JP2001522607A - Ｄｎａデメチラーゼおよびその治療および診断用途 - Google Patents

Ｄｎａデメチラーゼおよびその治療および診断用途

Info

Publication number
JP2001522607A
JP2001522607A JP2000520577A JP2000520577A JP2001522607A JP 2001522607 A JP2001522607 A JP 2001522607A JP 2000520577 A JP2000520577 A JP 2000520577A JP 2000520577 A JP2000520577 A JP 2000520577A JP 2001522607 A JP2001522607 A JP 2001522607A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
demethylase
dna
cdna
dmtase
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2000520577A
Other languages
English (en)
Inventor
スジフ，モーシェ
バタッチャルヤ，サンジョイ
ラムチャンダニ，シャイアム
Original Assignee
マクギル・ユニヴァーシティ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from CA 2220805 external-priority patent/CA2220805A1/en
Priority claimed from CA 2230991 external-priority patent/CA2230991A1/en
Application filed by マクギル・ユニヴァーシティ filed Critical マクギル・ユニヴァーシティ
Publication of JP2001522607A publication Critical patent/JP2001522607A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は、約４０ｋＤａを有するＤＮＡデメチラーゼ酵素に関し、そして上記ＤＮＡデメチラーゼ酵素は癌細胞において過剰発現されて正常細胞においては発現されない。本発明は、該ＤＮＡデメチラーゼ酵素の治療用並びに診断用用途にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明の背景 （ａ）本発明の分野 本発明は、新規の酵素、ＤＮＡデメチラーゼ、とその治療的診断的用途に関す
る。 （ｂ）先行技術の説明 脊椎動物ゲノム内のジヌクレオチド配列ＣｐＧ内にあるシトシン部分の修飾は
、パレンタルインプリンティング(parental imprinting) 、Ｘ−不活性化、異所
性遺伝子および間違った遺伝子発現のメチル化の抑制、の様な数多くのゲノム機
能の調節に含まれることが、多くの系での証拠から確立された（Ｓｚｙｆ，Ｍ．
，１９９６，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，７０，１−３７）。メチル化さ
れたＣｐＧｓの分布は、メチル化パターンが組織−および部位−特異的に形成さ
れるため、ＤＮＡのメチル化によって、示差マーキング遺伝子のその機能が完成
される（Ｓｚｙｆ，Ｍ．，１９９６、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，７０，
１−３７）。メチル化パターンは、発生の間にメチル化および脱メチル化の起こ
る配列によって形作られ（Ｂｒａｎｄｅｉｓ，Ｍ．ら、１９９３、Ｂｉｏａｓｓ
ａｙｓ，１５，７０９−７１３）、完全に分化した細胞内に維持される（Ｒａｚ
ｉｎ，Ａ．ら、１９８０、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１０，６０４−６１０）ことが明
らかである。元来、ＤＮＡの脱メチル化は、複製中のメチル基の受動損失によっ
て成し遂げられると考えられている（Ｒａｚｉｎ，Ａ．ら、１９８０，Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ，２１０，６０４−６１０）が、現在では、脱メチル化の活性化プロセス
は、胎児細胞内で（Ｆｒａｎｋ，Ｄ．ら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ，３５１，２
３９−２４１）、分化細胞系内で（Ｒａｚｉｎ，Ａ．ら、１９８６、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３，２８２７−２８３１；Ｓｚｙｆ，
Ｍ．ら、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，８
０９０−８０９４）、およびエストロゲン処理に応答して（Ｓａｌｕｚ，Ｈ．Ｐ
．ら、１９８６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３，７１
６７−７１７１）、起こることが明らかである。二通りの脱メチル化の様式が提
案されている：特異的遺伝子の遺伝子発現の始まりの多くの例と一致する部位特
異的脱メチル化；ならびに細胞分化の間および癌細胞内のインビボでの早期発生
中に起こる一般ゲノムの広範な脱メチル化：である（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｐ
．ら、１９８３、Ｎａｔｕｒｅ，３０１，８９−９２；Ｒａｚｉｎ，Ａ．ら、１
９８６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３，２８２７−２
８３１）。包括的脱メチル化は、発生またはオンコジーンの特異点で活性化され
る一般的デメチラーゼ活性が存在するという仮説と一致する。メチル化パターン
を調節する一つの機構は、メチルトランスフェラーゼの発現（Ｓｚｙｆ，Ｍ．、
１９９１、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，６９，７６４−７６７）お
よび脱メチル化活性（Ｓｚｙｆ，Ｍ．、１９９４、Ｔｒｅｎｄｅ Ｐｈａｒｍａ
ｃｏｌ．Ｓｃｉ．，７，２３３−２３８）を調節することであると、仮定されて
いる。過去２０年の間に、メチル化に応答する酵素活性およびその発現の調節に
ついて、広範囲の情報が得られている（Ｓｚｙｆ，Ｍ．、１９９６、Ｐｈａｒｍ
ａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，７０，１−３７）が、デメチラーゼの身元は謎のままで
ある。しかしながら、どのようなパターンのメチル化が形成され維持されるかを
完全に理解するために、そして、発生、生理および発癌でのそれらの役割を決定
するためには、デメチラーゼ酵素を同定しなければならないことは、明らかであ
る。以下の２つの主な困難点が、この酵素の同定を阻害してきた。第一に、メチ
ル化されたシトシンの脱メチル化は、非常に安定なＣ−Ｃ結合の破壊を含むため
、化学的にあり得ない。第二に、脱メチル化は、発生の非常に限定された段階で
起こり（Ｂｒａｎｄｅｉｓ，Ｍ．ら、１９９３、Ｂｉｏａｓｓａｙｓ，１５，７
０９−７１３）、この酵素の正確な組織起源を同定することは重要である。
【０００２】 一方で、真正の(bona fide)デメチラーゼは今日までに同定されていないが、 非メチル化シトシンとメチル化シトシンの変換を含む生化学的変換機構について
は説明されている。以前から予想されていた一つの機構は、グリコシラーゼによ
るメチル化塩基の除去、および「切除修復」機構を用いる非メチル化ヌクレオチ
ドとの置換である（Ｒａｚｉｎ，Ａ．ら、１９８６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３，２８２７−２８３１）。ＤＮＡからメチル化シト
シンを除去することの出来るグリコシラーゼ活性は、Ｖａｉｒａｐａｎｄｉおよ
びＤｕｋｅｒ（Ｖａｉｒｓｐａｎｄｉ，Ｍ．ら、１９９３、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．，２１，５３２３−５３２７）によって、さらにより最近には、Ｊ
ｏｓｔ（Ｊｏｓｔ，Ｊ．Ｐ．ら、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０
，９７３４−９７３９）によって、証明されている。しかしながら、この活性が
細胞分化中に認められる一般的脱メチル化に応答するか否かは、明らかではない
。Ｊｏｓｔによって同定された活性は、（ほとんどの場合、天然の基質ではない
）半メチル化配列に特異的に作用し、そしてチミジンおよび５−メチルシトシン
を除去することが出来ると言う事実は、このグリコシラーゼ−デメチラーゼの修
復機能を支持する（Ｊｏｓｔ，Ｊ．Ｐ．ら、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．，２７０，９７３４−９７３９）。最近では、ＲＮＡ依存性活性を含む変換機
構が、Ｗｅｉｓｓら（Ｗｅｉｓｓら、１９９６）に記載されている。このプロテ
イナーゼ−非感受性ＲＮＡ依存活性は、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリド分子内に含ま
れる非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドでのメチル化ＣｐＧの切除および置換を触
媒することが、示された（Ｗｅｉｓｓ，Ａ．ら、１９９６、Ｃｅｌｌ，８７，７
０９−７１８）。培養中の分化細胞内で同定されたこの活性は、発生の間は脱メ
チル化に含まれると、考えられていた。これらの以前の知見から、この分野で共
通に受け入れられるモデルは、真正のデメチラーゼが存在しないこと証明してい
る。
【０００３】 以前から、癌細胞内で認められる広範囲の低メチル化(hypomethylation) は、
オンコジーン経路による脱メチル化活性の活性化の結果であろうと、考えられて
きた（Ｓｚｙｆ，Ｍ．ら、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，１２
６９０−１２６９６）。この仮説に従って、我々は、ｖ−Ｈａ−ｒａｓの異所性
発現が細胞内の脱メチル化活性を誘導することを示した（Ｓｚｙｆ，Ｍ．ら、１
９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｎｍ．，２７０，１２６９０−１２６９６）。３
’32Ｐ標識したメチルｄＣＭＰ（ｍｄＣＭＰ）のｄＣＭＰへの変換を直接測定す
るアッセイを用いて、我々は、Ｐ１９−Ｒａｓトランスフェクタントから調製さ
れた核抽出物が高レベルのデメチラーゼ活性を持つことを示した（Ｓｚｙｆ，Ｍ
．ら、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，１２６９０−１２６９６
）。この知見を確立するために、我々は、癌細胞系がデメチラーゼの良好な起源
であると、仮定した。しかしながら、Ｐ１９細胞内のＲａｓ発現が癌細胞内の状
