JP2008506407A - 乳房細胞増殖性疾患を検出するためのエピジェネティックな方法および核酸 - Google Patents
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Abstract
Description
1.乳癌
乳房新生物のほとんどは、乳管癌を伴う、上皮を起源とするものであり、全腫瘍の80%を占める。さらに、あまり一般的ではない数種の乳癌サブタイプがある。延髄癌および小葉癌は共に、乳癌と診断された患者の約5%に見られる。他の頻度の低い腫瘍組織には、純粋な管状癌、粘液癌もしくはコロイド癌、乳頭癌、およびページェット病が含まれる。これらの癌の予後は、特に、リンパ節陰性期で見つかった場合非常に良い。癌腫および腺嚢胞腫瘍は孤発でしか生じない。
最も一般的な良性乳房状態には、乳腺線維症状態、良性乳房腫瘍、および乳房炎が含まれる。線維嚢胞疾患は、最も頻発する良性乳房状態であり、女性2人に1人が生涯で少なくとも一度は罹患する。乳房の乳腺線維嚢胞症には、嚢胞(蓄積された液包)、線維症(瘢痕様結合組織の形成)、塊、肥厚領域、圧痛、または乳房疼痛が含まれる。乳腺線維嚢胞は、マンモグラフィーで乳癌を検出するのをさらに難しくする恐れもある。
TNM分類は、国際対がん連合(UICC)が考案し、米国がん病期分類合同委員会により承認されている。TNMは、腫瘍(T)、局所リンパ節(N)の臨床特徴、および遠隔転移(M)の有無に基づく。腫瘍は、そのサイズによって特徴付けられ、したがってT1は2cm未満、T2は2〜5cm、およびT3は5cmを超える腫瘍である。非浸潤性(in-situ)乳癌は、Tisと表示され、非浸潤性乳管癌(DCIS)、非浸潤性小葉癌(LCIS)、およびページェット病に区別される。同様に、N0は、陰性または正常局所リンパ節、M0は遠隔転移の不在をそれぞれ表す。同側性腋下リンパ節を含めることが、原発性乳癌にとって最も確実で再現性ある予後の指標になる。一般に、陽性リンパ節患者の50〜70%が再発し、それに対して転移性疾患陰性リンパ節患者全てにおいては、局所領域的治療のみを施した後に20〜35%しか再発しない。
腫瘍等級は、腫瘍の分化状態を反映する。乳癌の分化は、通常、それぞれ、高分化(等級1)、中分化(等級2)、または低分化(等級3)と記載される。低分化腫瘍はより攻撃的になり易い。高核等級の腫瘍患者の86%が8年生存し、他方で核等級が低度と判定された人では64%であった。
ホルモン受容体レベルは、予後および治療計画ついて乳癌を分類するための重要なパラメータである。ER陽性腫瘍患者は、低悪性度コースへ進み、選択的に柔組織および骨に転移する傾向があり、それに反してER陰性腫瘍患者は早期に再発し、肝臓、肺、および中枢神経系への転移する可能性がより高い。ER陽性腫瘍は、より十分に分化していることが多く、他の好ましい予後の特性を伴う。ER陽性腫瘍患者は、ER陰性腫瘍患者よりも短期無疾患率および全体的生存率が高くなりやすいが、時間の経過と共に2群の差は減少し、または消失さえする傾向にある。PsRは、幾つかの研究でERよりも有益な予後の指標として登場した。さらに、高レベルのエストロゲン受容体の発現は、内分泌療法に対する好ましい応答の前兆である。
年齢および閉経状態
診断および治療。
乳癌は、患者が自己検査することによって、または内科医による臨床的乳房検査中に触診可能な瘤として診断されることが多い。乳癌スクリーニングにおけるマンモグラフィーの使用の増加によって、触診可能な瘤が検出されない段階で既に多くの癌が見つかるようになった。疑わしい瘤は、通常、さらに超音波やMRIなどの画像化によって追跡し、針生検によって最終的診断を確証する。
現在、米国癌学会は、無症候の女性で乳癌を検出するために以下のガイドラインを推奨している。
・年齢20歳以上の女性は、毎月、乳房自己検査(BSE)を実施するのが望ましい。
・20〜39歳の女性は、少なくとも3年毎に内科医、内科医助手、看護士、臨床看護士など、医療専門家が実施する乳房の理学的検査(CBEまたは臨床的乳房検査)を受けるのが望ましい。CBEは、しばしば、子宮頸癌検査(Pap smear)と同じ予約で受けることができる。
・20〜39歳の女性も、月一回BSEを実施するのが望ましい。
・40歳以上の女性は、年一回、内科医、内科医助手、看護士、臨床看護士など、医療専門家が実施する乳房の理学的検査(CBEまたは臨床的乳房検査)を受けるのが望ましい。CBEは、しばしば、マンモグラムと同じ受診で実施できる。月一回のBSEも実施するのが望ましい。
・年齢40歳以上の女性は、年一回のCBEと月一回のBSEに加えて、年一回のスクリーニングマンモグラムを受けるのが望ましい。
2001年に、臨床的乳房検査および乳房自己検査について新たな分析が行なわれた。CBEが乳癌死亡率を減少させる直接的証拠はないが、幾つかの間接的証拠がある。患者の年齢および瘤の大きさ、さらに臨床検査での施術者の技術によって異なるが、CBEの全体的感受性は54%である。直接的証拠がない場合、CBEの推奨は一致した意見に基づくものであった。乳房自己検査に関しては、制御された6回の大規模試行のメタ分析から、BSEを実施した女性対BSEを実施しなかった女性では、死亡率の相対リスクで減少は見られなかった(0.94、95% C.I.0.83〜1.06)。近年、慣例となったBSEは乳癌死亡率を減少させるか、有害ですらないかとさらに疑問視された。この証拠にも関わらず、乳房自己検査(BSE)および臨床的乳房検査(CBE)は依然として、乳癌スクリーニングの現在のガイドラインの一部である。
現在、マンモグラフィーは、米国食品医薬品局(FDA)によって認可されている、無症候の女性の乳癌をスクリーニングするための唯一の検査である。米国および欧州数ヵ国で実施された無作為制御の試行では、慣例となったマンモグラフィースクリーニングも毎年実施すれば、乳癌死亡率を20〜40%減少できることが実証されている。平均して、マンモグラフィーの感受性は85%までである。しかし、マンモグラフィーは、高濃度乳房または線維嚢胞変化や瘤などの良性乳房状態の患者では感受性が低い。スクリーニングマンモグラムの結果の5〜10%が、異常であり要精査である。偽陽性割合は、若い女性ほど、その乳房が高濃度なために高くなる。
MRIイメージングは、主として、陽性マンモグラフィーの結果を追跡するために使用される。MRIは非常に感受性が高く、高濃度乳房および若い女性の解析に非常に適しているが、時間がかかり、高価であり、乳房生検試料をガイドするのが難しい。現在、乳癌感受性遺伝子変異保因者など、高危険集団でのスクリーニングに向けてMRIを評価するために試行が進められている。
乳癌治療
DNAのメチル化など、エピジェネティックな調節は、発癌でよくある初期事象として確立されている。特に、DNAのメチル化が乳癌に寄与することは十分に実証されている。WidschwendterおよびJones(Oncogene. 2002 Aug 12;21(35):5462-82.)は、近年の概説で、乳房の発癌に関連する段階全ての状況において、DNAのメチル化の変化が報告されてきたと実証し、その段階には1)アポトーシスの回避、2)抗増殖シグナルに対して非感受性、3)増殖シグナルでの自給自足、4)無限の複製の可能性、5)組織浸潤および転移、ならびに6)持続する血管新生が含まれる。あまり実証されていないものには、DCISなどの初期前癌病変、および小葉癌などの低頻度癌病変におけるDNAのメチル化の役割がある。Facklerらは、DCIS病変(N=44)の95%が、RASSF1A、HIN‐1、RAR‐β、サイクリンD2、およびTwistを含む5個の遺伝子のうち少なくとも一個で高メチル化したことを指摘した。同著者らは、これらの遺伝子の高メチル化の頻度を乳管癌と小葉癌の間で比較し、小葉癌で過剰なメチル化が少ないことが分かったTWISTを除いて、同様のメチル化パターンを見出した。同様に、Lehmannらは、RASSF1Aおよびストラチフィン(stratifin)のメチル化で極初期変化を報告し、乳管癌と比較して小葉癌でDAPKがより頻繁に不活化することを見出した。DCISでRASSF1Aおよびストラチフィンが初期にメチル化変化することが他の群により確認された。
感受性=TP/(TP+FN)
特異性=TN/(FP+TN)
的中率=TP/(TP+FP)
