DE69417918T2

DE69417918T2 - Dna methyltransferase inhibierung

Info

Publication number: DE69417918T2
Application number: DE69417918T
Authority: DE
Inventors: Moshe Szyf
Original assignee: McGill University
Current assignee: McGill University
Priority date: 1993-11-30
Filing date: 1994-11-30
Publication date: 2000-01-05
Anticipated expiration: 2014-12-01
Also published as: EP1352956A1; AU1061395A; ATE178939T1; WO1995015373A3; WO1995015373A2; EP0889122A3; EP0734436B1; EP0734436A1; JPH09506253A; DE69417918D1; EP0889122A2; KR100392057B1; CA2177031A1; US6184211B1

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Zusammenspiel des Spiegels der DNA- Methyltransferase-Aktivität mit der Aktivität der Demethylase und auf die Rolle dieses Zusammenspiels bezüglich des proliferativen, differenzierten, tumorigenen und homöostatischen Zustands der Zelle.

Hintergrund

Während Transkriptionsfaktoren eine kritische Rolle bei der Regulierung der Genexpressionsprofile aller Organismen spielen, gibt es auch andere, "epigenetische" Informationsebenen, die für das Diversifikationsprogramm eines anderweitig einheitlichen genetischen Inhalts kodieren. Man nimmt an, daß die DNA-Methylierung eine dieser kritischen Determinanten des Diversifikationsprogramms darstellt (Razin et al., 1980, Science 210: 604-610).
Die DNA-Methylierung, eine postreplikative kovalente Modifikation der DNA, wird durch das Enzym DNA-Methyltransferase (MeTase) katalysiert (Koomar et al., 1994, Nucl. Acids Res. 22: 1-10 und Bestor et al., 1988, J. Mol. Biol. 203: 971-983). In Vertebraten sind die Cytosin- Reste eines Teils der CpG-Sequenzen in einer nicht-zufallsverteilten Art methyliert (60- 80%), wobei ein gen- und gewebespezifisches Methylierungsmuster erzeugt wird (Yisraeli und M. Szyf, 1985, In DNA methylation: Biochemistry and Biological significance, Seiten 353-378, Razin et al., (Hrsg.), Springer-Verlag, New York). Allgemein wird angenommen, daß die Methylierung innerhalb regulatorischer Regionen eines Gens mit dem reprimierten Status des Gens korreliert (Yisraeli und M. Szyf, 1985, In DNA methylation: Biochemistry and Biological significance, Seiten 353-378, Razin et al., (Hrsg.), Springer-Verlag, New York und Razin et al., 1991, Microbiol. Rev. 55, 451458). Aktuelle Daten weisen darauf hin, daß die DNA-Methylierung die Genexpression sowohl direkt durch die Hemmung der Bindung von Transkriptionsfaktoren an regulatorische Sequenzen reprimieren kann als auch indirekt, indem die Bindung von an methylierte DNA bindenden Faktoren angezeigt wird, die die Repression der Genaktivität lenken (Razin et al., 1991, Microbiol. Rev. 55: 451-458). Bekannterweise kommt es während der Entwicklung und der zellulären Differenzierung zu regulierten Veränderungen im DNA-Methylierungsmuster (Razin et al., 1991, Microbiol. Rev. 55: 451-458 und Brandeis et al., 1993, Bioessays 13: 709-713). Die kritische Rolle der DNA- Methylierung bei der Differenzierung wurde kürzlich gezeigt (Li et al., 1992, Cell 69: 915-926 und Szyfet al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 12831-12836). Das Methylierungsmuster wird während der Replikation durch die DNA-MeTase und den Spiegel der DNA-Metase-Aktivität aufrechterhalten und die Genexpression wird durch den Wachstumszustand von verschiedenen primären (Szyfet al., 1985, J. Biol. Chem. 260, 8653-8656) und immortalisierten Zellinien (Szyfet al., 1991, J. Biol. Chem. 266, 10027-10030) reguliert. Man nimmt an, daß diese regulierte Expression der DNA-MeTase für die Erhaltung des Methylierungsmusters kritisch ist.
Es gibt viele Beweise für das Vorliegen aberranter Methylierungsmuster in transformierten Zellen. So ist z. B. die 5'-Region des Retinoblastoms (Rb)- und des Wilms-Tumor (WT)-Gens in einem Anteil von Tumoren methyliert, und es wurde vorgeschlagen, daß die Inaktivierung dieser Gene in den jeweiligen Tumoren eher auf Methylierung als auf eine Mutation zurückzuführen ist. Zusätzlich ist in bestimmten neoplastischen Zellen der kurze Arm des Chromosoms 11 abschnittsweise hypermethyliert. Man nimmt an, daß in dieser Region einige Tumorsuppressorgene gruppiert vorliegen. Wenn der Spiegel der DNA-MeTase-Aktivität, wie bereits vorgeschlagen, kritisch für die Erhaltung des Methylierungsmusters ist (Szyf, 1991, Biochem. Cell Biol. 64: 764-769), dann stellt die Tatsache, daß die DNA-MeTase in vielen Tumorzellen weit über die Veränderung der DNA-Syntheserate hinaus induziert ist, eine mögliche Erklärung für die beobachtete Hypermethylierung dar. Die Tatsache, daß der DNA- MeTase-Promotor durch den Ras-AP-1 Signalweg aktiviert wird, stimmt mit der Hypothese überein, daß eine Anhebung der DNA-MeTase-Aktivität und die resultierende Hypermethylierung bei Krebs eine Auswirkung der Aktivierung des Ras-Jun-Signalweges darstellt.
Es ist klar, daß das Methylierungsmuster während der Entwicklung durch aufeinanderfolgende Methylierungs- und Demethylierungsereignisse etabliert wird (Razin et al., 1991, Microbiol. Rev. 55: 451-458 und Brandeis et al., 1993, Bioessays 13: 709-713), wobei das Muster in den somatischen Zellen aufrechterhalten bleibt. Ungeklärt bleibt dagegen noch, auf welche Weise Methylierungsmuster in vivo gebildet werden und aufrechterhalten bleiben. Obwohl zur Erklärung der klonalen Vererbung von Methylierungsmustern ein einfaches Modell vorgeschlagen wurde (Razin et al., 1980, Science 210: 604-610), erklärt es nicht, auf welche Weise spezifische Stellen im Genom während der Prozesse der Differenzierung und der zellulären Transformation de novo methyliert oder demethyliert werden. Es gibt verschiedene Hinweise darauf, daß neben dem Methylierungsstatus des parentalen Stranges andere Faktoren daran beteiligt sind, spezifische Stellen im Genom für die Methylierung auszuwählen.