況を反映しているかは、明らかではない。Ｐ１９は、胎児細胞であり、Ｒａｓの
発現は、それらを分化させることが出来る。
【０００４】 治療的および生物学的用途のために、発生プログラムを変化させる真正のＤＮ
Ａデメチラーゼ（ＤＮＡ ｄＭＴａｓｅ）と共に提供されることが、非常に望ま
しいであろう。発明の要約 本発明では、我々はヒト肺癌細胞系Ａ５４９からの真正のＤＮＡデメチラーゼ
（ＤＮＡ ｄＭＴａｓｅ）の精製を証明し、その動力学的パラメーターを測定し
、基質特異性を決定した。この研究により同定されたＤＮＡ ｄＭＴａｓｅ活性
は、ジヌクレオチド配列ｍｄＣｐＧ内に存在するメチル−ｄＣＭＰ（ｍｄＣＭＰ
）をｄＣＭＰに変え、一方、メチル基を、メタノールと同定された揮発性残基と
して遊離する。活性は、如何なる微量のｄＣＴＰも含まないように精製され、Ｄ
ＮＡポリメラーゼインヒビターｄｄＣＴＰに非感受性であり、反応物中に存在す
るメチルｄＣＴＰ（ｍｄＣＴＰ）に影響されず、そしてエキソヌクレアーゼ活性
またはグリコシラーゼ活性を示さない。この新規の酵素の同定は、どのようにＤ
ＮＡメチル化パターンが形成され変化するかの理解に新しい方向性を示す。
【０００５】 本発明の一つの目的は、真正のＤＮＡメチラーゼ（ＤＮＡ ｄＭＴａｓｅ）を
提供することである。
【０００６】 本発明では、約４０ＫＤａのＤＮＡデメチラーゼ酵素が提供され、ＤＮＡデメ
チラーゼ酵素は癌細胞内では過剰に発現されるが、正常細胞内ではそうではない
。
【０００７】 本発明に従って、配列番号１に示された配列を含むヒトのデメチラーゼをコー
ドするｃＤＮＡが提供される。
【０００８】 本発明に従って、ヒトｃＤＮＡと相同の２つのマウスｃＤＮＡが提供され、マ
ウスデメチラーゼをコードするｃＤＮＡは、配列番号５−７に示す配列を持つ。
【０００９】 本発明に従って、配列番号３に示す配列を持つヒトデメチラーゼと相同の蛋白
質をコードする異なるヒトｃＤＮＡが提供される。
【００１０】 本発明では、デメチラーゼｃＤＮＡｓの発現を用いて、細胞内インビトロで、
または、ヒト、動物および植物内インビボで、ＤＮＡのＤＮＡメチル化パターン
を変化させることが、提供される。
【００１１】 デメチラーゼｃＤＮＡｓは、ＣＭＶのような哺乳動物プロモーターの指揮下で
発現できる。
【００１２】 デメチラーゼｃＤＮＡｓは、植物特異的プロモーター下で発現でき、植物内で
のメチル化を変化させ、植物の発生状態および植物内での外来遺伝子の発現を変
えることができる。
【００１３】 デメチラーゼｃＤＮＡｓがアンチセンス方向に発現すると、治療プロセスで、
癌細胞内のデメチラーゼを阻害することができる。
【００１４】 哺乳動物細胞内でのデメチラーゼｃＤＮＡの発現は、それらの分化の状態を変
化させ、そして治療用肝細胞および動物クローニング用細胞を生成させ、さらに
外来遺伝子の発現を改良することができる。
【００１５】 本発明では、細菌または昆虫細胞内でデメチラーゼｃＤＮＡの発現を用いた、
大量のデメチラーゼの生成を、提供する。
【００１６】 本発明では、デメチラーゼｃＤＮＡｓの発現を用いた、脊椎動物、昆虫または
細菌あるいは植物細胞内でのデメチラーゼに対する抗体の様な蛋白質の生成を提
供する。
【００１７】 本発明では、鋳型としてデメチラーゼｃＤＮＡｓの配列を用いた、アンチセン
スオリゴヌクレオチドおよびリボザイムの設計を提供する。
【００１８】 本発明では、デメチラーゼｃＤＮＡｓの予想ペプチド配列を用いた、デメチラ
ーゼに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体の生成を提供する。
【００１９】 本発明では、酵母の２つのハイブリド系内でのｃＤＮＡｓの発現を用いた、診
断用および治療用目的でデメチラーゼと相互作用する蛋白質の同定を提供する。
【００２０】 本発明では、細菌、脊椎動物または昆虫細胞内でのｃＤＮＡｓの発現を用いた
、Ｘ−線結晶構造を得るため、ならびに治療用およびバイオテクノロジー用にデ
メチラーゼインヒビターを高処理量スクリーニングするのための、大量のデメチ
ラーゼの生成を提供する。
【００２１】 本発明に従って、 ａ） インビトロで転写および翻訳されたデメチラーゼｃＤＮＡｓを用いて、
メチル化ＤＮＡサンプル中に存在するメチル−シトシンをＤＮＡ中に存在するシ
トシンと揮発性メチル基に変換する； ｂ） 活性なデメチラーゼインヒビターの徴候としての揮発性メチル基の不在
または微小量を測定する： 段階を含む、治療用薬剤および抗癌剤としてのデメチラーゼインヒビターを高処
理量でスクリーニングするための揮発性アッセイを提供する。
【００２２】 本発明では、 ａ） メチル化ＤＮＡ内に存在するメチル−シトシンのＤＮＡ内に存在するシ
トシンへの変換およびメタノールとして遊離するメチル基としてのその揮発性を
アッセイすることによって、患者サンプル中のデメチラーゼ活性を測定し； ｂ） 患者サンプル中の癌の指標として、メチル基として遊離される揮発性メ
チルの存在または微小量を測定する： 段階を含む、患者サンプル中のガン診断用の揮発性アッセイを提供する。
【００２３】 本発明では、ＤＮＡデメチラーゼのアンタゴニストまたはインヒビターを用い
た、癌治療用、患者ＤＮＡ中の異常なメチル化パターンの修復用、または患者Ｄ
ＮＡ内のメチル化パターンの変換用の、薬剤製造を提供する。
【００２４】 そのようなアンタゴニストは、「ＣmＧＣmＧＣmＧＣmＧ ＧmＣＧmＣＧmＣＧmＣ」ｎ の様な、Ｋi５ ０ｎＭでデメチラーゼを阻害する二本鎖オリゴヌクレオチドである。
【００２５】 インヒビターには、限定するものではないが、抗−ＤＮＡデメチラーゼ抗体、
ＤＮＡデメチラーゼのアンチセンス、または任意のイミダゾール誘導体の様な小
分子が含まれる。
【００２６】 メチル化パターンの変化は、サイレント遺伝子を活性化することができる。そ
のようなサイレント遺伝子が活性化されると、β−サラセミアまたは鎌状赤血球
貧血で見出されたような遺伝子欠損を修正することができる。
【００２７】 本発明のＤＮＡデメチラーゼを用いると、クローニングＤＮＡに必要とされる
ように、インビトロでＤＮＡ上のメチル基を除去することができる。
【００２８】 本発明のＤＮＡデメチラーゼまたはそのｃＤＮＡｓは、細胞分化の状態を変化
させて、遺伝子治療、幹細胞選択または細胞クローニングを可能にするために、
用いることができる。
【００２９】 本発明のＤＮＡデメチラーゼまたはそのｃＤＮＡｓを、ベクター媒介遺伝子治
療を用いて癌細胞内のメチル化を阻害するために、用いることができる。
【００３０】 本発明では、患者のガン診断用アッセイであって、ＲＴ−ＰＣＴ、ＥＬＩＳＡ
または本発明の揮発アッセイのいずれかによって、患者からのサンプル内のＤＮ
Ａデメチラーゼの発現レベルを定量することを含み、その中でＤＮＡデメチラー
ゼの過剰発現が癌細胞の指標となる、前記アッセイを提供する。発明の詳細な説明 メチル化パターンは、発生の間、メチル化および脱メチル化の起こる配列によ
って、形作られる。メチル化の正体はミステリーのままであり、その選択的生化
学活性は、ＤＮＡの脱メチル化を示すが、ＤＮＡからメチル基を確実に除去でき
る活性を持たないことが、データから分かった。デメチラーゼ活性の源としてヒ
ト肺癌細胞を用いて、我々は、哺乳動物細胞が真正のＤＮＡデメチラーゼ（ＤＮ
Ａ ｄＭＴａｓｅ）活性を持つことを、証明している。ＤＮＡ ｄＭＴａｓｅは
、水から誘導された水素で５位のＣ上のメチル基の置換を触媒することによって
、メチル−ＣをＣにトランスフォームする。ＤＮＡ ｄＭＴａｓｅは、完全にメ
チル化されたＤＮＡおよび半メチル化ＤＮＡの両方を脱メチル化し、ジヌクレオ
チド特異性を示し、異なる配列状況のｍｄＣｐｄＧ部位を脱メチル化することが
できる。この酵素は、以前に記載された脱メチル化活性とは異なり；プロテイナ
ーゼ感受性であり、ＲＮａｓｅによって活性化され、異なる生成物を遊離する。
【００３１】 ＤＮＡ ｄＭＴａｓｅは、如何なる生物でも以前に記載されたことのなかった
新規の予想外の活性を示す新規酵素である。真正のデメチラーゼの発見は、ＤＮ
Ａメチル化の生物学的役割の我々の理解に新たな方向性を示す。
【００３２】 ｐ１９細胞内でのＲａｓ発現が脱メチル化活性を誘導することができることは
、以前から示されている事実であるにもかかわらず、この脱メチル化活性が本当
に真正のデメチラーゼからくるものか否かは、明らかではなかった。一つには、
デメチラーゼは胎児細胞内にあると予想されていた。脱メチル化活性が癌細胞内
に存在することが分かったことは驚きに値する。Ａ５４９細胞内で高レベルのデ
メチラーゼが発見されたことは、本当に、予想外の発見である。
【００３３】 本発明では、脱メチル化がＤＮＡ中のメチル化シトシンからのメチル基の除去
によって起こること、水からの水素が５’位のメチル基を置換すること、その結
果得られたメチル基が水からの残りのヒドロキシルと反応して揮発性であるメタ
ノールを生成すること（図４Ｅ−Ｆ）が、示され証明された。このように、真正
のＤＮＡの脱メチル化には、以下の反応： デメチラーゼ ＣＨ3-シトシン-(ＤＮＡ)＋Ｈ-ＯＨ −−−−−→ Ｈ-シトシン＋ＣＨ3-ＯＨ が含まれる。
【００３４】 本発明に従ってクローン化されたｃＤＮＡは、ＤＮＡ中のメチル−シトシンを
シトシンに変換することができ、インビトロで転写され翻訳された場合、ＤＮＡ
上のメチル基を揮発しメタノールとして遊離するので、デメチラーゼである。こ
れは、以前には記載されたことのない生化学活性をコードする新規ｃＤＮＡであ
る。
【００３５】 本発明に従って、デメチラーゼが阻害されることによって成長する癌を阻害す
るモデルが示される（図１７）。 実験方法 細胞培養 Ａ５４９肺癌細胞（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ１８５）を、１０％のウシ胎児血清、２
ｍＭグルタミン、１０Ｕ／ｍｌシフロフロキサシンを添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ
のイーグル修飾培地（低グルコース）で増殖させた。ヒトの皮膚繊維芽細胞＃７
２−２１３Ａ ＭＲＨＦを、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）か
ら得、２％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミンを添加したＤｕｌｂｅｃｃｏのイー
グル修飾培地内で増殖させた。Ｈ４４６肺癌細胞（ＡＴＣＣ：ＨＴＢ１７１）は
、５％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０内で増殖させた。 核抽出物の調製 核抽出物を、文献（Ｓｚｙｆら、１９９１；Ｓｚｙｆら、１９９５）記載の方
法に従って、集密に近いＡ５４９培地から調製した。細胞をトリプシン処理し、
集菌し、リン酸塩バッファーで洗浄し、そしてバッファーＡ（１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ、ｐＨ８．０、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、５ｍＭ ＫＣｌ、０．５％ ＮＰ−
