定を行い得る。
　また、メチル化特異的PCRにより、配列番号７～１４の塩基配列中のCpG部位のメチル化の有無を解析した結果に基づいて試料中の癌細胞の存否を判定する場合、図１２～１９において、好ましくは「＊」または「＊＊」が付されたCpG部位、より好ましくは「＊＊」が付されたCpG部位から選択されるCpG部位を増幅できるプライマーを用いることによって、より精度の高い判定を行い得る。
実施例７　　MSP法によるメチル化状態の解析
　乳癌細胞株および正常乳腺上皮細胞株のゲノムDNAについて、実施例５で同定した配列番号２０～２７の遺伝子領域に存在するCpG部位のメチル化状態をMSP法によって調べた。
１．バイサルファイト処理
　乳癌細胞株MCF7および正常乳腺上皮細胞株HMECからのゲノムDNA（各２μg）に対して、実施例２と同様にして、バイサルファイト処理を行った。バイサルファイト処理後の溶液に含まれるDNAを、Qiaquick PCR purification キット（QIAGEN社）を用いて精製し、解析用試料を得た。
２．MSP法
　得られた解析用試料中のDNAをテンプレートとして、下記のプライマーセットを用いてMSP法を行った。なお、本実施例のMSPでの解析対象であるCpG部位は、図１２～１９の「＊＊」が付されたCpG部位である。また、PCR反応液の調製は、実施例３と同様にして行った。
　プライマーの配列および反応条件を以下に示す。
（配列番号２０の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- TTTTAGAGTTTAGGATTGGCGGC -3'（配列番号３８）
R：5'- TACAACTTAACACTACCCGAAAACG -3'（配列番号３９）
　このプライマーセットは、配列番号２０の塩基配列の5'末端から数えて3、4、11および12番目（配列番号７の塩基配列においても同じ位置）のCpG部位を解析対象とする。
（反応条件）
　　95℃で9分30秒を1サイクル、
　　95℃で30秒、62℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
　　4℃で維持。
（配列番号２１の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- ATAGGTTGGAAACGTAGTTTTTCG -3'（配列番号４０）
R：5'- CTATAACGTCTAACGAATCCTCGC -3'（配列番号４１）
　このプライマーセットは、配列番号２１の塩基配列の5'末端から数えて8、9および14～16番目（配列番号８の塩基配列においても同じ位置）のCpG部位を解析対象とする。
（反応条件）
　　95℃で9分30秒を1サイクル、
　　95℃で30秒、62℃で30秒および72℃で30秒を40サイクル、
　　4℃で維持。
（配列番号２２の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- TGTTGTAAAGTTTGTTCGGTTTCGT -3'（配列番号４２）
R：5'- TTCTACTTCATTTAAACCCCTCGAA -3'（配列番号４３）
　このプライマーセットは、配列番号２２の塩基配列の5'末端から数えて15、16および22番目（配列番号９の塩基配列においても同じ位置）のCpG部位を解析対象とする。
（反応条件）
　　95℃で9分30秒を1サイクル、
　　95℃で30秒、60℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
　　4℃で維持。
（配列番号２３の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- TGTGTGGAGTAGAATTTTGAGTAAATATGC -3'（配列番号４４）
R：5'- AATTTAAAAACAAAAAAACAACCGCA -3'（配列番号４５）
　このプライマーセットは、配列番号２３の塩基配列の5'末端から数えて7および11番目（配列番号１０の塩基配列の5'末端から数えて2および6番目）のCpG部位を解析対象とする。
（反応条件）
　　95℃で9分30秒を1サイクル、
　　95℃で30秒、61℃で15秒および72℃で30秒を35サイクル、
　　4℃で維持。
（配列番号２４の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- GTAGTTTATTGGTTCGCGGTC -3'（配列番号４６）
R：5'- AAAAAAAATATATAAAAAAATAACGAT -3'（配列番号４７）
　このプライマーセットは、配列番号２４の塩基配列の5'末端から数えて1～3および10番目（配列番号１１の塩基配列においても同じ位置）のCpG部位を解析対象とする。
（反応条件）
　　95℃で9分30秒を1サイクル、
　　95℃で30秒、51℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
　　4℃で維持。
（配列番号２５の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- AGAGTTCGGTTTATTTGGGATAGAATC -3'（配列番号４８）