In gleicher Weise ungeklärt ist es, auf welche Weise spezifische Stellen im Genom während der Entwicklung und der zellulären Transformation demethyliert werden. Ein passiver Verlust der Methylierung könnte einen möglichen Mechanismus darstellen, obwohl eine weitere Hypothese besagt, daß die Demethylierung durch eine unabhängige enzymatische Maschinerie durchgeführt wird.
Der Verlust der Methylierung an spezifischen Stellen im Genom ist ein gut dokumentierter Fakt der Vertebratendifferenzierung (Yisraeli und Szyf, 1985, In DNA methylation: Biochemistry and Biological significance, Seiten 353-378, Razin et al., (Hrsg.), Springer-Verlag, New York, Razin et al., 1991, Microbiol. Rev. 55: 451-458 und Brandeis et al., 1993, Bioessays 13: 709-713). Während der Verlust der Methylierung über einen wie bereits oben genannten passiven Vorgang erfolgen könnte, zeigte eine Reihe von Beobachtungen, daß in Säugerzellen ein aktiver Demethylierungsprozeß erfolgt (z. B. Yisraeli et al., 1986, Cell 46: 409-416). Die Demethylierung wird, ähnlich der de novo-Methylierung, durch spezifische Signale innerhalb der DNA gelenkt (Yisraeli et al., 1986, Cell 46: 409-416, und vgl. Modell in Fig. 1). Die Wahrscheinlichkeit, mit der eine Stelle im Genom methyliert oder demethyliert wird, wird durch die Affinität dieser Stelle für eines der beiden Enzyme, DNA-MeTase oder Demethylase, bestimmt. Die Affinität jeder Stelle für eines der Enzyme wird durch die umgebende Chromatin-Struktur bestimmt (Szyf, 1991, Biochem. Cell Biol. 64: 764-769).
In normalen Zellen wird die DNA-Methyltransferase reguliert und reprimiert, wahrscheinlich durch einen der Tumorsuppressoren. Das Methylierungsmuster wird durch ein Gleichgewicht zwischen den Aktivitäten der DNA-Methyltransferase und der Demethylase aufrechterhalten. Methylierte Stellen im Genom werden durch (M) in Fig. 1 gezeigt. Die Hemmung des Repressors führt zur Überexpression der DNA-MeTase (gezeigt durch den dicken Pfeil), das Genom wird hypermethyliert und die Tumorgenese initiiert (Tumor a). Einen anderen Mechanismus zur Heraufregulierung der DNA-Methyltransferase stellt die Aktivierung des onkogenen Ras-Signalwegs dar, der in der Aktivierung von Jun und der Überexpression der DNA-MeTase resultiert. Anscheinend kann der Ras-Signalweg jedoch auch gleichermaßen die Demethylase aktivieren. Das abschließende Methylierungsmuster in dieser Tumorart wird beide Aktivitäten widerspiegeln: Hypermethylierung (M) an den Stellen im Genom, die eine niedrige oder mittlere Affinität für die Demethylase exprimieren (Stellen 3, 4, 5) und Hypomethylierung an den Stellen im Genom, die eine hohe Affinität besitzen, aber in der ursprünglichen Zelle methyliert waren (Stelle Nr. 6).
Beweise für eine Verbindung von Krebs und Hypermethylierung besitzen jedoch nach wie vor eher zufälligen Charakter. Die kritische Frage, deren Beantwortung noch aussteht, besteht darin, ob diese Veränderungen bei der DNA-Methylierung eine kausale Rolle in der Karzinogenese spielen.
Babiss et al., Science 228 (1985), 1099-1101, untersuchten den Mechanismus der schrittweisen Entwicklung eines transformierten Phenotyps in Typ 5 Adenovirus (Ad5)-transformierten Rattenembryozellen. Die Autoren zeigten, daß eine einzige Exposition der progressierten Zellen mit dem demethylierenden Agens 5-Azacytidin (Aza) zu einer stabilen Umkehrung zum nicht-progressierten Status des ursprünglichen parentalen Klons führt. Diese Beobachtungen zeigten, daß die Progression ein reversibler Prozeß ist und stellen einen Hinweis darauf dar, daß die Progression mit Veränderungen im Methylierungsstatus eines oder mehrerer spezifischer Gene assoziiert sein könnte; vgl. Seite 1099, Abstract, Zeilen 11 bis 13. Die Darstellung der Autoren zeigte, daß die Progression mittels geeigneter in vitro- Manipulationen umgekehrt oder beschleunigt werden kann. Dies wird für die Entwicklung eines Zellkultur-Modellsystems zur molekularen Analyse der Tumorprogression hilfreich sein.
Jones, Cell 40 (1985), 485-486 faßte in einem Minireview das Verändern der Genexpression durch 5-Azacytidin (5-aza-CR) zusammen. Jones beschrieb das breite Spektrum der 5-aza- CR-Aktivität und dessen Fähigkeit, Gene eher selektiv zu aktivieren, als einen umfassenden Anstieg in der Genexpression hervorzurufen sowie die medizinischen Anwendungsmöglichkeiten von 5-aza-CR.
Der Nachweis, daß die Hypermethylierung mit der Karzinogenese korreliert, wäre außerordentlich nützlich, da er einerseits zur Entwicklung von Methoden zur Bewertung des karzinogenen Potentials von Zellen und andererseits zu therapeutischen Behandlungen von Krebspatienten führen könnte. Die Tatsache, daß der DNA-MeTase-Spiegel in Säugerzellen einen limitierenden Faktor darstellt, wird durch die Beobachtung unterstützt, daß eine geringe Anhebung des zellulären DNA-MeTase-Spiegels durch gerichtete Expression exogen eingebrachter DNA-Methyltransferase in NIH 3T3-Zellen zu einer signifikanten Verände rung des Methylierungsmusters führt (Wu et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8891- 8895).
Wenn die DNA-Methylierung eine wichtige Kontrolle des Differenzierungsstatus von Säugerzellen darstellt, dann könnten DNA-Methylierungs-modifizierende Agenzien zusätzlich als wichtige therapeutische Agenzien wirken. Diese könnten ein genetisches Programm in vorhersagbarer Weise ändern und/oder ein ursprüngliches Programm, wenn es durch deregulierte DNA-Methylierung gestört ist, wiederherstellen.
Die Identifizierung des für die Demethylase-Aktivität verantwortlichen Moleküls wäre darüber hinaus aus den oben genannten Gründen sehr nützlich, da die Kontrolle der Genexpression, der Differenzierung und der zellulären Homöostase vom Gleichgewicht zwischen dem Spiegel der DNA-MeTase- und der Demethylase-Aktivität abhängig zu sein scheint.

Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Zusammenspiel zwischen dem Spiegel der DNA-Methyltransferase-Aktivität und der Aktivität der Demethylase und auf die Rolle dieses Zusammenspiels bezüglich des proliferativen, differenzierten, tumorigenen und homöostatischen Zustands der Zelle. Sie bezieht sich auch auf die Verwendung der Verminderung des Spiegels an methyliertem Cytosin in einem CpG-Dinukleotid zur Umkehrung des transformierten Status einer Zelle, zur Korrektur eines aberranten Methylierungsmusters der DNA einer Zelle oder zur Veränderung des Methylierungsmusters der DNA einer Zelle. Nach der vorliegenden Erfindung können DNA-Methyltransferase (DNA-MeTase)-Inhibitoren dazu benutzt werden, die exzessive Aktivität oder die Hypermethylierung der DNA-MeTase in Krebszellen zu inhibieren und das ursprüngliche Tumor-supprimierende Programm zu induzieren. Diese Inhibitoren können außerdem dazu benutzt werden, andere Genexpressionsprogramme anzuschalten. Spezifische DNA-Methyltransferase-Antagonisten können auch Therapeutika darstellen, die auf einen Knotenpunkt der Regulation der genetischen Information gerichtet sind. Zusätzlich bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die pharmakologischen Bedeutungen, die durch die Tatsache gewährleistet werden, daß spezifische Veränderungen im Methylierungsmuster einer Zelle durch die Modulierung des allgemeinen Spiegels der DNA-MeTase und der enzymatischen Aktivität der Demethylase dieser Zelle erzielt werden können. Deshalb können inaktive Gene durch eine Veränderung des Methylierungsmusters der DNA aktiviert werden. So können beispielsweise die β-Thalassämie und die Sichelzellanämie durch eine Aktivierung des β-Globingens nach einer Veränderung seines Methylierungsmusters behandelt werden.
Basierend auf dem Nachweis, daß die Überexpression der DNA-MeTase in NIH 3T3-Zellen zur Transformation der Zellen führte (Wu et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8891- 8895), bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf die DNA-MeTase als Zielkandidaten in der Krebstherapie.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die kürzlich aus P19-Zellen aufgereinigte Demethylase-Aktivität und den Nachweis, daß diese Demethylase in P19-Zellen, die mit Ras transformiert sind, induziert vorliegt. Basierend auf der gesteigerten Hypermethylierung in Krebszellen und auf dem Nachweis, daß die Demethylase aus den P19-Zellen durch Ras induziert wird, bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf die Demethylase als einen Zielkandidaten für die Krebstherapie. Außerdem könnte die Demethylase-Aktivität von großem Nutzen für die Behandlung von methylierten DNA-Proben sein, welche für molekulare Analysen, wie z. B. Restriktionskartierung oder Klonierungen benützt werden sollen.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auch auf poly- oder monoklonale, gegen DNA-MeTase oder Demethylase gerichtete Antikörper und den Gebrauch solcher Antikörper als therapeutische Agenzien.
Darüber hinaus bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf die Benutzung von allgemeinen oder spezifischen DNA-MeTase-Inhibitoren als therapeutische Agenzien gegen Krebs.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt ein für DNA-MeTase-mRNA-Sequenzen spezifisches Antisense-Oligonukleotid das spezifische therapeutische Agens gegen Krebs dar. Wenn Tumorsuppressorloci durch Hypermethylierung reprimiert werden und die Demethylierung zur Aktivierung von Genen führt, die für Tumorstimulatoren kodieren und somit zur Induktion der Tumorgenese beitragen, dann wird der Beginn der Antisense-Therapie gegen die DNA-Methyltransferase in einer Reduktion der DNA-MeTase-Aktivität, der Demethylierung und der Reaktivierung von Tumorsuppressorgenen resultieren. Die Produkte dieser Gene werden den durch die tumorstimulierenden Gene induzierten tumorigenen Effekt hemmen, und auf diese Weise wird die Hemmung der Hypermethylierung auch die Auswirkungen der Hypermethylierung hemmen.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist es jetzt möglich, basierend auf der Kristallstruktur der Hhal-Methylase (Koomar et al., 1994, Nucl. Acids. Res. 22: 1-10), die eine detaillierte Atomstruktur der DNA-Methyltransferase zeigt, hochspezifische Antagonisten zu entwerfen. Diese neuartigen Antagonisten können potentielle Kandidaten für die Krebs- und die Geninduktionstherapie darstellen. Der mögliche Vorteil der DNA-MeTase-Therapie gegenüber anderen Chemotherapieansätzen besteht darin, daß sie eher gegen einen potentiellen Regulator des Krebsstadiums gerichtet ist als gegen eine unspezifische proliferative Funktion. Die DNA-MeTase-Inhibitoren können somit einen neuen Therapieansatz bieten, der auf die Regulation der genetischen Information gerichtet ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann durch den Gebrauch der Antisense- Therapie die Umkehrung des tumorigenen Phänotyps einer Zelle beobachtet werden.
In der Beschreibung und den beigefügten Patentansprüchen soll die Antisense-Bezeichnung folgendermaßen interpretiert werden: als DNA- oder RNA-Molekül, welches komplementär ist zur mRNA oder zu einem der beiden DNA-Stränge, gegen die es gerichtet ist. Dieses Antisense-Molekül kann dabei eine komplementäre Version der vollständigen Länge der Zielsequenz darstellen, oder ein Fragment daraus oder ein davon abgeleitetes Oligonukleotid. Das Antisense-Molekül kann durch biotechnologische Methoden oder durch chemische Synthese gewonnen werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 stellt dar, daß DNA-MeTase- und Demethylase-Aktivitäten das Muster der DNA- Methylierung in Tumorzellen bestimmen;
Fig. 2A zeigt die Plasmide pZEM und pZαM. Der Metallothionin (MT)-Promotor (schattierter Kasten), die 3'-Region des humanen Wachstumshormons (HGH) (offener Balken) und die MeTase-cDNA-Sequenzen (gestrichelt) sind angezeigt;
Fig. 2B zeigt eine Southern Blot-Analyse zur Überprüfung der Anwesenheit der transfizierten Plasmide in den Transfektanten;
Fig. 2C zeigt eine Northern Blot-Analyse der positiven Klone, welche die erwartete chimäre 1,3 kb mRNA exprimieren. Gesamt-RNA (5 ug) wurde aus drei pZαM-Linien (7 und 9) und aus pZEM isoliert;
Fig. 3A, B zeigen den Status der Methylierung von vollständiger genomischer DNA in Y1pZαM-Transfektanten durch die "nearest neighbour"-Analyse von 2 ug DNA eines pZαM- Transfektanten (4) und einer pZEM-Kontrolle. Fig. 3A zeigt ein Autoradiogramm einer repräsentativen TLC-Platte. Die Standardspur stammt von in vitro synthetisierter hemimethylierter M13-DNA. Fig. 3B zeigt Szintillationszählungen von Spots, welche C- und 5-Methyl-C entsprechen. Die Werte stellen Mittelwerte ± Standardabweichung dar;
Fig. 3C-F zeigen Southern Blot-Analysen nach MspI/HpaII-Verdau (M/H) der DNA. Sie zeigen den Status der Methylierung von spezifischen Genen in den Y1 pZαM-Transfektanten: C: die C21 5'-Region, D: das C21-Gen, E: das Retinoblastom (Rb)-Gen und F: das p53-Gen. In den Fig. 3C-E zeigen die offenen Pfeile jeweils die Position der demethylierten Fragmente an.
Fig. 4A-C zeigen die morphologische Transformation und das reduzierte Substrat-unabhängige Wachstum von Y1-Zellen, die mit pZαM transfiziert sind. Fig. 4A zeigt ein 200fach vergrößertes phasenkontrastmikroskopisches Bild von lebenden Kulturen von klonalen Y1- Transfektanten mit pZαM- und Y1-Kontrollen. Fig. 4B zeigt Bilder einer 10fach vergrößerten phasenkontrastmikroskopischen Ansicht eines 21 Tage alten Soft-Agar-Assay von Y1 pZEM-Zellen (Klone 4 und 7) und Y1 pZαM-Transfektanten (Klone 4, 7 und 9). Fig. 4C zeigt einen Substrat-unabhängigen Wachstums-Assay: Y1 pZEM (Klone 4 und 7) und Y1pZαM- Transfektanten (Klone 4, 7 und 9) nach 21 Tagen Wachstum in Soft-Agar;
Fig. 5A-B zeigen die in vivo-Tumorigenität von Y1pZαM-Transfektanten. Fig. 5A zeigt die Fähigkeit zweier Kontrollinien (Y1 und pZEM4) und von drei Y1pZαM-Transfektanten (4, 7 und 9) in LAF-1-Mäusen Tumoren zu bilden, als auch den Grad der Neovaskularisation in diesen Tumoren. Fig. 5B zeigt Photographien der homogenisierten Tumore;
Fig. 6A-B stellen Northern Blot-Analysen dar, welche den Verlust der Antisense-Expression in Tumoren, die von Y1pZαM-Transfektanten abgeleitet sind, zeigen. Das 1.3 kb Antisense- Transkript ist nur in der ursprünglichen Zellinie pZαM 7 (dunkler Pfeil) zu sehen und ist in Tumoren, welche von den pZαM 7- oder Y1-Zellinien abstammen, nicht zu detektieren. Eine Kontrolle für die geladene RNA-Menge ist ebenfalls dargestellt. Fig. 6b zeigt die relative Expression des Antisense-Moleküls, abgeglichen zur Expression des 18S-Signals;
Fig. 7A zeigt einen Dichte-beschränkten Wachstums-Assay von Y1 pZαM im Vergleich zu Kontroll-pZEM-Transfektanten;
Fig. 7B zeigt den Prozentsatz an lebensfähigen Zellen, bestimmt durch eine Trypanblau- Färbung nach Serumentzug (1% Pferdeserum);
Fig. 7C zeigt eine Southern-Analyse vollständiger zellulärer DNA der angezeigten Transfektanten nach Wachstum im Medium, welches 1% Serum enthielt. Die Zellernte erfolgte nach 1 und 2 Tagen. Nur in den Y1pZdM-Transfektanten ist eine 130 bp internukleosomale Leiter zu sehen, welche charakteristisch für Zellen ist, die via Apoptose sterben;
Fig. 7D zeigt eine elektronenmikroskopische Analyse von verschiedenen Zellsektionen (I-V) von Y1-Transfektanten nach 24 Stunden Wachstum der Zellen in Medium mit 1% Serum.
Fig. 8A-D zeigen die Auswirkung der Behandlung von Y1-Zellen mit 5-azaCdR (0-10 uM).
Fig. 8A zeigt den Anteil von unmethylierten Cytosinen in der Dinukleotidsequenz CpG, bestimmt durch eine "nearest neighbour"-Analyse. Fig. 8B zeigt den Effekt von 5-azaCdR auf die Lebensfähigkeit von Zellen nach Wachstum in Medium mit niedriger Serumkonzentration (1%). Fig. 8C zeigt das Substrat-unabhängige Wachstum in Soft-Agar (ohne 5- azaCdR). Fig. 8D zeigt die Anzahl von Kolonien nach 5-azaCdR-Behandlung.
Fig. 9 stellt die Regulationsmechanismen des DNA-MeTase-Promotors, der die DNA-Methylierungsmuster und die zelluläre Transformation bestimmt, dar.