４０）内に、１０8 細胞／ｍｌの濃度で、１０分間、４゜Ｃで懸濁した。懸濁液
を１０００ｇで１０分間遠心分離することによって、核を収集した。ペレット状
の核を、バッファーＡ（４００μｌ）内に再懸濁し、実験法に記載の通り、収集
した。ペレット状になった核を、バッファーＢ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．
０、２５％グリセロール、０．２ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．４ｍＭ ＮａＣｌ）
内に３．３ｘ１０8 核／ｍｌの濃度で懸濁し、懸濁液を４゜Ｃで１５分間インキ
ュベートすることによって、核抽出物をペレット状の核から調製した。核抽出物
を、１０，０００ｇで３０分間遠心分離することによって、核ペレットから分離
した。核抽出物は、−８０゜Ｃで少なくとも２ヶ月間、活性を損失することなく
、保存された。 ＤＥＡＥ−セファデックスクロマトグラフィー 新たに調製した核抽出物（１ｍｌ、１．１ｍｇ）は、ＭｉｃｒｏｃｏｎTM １
００スピンカラムを通過させ、残留物をバッファーＬ内の０．２Ｍ ＮａＣｌと
等価な伝導率に希釈し、０．２Ｍ ＮａＣｌを含むバッファーＬ（１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ）で前もって平衡化したＤ
ＥＡＥ−セファデックスカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（１．０ｘ５ｃｍ）に、
流速１ｍｌ／分で適用した。次いで、カラムを１５ｍｌの開始バッファー（バッ
ファーＬ＋０．２Ｍ ＮａＣｌ）で洗浄し、蛋白質を５ｍｌのＮａＣｌ直線勾配
（０．２−５．０Ｍ）で溶出した。０．８ｍｌ画分を集め、ＭｉｃｒｏｃｏｎTM １０スピンカラム（Ａｍｉｃｏｎ）を通して脱塩し、０．８ｍｌバッファーＬ
内に残留物を再縣濁した後、メチラーゼ活性についてアッセイした。ＤＮＡデメ
チラーゼは、２−５．０ＭのＮａＣｌで溶出された。 Ｓ−セファロースクロマトグラフィー ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムの活性画分をプールし、希釈によって０
．１Ｍ ＮａＣｌに調整し、０．２Ｍ ＮａＣｌを含むバッファーＬで前もって
平衡化されたＳ−セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に流速１ｍｌ／
分で負荷した。実験方法に記載のようにカラムを洗浄した後、蛋白質を５ｍｌの
ＮａＣｌ直線勾配（０．２−５．０Ｍ）で溶出した。画分（０．５ｍｌ）を収集
し、ＭｉｃｒｏｃｏｎTM １０スピンカラムを用いて０．２ｍｌに濃縮した後、
ＤＮＡデメチラーゼ活性についてアッセイした。ＤＮＡデメチラーゼ活性は、５
．０Ｍ ＮａＣｌ付近で溶出した。 Ｑ−セファロースクロマトグラフィー Ｓ−セファロースカラムからの活性画分をプールし、希釈によって０．２Ｍ
ＮａＣｌに調整し、実験法に記載のように平衡化したＱ−セファロース（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ）カラム（１．０ｘ５ｃｍ）上に流速１ｍｌ／分で適用した。カラ
ムを洗浄し、蛋白質をＮａＣｌ直線勾配（０．２−５．０Ｍ）で溶出した。画分
（０．５ｍｌ）を集め、実験方法に記載に従って、脱塩し、最終容量０．２ｍｌ
に濃縮した後、デメチラーゼ活性についてアッセイした。デメチラーゼ活性は、
４．８−５．０Ｍ ＮａＣｌ付近で溶出した。 ＤＥＡＥ−セファセルのゲル−排出クロマトグラフィー Ｑ−セファロースカラムのプールされた画分を０．２Ｍ ＮａＣｌに調整し、
２．０ｘ２．０ｃｍのＤＥＡＥ−セファセルカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に
負荷し、０．２Ｍ ＮａＣｌを含むバッファーＬ（１０ｍｌ）で溶出した。画分
（０．８ｍｌ）を集め、ＭｉｃｒｏｃｏｎTM １０スピンカラムで約１８０μｌ
に濃縮した後、ＤＮＡデメチラーゼ活性についてアッセイした。活性は、ボイド
ボリュームに非常に近い画分４で検出された（〜２００ｋＤａ）。 ＤＮＡデメチラーゼ活性のアッセイ インビトロで、ＤＮＡデメチラーゼ活性を直接アッセイするために、２つの独
立した方法を適用した。 （Ａ）メチル−ｄＣＭＰ（ｍｄＣＭＰ）のｄＣＭＰへの変換をアッセイするため
に、Ｓｚｙｆら、１９９５に記載の方法を用いた。簡単に言えば、α32Ｐで標識
した全メチル化ポリ［ｍｄＣ32ＰｄＧ］ｎ基質を、以下の方法に従って調製した
。１００ｎｇの二本鎖の全メチル化（ｍｄＣｐｄＧ）オリゴマー（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）を沸騰させることによって変性させ、次いで室温で部分的にアニーリン
グさせた。メチル−５−ＣＴＰ（ｍｄＣＴＰ、０．１ｍＭ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および［α−32Ｐ］ＧＴＰ（１００μＣｉ、３０００
Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を用いて、相補鎖をクレノウフラグメントで伸長し、取り込ま
れなかったヌクレオチドを、ＮＡＰ−５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を通して
クロマトグラフィーによって除去した。ＮＡＰ−５クロマトグラフィーを繰り返
し、取り込まれなかったヌクレオチドを含む少量の混入物質を排除した。対照と
して、非メチル化ポリ［ｄＣ32ｐｄＧ］ｎ基質を同様の方法で調製したが、鋳型
としては非メチル化ｄＣｐｄＧオリゴマーが供給され、ｄＣＴＰを伸長反応に用
いた。実験方法に記載の方法に従って、カラム画分（３０μｌ）を、１ｎｇのポ
リ［ｍｄＣ32ｐｄＧ］ｎと共に、２５％グリセロール（ｖ／ｖ）および５ｍＭ
ＥＤＴＡを含むバッファーＬ中、３７゜Ｃで１時間、インキュベートした。反応
したＤＮＡならびに非メチル化ポリ［ｄＣ32ｐｄＧ］ｎおよびメチル化［ｍｄＣ 32 ｐｄＧ］ｎ未反応対照を、フェノール／クロロホルム抽出によって精製し、単
球菌ヌクレアーゼ消化（１０μｌで１００μｇ）およびウシ脾臓ホスホジエステ
ラーゼ（２μｇ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で、３’モ
ノヌクレオチドになるまで３７゜Ｃで１５時間、反応させた。消化生成物を薄層
クロマトグラフィー板（ＴＬＣ）（Ｋｏｄａｋ、１３２５５ Ｃｅｌｌｕｌｏｓ
ｅ）上に負荷し、１３２ｍｌのイソ酪酸：４０ｍＭの水：４ｍｌのアンモニア水
を含む溶媒で分離し、オートラジオグラフし、異なるスポットの強度を光画像診
断装置(phosphorimager)（Ｆｕｊｉ，ＢＡＳ２０００）を用いて測定した。32Ｐ
で標識した基質およびトリチウムで標識した基質は、それぞれＢＡＳ２０００プ
レートおよびＢＡＳ−ＴＲ２０４０光画像診断プレートを用いて、光画像診断さ
れた。 （Ｂ）第二の方法では、反応混合物からの3Ｈ−ＣＨ3または14Ｃ−ＣＨ3 の出現
を測定することによって、メチル化ＤＮＡからのメチル化残基の除去を測定した
。ＳｓｓＩメチラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）および過剰
の［3Ｈ−メチルＡｄｏＭｅｔ（８０ｃｉ／ｍｏｌ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）］を用いて、１００ｎｇのポリ［ｄＣｄＧ］ｎ二本鎖ＤＮＡを
メチル化した。ＤＮＡを含むトリチル化されたメチル基を、ＮＡＰ−５カラムク
ロマトグラフィーを用いて、標識されたＡｄｏＭｅｔから精製した。ＤＮＡデメ
チラーゼのすべてのカラム精製画分を、トリチル化された基質を用いてアッセイ
した。典型的アッセイでは、１ｎｇのＤＮＡを、３０μｌのカラム画分と共に、
バッファーＬ内、３７゜Ｃで１時間、インキュベートした（比活性４ｘ１０6 ｄ
ｐｍ／ｍｇ）。異なる画分とのインキュベーション後、ＤＮＡ内に残されたメチ
ル基の数を測定するために、２５０μｌの水を加え、混合物を６５゜Ｃで５分間
インキュベートした。１００μｌの反応混合物を、液体シンチレーションカウン
ターにかけた。対照は、カラム画分の代わりに同量のバッファーＬを加えること
を除いて、同様の処理を受けた。別の画分でＤＮＡから除去されたメチル基の数
は、対照中に残された数からそれぞれの画分内に残された数を引くことによって
、測定された。すべての試験は三重に行った。結果を、除去されたメチル基のピ
コモルで示した。１ユニットのＤＮＡ ｄＭＴａｓｅ活性は、「３７゜Ｃ、１時
間で、メチル化ｄＣｐｄＧ基質から１ピコモルのメチル化を遊離する酵素の量」
と定義した。 二重標識基質を用いたメチル除去アッセイ メチル基がＤＮＡから脱離するか否か、いかなるトリチウムの非特異的除去も
起こらないかを決定するために、デオキシ［６−3 Ｈ］ウリジン（２２Ｃｉ／ｍ
ｍｏｌ：Ａｍｅｒｓｈａｍ）（１０μＣｉ／ｍｌ）の存在下でプラスミドを持つ
細菌を増殖させることによって、シトシンおよびチミジンの６’位に3 Ｈを含む
ＳＫプラスミドＤＮＡを調製した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）を含む
［６−3 Ｈ］−シトシンを標準的プロトコールに従って精製し、過剰の［14Ｃ−
メチル］ＡｄｏＭｅｔ（５９ｍＣｉ／ｍｍｏｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ）（１０μＣ
ｉ／１００μｌ反応物）およびＳｓｓＩメチラーゼを用いてメチル化した。二重
に標識されたＤＮＡ基質をＮＡＰ−５カラム上で二度精製した。１５μｌのＤＮ
Ａ ｄＭＴａｓｅを、１ｎｇの二重標識ＤＮＡ（比活性２０００ｄｐｍ／ｎｇ）
と共に、３７゜Ｃで１時間、インキュベートした。インキュベーション後、残留
した14Ｃ対 3Ｈ数を、実験方法に記載の方法に従って、シンチレーションカウン
ター（Ｗａｌｌａｃ）で定量した。14Ｃカウントは、 3Ｈカウントに対して標準
的であった。対照は、ＤＮＡ ｄＭＴａｓｅの代わりに、等量の蒸留水をそれら
に加えることを除いて、同様の処理を受けた。
【００３６】 気相中の3Ｈ−ＣＨ3の数を定量するために、１ｎｇの3Ｈ−ＣＨ3ポリ［ｄＣｐ
ｄＧ］ＤＮＡを、ＤＮＡ ｄＭＴａｓｅと共に、シールドチューブ（Ｐｉｅｒｃ
ｅ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ）内で、一晩インキュベートした。０．８ｍｌの
空気を、ガスタイトシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｒｅｎｏ，Ｎｅｖａｄａ）を
用いて、チューブから除去し、１０ｍｌのＯｐｔｉＰｈａｓｅシンチレーション
液（Ｗａｌｌａｃ、ＵＫ）を含むシールドガスタイトシンチレーションバイアル
内に注入し、そしてカウントした。対照として、ＤＮＡを等量のバッファーＬと
共にインキュベートし、同様に処理した。 その他のメチル化ｄＣジヌクレオチドの合成 ポリ［ｍｄＣ32ｐｄＡ］および［ｍｄＣ32ｐｄＴ］基質を、以下の方法に従っ