R：5'- GACCGAAACGTCCTAAACCG -3'（配列番号４９）
　このプライマーセットは、配列番号２５の塩基配列の5'末端から数えて10、11および16～19番目（配列番号１２の塩基配列においても同じ位置）のCpG部位を解析対象とする。
（反応条件）
　　95℃で9分30秒を1サイクル、
　　95℃で30秒、62℃で30秒および72℃で30秒を35サイクル、
　　4℃で維持。
（配列番号２６の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- TATTGTTTAAGATTCGGAGTTGCGA -3'（配列番号５０）
R：5'- CTCCCAACATTTACCTAATAACGAA -3'（配列番号５１）
　このプライマーセットは、配列番号２６の塩基配列の5'末端から数えて9、10および17番目（配列番号１３の塩基配列の5'末端から数えて7、8および15番目）のCpG部位を解析対象とする。
（反応条件）
　　95℃で9分30秒を1サイクル、
　　95℃で30秒、61℃で15秒および72℃で30秒を30サイクル、
　　4℃で維持。
（配列番号２７の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- GGGAGGGAAGCGTAGTTTATTC -3'（配列番号５２）
R：5'- CTAAAAAATTTAAAAAAACAAAAACGAT -3'（配列番号５３）
　このプライマーセットは、配列番号２７の塩基配列の5'末端から数えて1、2および4番目（配列番号１４の塩基配列においても同じ位置）のCpG部位を解析対象とする。
（反応条件）
　　95℃で9分30秒を1サイクル、
　　95℃で30秒、54℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
　　4℃で維持。
　PCR終了後、実施例３と同様に、各反応液を２％アガロースゲルに電気泳動し、ゲルに現れたバンドの蛍光強度を定量化した。この結果を図２１～２８に示す。これらの図において、「－」はテンプレートを含まない陰性対照を意味する。
　配列番号２０～２７の各塩基配列についてのMSP法では、HMEC細胞よりもMCF7細胞において、顕著に高い強度のバンドが検出された（図２１～図２８参照）。
　上記のとおり、配列番号２０～２７の塩基配列についてのMSP法において、乳癌細胞に特異的に多くのPCR産物が得られた。これは、各細胞株のゲノムDNAについて、配列番号２０～２７の塩基配列、すなわち配列番号７～１４の塩基配列中のメチル化CpGの有無をMSP法で解析することにより、乳癌細胞と正常乳腺上皮細胞とを区別できたことを示す。
　したがって、被験者から採取した生体試料から抽出したDNAについて、本発明の判定用分子マーカーである配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３および／または１４の塩基配列に存在するCpG部位のメチル化の有無をMSP法で解析することにより、該生体試料中の癌細胞の存否を判定し得ることが示唆された。
実施例８　　MSP法による乳癌組織および正常乳腺組織のゲノムDNAのメチル化状態の解析
　MSP法により、乳癌細胞株のみならず乳癌組織のゲノムDNAについても、配列番号２０～２７の塩基配列で示される遺伝子領域に存在するメチル化CpG部位を検出できるか否かを検討した。
１．バイサルファイト処理
　ヒト乳癌組織およびヒト正常乳腺組織からのゲノムDNA（各２μg）に対して、実施例２と同様にして、バイサルファイト処理を行った。バイサルファイト処理後の溶液に含まれるDNAを、Qiaquick PCR purification キット（QIAGEN社）を用いて精製し、解析用試料を得た。
２．MSP法
　得られた解析用試料中のDNAをテンプレートとして、上記の配列番号３８～５３の塩基配列のプライマーセットを用いてMSP法を行った。なお、PCR反応液の調製は実施例３と同様にして行い、各プライマーセットを用いるMSPの反応条件は実施例７と同じである。
　PCR終了後、実施例３と同様に、各反応液を２％アガロースゲルに電気泳動し、ゲルに現れたバンドの蛍光強度を定量化した。この結果を図２９～３６に示す。これらの図において、「－」はテンプレートを含まない陰性対照を意味する。
　上記のプライマーセットセットを用いた、配列番号２０～２７の塩基配列についてのMSP法ではいずれも正常乳腺組織において、ほとんどバンドは検出されなかったが、乳癌組織で顕著に高い強度のバンドが検出された（図２９～３６参照）。
　このように、配列番号２０～２７の塩基配列についてのMSP法において、乳癌組織に特異的に多くのPCR産物が得られた。これは、各組織のゲノムDNAについて、配列番号２０～２７の塩基配列、すなわち配列番号７～１４の塩基配列中のメチル化CpGの有無をMSP法で解析することにより、乳癌組織と正常乳腺組織とを区別できたことを示す。
　したがって、本発明の判定用分子マーカーに存在するCpG部位のメチル化有無を解析することによって、被験者から採取した組織中の癌細胞の存否を判定し得ることが示唆された。
実施例９　　MSP法による大腸癌組織および正常大腸組織のゲノムDNAのメチル化状態の解析