Oncogene. 2002 Aug 12;21(35):5462-82. Br J Cancer. 1999 Jun;80(8):1262-4. Clin Cancer Res. 2004 Jan 1;10(1 Pt 1):28-32. Lancet. 2001 Apr 28;357(9265):1335-6. J.P. Egan. Signal Detection Theory and ROC Analysis, Academic Press, New York, 1975 Gonzalgoら, Cancer Research 57:594-599, 1997 Eadsら, Cancer Res. 59:2302-2306, 1999
・乳房細胞増殖性疾患の検出、
・良性乳房細胞増殖性疾患との区別を含む初期乳癌の検出、
・乳癌と他の癌の区別、
・血液または血液由来液体のバックグラウンド中の乳癌細胞の検出、
・DCISと(健康な乳房組織を含む)良性乳房細胞増殖性疾患の区別
である。
そのCpG位置のメチル化状況によって、前記遺伝子および/またはゲノム配列の発現状態を定量するのが特に好ましい。
「観察/推定率」(「O/E率」)という語は、特定のDNA配列内のCpGジヌクレオチドの頻度をさし、[CpG部位数/(C塩基数×G塩基数)]×各フラグメントのバンド長に対応する。
本発明は、遺伝子発現分析に有用な新規性を備える分子遺伝学的マーカー、最も好ましくは乳房細胞増殖性疾患の発生に付随し、そのメチル化で発現されるマーカーを提供する。前記マーカーは、乳房細胞増殖性疾患を検出し、かつ/またはその疾患間で区別するために使用され、それによって前記疾患を検出し、分類し、処理するための改良された手段を提供することができる。
i)対象から得たゲノムDNAと、そのゲノムDNAの少なくとも一個の標的領域中のメチル化CpGジヌクレオチドと非メチル化CpGジヌクレオチドを区別する少なくとも一種の試薬または一連の試薬を接触させる、前記近接するヌクレオチドが少なくとも一個のCpGジヌクレオチド配列を含む、そして
ii)乳房細胞増殖性疾患を検出し、またはその疾患間で検出区別すること。
本発明は、配列番号1〜配列番号118からなる群から選択されるゲノム配列の新規な使用を提供する。別の実施形態は、配列番号1〜配列番号118の修飾された変異体、特に化学的に修飾された変異体、ならびに配列番号1〜配列番号118からなる群内の、シトシンのメチル化パターンを分析するためのオリゴヌクレオチドおよび/またはPNAオリゴマーを提供する。
n〜(n+(X‐1))、
その場合、n=1、2、3、…(Y‐(X‐1))、
その場合、Yは配列番号1(6435)の長さ(ヌクレオチドまたは塩基対)に等しく、
その場合、Xはセット中の各オリゴヌクレオチドに共通する長さ(ヌクレオチド中)に等しく(例えば、連続重複する20‐merのセットではX=20)、かつ
その場合、長さYの所与の配列番号では、長さXの連続重複するオリゴマーの数(Z)はY‐(X‐1)に等しい。
例えば、配列番号1(X=20)のセンスまたはアンチセンスセットでは、Z=6435‐19=6416。
a)対象から対象のゲノムDNAを含む生物試料を得ること
b)ゲノムDNAを抽出する、もしくはそれ以外では単離すること
c)b)のゲノムDNAまたはそのフラグメントを一種または複数の試薬で処理して、その5位で非メチル化シトシン塩基を、ウラシルに、またはハイブリッド形成特性の点でシトシンと検出可能に異なる別の塩基に転換すること、その場合
d)c)の処理に続く増幅をメチル化特異的方法、すなわちメチル化特異的プライマーおよび/またはブロッキングオリゴヌクレオチドの使用によって実施し、さらにその場合
e)増幅物の検出は、上記のようにリアルタイム検出プローブによって実施する。
i)対象から得たゲノムDNAと、そのゲノムDNAの少なくとも一個の標的領域中のメチル化CpGジヌクレオチドと非メチル化CpGジヌクレオチドを区別する少なくとも一種の試薬または一連の試薬を接触させるものであり、その際、前記近接するヌクレオチドが少なくとも一個のCpGジヌクレオチド配列を含む、そして
ii)乳房細胞増殖性疾患を検出し、またはその疾患間で検出区別すること。
マーカー候補を評価するために、本出願人独自のメチル化感受性マイクロアレイ技術を使用し、非常に多くの患者および対照試料を分析した。マイクロアレイ研究では、475個の試料収集物について2つの遺伝子パネルを分析した。
マイクロアレイ研究用に収集した患者試料の概要を表25に提供する。
初期乳癌試料をオランダ国ロッテルダムのErasmus Medical Centreから得た。腫瘍細胞率を30%〜90%の範囲、平均して60%と推定した。浸潤性乳管癌(IDC)が最大の組織サブタイプであった。IDC患者試料の中には、エストロゲン受容体(ER)陽性および陰性、閉経前および閉経後、ならびに攻撃的(リンパ節転移陽性)および低攻撃的(リンパ節転移陰性)腫瘍が含まれた。さらに、浸潤性小葉癌(ILC)および非浸潤性乳管癌(DCIS)を分析した。全てのDCIS試料で、診断は病理学的再調査によって確認し、腫瘍細胞の含有量を見積もった。最後に、確認されたBRCA1変異を伴う腫瘍を分析して、全乳癌発生率の約5〜10%を占める遺伝子的乳癌試料が、異なるDNAのメチル化パターンを示したかどうかを評価した。
正常乳房試料は、主として乳房縮小術、または最初DCISと診断されたが、病理学的再調査中に正常と分類された患者試料から得た。乳癌のほぼ排他的な起源である乳房上皮細胞のDNAのメチル化パターンを分析するために、上皮細胞表面マーカーを使用し上皮細胞を選別した。さらに、線維腺腫、線維嚢胞疾患および異型乳管過形成と診断された試料を良性乳房状態群に加えた。
他の癌試料でマーカーの性能を評価するために、数種の他の癌型から得た腫瘍DNAを分析した。女性に最も頻繁に発生した癌クラス(肺、大腸)および女性生殖系(子宮内膜、卵巣)の腫瘍に重点を置いた。
同年齢の女性のリンパ球試料を使用して、血液細胞中の候補マーカーのメチル化レベルを評価した。
対照目的として、追加の試料を両マイクロアレイ研究に加えた。検出オリゴの質と機能性を制御するために、人工的に高メチル化および低メチル化させたDNA(Promega)を使用した。8人の男性リンパ球試料を含めて、男性と女性のリンパ球試料間の差次的メチル化の比較によって、全体的マイクロアレイ過程の正の対照を準備した。
63個の候補遺伝子または配列の初期選択を同定した。さらに、男性起源と女性起源のDNAを区別することが知られている一遺伝子フラグメントELK1を正の対照として含めた。第2のマイクロアレイ研究用の遺伝子パネルは、当初AP‐PCR、MCAまたはDMHを使用して同定し、配列決定および正の対照としてELK1遺伝子によって確認した59個の配列からなった。第2のパネルの配列が全て、既知の遺伝子へ現在マップされているわけではないことに留意しなければならない。両チップからの候補マーカーを全て表3に示す。
外部協力者または商業的提供者から、凍結組織、細胞核ペレット、または抽出したゲノムDNAとして試料を入手した。QiaAmp Miniキット(Qiagen, Hilden, Germany; No: 51306)を使用し、組織試料および細胞核ペレットからDNAを単離した。
全ての遺伝子フラグメントを増幅するために、PCRアッセイを設計して、重亜硫酸塩処理したDNAに適合させ、それぞれのフラグメントのメチル化状況から独立した増幅を可能にした。重亜硫酸塩処理したDNA用に本出願人によって最適化した標準化プライマー設計ワークフローを使用した。重亜硫酸塩処理したリンパ球DNAで好首尾な増幅が三つ組で複製され、ゲノムDNAのバックグラウンド増幅が検出されず、重亜硫酸塩DNA特異的増幅が確実になったとき、個々のPCRアッセイが確立したとみなされた。プライマーを表1に示す。
全ての試料および対照の全ゲノムDNAを重亜硫酸塩処理し、メチル化していないシトシンをウラシルに転換した。メチル化したシトシンを保存する。本出願人が最適化し独自の重亜硫酸塩処理手順に従って重亜硫酸塩処理を実施した。潜在的な過程の偏りを回避するために、試料を加工バッチにランダムに割り付けた。主要な診断クラスに従って、最初に患者試料をグループ分けした。
・ILC
・IDC、N0、ER=neg
・IDC、N0、ER=pos
・IDC、N1またはN2、ER=neg
・IDC、N1またはN2、ER=pos
・他の腫瘍:
・良性疾患/DCIS
・リンパ球:
・正常乳房および上皮細胞
・BRCA1