て調製した。約０．５μｇの２０マーのオリゴヌクレオチド、５’（ＧＧ）10３
’、５’（ＧＴ）10３’および５’（ＧＡ）10３’、をボイルし、それぞれ、オ
リゴヌクレオチド、５’ＣＣＣＣＣＣ３’、５’ＣＡＣＡＣＡ３’および５’Ｃ
ＴＣＴＣＴ３’と共に、室温でアニールした。ｍ５ｄＣＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、および［α32Ｐ］ｄＡＴＰ（１００μＣｉ、３００
０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）または［α32Ｐ］ｄＴＴＰ（１００μＣｉ、３０００Ｃｉ／
ｍｍｏｌ）のいずれかをそれぞれ用いて、相補鎖をクレノウフラグメントで伸長
した。取り込まれなかったヌクレオチドをＮＡＰ−５カラムを通してクロマトグ
ラフィーで除去した。半メチル化されたｍｄＣｐＧ基質を同様の方法で調製した
が、鋳型として非メチル化ポリｄＣｐｄＧ基質（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を用い
、ｍ５ｄＣＴｐおよび［α32Ｐ］ｄＧＴＰを実験法に記載の方法に従って伸長用
に用いた。 ヌクレアーゼおよびグリコシラーゼ活性についてのアッセイ ｍｄＣの５’に標識化32Ｐを含む［32ｐｍｄＣｐｄＧ］ｎ基質を、以下の様に
調製した。約１００ｎｇのポリｄＣｐｄＧ ＤＮＡをボイルし、室温で部分的に
アニールした。［α32Ｐ］ｄＣＴＰおよび冷ｄＧＴＰを、実験法に記載の方法に
従って、相補鎖伸長に用いた。ＮＡＰ−５カラムクロマトグラフィーを用いて、
遊離ヌクレオチドを分離した。精製された［32ｐｍｄＣｐｄＧ］ｎ ＤＮＡは、
３２０μＭ ＡｄｏＭｅｔを用いて、ＳｓｓＩメチラーゼでメチル化させた。Ｎ
ＡＰ−５カラムを用いて、二度ＤＮＡを再精製した。メチル化ＤＮＡ（１ｎｇ）
を、３０μｌ ＤＮＡ ｄＭＴａｓｅ、核抽出物またはバッファーＬのいずれか
と共にインキュベートした。α32Ｐ標識された残基がＤＮＡから切り出されるか
否かを決定するために、ＤＮＡを直接ＴＬＣプレート上に適用した（３μｌ）。
ＤＮＡが脱メチル化されるかどうかを決定するために、３’−ＯＨ基の遊離した
５’−モノヌクレオチドを攻撃するヘビ毒ホスホジエステラーゼ（反応容量１０
μｌ中０．２ｍｇ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で、ＤＮＡを
消化させた。得られたモノヌクレオチドを、ＴＬＣプレート上で分離し、オート
ラジオグラフした。
【００３７】 真正の脱メチル化以外の活性に含まれる可能性のある、ＤＮＡ ｄＭＴａｓｅ
と共に、ｄＣＴＰが精製されるのか否かを試験するために、１μｌのα32Ｐ標識
ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を含む２０μＭのｄＣＴＰを核抽出物と共
に、カラム上に負荷した。32Ｐカウントを、フロー中、洗浄中および別の画分中
で測定した。約１１万カウントを、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム上に負
荷し、最大で画分８まで、そのすべてを回収した。
【００３８】 ＤＮＡ ｄＭＴａｓｅがＤＮＡポリメラーゼ活性を含むか否かを決定するため
に、ＤＮＡデメチラーゼ反応を、５００μＭのｄｄＣＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
）または５００μＭのｍ５ｄＣＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ
）の存在下、初速条件で行った。
【００３９】 ＤＮＡ ｄＭＴａｓｅがＲＮａｓｅまたはプロテイナーゼＫ処理に感受性であ
るかを決定するために、ＤＮＡ ｄＭＴａｓｅを、２００μｇ／ｍｌのプロテイ
ナーゼＫ（Ｓｉｇｍａ）と共に、５６゜Ｃで１時間前処理した。脱メチル化反応
は、実験法に記載の両方の脱メチル化アッセイを用い、通常の様式で、この前処
理画分で行われた。脱メチル化反応へのＤＮＡ消化の影響を試験するために、異
なるカラムからの画分を１００μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅＡ（ｓｉｇｍａ）で処理
した。 ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）プラスミドの脱メチル化 約４μｇのプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
）を、ＳｓｓＩメチラーゼを用いて、メチル化した。メチル化プラスミド（４ｎ
ｇ）を、３０μｌのＤＮＡ ｄＭＴａｓｅ（ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌカラム
の画分４）と共に、標準的条件下でインキュベートし、フェノール：クロロホル
ムで抽出し、そしてエタノールで沈殿させた。約１ｎｇのプラスミドを、メチル
化の前後、ならびにＤＮＡ ｄＭＴａｓｅ処理後、制限エンドヌクレａｓｅ、Ｅ
ｃｏＲII（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）、ＤｐｎＩ、ＨｈａＩまたはＨｐａII（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）のいずれかをそれぞれ１０ユニット、１０
μｌの反応容量、３７゜Ｃで２時間で、消化した。制限消化後、プラスミドをフ
ェノール:クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿し、１０μｌに再縣濁した。 ０．８％（ｗ／ｗ）アガロースゲル上でプラスミドを電気泳動し、Ｈｙｂｏｎｄ
Ｎｙｌｏｎ膜上にトランスファーし、ランダム−プリミング（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）によって32Ｐで標識した、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＳＫ（＋）プラスミドとハイブリダイズした。 デメチラーゼ活性への酸化還元試薬（redox reagents）（ＮＡＤ、ＮＡＤＨ、Ｎ
ＡＤＰ、ＮＡＤＰＨおよびＦｅＣｌ3）の影響 試薬を、１００μＭ濃度に調製し、実験法に記載の方法に従って、初速度条件
下で、最終濃度が１０μＭになるように、標準メチル除去アッセイに加えた。そ
れぞれのコファクター存在下でのメチル除去活性を、対照のＤＮＡ ｄＭＴａｓ
ｅ反応と比較した。 動力学的パラメーターの測定 動力学的パラメーターを測定するために、実験法に記載の方法に従って、両方
のアッセイ（ｄＣＭＰの生成およびメチルの除去）を用いて、脱メチル化反応を
行ったが、ＤＮＡ濃度は０．１ｎＭから２．５ｎＭに変化させ、３０μｌのＤＮ
Ａ ｄＭＴａｓｅを含む総量５０μｌ内で用いた。反応は少なくとも３時間で進
行することが前の実験で確かめられたので、反応の初期速度を、１時間間隔で測
定した。両アッセイに記載したそれぞれの基質ＤＮＡ濃度範囲で、速度データを
収集した。ＤＮＡデメチラーゼ活性についてのＫmおよびＶmax値は、速度対基質
濃度の二重逆数プロットから、決定した。 デメチラーゼにより触媒されたメタノール生成物の、ガスクロマトグラフィーに
よる測定 ガスクロマトグラフィーは、３０ｍ ＳｔａｂｉｌｗａｘTM カラム（０．０
５３ｃｍ ｉ．ｄ．；Ｒｅｓｔｅｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を装備したＶａ
ｒｉａｎTM モデル３４００ ＧＣで、行われた。ＮｉｔｒｏｇｅｎTMを、流速
３２ｍｌ／分でキャリヤーガスとして用い、インジェクターおよびディテクター
容器は、それぞれ２００および３００゜Ｃであった。カラムを、サンプル注射後
、４０゜Ｃに５分間維持した。
【００４０】 デメチラーゼ反応は、水相として３００μｌの水を含むシールドシンチレーシ
ョンバイアル内に保たれたエッペンドルフチューブ内で、行われた（この放射能
トラップ実験では、３００μｌのメタノールによって置換された）。デメチラー
ゼ反応は、バッファーＬ（１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
、ｐＨ８．０）内で、５００ｎｇの 3Ｈ−ＳＫプラスミド（６０００ｄｐｍ／μ
ｌ）および１００μｌのデメチラーゼと共に、３７゜Ｃで開始した。３７゜Ｃで
一晩インキュベーションの後、エッペンドルフチューブを取り囲む水相を、新し
いエッペンドルフチューブに移し、２μｌのこの混合物を、ガスタイトシリンジ
（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｒｅｎｏ，Ｎｅｖａｄａ）を用いて、ガスクロマトグラフ
ィーに注入した。 インビトロでの転写翻訳の結合 上記のｐｃＤＮＡ ３．１／Ｈｉｓ Ｘｐｒｅｓｓ デメチラーゼ構築物によ
ってコードされたｍＲＮＡｓを、ＰｒｏｍｅｇａTM ＴＮＴ網状赤血球溶解キッ
トを（製造者らのプロトコールに従って）、５０μｌの反応容量中、それぞれの
構築物２μｇおよび４０μＣｉの［35−Ｓ］メチオニン（１．０００Ｃｉ／ｍｏ
ｌ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて、転写−翻訳の結合によって、転写し翻訳した
。インビトロで標識されなかった翻訳されたデメチラーゼを精製するために、イ
ンビトロでの転写−翻訳結合を、冷メチオニンの存在下ではあるが、上記の方法
に従って行った。翻訳生成物を、ＰｒｏｂｏｎｄTMニッケルカラム（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ）に結合し、製造者らのプロトコールに従って、イミダゾールの濃度
を増加させて、デメチラーゼを溶出した。デメチラーゼは、３５０−５００ｍＭ
のイミダゾールで溶出された。イミダゾールで溶出されたデメチラーゼを透析し
、そして凍結乾燥によって濃縮した。 メタノールとしてのデメチラーゼ触媒反応の揮発性生成物の同定についてのガス
クロマトグラフィー−質量分析法（ＧＣ−ＭＳ） 脱メチル化反応（容量５０μｌ）を、全内部容量３５０μｌのコニカルバイア
ル内で行った。バイアルをテフロンスクリューキャップで閉じ、室温に１８時間
置いた。バイアルを氷浴内で冷やし、キャップを開け、１０ｍｇのＮａＣｌおよ
び５０μｌのトルエンを加えた。バイアルは、１時間以上にわたって、たびたび
振とうさせた。トルエン相は、多少厳密に水を排除して、ピペットで清潔なバイ
アルに入れた。無水硫酸ナトリウム（５ｍｇ）をトルエン抽出物に加え、水を除
去し、トルエン相をＧＣ／ＭＳ用のオートインジェクターバイアル内にピペット
で入れた。３μｌのアリコートを以下の装置条件下で分析した：装置；Ｈｅｗｌ
ｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ５９８８Ａ：カラム；０．２５ミクロンのＤＢ−１液
相を持つ石英キャピラリーを融合させた３０ｍｘ０．２５ｍｍ ｉ．ｄ．、７−
ｄｅｇで１分間初期保持の後、５ｄｅｇ／ｍｉｎで８０ｄｅｇにし、次いで、２