Durchführung der Erfindung

Es wurde bereits vorhergehend gezeigt, daß die gerichtete Expression einer AntisensemRNA zu den äußersten 5'-gelegenen 600 bp des DNA-MeTase-Transkripts (pZαM) limitierte DNA-Demethylierung in 10 T 1/2 Zellen induzieren kann (Szyfet al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 12831-12836). Zur direkten Überprüfung der Hypothese, daß die Tumorigenität von Y1-Zellen durch die DNA-MeTase kontrolliert wird, wurden Y1-Zellen entweder mit pZαM oder einer pZEM-Kontrolle transfiziert.

I. Die Expression eines Antisense-Moleküls zum DNA-Methyltransferase-Gen in Y1-Zellen resultiert in limitierter DNA-Demethylierung.

Um die DNA-Methylierung in Y1-Zellen direkt zu inhibieren, wurden das DNA-MeTase-Antisense-Expressionskonstrukt pZαM oder ein pZEM-Kontrollvektor (Szyfet al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 12831-12836) durch DNA-vermittelten Gentransfer in Y1-Zellen eingebracht. Y1-Zellen wurden als Einschicht-Zellkulturen in F-10-Medium gehalten, welches 7,25% hitzeinaktiviertes Pferdeserum und 2,5% hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum (Immunocorp, Montreal) enthielt. Alle weiteren Medien und Reagenzien für die Zellkultur wurden von GIBCO-BRL bezogen. Y1-Zellen (1 · 10&sup6;) wurden 15 Stunden vor der Transfektion in 150 mm Zellkulturschalen (Nung) plattiert. Der pZαM-Expressionsvektor, der für den 5'-Bereich der murinen DNA-MeTase-cDNA (10 ug) kodiert, wurde zusammen mit 1 ug pUCSVneo als selektierbarer Marker durch DNA-vermittelten Gentransfer nach dem Calciumphosphat- Protokoll (Ausubel et al., 1988, In Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, New York) in Y1-Zellen eingebracht. 48 Stunden nach der Transfektion wurde die Selektion durch die Zugabe von 0,25 mg/ml G418 (GIBCO-BRL) zum Medium gestartet. G418-resistente Zellen wurden in selektivem Medium kloniert. Zur Analyse des Wachstums in Soft- Agar wurden 1 · 10³ Zellen im Dreifachansatz auf 30 mm Zellkulturschalen (Falcon) in 4 ml F- 10-Medium, das 7,5% Pferdeserum, 2,5% FCS, 0,25 mg/ml G418 (für die Transfektanten) und 0,33% Agarlösung enthielt, bei 37ºC (Freedman et al., 1974, Cell 3: 355-359) ausgesät. Die Zellen erhielten alle 2 Tage 2 ml Medium plus G418. Wachstum wurde in Form von Kolonien bewertet, die 21 Tage nach dem Ausplattieren mehr als 10 Zellen enthielten.
G418-resistente Kolonien wurden isoliert und für beide Konstrukte vermehrt. Zur Bestätigung, daß die Transfektanten das eingebrachte Konstrukt tragen, isolierten wir DNA von den Transfektanten und führten einen Verdau mit entweder MspI oder HpaII, eine Southern Blot- Analyse und Hybridisierung mit einem 32P-markierten 0,6 kb DNA-MeTase-cDNA-Fragment (Fig. 2A) durch. Die Isolierung der genomischen DNA und alte anderen Standard-Techniken der Molekularbiologie wie z. B. die Markierung (mit dem Random Primer Labelling Kit von Boehringer Mannheim) wurden nach Ausubel et al., 1988, In Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, New York, durchgeführt. Die Restriktionsenzyme MspI und HpaII (Boehringer Mannheim) wurden in einer Konzentration von 2,5 Einheiten/ug 8 Stunden bei 37ºC der DNA zugegeben. Radionukleotide (3000 mCi/mmol) wurden von Amersham bezogen. Die Ergebnisse in Fig. 2B zeigen, daß die drei pZαM-Transfektanten signifikante Spiegel der DNA-MeTase-cDNA-Sequenz enthielten, während die Kontrolltransfektanten davon frei waren. Um zu testen, ob das pZαM-Konstrukt in den Transfektanten exprimiert wird und ob der Metallothionin-Promotor in diesen Zellen funktionell ist, kultivierten wir die Transfektanten mit 50 uM ZnSO&sub4;, isolierten zu unterschiedlichen Zeitpunkten RNA, führten eine Northern Blot-Analyse durch und hybridisierten mit der ³²P-markierten MET 0,6-Sonde. Die Isolierung der vollständigen zellulären RNA, das Blotting der RNA auf die Hybond- N+Membran (Amersham) wurden gemäß Ausubel et al. (1988, In Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, New York) durchgeführt. Wie in Fig. 2C dargestellt, exprimieren die Transfektanten 7 und 9 schon vor der Induktion durch ZnSO&sub4; substantielle Mengen der MET 0,6-cDNA (~1,3 kb chimäre mRNA). Die ZnSO&sub4;-Induktion erhöht die relative Intensität einer 1.3 kb-RNA, die mit MET 0.6 hybridisiert. Dies könnte bedeuten, daß ZnSO&sub4; die Transkriptions-Initiation von einer bestimmten Stelle aus, aber nicht die vollständige Expression des Antisense-Transkripts induziert (dies führt zu einem Schmier in den nichtinduzierten RNA-Proben). In nachfolgenden Experimenten wurde daher die Induktion der Transfektanten mit ZnSO&sub4; nicht durchgeführt.
Um zu bestimmen, ob die Expression der Antisense-RNA zum DNA-MeTase-Gen zu einer allgemeinen Reduktion im Methylierungsstatus des Genoms führt, führten wir eine "nearest neighbour"-Analyse mit [α-³²P]-dGTP wie zuvor beschrieben durch. Dieser Versuchsansatz ermöglicht es, den Prozentsatz von methylierten Cytosinen in der Dinukleotidsequenz CpG zu bestimmen (Razin et al., 1985 In Biochemistry and Biology of DNA methylation, Seite 239, Razin et al., (Hrsg.), Allan R. Liss, Inc., N. Y.). Kurz gesagt, wurden 2 ug DNA bei 37ºC 15 Minuten mit 0,1 Einheiten DNAse, 2,5 ul 32P-a-dGTP (3000 mCi/mmol, Amersham) inkubiert. Dann wurden 2 Einheiten Kornberg-DNA-Polymerase (Boehringer) zugegeben, und die Reaktion zusätzliche 25 Minuten bei 30ºC inkubiert. 50 ul Wasser wurden zugegeben und die nicht-inkorporierten Nukleotide durch Zentrifugation durch eine Microcon®-Säule (Amicon) bei Höchstgeschwindigkeit 30 Sekunden entfernt. Die markierte DNA (20 ul) wurde mit 70 ug mikrokokaler Nuklease (Pharmacia) in dem vom Hersteller empfohlenen Puffer 10 Stunden bei 37ºC verdaut. Gleiche Mengen an Radioaktivität wurden auf TLC-Phosphocellulose-Platten (Merck) geladen und die 3'-Mononukleotide durch eindimensionale Chromatographie aufgetrennt (Iso-buttersäure : H&sub2;O : NH&sub4;OH im Verhältnis 66 : 33 : 1). Die Chromatogramme wurden mit XAR®-Filmen (Eastman-Kodak) belichtet. Spots, die Cytosin und 5- Methylcytosin entsprachen, wurden abgekratzt und in einem 13-Szintillationszähler gezählt.
Die Transfektanten und die Kontroll-DNAs wurden mit DNAseI "genickt" und mit einem einzelnen Nukleotid [α-³²P]-dGTP durch die DNA-Polymerase I "nick"-transfatiert. Markierte DNA wurde durch die mikrokokkale Nuklease zu 3'-Mononukleotidphosphaten verdaut, welche DNA im 3'-Bereich vom eingebrachten α-³²P spaltet. Die [α-³²P]-markierten 5'-Nachbarn des dGMPs wurden durch Chromatographie auf einer TLC-Platte aufgetrennt. Die resultierenden Spots für dCMP Und dCmetMP wurden abgekratzt und durch Flüssigszintillation gezählt. Die Ergebnisse eines Experiments im Dreifachansatz, die in Fig. 3A (Autoradiogramm der Proben) und B (graphische Darstellung) dargestellt sind, zeigen, daß in den Transfektanten, welche das pZαM-Konstrukt exprimieren, verglichen mit der Kontrollinie pZEM eine beschränkte, aber signifikante Reduktion im Gesamtspiegel der DNA-Methylierung (12% bei Transfektant Nr. 4 und 22% bei 7) stattgefunden hat.