次いで、分析下各CpG位置用に、個々の試料それぞれから全てのPCR生成物を、1対の固定したオリゴヌクレオチドを担持するガラススライドにハイブリッド形成した。ハイブリッド形成には、プロセスの潜在的偏りを回避するために試料を加工バッチにグループ分けした。試料は、重亜硫酸塩バッチにランダムに割り付けた80個の試料のバッチ中で加工した。元々メチル化していない(TG)またはメチル化した(CG)一CpG部位周辺で、重亜硫酸塩転換した配列とハイブリッド形成させるために、各検出オリゴヌクレオチドを設計した。使用した全てのハイブリッド形成オリゴヌクレオチド(情報的に有用および無用)のさらに詳しい説明は表2を参照されたい。ハイブリッド形成条件を選択して、TG変異体とCG変異体間の単一ヌクレオチドの差異を検出できるようにした。
チップデータの分析では、Epigenomics独自のソフトウェア(「Episcape」)を使用した。EpiScapeは、それぞれ、試料に対してクエリを支持するデータ保管庫、ゲノム、および研究室管理データベースを備える。それは、メチル化アレイデータを分析し視覚化するための様々な統計ツールを備える。以下の章では、本発明者らは、データを分析するために利用した最も重要なデータ分析技術を要約する。
各CpG位置の対数メチル化率(log(CG/TG))は、以下のステップを含む標準化した予備プロセシングパイプラインによって定量した。
・各スポットでは、中央値フォアグラウンドピクセル強度から中央値バックグラウンドピクセル強度を減算する。これにより、バックグラウンド修正したハイブリッド形成強度の良好な評価が得られる。
・各CpG位置のCGおよびTG検出オリゴヌクレオチドでは、4重複性スポット強度のバックグラウンド修正した中央値を得る。
・各チップおよび各CG/TGオリゴ対では、log(CG/TG)比を算出する。
・試料ごとに、重複性チップ反復に対するlog(CG/TG)強度の中央値を得る。
主成分分析(PCA)は、新規な座標系上に測定ベクトルを投影する(例えば、数個のCpG部位上のチップデータ、メチル化プロフィールなど)。新規な座標軸を主成分と称する。第1の主成分は、データの最大分散方向にスパンする。次の成分は、減少する分散によって順序付けられ、互いに直交する。異なるCpG位置が、異なるウェイトで、異なる成分に沿うデータクラウド伸展に寄与する。PCAは無管理技術であり、すなわち、データ点のどんな基または標識情報も考慮されない(さらに詳しい説明については、例えば、Ripley, B. D. 1996. Pattern Recognition and Neural Networks, Cambridge, UK, Cambridge University Press.を参照)。
チップ生成プロセスの全体的な安定性を制御するために、本発明者らは、多変量統計プロセスコントロール(MVSPC)の分野の方法を利用する。本発明者らの主要なツールは、T2コントロールチャートであり、これは通常作業条件からチッププロセスの有意な偏差を検出するために使用される(Model F, Koenig T, Piepenbrock C, Adorjan P. 2002. Statistical process control for large scale Microarray experiments. Bioinformatics. 18 Suppl 1:S155-163.)。
・プロセスパラメータに関してチップデータをオーダーする(例えば、ハイブリッド形成データまたはスポッティングロボット)。
・歴史的データセットを定義する。これは通常作業条件下でチッププロセスについて記載している(例えば、第1の75個のハイブリッド形成チップ)。チャートでは、特殊なプロット記号によって歴史的データセットのデータが示される。
・歴史的データセットに対してあらゆる新規なチップの距離を計算する。数個の連続的なチップの距離が、所与のコントロールリミットを超える場合、プロセスを制御不能とみなす必要がある。
ウィルコクソンの順位和検定を使用して単一CpG部位の測定値の点で群を比較する(例えば、男性対女性のリンパ球)。有意(p<0.05)な検査結果は、それぞれのメチル化対数比すなわちlog(CG/TG)の分布間での移行を示す。
本明細書に示す通り、マーカー(単に遺伝子または単位複製配列と称する場合もある)は、当該ゲノムの領域をさす(本明細書では略記ROIの使用もさす)。通常、ROIは数個のCpG位置を含む。マーカーが何一つ予測力を持たないとする帰無仮説を試験するために、本発明者らはロジスティック回帰モデル用に尤度テストを使用した(Venables, W. N.およびRipley, B. D. Modern Applied Statistics with S-PLUS, 第3版 edition. New York: Springer, 2002.参照)。単一マーカー用ロジスティック回帰モデルは、それぞれのROIで、全てのCpG位置からのメチル化測定の一次結合である。適合させたロジスティック回帰モデルを、メチル化に独立して、帰無仮説を表す一定確率モデルと比較する。マーカーのP値を尤度試験によって計算する。
5%レベルで多数の検査を実施することは、多数の偽陽性検査結果につながるであろう。群相互間に差がないならば、約200回の検査を実施した場合、等式の少なくとも一つの仮説を拒絶する確率は約1である。従って、多重度の修正は、検査結果が本当に有意であると確実に結論付けるために必要である。保存的であるが単純方法は、実施した検査数と全てのP値を掛けるボンフェローニ補正であり、その際、修正値>1は1.0に切り捨てる。
どれくらい首尾よく、選択されたマーカーのCpGの組が、異なる組織クラス間を区別することができるかを確実に推定するために、本発明者らは分類によってその予測精度を定量することができる。その目的において、本発明者らは、特異的クラス標識を有するある組織試料セットを使用し、メチル化プロフィールをベースとした予測関数を計算する。このステップは、トレーニングと呼ばれ、データ標識によって表される先行の知識を利用する。次いで、その関数の予測精度を独立した試料セットで試験する。選択方法として、本発明者らは、サポートベクターマシン(SVM)アルゴリズム(例えば、Cristiannini, N.およびShawe-Taylor, J. An introduction to support vector machines. Cambridge, UK: Cambridge University Press, 2000.;Duda, R. O., Hart, P. E., およびStork, D. G. Pattern Classification. New York: John Wiley & Sons, 2001.参照)を使用して予測関数を学習した。この報告では、感受性と特異性は等しく重点が置かれる。これは、偽陽性および偽陰性分類に付随するリスクをそれぞれのクラスサイズに反比例して設定することによって実現される。従って、得られた分類指標の感受性と特異性は、ほぼ同等であると推定することができる。この調整は、臨床要件に従って適合させることができることに留意されたい。
限られた標本サイズでの交差検証法によって、判別関数の予測精度のための有効で確実な見積が得られ、従ってマーカーの有意性に加えて、本発明者らは、交差検証法の精度、感受性および特異性見積も提供する。各分類タスクには、試料をおよそ同じサイズ5群に分類した。次いで、これら5個の試料群のうち4個で学習アルゴリズムを訓練した。次いで、この方法によって得られた予測因子を独立した検査試料の残余の群で試験した。正確な陽性および陰性分類の数は、独立した検査群の全ての可能な選択のための学習アルゴリズム用に、先行のランから得たどんな知識も使用することなしに、10ランを超えてカウントした。試料セットの10回のランダム置換順列でこの手順を繰り返すと、単純に試料を一つのトレーニング試料セットと一つの独立した検査セットに分けることによってこれを実施した場合に比べて、良好な予測性能の見積が得られる。
乳癌試料と良性乳房状態を比較する場合、アレイデータの分析の第1のステップは、判別マーカーを同定することである。この試験の好ましい目的は初期病変を検出することであるので、DCISと良性乳房状態を区別することは主要な焦点であった。血液を基にしたスクリーニング検査の要件を満たすために、乳癌とリンパ球および癌と他の起源それぞれを区別するマーカー候補遺伝子の機能を分析した。
マイクロアレイ1:結果は表12を参照。