　大腸癌組織および正常大腸組織のゲノムDNAについて、配列番号１７～１９、２１、２２および２５～２７の塩基配列で示される遺伝子領域に存在するCpG部位のメチル化状態をMSP法によって調べた。
１．バイサルファイト処理
　ヒト大腸癌組織およびヒト正常大腸組織のゲノムDNA（各２μg：BioChain社）に対して、実施例２と同様にして、バイサルファイト処理を行った。バイサルファイト処理後の溶液に含まれるDNAを、Qiaquick PCR purification キット（QIAGEN社）を用いて精製し、解析用試料を得た。
２．MSP法
　得られた解析用試料中のDNAをテンプレートとして、上記の配列番号３２～３７、４０～４３および４８～５３で示されるプライマーセットを用いてMSPを行った。なお、PCR反応液の調製は下記のとおりである。
　（i）PCR反応液の調製
　下記の試薬を混合して、25μlの反応液を調製した。
　　2×FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)(ROCHE社)12.5μl
　　Fプライマー（10μM）                                   1.0μl
　　Rプライマー（10μM）                                   1.0μl
　　解析用試料（テンプレート）                             1.0μl
　　蒸留水                                                 9.5μl
　　合計                                                  25.0μl
　上記の各プライマーセットを用いるMSPの反応条件は下記のとおりである。
（配列番号１７の塩基配列を増幅するプライマーセット（配列番号３２および３３）を用いるMSPの反応条件）
　　95℃で9分30秒を1サイクル、
　　95℃で30秒、62℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
　　4℃で維持。
（配列番号１８の塩基配列を増幅するプライマーセット（配列番号３４および３５）を用いるMSPの反応条件）
　　95℃で9分30秒を1サイクル、
　　95℃で30秒、58℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
　　4℃で維持。
（配列番号１９の塩基配列を増幅するプライマーセット（配列番号３６および３７）を用いるMSPの反応条件）
　　95℃で9分30秒を1サイクル、
　　95℃で30秒、60℃で15秒および72℃で30秒を35サイクル、
　　4℃で維持。
（配列番号２１の塩基配列を増幅するプライマーセット（配列番号４０および４１）を用いるMSPの反応条件）
　　95℃で9分30秒を1サイクル、
　　95℃で30秒、62℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
　　4℃で維持。
（配列番号２２の塩基配列を増幅するプライマーセット（配列番号４２および４３）を用いるMSPの反応条件）
　　95℃で9分30秒を1サイクル、
　　95℃で30秒、61℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
　　4℃で維持。
（配列番号２５の塩基配列を増幅するプライマーセット（配列番号４８および４９）を用いるMSPの反応条件）
　　95℃で9分30秒を1サイクル、
　　95℃で30秒、61℃で15秒および72℃で30秒を35サイクル、
　　4℃で維持。
（配列番号２６の塩基配列を増幅するプライマーセット（配列番号５０および５１）を用いるMSPの反応条件）
　　95℃で9分30秒を1サイクル、
　　95℃で30秒、60℃で15秒および72℃で30秒を35サイクル、
　　4℃で維持。
（配列番号２７の塩基配列を増幅するプライマーセット（配列番号５２および５３）を用いるMSPの反応条件）
　　95℃で9分30秒を1サイクル、
　　95℃で30秒、53℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
　　4℃で維持。
　PCR終了後、各反応液を２％アガロースゲルに電気泳動し、PCR産物のバンドの有無を確認した。この結果を図３７に示す。この図において、「CN」は正常大腸組織、「CT」は大腸癌組織を意味する。
　図３７より、上記のプライマーセットセットを用いた、配列番号１７～１９、２１、２２および２５～２７の塩基配列についてのMSP法では、正常大腸組織ではバンドが検出されず、大腸癌組織にのみバンドが検出されたことがわかる。
　このように、配列番号１７～１９、２１、２２および２５～２７の塩基配列についてのMSP法において、大腸癌組織に特異的にPCR産物が得られた。これは、各組織のゲノムDNAについて、配列番号１７～１９、２１、２２および２５～２７の塩基配列、すなわち配列番号３～６、８、９および１２～１４の塩基配列中のメチル化CpGの有無をMSP法で解析することにより、大腸癌組織と正常大腸組織とを区別できたことを示す。