II. Demethylierung von spezifischen Genen in Y1 pZαM-Transfektanten.

Zur weiteren Überprüfung, daß die Expression von pZαM zu Demethylierung führt und um zu bestimmen, ob spezifische Gene demethyliert wurden, führten wir eine HpaII/MspI- Restriktionsenzym Analyse durch, welche von Southern Blotting und Hybridisierung mit spezifischen Gensonden gefolgt wurde. HpaII spaltet die Sequenz CCGG, eine Untergruppe der CpG-Dinukleotidsequenz nur dann, wenn diese Stelle im Genom unmethyliert vorliegt, während MspI die gleiche Sequenz unabhängig von ihrem Methylierungsstatus schneiden wird. Durch den Vergleich des Musters nach HpaII-Spaltung von spezifischen Genen in Zellen, die pZαM exprimieren, mit dem Muster in parentalen Y1-Zellen oder Zellen, die nur einen Vektor tragen, kann bestimmt werden, ob die Gene in den Antisense-Transfektanten demethyliert sind. Der Status der Methylierung des Steroid 21-Hydroxylase-Gens C21 (Szyfet al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6853-6857 und Szyfet al., 1990, Mol. Endocrinol. 4: 1144- 1152) wurde zuerst analysiert. Dieses Gen, das im adrenalen Kortex spezifisch exprimiert und hypomethyliert ist, liegt in Y1-Zellen inaktiviert und hypermethyliert vor. Vorausgehend wurde vorgeschlagen, daß die Hypermethylierung von C21 in Y1-Zellen ein Teil des Transformationsprogramms ist, welches das Abschalten bestimmter differenzierter Funktionen einschließt. DNA von Y1, pZαM und pZEM-Transfektanten (Bernards et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6474-6478) wurde entweder mit MspI oder HpaII verdaut. Anschließend wurden eine Southern Blot-Analyse und eine Hybridisierung mit einem 0,36 kb XbaI-BamHI- Fragment, das die Enhancer- und Promotor-Regionen des C21-Gens enthält, durchgeführt (vgl. Referenzen in Szyfet al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6853-6857 und Szyfet al., 1990, Mol. Endocrinol. 4: 1144-1152, physikalische Karte der Sonde). Diese Sonde sollte, wenn die Promotor-Region vollständig demethyliert ist, 0,36 kb und 0,16 kb HpaII- Fragmente detektieren. Die Promotor- und die Enhancer-Region ist in den Y1-Zellen und den pZEM-Transfektanten stark methyliert, wie durch die Anwesenheit von partiellen HpaII- Fragmenten mit höherem Molekulargewicht bei 3,8 kb und 2 kb und durch die Abwesenheit jeglicher Fragmente mit niedrigerem Molekulargewicht gezeigt wird (Fig. 3C). Im Gegensatz dazu enthalten die Y1pZαM-Transfektanten eine partiell demethylierte C21 5'-Region, wie durch die relative Verminderung der 3,8 kb und der 2 kb-Fragmente und durch das Auftreten vollständig demethylierter schwacher Banden bei 0,36 kb angezeigt wird. Die Tatsache, daß die Spaltung mit HpaII zu partiellen Fragmenten bei 0,56 kb und -1 kb führt, zeigt außerdem die partielle Hypomethylierung von Regionen stromaufwärts und stromabwärts von der Enhancer-Region an (Fig. 3C). Um zu bestimmen, ob die Hypomethylierung auf die Enhancer-Region beschränkt war oder ob sie sich durch den C21-Genlocus hindurch erstreckt, wurde ein ähnlicher HpaII-Verdau und ein Southern Blot-Transfer mit verschiedenen Präparationen von DNA aus Y1-Zellen durchgeführt. DNA einer Kontroll-pZEM-Transfektante (Bernards et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6474-6478) und von drei pZαM-Antisense-Transfektanten (Fig. 3D) wurde auf dem Filter mit einem 3,8 kb BamHI-Fragment hybridisiert, welches den Korpus des C21-Gens und 3'-Sequenzen enthielt. Die komplette Demethylierung dieser Region sollte bei -1 kb eine Doppelbande, ein 0,8 kb-Fragment und ein 0,4 kb-Fragment und daneben eine Anzahl von Fragmenten zwischen 0,1 kb bis 0,2 kb mit niedrigem Molekulargewicht ergeben. Wie in Fig. 3D gezeigt, ist der C21-Locus sowohl in den Y1-Zellen als auch in den Kontroll-Transfektanten stark methyliert, wie durch die Fragmente mit hohem Molekulargewicht oberhalb von 23 kb gezeigt wird. In der erwarteten Spanne von 1 kb Molekulargewicht ist nur eine schwache Bande sowie eine partielle Bande bei 1,9 kb anwesend (Fig. 3D). DNA der Antisense-Transfektanten zeigt sowohl eine relative Verminderung der Fragmente mit hohem Molekulargewicht und auch eine relative Verstärkung des partiellen Fragments bei 1,9 kb als auch das Auftreten neuer partieller Fragmente im Bereich des niedrigeren Molekulargewichts zwischen 1 kb und 0,4 kb. Dies zeigt die partielle Hypomethylierung einer großen Anzahl von HpaII-Stellen an, welche in der 3'-Region des C21-Gens vorhanden sind. Das Muster der Demethylierung, wie es durch die große Anzahl von partiellen HpaII-Fragmenten angezeigt wird (Fig. 3D), stimmt eher mit einer allgemeinen partiellen Hypomethylierung als mit dem spezifischen Verlust der Methylierung in einer bestimmten Region des C21-Gens überein.
Um zu bestimmen, ob die Demethylierung auf Gene beschränkt ist, die in Y1-Zellen exprimiert werden können, wie das adrenale Kortex-spezifische C21-Gen, oder ob die Demethylierung im Genom weitläufig verteilt ist, wurden auch andere Gene wie das Muskelspezifische MyoD-Gen sowie das Hippocampus-spezifische 5HTIA-Rezeptorgen analysiert. Die Hypomethylierung beider Gene konnte gezeigt werden. Eine weitere Klasse von Genen, bei denen eine spezifische Hypomethylierung stattgefunden haben könnte, umfaßt die Tumorsuppressorgene. Deshalb wurde der Status der Methylierung zweier Gene dieser Klasse, p53 und Retinoblastom (Rb), die beide zu den Tumorsuppressorgenen gehören, die an der Zellzyklusregulation beteiligt sind, bestimmt. Es wurde bereits gezeigt, daß der Verlust eines dieser beiden Genprodukte zur Deregulation des Zellzyklus und zur Neoplasieentstehung führt.
Oligo-Primer für die 5'-Region des murinen p53-Gens wurden anhand der veröffentlichten genomischen Sequenz (Hinterlegungsnummer: X01235) unter Verwendung des "Primer selecting program" (PC Gene®) ausgewählt. Der 5'-Primer (entsprechend den Basen 154- 172: 5' TLC GAA TCG GTT TLC ACCC 3') und der 3'-Primer (entsprechend den Basen 472- 492, 5' GGA GGA TGA GGG CCT GAA TGC 3') wurden zu einem Amplifikationsreaktions- Mix, der 100 ng murine DNA (aus C2C12-Zellen) enthielt, zugegeben. Die DNA wurde in 40 Zyklen von 2 Minuten bei 95ºC, 2 Minuten bei 55ºC und 0.5 Minuten bei 72ºC anhand der Inkubationsbedingungen, die vom Hersteller empfohlen waren (Amersham Hot tub®; 1.5 mM MgCl&sub2;) amplifiziert. Die Reaktionsprodukte wurden auf einem Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt aufgetrennt (GIBCO-BRL), die der erwarteten Größe entsprechenden Bande ausgeschnitten und nach Standardprotokollen extrahiert (Ausubel et al., 1988, In Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, New York).
Da die genomische Sequenz des murinen Rb-Gens durch die Genbank nicht erhältlich war, führten wir eine reverse Transkription der Retinoblastom-mRNA aus 0.5 ug vollständiger muriner RNA (aus C2C12-Zellen) unter Verwendung von Random Oligonukleotid-Primern (Boehringer) mit der Superscript® reverse Transkriptase (GIBCO-BRL) unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen durch. Die Rb-Sequenz wurde aus der revers transkribierten cDNA durch Oligonukleotide amplifiziert, welche den Basen 2-628 der publizierten cDNA entsprachen (Bernards et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6474-6478). Als Oligo-Primer wurden 5' GGA CTG GGG TGA GGA CGG 3(1-18) und 5' TTT CAG TAG ATA ACG CAC TGC TGG 3' (620-610) verwendet. Die Amplifikationsbedingungen entsprachen den bereits oben beschriebenen.
Der Spiegel der Methylierung des Rb-Gens in mit einem Kontrollvektor transfizierten Y1- Zellen und in den pZαM-Transfektanten wurde unter Benützung einer Sonde gegen eine 300 bp lange Sequenz der 5'-Region der murinen RB-cDNA bestimmt (Fig. 3E). Die Spaltung dieser Region mit HpaII erzeugt 0,6 kb und 0,1 kb-Fragmente (Fig. 3E). Die Hybridisierung der Probe an Fragmente mit hohem Molekulargewicht zeigt an, daß der Rb-Locus in den Kontrollzellen stark methyliert ist. In den pZαM-Transfektanten ist der Locus partiell hypomethyliert. Dies zeigt sich durch die relative Verminderung der Intensität der Fragmente mit hohem Molekulargewicht, durch das Auftreten zahlreicher Fragmente zwischen 23 kb und 0,6 kb und dem Auftreten der demethylierten Fragmente bei 0,6 kb und -0,1 kb.
Der p53-Locus wurde mit einem 0.3 kb-Fragment als Probe untersucht, welches von der 5'- Region 300 bp stromaufwärts zur Initiations-Stelle abstammt (Fig. 3F). Die Spaltung der p53-Loci (das murine Genom enthält zwei p53-Gene) mit MspI führt zu Fragmenten im Molekulargewichtsbereich von 4,4, 2,5, 0,56 und 0,44 kb (Fig. 3F, erste Spur). Die Spaltung der Kontroll-Y1 pZEM-Transfektanten zeigt, daß nur die Stellen im Genom, die die 0,56 kb- Fragmente flankieren, in den Y1-Zellen demethyliert sind. Der Rest des Locus ist stark methyliert, wie durch die Intensität des Signals im Bereich von > 4,4 kb gezeigt wird (Fig. 3F, Spuren 2-4). Im Vergleich zu den Kontrolltransfektanten ist das p53-Gen in den Y1-Zellen, die ein Antisense-Molekül zur DNA-MeTase exprimieren, partiell hypomethyliert. Dies zeigt sich in der relativen Abnahme der Intensität der Fragmente mit hohem Molekulargewicht oberhalb 4,4 kb und in dem Auftreten des 4,4 kb-HpaII-Fragments, dem partiell gespaltenen HpaII-Fragment bei 4 kb, dem schwachen partiellen Fragment bei etwa 3,5 kb und dem schwachen Fragment bei 2,5 kb (Fig. 3F, die letzten drei Spuren). Diese Ergebnisse unterstützen weiterhin die Schlußfolgerung, daß die Expression eines Antisense-Moleküls zur DNA-MeTase zu einer Genom-weiten partiellen Hypomethylierung führt. Keines der untersuchten Gene zeigt deutliche Selektivität bei der Demethylierung.