この比較では、陽性は、それぞれ、197個のIDC、24個のILC、22個のDCISおよび20個のBRCA1試料からなる263個の乳癌試料であった。陰性クラスは、線維腺腫、線維嚢胞疾患および異型乳管過形成を含む良性乳房状態を有する28個の正常乳房試料および46個の乳房試料からなった。多変量ロジスティック回帰分析に基づき、49個のマーカーは、統計的有意性を有して乳癌と良性乳房状態を区別する。これらのうち28個のマーカーは、一変量分析に基づく少なくとも2個の検出オリゴで共メチル化判定基準を満たした。
この比較では、陽性クラスは、それぞれ、191個のIDC、22個のILC、21個のDCISおよび22個のBRCA1試料からなる256個の乳癌試料であった。陰性は、線維腺腫、線維嚢胞疾患および異型乳管過形成を含む、良性乳房状態を有する26個の正常乳房試料および42個の乳房試料からなった。多変量ロジスティック回帰に基づき、48個のマーカーは、統計的有意性を有して乳癌と良性乳房状態を区別する。これらのうち、32個のマーカーは、一変量分析に基づく少なくとも2個の検出オリゴで共メチル化判定基準を満たした。
マイクロアレイ1:結果は表10を参照。
この比較では、陽性クラスは、それぞれ、197個のIDC、24個のILC、22個のDCISおよび20個のBRCA1試料からなる263個の乳癌試料であった。陰性クラスは、線維腺腫、線維嚢胞疾患および異型乳管過形成を含む良性乳房状態を有する28個の正常乳房試料および46個の乳房試料から構成される。多変量ロジスティック回帰分析に基づき、31個のマーカーは、統計的有意性を有して乳癌と良性乳房状態を区別する。これらのうち13個のマーカーは、一変量分析に基づく統計上有意な少なくとも2個の検出オリゴで共メチル化判定基準を満たした。
この比較では、陽性クラスは、それぞれ、191個のIDC、22個のILC、21個のDCISおよび22個のBRCA1試料からなる256個の乳癌試料であった。陰性クラスは、線維腺腫、線維嚢胞疾患および異型乳管過形成を含む良性乳房状態を有する26個の正常乳房試料および42個の乳房試料からなる。多変量ロジスティック回帰に基づき、35個のマーカーは、統計的有意性を有して乳癌と良性乳房状態を区別する。これらのうち17個のマーカーは、一変量分析に基づく統計上有意な少なくとも2個の検出オリゴで共メチル化判定基準を満たした。
マイクロアレイ1:結果は表8を参照。
この比較では、陽性クラスは、それぞれ、197個のIDC、24個のILC、22個のDCISおよび20個のBRCA1試料からなる263個の乳癌試料であった。陰性クラスは28個のリンパ球試料からなった。多変量ロジスティック回帰分析に基づき、49個のマーカーは、統計的有意性を有して乳癌と良性乳房状態を区別する。これらのうち30個のマーカーは、一変量分析に基づく統計上有意な少なくとも2個の検出オリゴで共メチル化判定基準を満たした。
この比較では、陽性クラスは、それぞれ、191個のIDC、22個のILC、21個のDCISおよび22個のBRCA1試料からなる256個の乳癌試料であった。陰性クラスは34個のリンパ球試料からなった。多変量ロジスティック回帰に基づき、47個のマーカーは、統計的有意性を有して乳癌と良性乳房状態を区別する。これらのうち、37個のマーカーは、一変量分析に基づく統計上有意な少なくとも2個の検出オリゴで共メチル化判定基準を満たした。
マイクロアレイ1:結果は表6を参照。
この比較では、陽性クラスは、それぞれ、197個のIDC、24個のILC、22個のDCISおよび20個のBRCA1試料からなる263個の乳癌試料であった。陰性クラスは、12個の大腸試料、19個の肺試料、16個の卵巣試料、および小さい組織群のさらに28個の試料から構成される71個の他の癌試料からなった。多変量ロジスティック回帰分析に基づき、28個のマーカーは、統計的有意性を有して乳癌と良性乳房状態を区別する。これらのうち、16個のマーカーは、一変量分析に基づく統計上有意な少なくとも2個の検出オリゴで共メチル化判定基準を満たした。
この比較では、陽性クラスは、それぞれ、191個のIDC、22個のILC、21個のDCISおよび22個のBRCA1試料からなる256個の乳癌試料であった。陰性クラスは、18個の大腸試料、18個の肺試料、16個の卵巣試料、および小さな組織群のさらに21個の試料からなる他の73個の癌試料からなった。多変量ロジスティック回帰に基づき、25個のマーカーは、統計的有意性を有して乳癌と良性乳房状態を区別する。これらのうち、を有する15個のマーカーは、一変量分析に基づく統計上有意な少なくとも2個の検出オリゴで共メチル化判定基準を満たした。
マイクロアレイ1:結果は表4を参照。
この比較では、陽性クラスは、それぞれ、197個のIDC、24個のILC、22個のDCISおよび20個のBRCA1試料からなる263個の乳癌試料であった。陰性クラスは、74個の乳房試料(正常および良性疾患)、他の71個の癌試料および28個のリンパ球試料からなった。多変量ロジスティック回帰分析に基づき、50個のマーカーは、統計的有意性を有して乳癌と良性乳房状態を区別する。これらのうち29個のマーカーは、一変量分析に基づく統計上有意な少なくとも2個の検出オリゴで共メチル化判定基準を満たした。
この比較では、陽性クラスは、それぞれ、191個のIDC、22個のILC、21個のDCISおよび22個のBRCA1試料からなる256個の乳癌試料であった。陰性クラスは、68個の乳房試料(正常および良性疾患)、他の73個の癌試料、および34個のリンパ球試料からなった。多変量ロジスティック回帰に基づき、48個のマーカーは、統計的有意性を有して乳癌と良性乳房状態を区別する。これらのうち32個のマーカーは、一変量分析に基づく統計上有意な少なくとも2個の検出オリゴで共メチル化判定基準を満たした。
表27に示す、乳癌と良性乳房状態を区別するのに有意であるが、乳癌と他の癌の区別には有意ではなかった両マイクロアレイのマーカーは、一般的な癌マーカーとして有用であると判断された。
以下の実施例では、様々なリアルタイムアッセイが、以下のメチル化分析用に開発された:
SEQ ID NO: 104 (CCND2)
SEQ ID NO: 77 (FABP3)
SEQ ID NO: 90 (RASSF1A)
SEQ ID NO: 13 (MSF)
SEQ ID NO: 15
SEQ ID NO: 20 (PRDM6)
SEQ ID NO: 38 (LMX1A)
SEQ ID NO: 3
SEQ ID NO: 4
SEQ ID NO: 29
SEQ ID NO: 22 (NR2E1)
SEQ ID NO: 115 (SCGB3A1)
SEQ ID NO: 112 (SLIT2)
SEQ ID NO: 6
SEQ ID NO: 98 (DAPK1)。
配列番号104(CCND2)(アッセイ4)
Lightcycler熱サイクリングプログラム:
初期変性 95℃で10分間
55サイクル:
変性 95℃で 15秒間
アニーリング 62℃で 45秒間
試薬:
試薬 濃度
1a+1b混合試薬 1.00×
Taqmanプローブ 0.30μM
混合プライマー 0.60pmol/μl(各)
MgCl2 3.50mM
配列番号77(FABP3)(アッセイ1‐5)
Lightcycler熱サイクリングプログラム:
初期変性 95℃で10分間
55サイクル:
変性 95℃で 15秒間
アニーリング 62℃で 45秒間
試薬:
試薬 濃度
1a+1b混合試薬 1.00×
Taqmanプローブ 0.30μM
混合プライマー 0.60pmol/μl(各)
MgCl2 3.50mM
配列番号90(RASSF1A)(アッセイ1)
Lightcycler熱サイクリングプログラム:
初期変性 95℃で10分間
55サイクル:
初期変性 95℃で15秒間
アニーリング 62℃で45秒間
試薬:
試薬 濃度
1a+1b混合試薬 1.00×
Taqmanプローブ 0.30μM
混合プライマー 0.60pmol/μl(各)
MgCl2 3.50mM
配列番号13(MSF)(アッセイ2)
Lightcycler熱サイクリングプログラム:
初期変性 95℃で10分間
55サイクル:
初期変性 95℃で 15秒間
アニーリング 62℃で 45秒間
試薬:
試薬 濃度
1a+1b混合試薬 1.00×
Taqmanプローブ 0.30μM
混合プライマー 0.60pmol/μl(各)
MgCl2 3.50mM
配列番号15(アッセイ5)
Lightcycler熱サイクリングプログラム:
活性化: 95℃ 10分
55サイクル: 95℃ 10秒
56℃ 30秒
72℃ 10秒