　したがって、膵臓癌組織および乳癌細胞株から同定された本発明の判定用分子マーカーに存在するCpG部位のメチル化の有無をMSP法で解析することによって、膵臓組織および乳腺組織とは異なる組織中の癌細胞の存否を判定し得ることが示唆された。
実施例１０　　MSP法による各種正常組織のゲノムDNAのメチル化状態の解析
　各種正常組織のゲノムDNAについて、配列番号２０～２７の塩基配列で示される遺伝子領域に存在するCpG部位のメチル化状態をMSP法によって調べた。
１．バイサルファイト処理
　ヒト正常心臓組織、ヒト正常腎臓組織、ヒト正常肝臓組織、ヒト正常肺組織およびヒト正常末梢血中の白血球からのゲノムDNA（各２μg：BioChain社）に対して、実施例２と同様にして、バイサルファイト処理を行った。バイサルファイト処理後の溶液に含まれるDNAを、Qiaquick PCR purification キット（QIAGEN社）を用いて精製し、解析用試料を得た。また、乳癌細胞株MCF7からのゲノムDNAを上記の正常組織からのゲノムDNAと同様に処理して、陽性対照用試料を得た。
２．MSP法
　得られた解析用試料及び陽性対照用試料中のDNAをテンプレートとして、上記の配列番号３８～５３で示されるプライマーセットを用いてMSPを行った。なお、PCR反応液の調製は実施例９と同様にして行った。
　上記の各プライマーセットを用いるMSPの反応条件は下記のとおりである。
（配列番号２０の塩基配列を増幅するプライマーセット（配列番号３８および３９）を用いるMSPの反応条件）
　　95℃で9分30秒を1サイクル、
　　95℃で30秒、62℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
　　4℃で維持。
（配列番号２１の塩基配列を増幅するプライマーセット（配列番号４０および４１）を用いるMSPの反応条件）
　　95℃で9分30秒を1サイクル、
　　95℃で30秒、62℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
　　4℃で維持。
（配列番号２２の塩基配列を増幅するプライマーセット（配列番号４２および４３）を用いるMSPの反応条件）
　　95℃で9分30秒を1サイクル、
　　95℃で30秒、61℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
　　4℃で維持。
（配列番号２３の塩基配列を増幅するプライマーセット（配列番号４４および４５）を用いるMSPの反応条件）
　　95℃で9分30秒を1サイクル、
　　95℃で30秒、60℃で15秒および72℃で30秒を35サイクル、
　　4℃で維持。
（配列番号２４の塩基配列を増幅するプライマーセット（配列番号４６および４７）を用いるMSPの反応条件）
　　95℃で9分30秒を1サイクル、
　　95℃で30秒、50℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
　　4℃で維持。
（配列番号２５の塩基配列を増幅するプライマーセット（配列番号４８および４９）を用いるMSPの反応条件）
　　95℃で9分30秒を1サイクル、
　　95℃で30秒、61℃で15秒および72℃で30秒を35サイクル、
　　4℃で維持。
（配列番号２６の塩基配列を増幅するプライマーセット（配列番号５０および５１）を用いるMSPの反応条件）
　　95℃で9分30秒を1サイクル、
　　95℃で30秒、60℃で15秒および72℃で30秒を35サイクル、
　　4℃で維持。
（配列番号２７の塩基配列を増幅するプライマーセット（配列番号５２および５３）を用いるMSPの反応条件）
　　95℃で9分30秒を1サイクル、
　　95℃で30秒、53℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
　　4℃で維持。
　PCR終了後、各反応液を２％アガロースゲルに電気泳動し、PCR産物の有無を確認した。この結果を図３８に示す。この図において、「MCF7」は乳癌細胞株MCF7、「H」は正常心臓組織、「K」は正常腎臓組織、「Li」は正常肝臓組織、「Lu」は正常肺組織、「Phe」は正常抹消血中白血球を意味する。
　図３８より、上記のプライマーセットセットを用いた、配列番号２０～２７の塩基配列についてのMSP法ではいずれの正常組織でもバンドは検出されなかったことがわかる。なお、上記のMSPの反応条件はいずれも、MCF7細胞のゲノムDNAから調製された陽性対照用試料をテンプレートとした場合にバンドが十分に検出される条件である。
　このように、配列番号２０～２７の塩基配列についてのMSP法において、各種の正常組織ではPCR産物が得られなかった。これは、各正常組織のゲノムDNAのMSP法による解析では、配列番号２０～２７の塩基配列、すなわち配列番号７～１４の塩基配列に存在するCpG部位のメチル化が検出されないことを示す。
　したがって、本発明の判定用分子マーカーに存在するCpG部位のメチル化の有無を解析することによって、種々の正常組織中には癌細胞が存在しないと判定し得ることが示唆された。
　本出願は２０１０年２月２６日に出願された日本国特許出願特願２０１０－０４２８１４号に関し、これらの特許請求の範囲、明細書、図面および要約書の全ては本明細書中に参照として組み込まれる。