８０ｄｅｇで５分間焼く：インジェクターおよびインターフェイス温度；２５０
ｄｅｇ：ヘリウムの流速１．５ｍｌ／分：質量分析計；イオン源２００ｄｅｇ、
７０ｅＶ電子衝撃イオン化法、フルスキャンモードでのｍ／ｚ１０−５０のスキ
ャニングをインジェクションの６秒後に開始し、そして１．５分で終止して、多
量のトルエン溶媒ピークを排除した。 ヒトＡ５４９細胞はデメチラーゼ活性を持ち、ｄＣＴＰおよびＤＮＡ ＭｅＴａ
ｓｅを含まないように精製することができた デメチラーゼ活性用に適当な細胞源および直接アッセイを用いることは明らか
に重要である。以前、我々は、デメチラーゼ活性がＲａｓオンコジーンの異所性
発現に応答して誘導されることを示した（Ｓｚｙｆら、１９９５）ので、癌細胞
が高レベルのデメチラーゼ活性を持つのであろうと推論した。ヒト肺癌細胞系Ａ
５４９内の高レベルのデメチラーゼ活性の存在を証明した予備実験より、我々は
、さらなる研究および精製段階用にこの細胞系を選んだ。以前の研究では、デメ
チラーゼ活性の指標としてメチル化−感受性制限高をへの感受性の増加と言った
ような間接的測定が用いられてきた（Ｗｅｉｓｓら、１９９６；Ｊｏｓｔら、１
９９５）。ＤＮＡ内の５−ｍｄＣＭＰのｄＣＭＰへの変換を直接測定するために
、我々は、以前に記載した（Ｓｚｙｆら、１９９５）完全にメチル化された32Ｐ
で標識した［ｍｄＣ32ｐｄＧ］ｎ二本鎖オリゴマーを用いた。異なる画分と共に
インキュベーションの後、ＤＮＡを精製して、単球菌ヌクレアーゼで３’−モノ
ヌクレオチドに切断した。３’標識ｍｄＣＭＰおよびｄＣＭＰは、薄層クロマト
グラフィー（ＴＬＣ）で分離され、ｍｄＣＭＰのｄＣＭＰへの転化が直接測定さ
れる。このアッセイは、真正の脱メチル化に関する厳格な試験を提供し、以前か
ら言われている５ｍＣｐＣ置換活性とは識別される（Ｊｏｓｔら、１９９５；Ｗ
ｅｉｓｓら、１９９６）。Ｊｙｏｓｔら、１９９５、に記載のグリコシラーゼ−
デメチラーゼ活性は、リガーゼ活性および我々のアッセイで検出するためにＣで
ｍｄＣを置換するためのエネルギー源の存在を必要とし、一方、Ｗｅｉｓｅらに
記載のデメチラーゼ活性は、そのメチル化状態を変化させることなく完全なｍｄ
Ｃ32ｐｄＧジヌクレオチドを冷ｄＣｐｄＧで置換するため、検出されないであろ
う（Ｗｅｉｓｓら、１９９６）。
【００４１】 ヌクレオチド抽出物をＡ５４９から調製し、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘカラ
ム上に適用し、０．２−５．０Ｍ ＮａＣｌの直線勾配で溶出し、そして実験法
に記載の方法に従って、画分をデメチラーゼ（ｄＭＴａｓｅ）活性についてアッ
セイした。図１Ａに示すように、ｄＭＴａｓｅ活性の鮮明なピークが高塩図画分
１０で溶出される。
【００４２】 メチル化シトシンのシトシンへの転化：Ａ５４９細胞から調製された核抽出物
（１．１ｍｇ）はＡＭＩＣＯＮTM １００スピンカラムを通過させた。残留物（
９８．５ｍｇ、０．２ｍｇ／ｍｌ）をＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム上に負
荷し、直線ＮａＣｌ勾配（０．２Ｍ−５Ｍ）で溶出された別のクロマトグラフィ
ーカラム画分を脱塩し、そして（３０μｌを）１ｎｇの［ｍｄＣ32ｐｄＧ］ｎ二
本鎖オリゴマーと共に３７゜Ｃで１時間インキュベートし、３’モノヌクレオチ
ドに消化し、実験法に記載の方法に従って、ＴＬＣ上で分析した。ｄＣＭＰおよ
びｍｄＣＭＰの予想させる位置を示すために、対照のメチル化（ＭＥ）および非
メチル化（ＮＭ）［ｄＣ32ｐｄＧ］ｎ基質を３’モノヌクレオチドに消化し、Ｔ
ＬＣプレートに負荷した。活性画分を矢印で示す。この画分をＳ−セファロース
、次いでＱ−セファロースおよびＤＥＡＥ−セファセル分画に負荷した。
【００４３】 第一のクロマトグラフィーは、大量の核蛋白質からｄＭＴａｓｅ活性を精製す
る段階であり、非常に効果的な精製段階である。
【００４４】 揮発性メチル残基の放出によって測定されるＤＮＡ ｄＭＴａｓｅ活性。異な
るカラム画分を１ｎｇ（４ｘ１０6ｄｐｍ／μｇ）の［3Ｈ］−ＣＨ3−［ｍｄＣ ｐｄＧ］ｎオリゴマーと共にインキュベートし、揮発性のメチル化の遊離を、定
量（−）し、全ｄｐｎとして表した。結果は、３回の独立定量の平均で示す。蛋
白質濃度は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｂｒａｄｆｏｒｄキット（−）を用いて定量され
た。蛋白質と共にインキュベートされた２０μＭの［32Ｐ］−α−ｄＣＴＰの溶
出プロフィールを、別のＤＥＡＥ画分（−）のシンチレーションカウントによっ
て定量し、カラム上に負荷したｄＣＴＰの画分として表した。
【００４５】 我々のアッセイで検出されたＤＮＡ ｄＭＴａｓｅ活性が、ＤＮＡ ＭｅＴａ
ｓｅによるものである可能性を排除するために、我々は、前記の方法（Ｓｚｙｆ
ら、１９９１）に従って、半メチル化したＤＮＡ基質を用いてＤＮＡ ＭｅＴａ
ｓｅ活性について、画分をアッセイした。図１Ｂから分かるように、ＤＮＡ Ｍ
ｅＴａｓｅ活性は、第二および第三の画分で検出され、従って、我々の分画は、
ＤＮＡ ＭｅＴａｓｅとは別にＤＮＡ ｄＭＴａｓｅが分離され、それらが独立
した蛋白質であることを示唆している。
【００４６】 認められた脱メチル化が真正の脱メチル化ではなく、グリコシラーゼによりｍ
Ｃが除去され、次いで残ったデオキシリボース−リン酸がＡＰ（アピリミジン）
ヌクレアーゼによって除去され、画分中に含まれる極微量のｄＣＴを用いてＤＮ
Ａポリメラーゼによりｇａｐの修飾が触媒され、そして残留ＡＴＰの存在下リガ
ーゼで切断物が連結される、僅かな可能性も残されている。我々のデータと矛盾
しないこの仮説では、４つの異なる酵素および２つのコファクターがＤＮＡ ｄ
ＭＴａｓｅと共に同時分画されねばならない。極微量のｄＣＴＰがＤＮＡ ｄＭ
Ｔａｓｅ活性画分と結合している可能性を排除するために、我々は、２０μＭの 32 Ｐで標識したｄＣＴｐ（１０ｘ１０6 ｃｐｍ）を、核抽出物に加え、ＤＥＡＥ
カラムでのその溶出プロフィールを測定した。バックグラウンド以下のｃｐｍ（
１０ｃｐｍ）しか、ＤＮＡ ｄＭＴａｓｅ活性画分内には検出されず、我々の第
一のカラムでは、ｄＣＴＰが少なくとも１ｘ１０6 倍、ＤＮＡ ｄＭＴａｓｅか
ら離れて精製されることを示唆している（図１Ｂ）。もし任意のｄＣＴＰが核抽
出物内に存在しているとすれば、ＤＥＡＥ上での分画後に残された濃度は、既知
のＤＮＡポリメラーゼのＫｍｓ以下である。基質としてｄＣＴＰを用いる酵素は
すぐにｄＣＴＰを変換しなければならないので、外因性の32Ｐ標識ｄＣＴＰによ
って置き換えることのできない酵素に、ｄＣＴＰがしっかりと結合している可能
性は非常に少ない。
【００４７】 さらに活性画分１０を順番に次のカラム：Ｓ−セファロースおよびＱ−セファ
ロース：上で分画した。［ｍｄＣ32ｐｄＧ］ｎ脱メチル化アッセイで測定された
ような両カラムからの高塩画分で、ＤＮＡ ｄＭＴａｓｅが溶出された（図１Ａ
）。イオン交換クロマトグラフィー、次いでＤＥＡＥ−セファセルクロマトグラ
フィーを行った。
【００４８】 ４段階の分画後でさえ活性が維持され（表１）、単一のポリペプチドのみが最
終精製段階後表れたと言う事実は、我々の研究で検出された活性が修復または置
換活性である可能性を強く立証する。任意の置換機構は、数多くの蛋白質および
コファクターおよび基質を含まねばならない。要約すると、Ａ５４９細胞内のデ
メチラーゼ活性のクロマトグラフィーから、、哺乳動物細胞が真正のデメチラー
ゼ活性を持つという仮説が強く支持される。 ＤＮＡ ｄＭＴａｓｅは揮発性誘導体を遊離する 真正の脱メチル化は、結果としてＣＯ2 、メタノール、メタンまたはホルムア
ルデヒドの様な揮発性誘導体としてメチル基を遊離するはずである。それ故、我
々は、｛［3Ｈ］−ＣＨ3−ｄＣｐｄＧ｝ｎ二本鎖オリゴヌクレオチドを別のカラ
ム画分と共にインキュベートし、トリチル化されたメチル水相からの遊離速度を
反応混合物中に残された放射能のシンチレーションカウンターによって、測定し
た。図１Ｂ（◇）に示すように、ｄＭＴａｓｅ活性画分は、メチル化された基質
から標識されたメチル基を遊離する。 ＤＮＡ ｄＭＴａｓｅはＲＮＡによって阻害される蛋白質であり、変換活性を含
まず、そしてさらなるコファクターを必要としない ｍｄＣのＣへのトランスフォーメーションとして（図２Ａ）または揮発性メチ
ル残基の遊離（図２Ｃ）としてのいずれかで測定されたＤＮＡ ｄＭＴａｓｅ活
性は、プロテイナーゼＫ処理後なくなり、次のＲＮａｓｅ処理では阻害されずむ
しろ強化される。ＤＮＡポリメラーゼを阻害する５００μＭのｄｄＣＴＰは、［
ｍｄＣ32ｐｄＧ］ｎ基質の脱メチル化を阻害せず、高濃度のメチル−ｄＣＴｐ（
５００μＭ）によっても阻害されず（図２Ａ）、このことは、脱メチル化が切除
および置換の機構を含まないと言う仮説と一致する。置換の機構が脱メチル化に
含まれるならば、ｍｄＣＴＰの存在は、結果としてメチル化シトシンを取り込み
、脱メチル化の重要な阻害を生ずるはずである。従って、本明細書中で同定され
たＤＮＡ ｄＭＴａｓｅは、蛋白質であり、ＲＮＡでなく、以前から報告されて
いるようなＲＮＡに基づくまたはグリコシラーゼに基づくデメチラーゼ活性とは
はっきりと異なる。
【００４９】 ＤＮＡ ｄＭＴａｓｅ反応は、ｄＣＴＰの様なさらなる基質、ＮＡＤＨおよび
ＮＡＤＰＨのような酸化還元因子またはＡＴＰのようなエネルギー源のような如
何なる要求もなしに進行する（データには示していない）。図２Ｂおよび２Ｄか
ら分かるように、ＤＮＡ ｄＭＴａｓｅ反応は、最大で９０分にわたりその初速
度を維持し、最大で１２０分まで持続する。この時間経過は、ｄＣＴＰまたはＡ
ＴＰのような酵素に結合したさらなる補充の不可能な基質またはＮＡＤＨあるい
はＮＡＤＰＨのような補充不可能な酸化還元因子への依存と一致しない。補充不
可能な基質または酸化還元因子を排除すると、初期揮発性の急速な減速を生ずる
。 脱メチル化反応生成物は、ＤＮＡ内のデオキシシトシンである メチル化反応の生成物が何であるか？一方向ＴＬＣ分離を基に示された結果（
図１Ａ、２ＡおよびＢ）から、ＤＮＡ ｄＭＴａｓｅは、ＤＮＡ内のｍｄＣから
ｄＣを生成することが分かる。この結論をさらに実証するために、われわれは、
ＤＮＡ ｄＭＴａｓｅ処理ＤＮＡを、ｄＣにメチル化を排他的にトランスファー
することのできるＣｐＧ ＭｅＴａｓｅ Ｍ．ＳｓｓＩで、再びメチル化した。
図３Ａで示された結果から、ＤＮＡ ｄＭＴａｓｅの脱メチル化生成物は、Ｍ．
ＳｓｓＩで完全に再メチル化されているため、ｄＣであることが分かる。さらに
、ｄＣのような脱メチル化生成物の同定は、ｄＭＴａｓｅの生成物が冷ｄＣＭＰ
標準と両方向で共に移動することを示した二方向性ＴＬＣ分析によって確かめら
れた（図３Ｂ）。
【００５０】 ＤＮＡ ｄＭＴａｓｅは、ｍｄＣの５’に標識された32Ｐを含む［32ｐｍｄＣ
ｐｄＧ］ｎ基質またはｍ５ｄＣの３’が32Ｐである我々の標準のメチル化基質（
図３）と共にインキュベートした場合、ヌクレオチド、リン酸化塩基またはメチ
ル化ＤＮＡからのリン酸塩を遊離しない。多数のグリコシラーゼおよびヌクレａ
ｓｅを明らかに含む核抽出物は、同アッセイでリン酸化された誘導体を遊離する