融解曲線: 95℃ 10秒
40℃ 10秒
70℃ 0秒
冷却: 40℃ 5秒
試薬:
試薬 濃度
MgCl2 3.50mM
混合プライマー 0.30μM(各)
ブロッカー 4.00μM
検出プローブ 0.15μM(各)
1a+1b試薬FastStart混合物 1.00
配列番号20(PRDM6)(アッセイ100)
Lightcycler熱サイクリングプログラム:
初期変性 95℃で10分間
55サイクル:
初期変性 95℃で 15秒間
アニーリング 62℃で 45秒間
試薬:
試薬 濃度
1a+1b混合試薬 1.00×
Taqmanプローブ 0.30μM
混合プライマー 0.60pmol/μl(各)
MgCl2 3.50mM
配列番号38(LMX1A)(アッセイ3)
Lightcycler熱サイクリングプログラム:
初期変性 95℃で10分間
55サイクル:
初期変性 95℃で 15秒間
アニーリング 62℃で 45秒間
試薬:
試薬 濃度
1a+1b混合試薬 1.00×
Taqmanプローブ 0.30μM
混合プライマー 0.60pmol/μl(各)
MgCl2 3.50mM
配列番号3(アッセイ8)
Lightcycler熱サイクリングプログラム:
初期変性 95℃で10分間
55サイクル:
変性 95℃で 15秒間
アニーリング 62℃で 45秒間
試薬:
試薬 濃度
1a+1b混合試薬 1.00×
Taqmanプローブ 0.30μM
混合プライマー 0.60pmol/μl(各)
MgCl2 3.50mM
配列番号29(アッセイ2)
Lightcycler熱サイクリングプログラム:
初期変性 95℃で10分間
55サイクル:
変性 95℃で 15秒間
アニーリング 62℃で 45秒間
試薬:
試薬 濃度
1a+1b混合試薬 1.00×
Taqmanプローブ 0.30μM
混合プライマー 0.60pmol/μl(各)
MgCl2 3.50mM
配列番号22(NR2E1)(アッセイo)
Lightcycler熱サイクリングプログラム:
初期変性 95℃で10分間
55サイクル:
変性 95℃で 15秒間
アニーリング 62℃で 45秒間
試薬:
試薬 濃度
1a+1b混合試薬 1.00×
Taqmanプローブ 0.30μM
混合プライマー 0.60pmol/μl(各)
MgCl2 3.50mM
配列番号115(SCGB3A1)(アッセイ1)
Lightcycler熱サイクリングプログラム:
初期変性 95℃で10分間
55サイクル:
変性 95℃で 15秒間
アニーリング 62℃で 45秒間
試薬:
試薬 濃度
1a+1b混合試薬 1.00×
Taqmanプローブ 0.30μM
混合プライマー 0.60pmol/μl(各)
MgCl2 3.50mM
配列番号112(SLIT2)(アッセイ2‐2)
Lightcycler熱サイクリングプログラム:
初期変性 95℃で10分間
55サイクル:
変性 95℃で 15秒間
アニーリング 62℃で 45秒間
試薬:
試薬 濃度
1a+1b混合試薬 1.00×
Taqmanプローブ 0.30μM
混合プライマー 0.60pmol/μl(各)
MgCl2 3.50mM
配列番号6(アッセイ5)
Lightcycler熱サイクリングプログラム:
活性化: 95℃ 10分
55サイクル: 95℃ 10秒
56℃ 30秒
72℃ 10秒
融解曲線: 95℃ 10秒
40℃ 10秒
70℃ 0秒
冷却: 40℃ 5秒
試薬:
試薬 濃度
MgCl2 3.50mM
混合プライマー 0.30μM(各)
ブロッカー 4.00μM
検出プローブ 0.15μM(各)
1a+1b試薬FastStart混合物 1.00
配列番号98(DAPK1)(アッセイ2)
Lightcycler熱サイクリングプログラム:
初期変性95℃で10分間
55サイクル:
変性 95℃で 15秒間
アニーリング 62℃で 45秒間
試薬:
試薬 濃度
1a+1b混合試薬 1.00×
Taqmanプローブ 0.30μM
混合プライマー 0.60pmol/μl(各)
MgCl2 3.50mM
配列番号22(NR2E1)(アッセイ2)
Lightcycler熱サイクリングプログラム:
活性化: 95℃ 10分
55サイクル: 95℃ 10秒
56℃ 30秒
72℃ 10秒
融解曲線: 95℃ 10秒
40℃ 10秒
70℃ 0秒
冷却: 40℃ 5秒
試薬:
試薬 濃度
MgCl2 3.50mM
混合プライマー 0.30μM(各)
ブロッカー 4.00μM
検出プローブ 0.15μM(各)
1a+1b試薬FastStart混合物 1.00
本アッセイを異なる2つの設定で試験した。第1の設定では、血液を基にしたスクリーニング検査での使用に適当な診断マーカーとしてのその有用性を判定するために、上記マイクロアレイ実験に従って確認された以下の乳癌マーカーを血液および乳癌試料で分析した。
SEQ ID NO: 104 (CCND2)
SEQ ID NO: 77 (FABP3)
SEQ ID NO: 90 (RASSF1A)
SEQ ID NO: 13 (MSF)
SEQ ID NO: 15
SEQ ID NO: 20 (PRDM6)
SEQ ID NO: 38 (LMX1A)
SEQ ID NO: 3
SEQ ID NO: 4
SEQ ID NO: 29
SEQ ID NO: 22 (NR2E1)
SEQ ID NO: 115 (SCGB3A1)
SEQ ID NO: 112 (SLIT2)
SEQ ID NO: 6
SEQ ID NO: 98 (DAPK1)
SEQ ID NO: 104 (CCND2)
SEQ ID NO: 77 (FABP3)
SEQ ID NO: 90 (RASSF1A)
SEQ ID NO: 13 (MSF)
SEQ ID NO: 20 (PRDM6)
SEQ ID NO: 38 (LMX1A)
各アッセイによって測定した、メチル化したDNAの量の数量化は、検査試料の増幅曲線と検量線を比較することによって算出した。検量線は、参照として使用した希釈系列に従って導き出した。
Claims (35)
- 対象中の乳房細胞増殖性疾患の検出方法、またはその疾患間で検出区別する方法であって、SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, PROSTAGLANDIN E2 RECEPTOR, EP4 SUBTYPE (PROSTANOID EP4 RECEPTOR) (PGE RECEPTOR, EP4 SUBTYPE), ORPHAN NUCLEAR RECEPTOR NR5A2 (ALPHA-1-FETOPROTEIN TRANSCRIPTION FACTOR) (HEPATOCYTIC TRANSCRIPTION FACTOR) (B1-BINDING FACTOR) (HB1F) (CYP7A PROMOTER BINDING FACTOR), LIM DOMAIN KINASE 1, MSF, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, PRDM6, RAP2B, NR2E1, PCDH7, DKK3, RTTN, SEQ ID NO: 26, GIRK2, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, ARL7, SEQ ID NO: 31, THH, SNAP25, HOXB13, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, MGC10561, LMX1A, SENP3, GS1, TITF1, SEQ ID NO: 42, DDX51, Q8NAN2, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, O60279, SEQ ID NO: 48, KOX7, BCL11B, SEQ ID NO: 51, MGC34831, COL5A1, SEQ ID NO: 54, PDLIM1, BRCA2, CDKN2A, EYA4, GSTP1, SYK, AR, PLAU, LEF1, ALX4, APC, BRCA1, CDKN1A, SERPINB5, SFN, CDH13, CASP8, PRSS8, SNCG, IGSF4, ESR1, FHIT, FABP3, HOXA5, CDH1, TP53, THBS1, APAF1, PGR, TMS1/ASC, HIC1, TP73, CLDN7, RARB, MLH1, RASSF1A, ESR2, TERT, TGFBR2, IGFBP7, LOT1, S100A7, ARH1/NOEY2, DAPK1, IL6, TWIST, MCT1, SASH1, TIMP3, CCND2, SOD2, THRB, NME1, RARA, STAT1, TPM1, GJB2, SLIT2, HS3ST2, PRDM2, SCGB3A1, SLC19A1, SEQ ID NO: 117, GPC3からなる群から選択される少なくとも一個の遺伝子または配列の発現を定量すること、および乳房細胞増殖性疾患の有無、またはサブクラスからの判定を含む方法。