Claims (13)

  1. 　被験者から採取した生体試料からDNAを抽出する工程と、
    　抽出工程で得られたDNAについて、配列番号１～１４の塩基配列から選択される少なくとも１つの塩基配列に存在する少なくとも１つのCpG部位のメチル化状態を解析する工程と、
    　解析工程で得られた解析結果に基づいて、生体試料中の癌細胞の存否を判定する工程と
    を含む、生体試料中の癌細胞の存否を判定する方法。
  2. 　CpG部位が、
    　配列番号１の塩基配列の5'末端側から1、3～7、9～26および28～54番目のCpG部位、
    　配列番号２の塩基配列の5'末端側から1～11、13～23、25、26、28、29、31、32、34、35、38、40～44、46～49、51～57、59～66、68、70～73、75、76、78および79番目のCpG部位、
    　配列番号３の塩基配列の5'末端側から1～10および12番目のCpG部位、
    　配列番号４の塩基配列の5'末端側から1～3番目のCpG部位、
    　配列番号５の塩基配列の5'末端側から1～4番目のCpG部位、
    　配列番号６の塩基配列の5'末端側から1および2番目のCpG部位、
    　配列番号７の塩基配列の5'末端側から1～7および9～52番目のCpG部位、
    　配列番号８の塩基配列の5'末端側から1～16、18～25および27～39番目のCpG部位、
    　配列番号９の塩基配列の5'末端側から1、2、4、7～11および13～23番目のCpG部位、
    　配列番号１０の塩基配列の5'末端側から1～6、8および10番目のCpG部位、
    　配列番号１１の塩基配列の5'末端側から1～3、5～11、13、15～19および21～23番目のCpG部位、
    　配列番号１２の塩基配列の5'末端側から1～6、8、10～22、25～28および32番目のCpG部位、
    　配列番号１３の塩基配列の5'末端側から1～3、7～13、15および19番目のCpG部位、ならびに
    　配列番号１４の塩基配列の5'末端側から1～4、14～16、18、19、21および22番目のCpG部位
    から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 　解析工程が、複数のCpG部位のメチル化状態を解析する工程である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　解析工程が、CpG部位のメチル化の有無を解析する工程である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　判定工程が、解析工程においてメチル化されたCpG部位が有るという結果が得られた場合に、生体試料中に癌細胞が存在すると判定する工程である、請求項４に記載の方法。
  6. 　解析工程が、CpG部位のメチル化の頻度を解析する工程である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　判定工程が、解析工程においてメチル化の頻度が所定の閾値より高いという結果が得られた場合に、生体試料中に癌細胞が存在すると判定する工程である、請求項６に記載の方法。
  8. 　解析工程が、抽出工程で得られたDNAに含まれるメチル化されたDNAを免疫沈降により濃縮し、該濃縮されたメチル化DNAのメチル化状態を解析する工程である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　配列番号１～１４の塩基配列に存在するCpG部位から少なくとも１つ選択される、メチル化状態の解析を用いた癌細胞の存否の判定用分子マーカー。
  10. 　CpG部位が、
    　配列番号１の塩基配列の5'末端側から1、3～7、9～26および28～54番目のCpG部位、
    　配列番号２の塩基配列の5'末端側から1～11、13～23、25、26、28、29、31、32、34、35、38、40～44、46～49、51～57、59～66、68、70～73、75、76、78および79番目のCpG部位、
    　配列番号３の塩基配列の5'末端側から1～10および12番目のCpG部位、
    　配列番号４の塩基配列の5'末端側から1～3番目のCpG部位、
    　配列番号５の塩基配列の5'末端側から1～4番目のCpG部位、
    　配列番号６の塩基配列の5'末端側から1および2番目のCpG部位、
    　配列番号７の塩基配列の5'末端側から1～7および9～52番目のCpG部位、
    　配列番号８の塩基配列の5'末端側から1～16、18～25および27～39番目のCpG部位、
    　配列番号９の塩基配列の5'末端側から1、2、4、7～11および13～23番目のCpG部位、
    　配列番号１０の塩基配列の5'末端側から1～6、8および10番目のCpG部位、
    　配列番号１１の塩基配列の5'末端側から1～3、5～11、13、15～19および21～23番目のCpG部位、
    　配列番号１２の塩基配列の5'末端側から1～6、8、10～22、25～28および32番目のCpG部位、