（図３Ｃ）。反応したＤＮＡを５’モノヌクレオチドに消化し（図３Ｃ ＋Ｖ
ＰＤＳ）、ＴＬＣで分析した場合に明らかになるように、ｄＭＴａｓｅは、［32 ｐｍｄＣｐｄＧ］基質内のメチルシトシンをシトシンにトランスフォームする。
この反応は、３２Ｐ誘導体の遊離を含まない（図３Ｃ． −Ｖ ＰＤＳ）ので、
グリコシラーゼまたはヌクレアーゼ活性によってＤＮＡ基質の完全性が壊される
ことなく、ｄＭＴａｓｅは、ＤＮＡ上でメチル化シトシンとシトシンにトランス
フォームすることを証明する。 ｄＭＴａｓｅ反応の第二の生成物はメタノールである 遊離基の同定は、何であろうか？図１Ｂに示された結果は、標識されたメチル
が、揮発性化合物としてＤＮＡから遊離することを、示唆している。デメチラー
ゼ反応は、本来メチル基の遊離を含み、一方、シトシン環塩基は、水相に留まる
。図４Ａは、基質として、シトシンの６位を 3Ｈ−水素で、およびシトシンの５
位を［14Ｃ］−メチルで標識されたメチル化プラスミドを用いることによって、
この点を明らかにしている。
【００５１】 ３つの最も明らかな候補メチル基は、ホルムアルデヒド、二酸化炭素およびメ
タノールとして遊離する。標識されたホルムアルデヒドの検出用のメタドンとラ
ップ、標識された二酸化炭素用の水酸化ナトリウムトラップは、両方とも、ｄＭ
Ｔａｓｅ反応でメチル基を遊離する型の同定では（−）であった（データには示
していない）。メチル基がＤＮＡを遊離するであろうその他の可能な化学形は、
メタノールである。メタノールは、揮発性化合物であるので、メタノールの生成
を測定する単純な方法は、シンチレーション−揮発物アッセイである（図４Ｂの
説明を参照のこと）。以前、揮発物アッセイは、脱メチル化反応でメタノールの
遊離を測定するために用いられていた。標識された｛［3Ｈ］ −ＣＨ3 −ｄＣ ｐｄＧ｝ｎ基質を含む脱メチル化反応混合物を、ｄＭＴａｓｅと共に、または対
照として酵素を含まないかのいずれかで、シンチレーション液を含むシールされ
たシンチレーションバイアル内に置かれたキャップのない０．５ｍｌチューブに
加えた。遊離されたメタノールは、揮発性であり、解放状態の反応チューブから
拡散し、シンチレーションカウンタ−内の計数として記録されるバイアル内の過
剰なシンチレーション液と共に混合される。メタノールがアッセイ条件下で揮発
性であることを示す対照として、我々は、おおよそ等カウントの放射能で標識さ
れたメタノールを同条件下でカウントし、異なる時点のシンチレーションカウン
ター内でのカウントを測定した。図４Ｃから分かるように、３７゜Ｃで一晩イン
キュベーションした後では、反応チューブ内のメタノールの大部分は、反応チュ
ーブからシンチレーション液内に揮発する。図４Ｃに示した実験から、揮発した
標識は、ｄＭＴａｓｅ存在下でのみメチル化ＤＮＡから遊離することが分かる。
【００５２】 揮発性基の同定は、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析によってメタノール
であることが分かった。脱メチル化および対照反応（図４Ｅに示す）は、大容量
の水（３００μｌ）を含むシールされたシンチレーションバイアル内に置かれた
キャップされていないチューブ内で行われた。揮発性残基は、周囲の水の中に拡
散し、それと混ざる。２μｌの周囲水のサンプルを、記載の方法に従って、ＧＣ
カラム内にインジェクトした。図４Ｅに示すように、投与量応答様式でｄＭＴａ
ｓｅによって遊離された揮発性化合物は、メタノールと共に溶出する。メタノー
ルの遊離は、ｄＭＴａｓｅとメチル化ＤＮＡの両方が存在する場合にのみ、認め
られる。ｄＭＴａｓｅを非メチル化ＤＮＡと反応させる場合、メタノールは遊離
せず、このことは、メタノールがＤＮＡの脱メチル化生成物であることを示して
いる。
【００５３】 遊離基もまた、ガスクロマトグラフィー−質量分析法（ＧＣ−ＭＳ）を用いて
メタノールと同定された。図４Ｆに示すように、ｄＭＴａｓｅと共にメチル化Ｄ
ＮＡをインキュベーションする（ｄＭＴａｓｅ＋ＭＥ−ＤＮＡ）と、結果として
メタノールとしてのその同定結果と一致する保持時間でピークを遊離し、そして
メタノールと一致するマススペクトル（ピークは、メタノールの原子量である３
２および２９原子量と同定される、それぞれイオン化されたメタノールである）
を生ずる。ｄＭＴａｓｅを非メチル化ＤＮＡと共にインキュベーションしても、
メタノールは遊離せず、このことは、メタノールが脱メチル化反応の生成物であ
ることを示唆している。メタノールは、サンプルをプロテアーゼＫで処理したｄ
ＭＴａｓｅとインキュベートする場合にも遊離せず、このことは、メチル化ＤＮ
Ａからのメタノールの遊離が酵素活性によって触媒されることを示唆している。
脱メチル化は、水からの水素のトランスファーを含み、シトシンを再生する メチル化がｍｄＣからのメチル部分の除去を含むならば、水素は、５’位の炭
素にトランスファーされ、シトシンを再生するはずである。酸化還元因子が含ま
れないので、水素源は何であるか？水素源が水であると言う仮説を調べるため、
我々は、非標識［ｍｄＣｐｄＧ］ｎまたは［ｄＣｐｄＧ］ｎの二本鎖ＤＮＡのい
ずれかを、ＤＮＡ ｄＭＴａｓｅと共に、異なる期間、トリチル化水の存在下で
インキュベートし、次いで、ＤＮＡｓを３’ｄＮＭＰｓに消化し、５つの可能な
ｄＮＭＰｓのそれぞれについての非放射能標準と共にＴＬＣ上で分離し、トリチ
ウム感受性画像処理プレートに晒した。図４Ｄに示すように、ｄＭＴａｓｅは、
メチル化ＤＮＡ内、時間依存性様式で、メチル化ＤＮＡを基質として用いた場合
にのみ、トリチル化水素の水からｄＣＭＰへのトランスファーを触媒する。図３
および４に記載された実験に基づいて、我々は、ｄＭＴａｓｅが、ＤＮＡ内のシ
トシン５’位で、水からの水素と共に、メチル基の変換を触媒し、そしてメチル
基は、残った水酸基と反応してメタノールを形成することを、提案する（図５）
。 ＤＮＡ ｄＭＴａｓｅの基質および配列特異性 ＣｐＧジヌクレオチドのメチル化は、ゲノムＤＮＡ８，４８内で起こる最も特
徴的な修飾である。図６で示された結果は、ＤＮＡ ｄＭＴａｓｅが、異なる頻
度で分布する様々な配列に隣接するＤＮＡ内で全メチル化したまたは半メチル化
ｄＣｐｄＧを脱メチル化するが、ジヌクレオチドＣＧ内に存在しないメチル化ア
デニンまたはメチル化シトシンは脱メチル化しない、一般的なＤＮＡ ｄＭＴａ
ｓｅ活性であることを、示している。第一に、図６ａに示すように、インビトロ
では、Ｍ．ＳｓｓＩのすべてのｄＣｐｄＧ部位およびＭ．ＭｓｐＩ（配列＊ＣＣ
ＧＧ中の外のＣをメチル化し、即ちＣＣヌクレオチドにおける脱メチル化の測定
を可能にする）のすべてのｄ＊ＣｄＣｄＧｄＧ部位でメチル化され、そしてイン
ビボでは、大腸菌ＤＣＭ ＭｅＴａｓｅではｄＣｍｄｃｄＡ／ｄＴｄＧｄＧ部位
およびＤＡＭ ＭｅＴａｓｅではｄＧｍｄＡｄＴｄＣ部位（アデニンのメチル化
）をメチル化したプラスミドＤＮＡは、ｄＭＴａｓｅで処理され、プラスミドの
メチル化状態を、望ましいメチル化感受性制限酵素を用いて決定した。ｄＭＴａ
ｓｅは、ＨｐａIIおよびＨｈａＩに対するｄＭＴａｓｅ処理プラスミドの感受性
によって示されるように、Ｃ＊Ｇメチル化部位を脱メチル化するが、ＭｓｐＩお
よびＥｃｏＲII制限酵素に対する耐性によって示されるようにＣ＊Ｃ、Ｃ＊Ａま
たはＣ＊Ｔメチル化部位を、またはＤｐａＩに対するその感受性によって示され
るようにメチル化アデニンを脱メチル化しない。第二に、ｄＭＴａｓｅ処理後の
Ｍ．ＳｓｓＩ内に位置する５メチル化Ｃ＊Ｇ部位のメチル化の亜硫酸水素塩マッ
ピング分析は、すべてのＣ＊Ｇ部位がそれらに隣接する配列にかかわらず脱メチ
ル化され、それ故、脱メチル化がＣＣＧＧまたはＣＧＣＧ配列に制限される可能
性が排除される（図６Ｂ）。第三に、ｄＭＴａｓｅは、２つの完全にメチル化さ
れたシトシンを持つオリゴマー［ｄｍＣ32ｐｄＴ］ｎ、［ｍｄＣ32ｐｄＴ］ｎを
脱メチル化せず、このことは、ｍｄＣｐｄＡおよびｍｄＣｐｄＴがＤＮＡ ｄＭ
Ｔａｓｅによって脱メチル化されないことを示している（図６Ｄ）。第四に、ｄ
ＭＴａｓｅは、半メチル化された合成基質［ｄＣｐｄＧ］ｎ＊［ｍｄＣ32ｐｄＧ
］ｎを脱メチル化する（図６Ｄ）。ＳＫの脱メチル化はこのような条件下では完
全であり（図６Ａ）、一方、メチル化［ｍｄＣｐｄＧ］ｎ基質の脱メチル化は、
同条件下では完全ではない（図６Ｄ）。これは、基質の配列組成およびメチル化
シトシンの頻度の差を反映している可能性がある。［ｍｄＣｐｄＧ］は、プラス
ミドＤＮＡよりモル当たり平均で１６倍多いメチル化シトシンを含んでいる。代
わりに、これらの差は、用いたアッセイの矛盾、制限酵素消化：最も近い分析、
を反映しているであろう。この矛盾を解決するために、我々は、全メチル化ＳＫ
プラスミドを［α32Ｐ］ｄＣＴＰ、５−メチル−ｄＣＴＰおよび別のｄＮＴＰｓ
で標識し、それをｄＭＴａｓｅ処理し、反応開始後、異なる時間、モノヌクレオ
チドにまで消化し、そしてサンプルをＴＬＣ分析にかけた。図６Ｃに示すように
、ＳＫプラスミドは、３時間で完全に脱メチル化され、これはメチル化感受性制
限酵素で得られた結果と一致する（図６Ａ）。
【００５４】 半メチル化および全メチル化されたＤＮＡについてのＤＮＡ ｄＭＴａｓｅの
Ｋｍは、異なる濃度の基質での反応物の初期揮発性を測定することによって、定
量した（表２）。半メチル化ＤＮＡについて計算されたＫｍは、６ｎＭであり、
両鎖をメチル化されたＤＮＡのＫｍ（２．５−３ｎＭ）より２倍高い（表２）。
基質へのアフィニティーでのこのわずかな差が細胞状況にいくらかの意味をもつ
か否かについては、未だ明らかではない。このように、ＤＮＡ ＭｅＴａｓｅと
同様に、ＤＮＡ ｄＭＴａｓｅもジヌクレオチド配列選択性を示すが、半メチル
化基質に選択性を示すＤＮＡ ＭｅＴａｓｅの差の内、ｄＭＴａｓｅは、全メチ
ル化されたＤＮＡを好み、それは、確立されたメチル化パターンを変える、ＤＮ
Ａ ｄＭＴａｓｅの役割と一致する。
【００５５】
【表１】
【００５６】
【表２】
【００５７】 デメチラーゼ発現ベクターのクローニングおよび構築 推定されるデメチラーゼ候補ｃＤＮＡのＭＢＤドメインのＰＣＲ増幅 ヒトの小さい肺癌細胞系Ａ５４９から調製された全ＲＮＡ（１μｇ）は、製造
者ら（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）による推奨の条件に従って、２５μｌの反応容量中
、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素およびランダムプライマー（Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ）を用いて逆転写された。５μｌの逆転写されたｃＤＮＡを、以下のプ
ライマーセット：センス５’ＣＴＧＧＣＡＡＧＡＧＣＧＡＴＧＴＣ３’（配列番
号９）、アンチセンス５’ＡＧＴＣＧＴＴＴＡＣＣＣＴＡＴＴＴＴＧ３’（配列
番号１０）：を用いて、Ｔａｑプロモーター（Ｐｒｏｍｅｇａ、１ユニット）と
ともに、増幅反応させた。
【００５８】 増幅条件は：段階１；９５゜Ｃで１分間：段階２；９４゜Ｃで０．５分：段階
３；４５゜Ｃで０．５分：段階４；７２゜Ｃで１．５分：段階２−４を３０回繰