BEISPIEL 1

Morphologische Transformation und Verlust des Substrat-unabhängigen Wachstums der Y1-Zellen, die ein Antisense-Molekül zur DNA-MeTase exprimieren

Um zu bestimmen, ob die durch das DNA-MeTase-Antisense-Konstrukt induzierte Demethylierung zur Veränderung der Wachstumseigenschaften von Krebszellen führt, wurden die Charakteristika des Wachstums und der Morphologie der pZαM-Transfektanten mit denen der Kontrollen verglichen. Zum Vergleich der Wachstumskurve der pZαM-Transfektanten und der Kontrollen wurden 5 · 10&sup4; Y1-pZEM- und pZαM-Transfektanten (4 und 7) im Dreifachansatz plattiert. Die Zellen wurden geerntet und an den angegebenen Zeitpunkten gezählt (Fig. 7A). Die Ergebnisse dieses Experiments zeigen, daß die Antisense-Transfektanten die Sättigungsdichte bei niedrigeren Konzentrationen erreichen als die Kontrollzellen. Dies könnte bedeuten, daß die Transfektanten die Kontaktinhibition zurückgewonnen haben, eine Eigenschaft, die in Krebszellen verloren gegangen ist. Die morphologischen Eigenschaften der Y1 pZαM-Transfektanten unterstützen diese Schlußfolgerung zusätzlich (Fig. 4A). Während die Kontroll-Y1- und Y1 pZEM-Zellen eine beschränkte Kontaktinhibition zeigen und mehrschichtige Foci bildeten, zeigen die Y1-pZαM-Transfektanten eine mehr abgerundete und klare Morphologie und wachsen ausschließlich einschichtig (Fig. 4A).
Um zu bestimmen, ob die Expression eines Antisense-Moleküls zur DNA-MeTase in einer Umkehrung des tumorigenen Potentials resultiert, wurde die Fähigkeit der Transfektanten, in einer Substrat-unabhängigen Art zu wachsen, die als ein Indikator für Tumorigenität betrachtet wird, bestimmt. Die Y1 pZαM-Transfektanten zeigen den fast vollständigen Verlust der Fähigkeit, in Soft-Agar Kolonien zu bilden, und darüber hinaus enthalten die sich bildenden Kolonien nur sehr wenige Zellen, wie in Fig. 4B gezeigt wird. Das Wachstum auf Soft-Agar wurde durch visuelle Untersuchung quantifiziert und in Fig. 4C graphisch dargestellt.
Diese Experimente zeigen, daß die Inhibition der DNA-Methylierung durch die Expression eines Antisense-Moleküls zur DNA-MeTase in vitro zum Verlust der Tumorigenität führt.