    　配列番号１３の塩基配列の5'末端側から1～3、7～13、15および19番目のCpG部位、ならびに
    　配列番号１４の塩基配列の5'末端側から1～4、14～16、18、19、21および22番目のCpG部位
    から選択される、請求項９に記載の判定用分子マーカー。
  11. 　被験者から採取した生体試料から抽出したDNAに含まれる非メチル化シトシンを他の塩基に変換する非メチル化シトシン変換剤と、
    　配列番号１～１４の塩基配列に存在する少なくとも１つのCpG部位のメチル化状態をメチル化特異的PCR法により確認するためのプライマーセットと
    を含む、生体試料中の癌細胞の存否の判定用キット。
  12. 　CpG部位が、
    　配列番号１の塩基配列の5'末端側から1、3～7、9～26および28～54番目のCpG部位、
    　配列番号２の塩基配列の5'末端側から1～11、13～23、25、26、28、29、31、32、34、35、38、40～44、46～49、51～57、59～66、68、70～73、75、76、78および79番目のCpG部位、
    　配列番号３の塩基配列の5'末端側から1～10および12番目のCpG部位、
    　配列番号４の塩基配列の5'末端側から1～3番目のCpG部位、
    　配列番号５の塩基配列の5'末端側から1～4番目のCpG部位、
    　配列番号６の塩基配列の5'末端側から1および2番目のCpG部位、
    　配列番号７の塩基配列の5'末端側から1～7および9～52番目のCpG部位、
    　配列番号８の塩基配列の5'末端側から1～16、18～25および27～39番目のCpG部位、
    　配列番号９の塩基配列の5'末端側から1、2、4、7～11および13～23番目のCpG部位、
    　配列番号１０の塩基配列の5'末端側から1～6、8および10番目のCpG部位、
    　配列番号１１の塩基配列の5'末端側から1～3、5～11、13、15～19および21～23番目のCpG部位、
    　配列番号１２の塩基配列の5'末端側から1～6、8、10～22、25～28および32番目のCpG部位、
    　配列番号１３の塩基配列の5'末端側から1～3、7～13、15および19番目のCpG部位、ならびに
    　配列番号１４の塩基配列の5'末端側から1～4、14～16、18、19、21および22番目のCpG部位
    から選択される、請求項１１に記載の判定用キット。
  13. 　プライマーセットが、
    　配列番号２８および配列番号２９の塩基配列であるプライマーセット、
    　配列番号３０および配列番号３１の塩基配列であるプライマーセット、
    　配列番号３２および配列番号３３の塩基配列であるプライマーセット、
    　配列番号３４および配列番号３５の塩基配列であるプライマーセット、
    　配列番号３６および配列番号３７の塩基配列であるプライマーセット、
    　配列番号３８および配列番号３９の塩基配列であるプライマーセット、
    　配列番号４０および配列番号４１の塩基配列であるプライマーセット、
    　配列番号４２および配列番号４３の塩基配列であるプライマーセット、
    　配列番号４４および配列番号４５の塩基配列であるプライマーセット、
    　配列番号４６および配列番号４７の塩基配列であるプライマーセット、
    　配列番号４８および配列番号４９の塩基配列であるプライマーセット、
    　配列番号５０および配列番号５１の塩基配列であるプライマーセット、ならびに
    　配列番号５２および配列番号５３の塩基配列であるプライマーセット
    から少なくとも１つ選択される、請求項１１または１２に記載の判定用キット。
PCT/JP2011/054363 2010-02-26 2011-02-25 生体試料中の癌細胞の存否を判定する方法、判定用分子マーカーおよびキット WO2011105570A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012501890A JPWO2011105570A1 (ja) 2010-02-26 2011-02-25 生体試料中の癌細胞の存否を判定する方法、判定用分子マーカーおよびキット
EP11747526.9A EP2540839B1 (en) 2010-02-26 2011-02-25 Method for determining presence or absence of cancer cell in biological sample, and molecular marker and kit for determination
US13/594,526 US20130130242A1 (en) 2010-02-26 2012-08-24 Method for determining presence or absence of cancer cell in biological sample, and molecular marker and kit for determination