り返す：であった。ＭｇＣｌ2を、製造者らの推薦する条件に従って、１ｍＭに 調整した。ＰＣＲ生成物をｐＣＲ２．１ベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）内に
クローン化し、ｃＤＮＡｓの配列を、Ｔ７ ＤＮＡ配列決定キット（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ）を用いて、ジデオキシ鎖終止法によって確かめた。増幅されたフラグ
メントをＥｃｏＲＩでプラスミドより切り出し、製造者らのプロトコールに従っ
てＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒランダムプライムラベリングキットとα３２Ｐ−ｄＣＴ
Ｐで標識した。標識されたプローブを用いて、標準法に従って、ＨｅＬａ細胞ｃ
ＤＮＡライブラリーをλＴｒｉｐｌＥｘファージ（Ｃｌｏｎｔｅｃｋ）内でスク
リーニングした。陽性クローンを同定し、さらに４回の一連希釈によって精製し
た。ｐＴｒｉｐｌＥｘプラスミド内への挿入物を製造者らのプロトコールに従っ
て、ファージから切り出し、挿入物の同一性は、配列決定によって確認される。
挿入物をＮｏｔＩ制限酵素で切り出し、センスおよびアンチセンス方向で誘導可
能な発現ベクター：Ｒｅｔｒｏ ｔｅｔ ｏｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）：または、
全３フレームでしかもアンチセンス方向でｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ Ｘｐｒｅ
ｓｓベクターのいずれかに、サブクローン化した。 脊椎動物細胞内でのデメチラーゼのトランスフェクションおよび発現 １０μｇのＲｅｔｒｏ ｔｅｔ ｏｎデメチラーゼまたはｐｃＤＮＡ ３．１
／Ｈｉｓ Ｘｐｒｅｓｓデメチラーゼのいずれかを、８μｌのトランスフェクシ
ョン親油性試薬Ｐｆｘ−２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、製造者らのプロ
トコールに従って、ＯＰＴＩＭＥＭ培地内で４時間、１００，０００のマウス（
３Ｔ３ Ｂａｌｂ／ｃ、ヒト（Ａ５４９）またはサル細胞（ＣＶ−１）上に置い
た。細胞を４８時間後に収集し、脱メチル化およびデメチラーゼ活性は、標準技
術を用いて全ゲノムＤＮＡメチル化を、またはＨｐａII／ＭｓｐＩ制限酵素分析
を用いてインビトロでコトランスフェクトしたメチル化プラスミドを、測定する
ことによって、定量した。細胞トランスフェクションを、軟寒天アッセイで測定
する。 ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）プラスミドの脱メチル化 約４μｇのプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ
）を、ＳｓｓＩメチラーゼを用いてメチル化した。メチル化されたプラスミド（
４ｎｇ）を、３０μｌのＤＮＡ ｄＭＴａｓｅ（標準条件下ではＤＥＡＥ−Ｓｅ
ｐｈａｃｅｌTMカラムの画分４）と共に、示された異なる時点でインキュベート
し、フェノール：クロロホルムで抽出し、そしてエタノールで沈殿させた。約１
μｇのプラスミドを、それぞれ１０ユニットの制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲ
II（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）、ＤｐｎＩ、またはＨｐａII（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ
ｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）のいずれかで、メチル化の前後ならびにＤＮＡ ｄＭＴａ
ｓｅ処理後、反応容量１０μｌ、３７゛Ｃで２時間、消化した。制限消化の後、
プラスミドをフェノール：クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿させ、そして
１０μｌに再縣濁した。０．８％（ｗ／ｗ）アガロースゲル上で、プラスミドを
電気泳動し、ＨｙｂｏｎｄTM Ｎｙｌｏｎ膜上に移し、そして、ランダムプライ
ミング（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）によって32Ｐ標識した、ｐ
Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）プラスミドとハイブリダイズした。 ｄＭＴａｓｅ活性は、変性条件下でサイズ決定した場合、−４５ｋＤａポリペプ
チドと共に溶出されるが、非変性条件下では、より高分子量複合体として移動す
る ｄＭＴａｓｅは、クロマトグラフィーの４段階で最大で５００，０００倍に精
製された（表１）。我々は、最初に、活性画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって
、ｄＭＴａｓｅ活性と関連するポリペプチドの同一性を決定した。図７ａに認め
られるように、〜４４ＫＤａから３５ＫＤａの４つのポリペプチドバンドのくラ
スターは、最終の２段階のクロマトグラフィーでｄＭＴａｓｅと共に溶出する（
より低分子のフラグメントは、ｚとのクロマトグラフィー段階でのその多さによ
って明らかにされるように分解生成物であろう）。しかしながら、活性なＤＥＡ
Ｅ−セファセル画分を、４％の非変性アクリルアミドカラム上でサイズ分画する
場合、ｄＭＴａｓｅ活性は、〜１７０ＫＤａの高い分子量で溶出する（図７Ｃ、
画分６３）。この画分６３のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、活性なクロマトグラフ画
分内で認められた（図７Ａ）２つのバンドのみが現れた（図７Ｂ）。さらに、ｄ
ＭＴａｓｅがマルチマーの複合体内に認められるか否かを決定するために、画分
６３をグリセロール勾配上でサイズ分画し（図７Ｄ）、そしてＤＮＡ ｄＭＴａ
ｓｅ活性は、〜１７０ｋＤａの範囲で溶出した。２つの主な小ポリペプチドのみ
が画分６３内に同定された（おおよそ３５−４３ＫＤａ）ので、ｄＭＴａｓｅは
、多分、２つのペプチドの１つのみがｄＭＴａｓｅである場合にはホモメリック
複合体または両方のポリペプチドがｄＭＴａｓｅ活性と関連する場合にはヘテロ
メリック複合体のいずれかであることがわかる。 ａ．ｄｂＥＳＴのホモロジーサーチによるリードＤＮＡ ｄＭＴａｓｅ候補の同
定 ｄＭＴａｓｅが極めて低い富裕性であることをｄＭＴａｓｅの精製が示唆する
とおり、たった約１９ｎｇのｄＭＴａｓｅしか６ｍｇの核抽出物から単離できず
（表１）、我々は、ｄＭＴａｓｅの以下の機能性に基づいてｄＭＴａｓｅをクロ
ーン化することに決めた。第１に、ｄＭＴａｓｅはメチル化されたＣＧジヌクレ
オチドを特異的に脱メチル化するので、我々は、ｄＭＴａｓｅがメチル化された
ＣＧジヌクレオチドを認識する能力を有するべきであると推定した。第２に、該
デメチラーゼはＤＮＡ中のメチル化シトシンをシトシンに変換する。第３に、該
デメチラーゼはメチル基を揮発性化合物として放出する。
【００５９】 以前の報告は、メチル化ＤＮＡと相互作用する蛋白質は共通のドメインを共有
する（ＭＤＢＤ）ことを示してきた。ｄｂＥＳＴデータベースのＴＢＬＡＳＴＮ
サーチは、（Ｔ−細胞リンパ腫ホモサピエンスｃＤＮＡ５’末端から）新規な発
現タグｃＤＮＡ（ｇｂ／ＡＡ３６１９５７／ＡＡ３６１９５７ＥＳＴ７１２９５
）およびＭＤＢＤに類似性を有する未知の機能を伴うマウス類似体（（ｇｂ／Ｗ
９７１６５／Ｗ９７１６５ｍｆ９０ｇ０５．ｒ１）ソアレスマウス胚ＮｂＭＥ１
３．５から）を同定した（図８ａ）。ジェンバンクデータベースのサーチは、そ
れが、ジェンバンクに含まれなかった新規なｃＤＮＡであることを実証した。新
規なＥＳＴおよびＭｅＣＰ２およびＭｅＣＰ１関連蛋白質の並置は、このメチル
化されたＤＮＡ結合蛋白質に関して異なる機能と一致する、以前に特性決定され
たＭＤＢＤ以上の相同性を示さなかった。該サーチにおいて同定された配列を有
する２０１ｂｐの断片をヒト肺癌細胞系Ａ５４９のＲＮＡから逆転写し、増幅し
、そしてＨｅＬａ細胞からのｃＤＮＡライブラリーをスクリーンするために用い
た。クローン化されたもっとも大きな挿入物は１．３６ｋｂのサイズであり、そ
してその配列と上記ＥＳＴ配列との同一性を決定した。該ｃＤＮＡは新規であり
、そしてジェンバンクにおける相同性を有さず、そしてそれに対してかつて何の
機能も割り当てられたことがない。該蛋白質の仮想上の翻訳は２６２アミノ酸の
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を同定した（図８ｂ）。該ＯＲＦは、
このＡＴＧの上流においてインフレームの停止コドンが見いだせないので、さら
に５’に伸びるかもしれない。しかしながら、ＲＡＣＥ分析およびさらなるｄｂ
ＥＳＴのサーチは、我々のスクリーニングにおいて同定されたものの上流の５’
配列を同定しそこなった。
【００６０】 蛋白質ドメインファミリーのデータベースに対する予測蛋白質サーバー（Ｐｒ
ｅｄｉｃｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｒｖｅｒ）を用いた該候補蛋白質のＢＬＡＳ
Ｔサーチは、ＭＤＢＤドメインしか同定せず、そしてデータベースサーチにおい
て該配列に対する何の相同性も見いださなかった。プロサイト分析により別の機
能性モチーフは同定されなかった。これは、この蛋白質に関する新規な生化学上
の機能と一致する。該配列のコイルドコイル予測は、蛋白質蛋白質相互作用にお
いて役割を担うことが知られているコイルドコイルドメインを同定した。
【００６１】 同定されたｃＤＮＡはヒトポリＡ＋ｍＲＮＡのノーザンブロット分析により明
らかにされたとおり（図８ｃ）、クローン化されたｃＤＮＡのサイズに接近した
約１．６ｋｂの一つの主要な転写物として、ヒト細胞中で広く発現されるｍＲＮ
Ａをコードすることから、該クローン化されたｃＤＮＡは高頻度繰り返しＲＮＡ
を表さず、むしろ単コピーまたは低コピー数の遺伝子によりコードされるｍＲＮ
Ａを表すことを実証する。 インビトロ翻訳された候補ｃＤＮＡはｄＭＴａｓｅ活性を有する 本当にＤＮＡを脱メチル化する一つの蛋白質の存在に関する結論的証明は、単
離された系において、インビトロ翻訳された候補ｃＤＮＡがメチル化ＤＮＡから
メチル基を揮発させ、そしてメチルシトシンをシトシンに変換できることを証明
することである。該候補ｄＭＴａｓｅのｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ
Ｘｐｒｅｓｓ（インビトロジェン）発現ベクター中に仮想翻訳フレームにてサブ
クローン化し（ｐｃＤＮＡ３．１Ｈｉｓ Ｂ）、そして35Ｓ−メチオニン存在下
でインビトロにおいて転写および翻訳し、その結果の翻訳産物をＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにより分析した。オートラジオグラフは、約４０ｋＤａの蛋白質を明らかにし
た（図１０ａ）。インビトロ翻訳された蛋白質の見かけ上のサイズは、精製され
た蛋白質の見かけ上のサイズよりも約３．５ｋＤａ短い。クローン化されたｃＤ