BEISPIEL 2

Y1-Zellen, die ein Antisense-Molekül zur DNA-MeTase exprimieren, zeigen verminderte Tumorigenität in vivo

Um zu bestimmen, ob die Demethylierung in vivo zu einer Hemmung der Tumorgenese führen kann, erhielten LAF-1-Mäuse (6-8 Wochen alte Männchen) eine subkutane Injektion (in den Bereich der Flanken) von je 106 Zellen von Y1-pZαM, Y1- und Y1-pZEM-Transfektanten. Die Mäuse wurden durch tägliches Abtasten auf die Anwesenheit von Tumoren überprüft. Mäuse mit Tumoren, die größer als 1 cm im Durchmesser waren, wurden durch CO&sub2; Begasung getötet, die Tumoren wurden entfernt und in Guanidium-isothiocyanat homogenisiert. Tumorfreie Mäuse wurden 90 Tage gehalten und dann abgetötet. Tumor-RNA wurde durch CsCl&sub2;-Dichtegradientenzentrifugation nach Ausubel et al., 1988, In Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, New York, isoliert. Während sich nach Injektion von Y1- Zellen in allen Tieren zwei bis drei Wochen nach der Injektion Tumoren bildeten, war die Rate der Tumorbildung in den Tieren nach Injektion der pZαM-Transfektanten signifikant niedriger (Fig. 5A; p> 0,005).
Viele Hinweise zeigen darauf hin, daß das angiogene Potential und das Potential zur Metastasierung von Zellinien direkt verbunden sind. Tumoren, die von pZαM-Transfektanten abstammen, zeigen eine sehr begrenzte Neovaskularisation (Fig. 5B), während Tumoren, die sich in den Tieren nach Injektion von Y1-Zellen oder Kontroll-Transfektanten gebildet hatten, hoch vaskularisiert waren (Fig. 5B). Dieser Unterschied in der Neovaskularisation zeigt sich in der blassen Farbe der Tumorhomogenate, die aus Tieren entfernt wurden, die eine Injektion von Y1-pZαM-Transfektantenzellen erhalten haben, im Vergleich zu den sehr dunklen Homogenaten der Tumoren, die von Kontrollinien (Y1 und Y1 pZEM; Fig. 5B) abstammen.
Eine geringe Anzahl von Tumoren bildete sich auch in Tieren, welchen pZαM-Transfektanten injiziert wurden. Eine mögliche Erklärung dafür ist, daß die Transfektanten von Revertanten abgeleitet sind, die die Expression des Antisense-Moleküls zur DNA-MeTase unter dem in vivo-Selektionsdruck verloren haben. Diese Hypothese wurde folgendermaßen überprüft: aus einem von einer Y1pZαM-Transfektante abstammendem Tumor wurde RNA isoliert und mit dem Spiegel der Expression des 0,6 kb-Antisense-Transkripts, welche für diese transfektante Linie in vitro beobachtet wurde, verglichen. Mit den isolierten RNAs wurde eine Northern Blot-Analyse und eine Hybridisierung mit einem ³²P-markierten MET 0,6-Fragment durchgeführt. Zur Entfernung der Radioaktivität wurde der Filter "gestrippt" und mit einer ³²P- markierten Oligonukleotidsonde für 18S rRNA (Fig. 6A), die bereits zuvor beschrieben wurde (Szyfet al., 1990, Mol. Endocrinol. 4: 1144-1152), rehybridisiert. Die Autoradiogramme wurden gescannt und der Expressionsspiegel von MET 0,6 relativ zu dem mit der 18S-Probe erhaltenen Signal bestimmt (Fig. 6B). Die Expression des Antisense-Transkripts ist in den Tumoren signifikant reduziert. Dies unterstützt die Hypothese, daß die Expression eines Antisense-Transkripts zur DNA-MeTase mit der Tumorgenese nicht in Einklang steht.

BEISPIEL 3

Die Expression von pZαM in Y1-Zellen führt zur Induktion eines apoptotischen Zelltod-Programms nach Serum-Entzug

Tumorzellen zeigen eine beschränkte Abhängigkeit von Serum und sind gewöhnlich zu Serum-unabhängigem Wachstum fähig. Im Serum anwesende Faktoren sind für das Überleben vieler nicht-tumorigener Zellen essentiell. Verschiedene Hinweise haben kürzlich nahegelegt, daß die erhöhte Überlebensrate tumorigener Zellen mit der Hemmung des programmierten Zelltods assoziiert ist. So ist z. B. das Onkogen bcl-2 nicht ein Stimulator der Zellproliferation, sondern eher ein Inhibitor der Apoptose. Der Tumorsuppressor p53 kann in einer Linie, die von einem humanen Kolon-Tumor abgeleitet ist, Apoptose induzieren. Bei einigen chemotherapeutischen Agenzien wurde gezeigt, daß sie in Krebszellen Apoptose induzieren. Aufgrund der verstärkten Abhängigkeit von Serum und der beschränkten Überlebensfähigkeit der pZαM-Transfektanten unter Serumentzug, wurde die Möglichkeit untersucht, ob die Demethylierung ein apoptotisches Programm in den Y1-Zellen induzieren kann. Da bestimmte Faktoren im Serum dafür bekannt sind, als Überlebens-Faktoren für Zellen zu wirken, könnte ein apoptotisches Programm nur bei Entfernung dieser Faktoren aktiviert werden. Um zu überprüfen, ob die pZαM-Transfektanten unter Serumentzug den programmierten Zelltod eingehen, wurden die Auswirkungen des Serumentzugs in diesen Transfektanten untersucht. pZαM-Transfektanten und Kontroll-Y1-pZEM-Transfektanten (3 · 10&sup5; pro Vertiefung) wurden in Medium mit geringer Serumkonzentration (1% Pferdeserum) in 6- Loch-Platten plattiert, alle 24 Stunden geerntet und durch Trypanblau-Färbung auf Lebensfähigkeit getestet (Fig. 7B). Während die Kontrollzellen nahezu 100% Lebensfähigkeit bis zu 72 Stunden nach dem Transfer in das Serumentzugs-Medium zeigten, war in den Y1 pZαM- Zellen ein bis zu 75%iger Verlust der Lebensfähigkeit nach 48 Stunden zu erkennen (Fig. 7B).
Der schnelle Eintritt des Absterbens der Y1 pZαM-Klone unter Serumentzugs-Bedingungen weist darauf hin, daß ein aktiver Prozeß beteiligt ist. Einige beobachtbare Veränderungen unterscheiden die Apoptose von der Nekrose: die Apoptose ist ein aktiver Prozeß, der de novo-Proteinsynthese erfordert; die Apoptose ist, im Gegensatz zur Nekrose, bei der größere Gebiete des Gewebes absterben, mit dem Tod isolierter Zellen assoziiert; Zellen, die durch Apoptose absterben, rufen keine Immunantwort hervor; und die wichtigste diagnostische Eigenschaft der Apoptose ist das DNA-Degradationsmuster apoptotischer Zellen (Ellis et al., 1991, Annu. Rev. Cell Biol. 7: 663-698). DNA aus Zellen, die durch Apoptose abgestorben sind, zeigt im allgemeinen bei der Analyse durch Gelelektrophorese eine charakteristische Leiter, da Ca²&spplus;/Mg²&spplus;-abhängige Endonukleasen die DNA an internukleosomalen Regionen spalten (Ellis et al., 1991, Annu. Rev. Cell Biol. 7: 663-698). Obwohl das Auftreten einer 180 bp-internukleosomalen Leiter ein diagnostisches Merkmal des apoptotischen Todes ist, werden andere morphologische Veränderungen, wie die Kondensation des Chromatins, die Fragmentierung der Zelle und die Bildung von apoptotischen Körperchen allgemein als frühere Ereignisse im apoptotischen Prozeß betrachtet und dienen daher ebenfalls als nützliche Marker. Um zu überprüfen, ob die Y1-pZαM-Zellen unter Serumentzug im Zuge eines aktivierten apoptotischen Absterbe-Programms sterben, wurden die Zellen in Serumentzugs-Medium (1% Pferdeserum) plattiert und in Intervallen von 24 Stunden geerntet. Aus den Zellen wurde vollständige zelluläre DNA isoliert und auf einem 1,5%igen Agarosegel durch Elektrophorese aufgetrennt. Anschließend folgte der Transfer auf eine Nylonmembran und Hybridisierung mit zufällig markierter Y1-genomischer DNA. Nach 48 Stunden unter Serumentzug zeigen pZαM-Transfektanten die charakteristische 180 bp internukleosomale DNA-Leiter, während die Kontroll-pZEM-Transfektanten zu diesem Zeitpunkt keine Apoptose zeigen (Fig. 7C).
Zum Nachweis, ob Zellen, die ein Antisense-Molekül zur DNA-MeTase exprimieren, die frühen morphologischen Marker der Apoptose zeigen, wurde den Zellen für 24 Stunden das Serum entzogen (2% Pferdeserum), die Zellen geerntet und durch Elektronenmikroskopie analysiert. Zur Elektronenmikroskopie wurden die Zellen zunächst 1 Stunde in Glutaraldehyd-(2,5%) haltigem Cacodylat-Puffer (0,1 M) und dann weiter in 1% Osmiumtetroxid fixiert. Die Proben wurden in einer aufsteigenden Alkoholreihe und Propylenoxid dehydratisiert und anschließend in Epon eingebettet. Semi-dünne Schnitte (1 um) wurden mit einem Ultramikrotom von Blöcken geschnitten und mit Uranylacetat und Bleicitrat gegengefärbt. Die Proben wurden unter Verwendung eines Philips 410-Elektronenmikroskops analysiert (Maysinger et al., 1993, Neurochem. Intl. 23: 123-129). Fig. 7D zeigt die elektronenmikroskopischen Bilder der Kontrolle Y1-pZEM- und der Y1-pZαM-Transfektanten bei verschiedenen Vergrößerungen (I-V). Die Kontrollzellen besitzen eine feine gleichmäßige Kernmembran, während die pZαM-Zellen die Hauptmarker der Apoptose zeigen: Kondensation des Chromatins und dessen Anlagerung an der Kernperipherie (Tafeln I und II), Kondensation des Chromatins (Tafel II), Kern-Fragmentation (Tafel III), die Bildung von apoptotischen Körperchen (Tafel V) und die zelluläre Fragmentation (Tafel IV). Diese Reihe von Experimenten zeigt, daß die Aktivierung des programmierten Zelltodes einen möglichen Mechanismus darstellt, anhand dessen die Demethylierung die Tumorgenese hemmen kann. Dies wird durch Daten unterstützt, die darauf hinweisen, daß der Zelltod durch eine Endonuklease-Aktivität ausgelöst wird (Ellis et al., 1991, Annu. Rev. Cell Biol. 7: 663-698). Somit kann der Signalweg, der zur Apoptose führt, durch Einwirkungen auf die Methylierungsspiegel der DNA beeinflußt werden.