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2010-042814 2010-02-26
JP2010042814 2010-02-26

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US13/594,526 Continuation US20130130242A1 (en) 2010-02-26 2012-08-24 Method for determining presence or absence of cancer cell in biological sample, and molecular marker and kit for determination

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2011105570A1 true WO2011105570A1 (ja) 2011-09-01

Family

ID=44506967

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2011/054363 WO2011105570A1 (ja) 2010-02-26 2011-02-25 生体試料中の癌細胞の存否を判定する方法、判定用分子マーカーおよびキット

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20130130242A1 (ja)
EP (1) EP2540839B1 (ja)
JP (1) JPWO2011105570A1 (ja)
WO (1) WO2011105570A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015006163A (ja) * 2013-05-29 2015-01-15 シスメックス株式会社 肝細胞癌に関する情報の取得方法、ならびに肝細胞癌に関する情報を取得するためのマーカーおよびキット
JP2018509934A (ja) * 2015-02-24 2018-04-12 ルプレクト−カールズ−ウニベルシタット ハイデルベルク 癌の検出のためのバイオマーカーパネル

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6418595B2 (ja) 2014-07-11 2018-11-07 シスメックス株式会社 複数種類の癌に関する情報を取得する方法、システムおよびプログラム
CN111118160B (zh) * 2020-02-12 2023-06-06 中国医学科学院肿瘤医院 结直肠癌诊断中的甲基化标志物

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003074736A1 (fr) * 2002-03-04 2003-09-12 Institute Of Gene And Brain Science Diagnostic et traitement d'une tumeur maligne du cerveau
JP2007524369A (ja) 2003-03-17 2007-08-30 ザ ジョンズ ホプキンス ユニバーシティー 膵癌における異常メチル化遺伝子
JP2008506407A (ja) 2004-07-18 2008-03-06 エピゲノミクス アーゲー 乳房細胞増殖性疾患を検出するためのエピジェネティックな方法および核酸

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003074736A1 (fr) * 2002-03-04 2003-09-12 Institute Of Gene And Brain Science Diagnostic et traitement d'une tumeur maligne du cerveau
JP2007524369A (ja) 2003-03-17 2007-08-30 ザ ジョンズ ホプキンス ユニバーシティー 膵癌における異常メチル化遺伝子
JP2008506407A (ja) 2004-07-18 2008-03-06 エピゲノミクス アーゲー 乳房細胞増殖性疾患を検出するためのエピジェネティックな方法および核酸

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JACINTO F.V. ET AL: "Methyl-DNA immunoprecipitation (MeDIP): Hunting down the DNA methylome", BIOTECHNIQUES, vol. 44, no. 1, 2008, pages 35, 37, 39, 41, 43, XP001525871 *
RAUCH T. ET AL: "Homeobox gene methylation in lung cancer studied by genome-wide analysis with a microarray-based methylated CpG island recovery assay", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, vol. 104, no. 13, 2007, pages 5527 - 5532, XP002577090 *
RUIKE Y. ET AL: "Genome-wide analysis of aberrant methylation in human breast cancer cells using methyl-DNA immunoprecipitation combined with high-throughput sequencing", BMC GENOMICS, vol. 11, no. 137, 25 February 2010 (2010-02-25), pages 1 - 11 *
See also references of EP2540839A4 *
WU Q. ET AL.: "DNA methylation profiling of ovarian carcinomas and their in vitro models identifies HOXA9, HOXB5, SCGB3A1, and CRABP1 as novel targets.", MOLECULAR CANCER, vol. 6, no. 45, 2007, pages 1 - 10 *
YOSHIHIKO TAJIMA ET AL.: "Shinki Kaiseki Shuho o Mochiita MeDIP on chip assay no Yuyosei Hyoka to, Nyugan ni Okeru Shinki Methyl-ka Idenshi Marker Kensaku, #P-0383", DAI 68 KAI PROCEEDINGS OF THE JAPANESE CANCER ASSOCIATION, vol. 68, 2009, pages 179 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015006163A (ja) * 2013-05-29 2015-01-15 シスメックス株式会社 肝細胞癌に関する情報の取得方法、ならびに肝細胞癌に関する情報を取得するためのマーカーおよびキット
JP2018509934A (ja) * 2015-02-24 2018-04-12 ルプレクト−カールズ−ウニベルシタット ハイデルベルク 癌の検出のためのバイオマーカーパネル
JP2021052777A (ja) * 2015-02-24 2021-04-08 ルプレクト−カールズ−ウニベルシタット ハイデルベルク 癌の検出のためのバイオマーカーパネル