- 乳癌の有無を判定する方法であって、遺伝子または配列が、APC, ARH1/NOEY2, BRCA2, CCND2, CDKN1A, CDKN2A, SEQ ID NO: 9, DAPK1, SEQ ID NO: 2, EYA4, FHIT, GSTP1, HIC1, IGFBP7, MLH1, PGR, SERPINB5, RARB, SFN, SOD2, TGFBR2, THRB, TIMP3, TP73, NME1, CDH13, THBS1, TMS1/ASC, ESR1, IL6, APAF1, CASP8, SYK, HOXA5, FABP3, RASSF1A, SEQ ID NO: 3, RARA, TWIST, ESR2, PLAU, STAT1, SEQ ID NO: 4, BRCA1, LOT1, PRSS8, SNCG, TPM1, GPC3, CLDN7, SLC19A1, GJB2, SLIT2, IGSF4, MCT1, HS3ST2, PRDM2, ALX4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SCGB3A1, SEQ ID NO: 1, PROSTAGLANDIN E2 RECEPTOR, EP4 SUBTYPE (PROSTANOID EP4 RECEPTOR) (PGE RECEPTOR, EP4 SUBTYPE), ORPHAN NUCLEAR RECEPTOR NR5A2 (ALPHA-1-FETOPROTEIN TRANSCRIPTION FACTOR) (HEPATOCYTIC TRANSCRIPTION FACTOR) (B1-BINDING FACTOR) (HB1F) (CYP7A PROMOTER BINDING FACTOR), LIM DOMAIN KINASE 1, SASH1, S100A7, BCL11B, SEQ ID NO: 51, MGC34831, SEQ ID NO: 54, PDLIM1, MSF, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, PRDM6, RAP2B, NR2E1, PCDH7, DKK3, RTTN, SNAP25, SEQ ID NO: 26, GIRK2, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, ARL7, SEQ ID NO: 31, THH, HOXB13, SEQ ID NO: 35, MGC10561, LMX1A, SENP3, GS1, TITF1, SEQ ID NO: 42, DDX51, SEQ ID NO: 117 , SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, O60279, SEQ ID NO: 48からなる群から選択される少なくとも一個の遺伝子または配列の少なくとも16個の近接するヌクレオチドの配列を含むか、またはストリンジェント条件下で該配列とハイブリッド形成する、請求項1に記載の方法。
- 前記遺伝子または配列が、PRDM2, PLAU, GSTP1, SLIT2, CCND2, HOXA5, RASSF1A, HS3ST2, ARH1/NOEY2, SCGB3A1, LIMK-1, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 31からなる群から選択される少なくとも一個の遺伝子または配列の少なくとも16個の近接するヌクレオチドの配列を含むか、またはストリンジェント条件下で該配列とハイブリッド形成する、請求項2に記載の方法。
- 前記乳房細胞増殖性疾患が他の癌と区別される乳癌であり、かつ前記遺伝子または配列が、ARH1/NOEY2, CCND2, CDKN1A, CDKN2A, DAPK1, SEQ ID NO: 2, EYA4, FHIT, GSTP1, HIC1, IGFBP7, SERPINB5, TERT, TGFBR2, THRB, TIMP3, TP73, NME1, CDH13, THBS1, TMS1/ASC, IL6, APAF1, SYK, HOXA5, FABP3, RASSF1A, SEQ ID NO: 3, TWIST, ESR2, PLAU, STAT1, SEQ ID NO: 4, LOT1, GPC3, CLDN7, GJB2, SLIT2, IGSF4, MCT1, PRDM2, ALX4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SCGB3A1, SEQ ID NO: 1, PROSTAGLANDIN E2 RECEPTOR, EP4 SUBTYPE (PROSTANOID EP4 RECEPTOR) (PGE RECEPTOR, EP4 SUBTYPE), LIM DOMAIN KINASE 1, MGC34831, SEQ ID NO: 54, MSF, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, PRDM6, NR2E1, PCDH7, RTTN, SNAP25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, ARL7, SEQ ID NO: 31, THH, HOXB13, SEQ ID NO: 35, MGC10561, LMX1A, SENP3, TITF1, SEQ ID NO: 42, DDX51, SEQ ID NO: 45, O60279, SEQ ID NO: 48からなる群から選択される少なくとも一個の遺伝子または配列の少なくとも16個の近接するヌクレオチドの配列を含むか、またはストリンジェント条件下で該配列とハイブリッド形成する、請求項1に記載の方法。
- 前記遺伝子または配列が、PRDM2, GSTP1, ALX4, HOXA5, PLAU, RASSF1A, IGSF4, SLIT2, DAPK1, CDKN1A, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 35, LIMK-1, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 47からなる群から選択される少なくとも一個の遺伝子または配列の少なくとも16個の近接するヌクレオチドの配列を含むか、またはストリンジェント条件下で該配列とハイブリッド形成する、請求項4に記載の方法。