BEISPIEL 4

Behandlung von Y1-Zellen mit 5-azaCdR

1 · 10&sup5; Y1-Zellen wurden in Wachstumsmedium plattiert. 24 Stunden nach dem Plattieren wurde das Medium durch frisches Medium, das verschiedene Konzentrationen (0-10 uM) 5- azaCdR (Sigma) enthielt, ersetzt. Das Medium wurde während eines Zeitraums von 72 Stunden alle 12 Stunden entfernt und durch frisches Medium, welches 5-azaCdR enthielt, ersetzt. Im Anschluß an die 5-azaCdR-Behandlung wurden die Zellen zur Kologenezitätsbestimmung in 6-Loch-Platten in Wachstumsmedium ausplattiert (100, 300, 500 Zellen pro Vertiefung), in Soft-Agar zur Bestimmung des Substrat-unabhängigen Wachstums (3 · 10³ Zellen pro Vertiefung) und in Medium mit niedriger Serumkonzentration (1% Pferdeserum) für einen Zeitraum von 5 Tagen, um die Lebensfähigkeit unter Serumentzug zu bestimmen. Jeder dieser Assays wurde in Abwesenheit von 5-azaCdR durchgeführt.
Wie in Fig. 8 gezeigt, ahmt die Behandlung der Y1-Zellen mit 5-azaCdR die Auswirkungen der Expression eines Antisense-Moleküls für DNA-MeTase nach. Tatsächlich führt die Behandlung der Y1-Zellen mit 5-azaCdR zu einem Anstieg des Spiegels an nicht-methyliertem Cytosin (Fig. 8A), zu einer Verminderung der Lebensfähigkeit der Zellen unter Serumentzug (Fig. 8B), und schließlich zur drastischen Hemmung des Wachstums der Y1-Zellen im Soft-Agar (Fig. 8C-D). Der Effekt von 5-azaCdR auf die Y1-Zellen war dabei nicht von der Zellinie per se abhängig, da die Durchführung des gleichen Experiments unter den gleichen Bedingungen mit humanen RB-Tumoren und humanen "small cell"-Lungenkarzinomzellen zu ähnlichen Ergebnissen führte.
Diese Experimente weisen daher darauf hin, daß 5-azaCdR zur Änderung des genetischen Programms oder zur Wiederherstellung eines authentischen Programms, das durch die Deregulation der DNA-Methylierung zerstört wurde, erfolgreich als ein gegen Krebs gerichtetes Agens benutzt werden kann.
Die hier gezeigten Daten unterstützen die Hypothese, daß die Hypermethylierung eine kritische Rolle in der Aufrechterhaltung des transformierten Status spielt und sagen darüber hinaus vorher, daß der Anstieg in der Methylierung kritisch für den transformierten Status ist. Die Tatsache, daß der Ras-Signalweg die Aktivität des DNA-MeTase-Promotors induziert, zeigt uns einen Mechanismus auf, diesen Anstieg mit der Fähigkeit von Krebszellen zur DNA-Methylierung zu erklären (Fig. 9). Hier muß deshalb darüber nachgedacht werden, ob die DNA-MeTase einen wichtigen Effektor des Ras-Signalwegs darstellt.
Zusammengefaßt liefern die hier präsentierten Ergebnisse grundlegende Prinzipien im Hinblick auf die therapeutische Bedeutung der DNA-Methylierung. Zunächst kann die partielle Hemmung der DNA-MeTase-Aktivität zu einer Änderung im Methylierungsmuster führen, da der Spiegel der DNA-MeTase-Aktivität eine Determinante des DNA-Methylierungsmusters darstellt. Wenn die aberrante Hypermethylierung in Krebszellen durch die Überexpression der DNA-Methyltransferase hervorgerufen wird, ist anzunehmen, daß die partielle Hemmung der Methylierung zur Wiederherstellung des ursprünglichen Methylierungsmusters führt. Da zweitens dieses Muster nicht ausschließlich durch die DNA-MeTase-Aktivität, sondern auch durch cis- und trans-agierende Signale an der Genregion bestimmt wird, wird eine teilweise Hemmung der DNA-MeTase eher zu einer gerichteten Veränderung der Genexpression als zu einer chaotischen Transformation der Zelle führen. Außerdem können DNA-MeTase-Inhibitoren dazu verwendet werden, ein Programm zu induzieren, welches in den Zellen latent vorhanden ist.
Während die Erfindung mit spezifischem Bezug auf die dargestellte Ausführungsform beschrieben wurde, versteht es sich von selbst, daß von den jeweiligen Fachleuten zahlreiche Modifikationen hinzugefügt werden können. Deshalb sollten die vorhergehende Beschreibung und die begleitenden Zeichnungen als Illustration der Erfindung und nicht als Einschränkung betrachtet werden.

Claims

1. Ein DNA-Methyltransferase-Inhibitor oder -Antagonist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem anti-DNA-Methyltransferase-Antikörper und einer Antisense-Nukleinsäure der DNA-Methyltransferase zur Verwendung als therapeutisches oder diagnostisches Agens.

2. DNA-Methyltransferase-Inhibitor oder -Antagonist nach Anspruch 1 zur Verminderung der Menge an methyliertem Cytosin in ein CpG-Dinukleotid zur Umkehrung eines Transformationszustandes einer Zelle, zur Korrektur eines anomalen Methylierungsmusters der DNA einer Zelle oder zur Änderung eines Methylierungsmusters der DNA einer Zelle.

3. Verwendung des DNA-Methyltransferase-Inhibitors oder -Antagonisten nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Krebsbehandlung, zur Wiederherstellung eines anomalen Methylierungsmusters in einer Patienten-DNA oder zur Änderung eines Methylierungsmusters in einer Patienten-DNA.

4. Verwendung nach Anspruch 3, wobei das Arzneimittel einen anti-DNA-Methyltransferase-Antikörper und eine Antisense-Nukleinsäure der DNA-Methyltransferase umfaßt.

5. Verwendung nach Anspruch 3 oder 4 zur Korrektur eines bei β-Thalassämie- oder Sichelzellanämie vorkommenden genetischen Defekts.