Also Published As

Publication number Publication date
EP2540839A1 (en) 2013-01-02
EP2540839A4 (en) 2013-07-31
EP2540839B1 (en) 2015-07-01
JPWO2011105570A1 (ja) 2013-06-20
US20130130242A1 (en) 2013-05-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6369857B2 (ja) 肝細胞癌に関する情報の取得方法、ならびに肝細胞癌に関する情報を取得するためのマーカーおよびキット
JP6418595B2 (ja) 複数種類の癌に関する情報を取得する方法、システムおよびプログラム
JP6269494B2 (ja) 子宮体癌に関する情報の取得方法、ならびに子宮体癌に関する情報を取得するためのマーカーおよびキット
CN110129436A (zh) Dna甲基化的数字序列分析
WO2010118559A1 (zh) 一种癌症筛检的方法
WO2012143481A2 (en) Prostate cancer markers
JP6395131B2 (ja) 肺癌に関する情報の取得方法、ならびに肺癌に関する情報を取得するためのマーカーおよびキット
JP6381020B2 (ja) 大腸癌に関する情報の取得方法、ならびに大腸癌に関する情報を取得するためのマーカーおよびキット
Kirches MtDNA as a cancer marker: a finally closed chapter?
CN110484621A (zh) 一种肝癌早期预警的方法
WO2011105570A1 (ja) 生体試料中の癌細胞の存否を判定する方法、判定用分子マーカーおよびキット
EP2270747B1 (en) Methods for detecting nucleic acid with microarray and program product for use in microarray data analysis
JP2008136404A (ja) Ｄｎａメチル化検出における非メチル化シトシン変換処理後のｄｎａ量の確認方法
JP5986746B2 (ja) 生体試料中の上皮性癌由来の細胞の存否を判定するための方法、分子マーカー及びキット
US20220364173A1 (en) Methods and systems for detection of nucleic acid modifications
WO2013129397A1 (ja) 肝細胞癌由来の癌細胞の存否の判定方法、判定用マーカーおよびキット
JP6269493B2 (ja) 脳腫瘍に関する情報の取得方法、ならびに脳腫瘍に関する情報を取得するためのマーカーおよびキット
JP4359497B2 (ja) 核酸増幅用プライマー、核酸増幅用プライマーセット及びこれを用いた癌の検査方法
JP6418594B2 (ja) 子宮体癌に関する情報の取得方法、ならびに子宮体癌に関する情報を取得するためのマーカーおよびキット
JP6636105B2 (ja) 大腸癌に関する情報の取得方法、ならびに大腸癌に関する情報を取得するためのマーカーおよびキット
WO2022232795A1 (en) Compositions and methods related to modification and detection of pseudouridine and 5-hydroxymethylcytosine
JP6551656B2 (ja) 卵巣癌に関する情報の取得方法、ならびに卵巣癌に関する情報を取得するためのマーカーおよび卵巣癌検出用キット
JP2016192909A (ja) 胃癌に関する情報の取得方法、ならびに胃癌に関する情報を取得するためのマーカーおよび胃癌検出用キット
JP2016192908A (ja) 婦人科がんに関する情報の取得方法、ならびに婦人科がんに関する情報を取得するためのマーカー及び婦人科がん検出用キット
TW201408778A (zh) 一種癌症篩檢的方法ｉｉｉ

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11747526

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2012501890

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2011747526

Country of ref document: EP