- 乳癌の有無を血液または血液成分のバックグラウンドで判定する方法であって、前記遺伝子または配列が、APC, ARH1/NOEY2, CCND2, CDH1, CDKN1A, CDKN2A, SEQ ID NO: 9, DAPK1, SEQ ID NO: 2, EYA4, FHIT, GSTP1, HIC1, IGFBP7, PGR, SERPINB5, RARB, SFN, SOD2, TERT, TGFBR2, THRB, TIMP3, NME1, CDH13, THBS1, TMS1/ASC, ESR1, IL6, APAF1, CASP8, SYK, HOXA5, FABP3, RASSF1A, SEQ ID NO: 3, TWIST, ESR2, PLAU, STAT1, SEQ ID NO: 4, BRCA1, LOT1, PRSS8, SNCG, GPC3, CLDN7, SLC19A1, GJB2, SLIT2, IGSF4, MCT1, HS3ST2, PRDM2, ALX4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SCGB3A1, SEQ ID NO: 1, PROSTAGLANDIN E2 RECEPTOR, EP4 SUBTYPE (PROSTANOID EP4 RECEPTOR) (PGE RECEPTOR, EP4 SUBTYPE), ORPHAN NUCLEAR RECEPTOR NR5A2 (ALPHA-1-FETOPROTEIN TRANSCRIPTION FACTOR) (HEPATOCYTIC TRANSCRIPTION FACTOR) (B1-BINDING FACTOR) (HB1F) (CYP7A PROMOTER BINDING FACTOR), LIM DOMAIN KINASE 1, SASH1, S100A7, BCL11B, SEQ ID NO: 51, MGC34831, SEQ ID NO: 54, PDLIM1, MSF, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, PRDM6, RAP2B, NR2E1, PCDH7, DKK3, RTTN, SNAP25, SEQ ID NO: 26, GIRK2, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, ARL7, SEQ ID NO: 31, THH, HOXB13, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, MGC10561, LMX1A, SENP3, GS1, TITF1, SEQ ID NO: 42, DDX51, SEQ ID NO: 117 , SEQ ID NO: 46, O60279, SEQ ID NO: 48からなる群から選択される少なくとも一個の遺伝子または配列の少なくとも16個の近接するヌクレオチドの配列を含むか、またはストリンジェント条件下で該配列とハイブリッド形成する、請求項1に記載の方法。
- 前記遺伝子または配列が、FABP3, RASSF1A, MSF, PRDM6, LMX1A, SEQ ID NO: 4 , SCGB3A1, SLIT2, NR2E1, EYA4, PRDM2, SERPINB5, TWIST, STAT1, ALX4, IGFBP7, DAPK1, THBS1, PLAU, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 6, LIMK-1, SEQ ID NO: 46からなる群から選択される少なくとも一個の遺伝子または配列の少なくとも16個の近接するヌクレオチドの配列を含むか、またはストリンジェント条件下で該配列とハイブリッド形成する、請求項6に記載の方法。
- 非浸潤性乳管癌が健康な乳房組織または良性乳房細胞増殖性疾患と区別され、かつ前記遺伝子または配列が、APC, ARH1/NOEY2, CCND2, CDKN1A, CDKN2A, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 2, EYA4, FHIT, GSTP1, HIC1, IGFBP7, MLH1, PGR, SERPINB5, RARB, SOD2, TERT, TGFBR2, THRB, TIMP3, TP73, CDH13, THBS1, TMS1/ASC, ESR1, APAF1, CASP8, SYK, HOXA5, FABP3, RASSF1A, SEQ ID NO: 3, RARA, TWIST, ESR2, PLAU, SEQ ID NO: 4, SNCG, SLC19A1, GJB2, SLIT2, IGSF4, MCT1, HS3ST2, PRDM2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SCGB3A1, PROSTAGLANDIN E2 RECEPTOR, EP4 SUBTYPE (PROSTANOID EP4 RECEPTOR) (PGE RECEPTOR, EP4 SUBTYPE), ORPHAN NUCLEAR RECEPTOR NR5A2 (ALPHA-1-FETOPROTEIN TRANSCRIPTION FACTOR) (HEPATOCYTIC TRANSCRIPTION FACTOR) (B1-BINDING FACTOR) (HB1F) (CYP7A PROMOTER BINDING FACTOR), LIM DOMAIN KINASE 1, SASH1, S100A7, BCL11B, SEQ ID NO: 51, MGC34831, SEQ ID NO: 54, PDLIM1, MSF, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, NR2E1, PCDH7, DKK3, RTTN, SNAP25, GIRK2, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, ARL7, SEQ ID NO: 31, THH, HOXB13, SEQ ID NO: 36, LMX1A, SENP3, TITF1, SEQ ID NO: 42, DDX51, SEQ ID NO: 117 , SEQ ID NO: 46, O60279, SEQ ID NO: 48からなる群から選択される少なくとも一個の遺伝子または配列の少なくとも16個の近接するヌクレオチドの配列を含むか、またはストリンジェント条件下で該配列とハイブリッド形成する、請求項1に記載の方法。
- 前記遺伝子または配列が、HS3ST2, SLIT2, RASSF1A, GSTP1, GJB2, IGFBP7, CDH13, ARH1/NOEY2, SCGB3A1, FHIT, SEQ ID NO: 27, LIMK-1, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 24からなる群から選択される少なくとも一個の遺伝子または配列の少なくとも16個の近接するヌクレオチドの配列を含むか、またはストリンジェント条件下で該配列とハイブリッド形成する、請求項8に記載の方法。
- 乳癌が健康な乳房組織または良性乳房細胞増殖性疾患と区別され、かつ前記遺伝子または配列が、ARH1/NOEY2, CCND2, CDKN1A, CDKN2A, SEQ ID NO: 9, DAPK1, SEQ ID NO: 2, EYA4, FHIT, GSTP1, HIC1, IGFBP7, SERPINB5, TERT, TGFBR2, THRB, TIMP3, TP73, NME1, CDH13, THBS1, TMS1/ASC, IL6, APAF1, SYK, HOXA5, FABP3, RASSF1A, SEQ ID NO: 3, TWIST, ESR2, PLAU, STAT1, SEQ ID NO: 4, LOT1, GPC3, CLDN7, GJB2, SLIT2, IGSF4, MCT1, PRDM2, ALX4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SCGB3A1, SEQ ID NO: 1, PROSTAGLANDIN E2 RECEPTOR, EP4 SUBTYPE (PROSTANOID EP4 RECEPTOR) (PGE RECEPTOR, EP4 SUBTYPE), ORPHAN NUCLEAR RECEPTOR NR5A2 (ALPHA-1-FETOPROTEIN TRANSCRIPTION FACTOR) (HEPATOCYTIC TRANSCRIPTION FACTOR) (B1-BINDING FACTOR) (HB1F) (CYP7A PROMOTER BINDING FACTOR), LIM DOMAIN KINASE 1, BCL11B, SEQ ID NO: 51, MGC34831, SEQ ID NO: 54, PDLIM1, MSF, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, PRDM6, NR2E1, PCDH7, DKK3, RTTN, SNAP25, SEQ ID NO: 26, GIRK2, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, ARL7, SEQ ID NO: 31, THH, HOXB13, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, MGC10561, LMX1A, SENP3, GS1, TITF1, SEQ ID NO: 42, DDX51, SEQ ID NO: 117 , SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, O60279, SEQ ID NO: 48からなる群から選択される少なくとも一個の遺伝子または配列の少なくとも16個の近接するヌクレオチドの配列を含むか、またはストリンジェント条件下で該配列とハイブリッド形成する、請求項1に記載の方法。
- 前記遺伝子または配列が、SLIT2, HS3ST2, HOXA5, ARH1/NOEY2, IGFBP7, PLAU, CDH13, TIMP3, CCND2, GSTP1, SEQ ID NO: 117, LIMK-1, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 41,SEQ ID NO: 27,SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 4からなる群から選択される少なくとも一個の遺伝子または配列の少なくとも16個の近接するヌクレオチドの配列を含むか、またはストリンジェント条件下で該配列とハイブリッド形成する、請求項10に記載の方法。
- 前記発現が、CpGのメチル化を分析することによって定量される、請求項1〜11のいずれかに記載の方法。
- 対象から得た生物試料から単離したゲノムDNAと、該標的核酸の一つまたは複数の中のメチル化CpGジヌクレオチドと非メチル化CpGジヌクレオチドを区別する少なくとも一種の試薬または一連の試薬を接触させることを含む、請求項12に記載の方法。
- i)対象から対象のゲノムDNAを有する生物試料を得ること
ii)該ゲノムDNAまたはそのフラグメントと、メチル化CpGジヌクレオチド配列と非メチル化CpGジヌクレオチド配列を区別するための一試薬または複数の試薬とを接触させること
iii)その配列が、配列番号493〜配列番号964およびそれらに相補的な配列からなる群から選択される塩基配列の少なくとも16塩基対長のセグメントと逆相補的であるか、同一であるか、または該配列とストリンジェントまたは高度にストリンジェント条件下でハイブリッド形成する少なくとも一個のプライマー対によって、該DNAの少なくとも一個の標的配列を増幅すること
iv)少なくとも部分的に前記区別に基づいて、少なくとも一個の標的CpGジヌクレオチド配列のメチル化状態、あるいは複数の標的CpGジヌクレオチド配列の平均的メチル化状態を反映する平均または値を定量し、乳房細胞増殖性疾患を検出し、またはその疾患間で検出区別することによって少なくとも部分的に与えられる、請求項13に記載の方法。 - ii)において、重亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、二亜硫酸塩、およびそれらの組合せからなる群から選択される試薬の使用を含む、請求項14の方法。
- 前記生物試料が、乳頭吸引液、リンパ液、乳管洗浄液、極細針吸引物、血漿、血清、全血、単離した血液細胞、血液から単離した細胞からなる群から選択される、請求項14または15のいずれかの方法。
- 配列番号493〜配列番号964からなる群から選択される配列に相補的であり、または中程度にストリンジェントまたはストリンジェント条件下で該配列とハイブリッド形成する少なくとも9ヌクレオチド長の隣接配列をいずれの場合にも含む、少なくとも一個の核酸分子またはペプチド核酸(PNA)分子の使用を含む、請求項14〜16のいずれかの方法。
- 前記隣接配列が、少なくとも一個のCpG、TpG、またはCpAジヌクレオチド配列を含む、請求項17の方法。
- 少なくとも2個のそのような核酸分子またはペプチド核酸(PNA)分子の使用が含まれる、請求項18の方法。
- iii)において、その増幅酵素として耐熱性DNAポリメラーゼの使用、5'‐3'エクソヌクレアーゼ活性を欠損しているポリメラーゼの使用、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の使用、検出可能な標識を有する増幅核酸分子の生成、およびそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも一つの方法の使用を含む、請求項14〜19のいずれかに記載の方法。
- 前記プライマーが、メチル化特異的プライマーである、請求項14〜19のいずれかに記載の方法。
- iii)において、配列番号493〜配列番号964からなる群から選択される配列およびその相補鎖に相補的であり、または中程度にストリンジェントまたはストリンジェント条件下で該配列とハイブリッド形成する少なくとも9ヌクレオチド長の隣接配列をいずれの場合にも含む、少なくとも一個の核酸分子またはペプチド核酸分子の使用がさらに含まれる方法であって、該核酸分子またはペプチド核酸分子が、それとハイブリッド形成する核酸の増幅を抑制する、請求項14〜19のいずれかに記載の方法。
- iv)において、配列番号493〜配列番号964からなる群から選択される配列およびその相補鎖に相補的であり、または中程度にストリンジェントまたはストリンジェント条件下で該配列とハイブリッド形成する少なくとも9ヌクレオチド長の隣接配列をいずれの場合にも含む少なくとも一個の核酸分子またはペプチド核酸分子のハイブリッド形成を含む、請求項14〜22のいずれかに記載の方法。
- 少なくとも一個のそのようなハイブリッド形成する核酸分子またはペプチド核酸分子が固相に結合されている、請求項23の方法。
- 少なくとも一個のヌクレオチド塩基によって、少なくとも一個のそのようなハイブリッド形成した核酸分子を伸長することをさらに含む、請求項24の方法。
- iv)の定量において、増幅物の配列決定を含む、請求項14の方法。
- 配列番号1〜配列番号118に由来する処理した核酸であって、該処理が、そのゲノムDNA配列の少なくとも一個の非メチル化シトシン塩基を、ウラシルまたはハイブリッド形成の点でシトシンと検出可能に異なる別の塩基に転換するのに適している核酸。
- 配列番号493〜配列番号964およびそれらに相補的な配列からなる群から選択される処理したゲノムDNA配列の少なくとも16個の近接するヌクレオチドを含む核酸であって、該処理が、そのゲノムDNA配列の少なくとも一個の非メチル化シトシン塩基を、ウラシルまたはハイブリッド形成の点でシトシンと検出可能に異なる別の塩基に転換するのに適している核酸。
- 前記近接する塩基配列が、少なくとも一個のCpG、TpG、またはCpAジヌクレオチド配列を含む、請求項27および28の核酸。
- その処理が、重亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、二亜硫酸塩、およびそれらの組合せからなる群から選択される試薬の使用を含む、請求項27〜29のいずれかの核酸。
- 配列番号493〜配列番号964からなる群から選択される処理したゲノムDNA配列に相補的であり、または中程度にストリンジェントまたはストリンジェント条件下で該配列とハイブリッド形成する少なくとも9個の近接するヌクレオチド配列を含むオリゴマー。
- 少なくとも一個のCpG、CpA、またはTpGジヌクレオチドを含む、請求項31のオリゴマー。
- いずれの場合にも、請求項31または32のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを少なくとも2つ含むオリゴマーのセット。
- 対象の乳房細胞増殖性疾患を検出し、またはその疾患間で検出区別するのに有用なキットであって、
‐ 重亜硫酸塩試薬またはメチル化感受性制限酵素の少なくとも一種、および
‐ 配列番号493〜配列番号964からなる群から選択される配列およびその相補鎖に相補的であり、または中程度にストリンジェントまたはストリンジェント条件下で該配列とハイブリッド形成する少なくとも9個のヌクレオチドの隣接配列をいずれの場合にも含む少なくとも一個の核酸分子またはペプチド核酸分子
を含むキット。 - MS‐SNuPE法、MSP、MethyLight法、HeavyMethyl法、核酸の配列決定、およびそれらの組合せからなる群から選択されるメチル化アッセイを実施するための標準試薬をさらに含む、請求項34のキット。
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