ＮＡは上記議論のとおりいくらかの上流アミノ酸を欠くのかもしれないし、ある
いはヒト細胞中で別の修飾をされるのかもしれない。
【００６２】 ２つの試験が、インビトロ翻訳された候補ｃＤＮＡが真正なｄＭＴａｓｅであ
るか否かを立証した。我々は、第１に、インビトロ翻訳された蛋白質（Ｎｉ２＋
荷電されたアガロース樹脂上で精製された）が［3Ｈ］−ＣＨ3−ＤＮＡにおいて
メチル残基を揮発させて放出することができるか否かを、放射性トラッピング揮
発アッセイにおいて試験した。揮発されたカウントが真の3Ｈカウントであるこ とを実証するため、スペクトル分析を実施した。図１０ｂにおいて示されるとお
り、トリチウム化メチル残基の揮発はミスフレームｄＭＴａｓｅ（ミスフレーム
）において観察されないのに対して、インビトロ翻訳された仮想ｄＭＴａｓｅの
ｃＤＮＡは3Ｈ−ＣＨ3残基の揮発を触媒し、シンチレーションカクテル中にトラ
ップされる。
【００６３】 第２に、インビトロ翻訳されたｄＭＴａｓｅのｃＤＮＡは、［32Ｐ］−アルフ
ァ−ｄＧＴＰ標識プラスミドＤＮＡまたは［メチル−ｄＣ３２ｐｄｇ］ｎ二本鎖
オリゴマーＤＮＡ中のＣＨ3−シトシンをシトシンに変換する一方、フレームシ フトのインビトロ翻訳されたｄＭＴａｓｅはＤＮＡを脱メチル化しない（図１０
ｄ）。これは、ｄＭＴａｓｅ活性がｄＭＴａｓｅ翻訳産物に依存し、そして仮想
ｄＭＴａｓｅと共に同時精製する（ｃｏｐｕｒｉｔｉｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ
ｐｕｔａｔｉｖｅ ｄＭＴａｓｅ）インビトロ翻訳キット中に見いだされる汚染
活性でないことを証明する。インビトロ翻訳されたｄＭＴａｓｅにより実施され
た反応が示すことは：インビトロ翻訳された産物の投薬量への依存性（図１０ｃ
）、時間依存性（図１０ｄ）および翻訳された蛋白質への依存性（図１０ｂおよ
びｄミスフレーム、図１０ｃプロテアーゼＫ処理）。参酌すると、これらの結果
は、ここでクローン化されたｃＤＮＡが真正な酵素ＤＮＡデメチラーゼ活性をコ
ードすることを強く示唆する。 一時的にトランスフェクトされたｄＭＴａｓｅのｃＤＮＡはＤＮＡを脱メチル化
する ｄＭＴａｓｅのｃＤＮＡおよびｐｃＤＮＡ３．１ＨｉｓＣベクター対照を一時
的にヒト胚腎臓細胞にトランスフェクトすることにより、該ｃＤＮＡがヒト細胞
においてｄＭＴａｓｅ活性の発現を直接指示することができるか否かを試験した
。Ｈｉｓ−付加された蛋白質をＮｉ２＋アガロース樹脂に結合させ、そしてイミ
ダゾール濃度を上昇させることにより該樹脂から溶出した。トランスフェクトさ
れたｄＭＴａｓｅの発現はウエスタンブロット分析により確認された（図１１ｂ
）。放射性トラッピング揮発アッセイ１を用いて［3Ｈ］−ＣＨ3−ＤＮＡ中のメ
チル残基を揮発して放出するそれらの能力に関して、イミダゾール画分をアッセ
イした。図１１ａに見られるとおり、ｄＭＴａｓｅトランスフェクトされた細胞
からのイミダゾール画分は［3Ｈ］−ＣＨ3を放出するのに対して、ｄＭＴａｓｅ
のミスフレーム変異をトランスフェクトされた細胞または非トランスフェクト細
胞からのイミダゾール画分を用いて処理されたＤＮＡ中にはトリチウムカウント
は検出されなかった。一時的に発現されたｄＭＴａｓｅは、ＤＮＡ中のメチル化
シトシンを、２つの異なる基質（図１１ｃおよび１１ｄ）、蛋白質依存性様式（
図１１ｃおよび１１ｅ）で存在するシトシンに変換し、そして該反応は基質依存
性および飽和可能性を表す（図１１ｆ）。一時的に発現されたｄＭＴａｓｅを非
変性グリセロール勾配に負荷してその天然分子量を測定した。ヒト細胞から精製
されたｄＭＴａｓｅに類似して、クローン化されて精製されたｄＭＴａｓｅ活性
は１６０−１９０ｋＤａ範囲に分画された（データは示さず）。これは、コイル
ドコイルドメインによりおそらくは媒介されるクローン化ｄＭＴａｓｅの自己対
合と一致する。 クローン化されたＤＮＡ ｄＭＴａｓｅは５−メチル−シトシンの加水分解を触
媒してメタノールを放出する 我々は、クローン化ｄＭＴａｓｅによりメチル残基が放出される機構を決定し
（図１１）、そしてそれを精製された真正なｄＭＴａｓｅ活性と比較した。非標
識［メチル−ｄＣｐｄＧ］ＤＮＡの量を増加させて、Ａ５４９細胞から精製され
た真正なｄＭＴａｓｅ活性またはクローン化ｄＭＴａｓｅの何れかと共に、［3 Ｈ］の水の存在下で３時間インキュベートして、次にモノヌクレオチドに消化し
、薄層クロマトグラフおよびオートラジオグラフに供した。図１２ａが示すとお
り、シトシン中の［3Ｈ］標識の存在により示されるとおり、両反応は５−メチ ルシトシン中のメチル基を水から付与されたプロトンで置換する。
【００６４】 精製された真正のｄＭＴａｓｅ活性により触媒された脱メチル化反応における
残りのメチル基の正体は、メタノールであることが示された。クローン化ｄＭＴ
ａｓｅにより触媒された脱メチル化反応におけるとおりにメチル残基が離れる形
態を同定するため、反応産物の、同一のガスクロマトグラフ／質量分光分析を１
におけるとおりに実施した。正確に翻訳された形態のｄＭＴａｓｅのみが（イン
キュベート翻訳された場合と一時的にトランスフェクトされて精製された場合の
両者）、質量分光分析においてメタノールのイオン特性（ｉｏｎｓ ｃｈａｒａ
ｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）を生じることができる（３２および２９の質量、図１２ｂ
）。これらの結果は、クローン化ｄＭＴａｓｅにより触媒された脱メチル化反応
が５−メチル−シトシンのシトシンとメタノールへの加水分解であることを示唆
し、精製されたｄＭＴａｓｅ１に関して記載されたとおりである。 ＤＮＡ ｄＭＴａｓｅ活性は非形質転換細胞において検出不可能である 本明細書に記載されたｄＭＴａｓｅ活性に関するアッセイおよびＤＮＡ ｄＭ
Ｔａｓｅ ｃＤＮＡのクローニングは、異なる細胞状態におけるその発現の研究
を可能にする。ＤＮＡの総体的低メチル化は癌細胞における共通の観察である。
これは当惑させる観察であるが、なぜなら、ＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ活性は癌細胞
において上昇するからである。ＤＮＡ ＭｅＴａｓｅ活性の高活性化は、癌の発
生において役割を担うことが提案されてきた。このパラドックスを解明するため
に以前に示唆された一つの単純な説明は、癌細胞が、誘発されたレベルのＤＮＡ
ｄＭＴａｓｅを発現することである。我々は、多くのカルシノーマ細胞系Ｈ４
４６，Ｃｏｌｏ２０５，ＨｅＬａ，およびＡ５４９から調製されたＤＥＡＥ−セ
ファデックス分画核抽出物（画分９−１０）の等濃度中のＤＮＡ ｄＭＴａｓｅ
活性を、ヒト皮膚繊維芽細胞からの類似調製物と、初期比率条件にて、［ｍｄＣ
３２ｐｄＧ］ｎ二本鎖オリゴマーを基質として用いて比較した。図１３ａに観察
されるとおり、ＤＮＡ ｄＭＴａｓｅ活性は全てのカルシノーマ細胞系において
容易に観察されたが、それは、非形質転換ヒト細胞においては検出不可能である
。ヒト始原細胞中のｄＭＴａｓｅ活性の不在はインビボの状況を反映するが、ｄ
ＭＴａｓｅ活性が別のマウス組織からの調製物において検出されず、一方で、ｄ
ＭＴａｓｅ活性はＨ−Ｒａｓプロトオンコジーンをトランスフェクトされたマウ
スカルシノーマ細胞系Ｐ１９、またはマウスの同じ株において異種移植片として
運ばれるヒト腫瘍には存在するからである（図１ａ：ＣＯＬＯ ２０５，Ａ５４
９．ＨｅＬａ）。これらの結論は、図１３ｃに示される放射性−トラッピング揮
発アッセイを用いて実証された。
【００６５】 ｄＭＴａｓｅのｍＲＮＡは全ての正常ヒト組織において感受性ポリＡ＋ノーザ
ンブロットを用いて検出されたから、我々は、正常組織における検出されたｄＭ
Ｔａｓｅ活性の不在が正常組織と癌系の間のＤＮＡ ｄＭＴａｓｅ ｍＲＮＡ中
の量的差異を反映するという仮説を試験した。全ＲＮＡを用いた図１３ｄに示す
スロットブロット分析によるｄＭＴａｓｅ ｍＲＮＡのノーザンブロット分析お
よび定量は、この仮説を支持する。僅かなレベルのｄＭＴａｓｅのｍＲＮＡが正
常組織において検出されるが、高いレベルのｄＭＴａｓｅはＨａ−ｒａｓの３０
倍増幅を有するマウスカルシノーマ細胞系Ｙ１において発現される。 第２のＤＮＡデメチラーゼｄＭＴａｓｅ２がヒトおよびマウスにおいて同定され
た ヒトおよびマウスからのｄＭＴａｓｅ１およびｄＭＴａｓｅ２両方のｃＤＮＡ
配列、予測されたアミノ酸配列、およびジェンバンクの加盟番号を示す。我々は
、該２つの蛋白質の高いレベルの同一性（図９ｃおよびｅ）は、該２つの蛋白質
が同じ機能のＤＮＡメチル化を実施できることを示唆すると確信する。ｄＭＴａ
ｓｅ１とｄＭＴａｓｅ２のＮ−末端はメチル化ＤＮＡ結合ドメイン（ＭＢＤ）を
含み、そしてそれらのＣ−末端近傍はコイルドコイルドメインであるが、しかし
ながら、該蛋白質配列の中部はあらゆる公知の構造モチーフまたは触媒モチーフ
と相同性を有さない。重要なことに、それらの中部領域が一層広範囲に相同であ
ることから、デメチラーゼ活性の触媒部位が両蛋白質においてこのエリアに存在
することを示唆する。 アンチセンス方向におけるＤＮＡデメチラーゼの誘発された発現はエクスビボに
おいて腫瘍発生を阻害する ＤＮＡ ｄＭＴａｓｅの阻害が腫瘍発生を阻害できるとの仮説を試験するため
、センスあるいはアンチセンスの方向の何れかにおいてヒトｄＭＴａｓｅ１のｃ
ＤＮＡを運ぶテトラサイクリン誘発可能ベクターを構築して、一時的にヒトＨＥ
Ｋ２９３細胞にトランスフェクトし、ドキシサイクリン（テトラサイクリン類似
体）の存在または不在下の何れかで４８時間処理し、最後の２４時間にプロマイ
シンで選択し、そしてソフトアガー上にプレートして７日間生育させた。７日後
、コロニーを数えたところ、データは、アンチセンス方向におけるｄＭＴａｓｅ
１のｃＤＮＡのドキシサイクリン誘発発現がコロニー形成を減じさせたことを明
確に示した（図１５）。 イミダゾールはＤＮＡデメチラーゼ活性の小分子阻害剤である 鋳型の小分子イミダゾールを、ＤＮＡ ｄＭＴａｓｅ活性を阻害する能力に関
して試験した。放射性メチル残基アッセイの揮発において、１μＭから１０ｍＭ
のイミダゾール濃度を上記のとおり放射性メチル残基の典型的揮発中でインキュ
ベートした。グラフは、イミダゾールのＤＮＡ ｄＭＴａｓｅ活性の投薬量依存
性阻害を明確に証明し、そしてＤＮＡ ｄＭＴａｓｅ活性の阻害剤としてイミダ
ゾールに基づく分子を試験するための論理的解釈を根拠あるものにする。 ＤＮＡデメチラーゼｃＤＮＡおよび蛋白質配列の同定 図９ａは、ヒトｄＭＴａｓｅ１のｃＤＮＡ配列（配列番号：１）およびその予
測されたアミノ酸配列（配列番号：２）を示し、そのジェンバンク位置を含む。
図９ｂは、ヒトｄＭＴａｓｅ２のｃＤＮＡ配列（配列番号：３）およびその予測
されたアミノ酸配列（配列番号：４）を示し、そのジェンバンク位置を含む。図
９ｃは、ヒトｄＭＴａｓｅ１とヒトｄＭＴａｓｅ２の蛋白質配列の並置を示す。
図９ｄは、マウスｄＭＴａｓｅ１のｃＤＮＡ配列（配列番号：５）およびその予
測されたアミノ酸配列（配列番号：６）を示し、そのジェンバンク位置を含む。
図９ｅは、マウスｄＭＴａｓｅ２のｃＤＮＡ配列（配列番号：７）およびその予
測されたアミノ酸配列（配列番号：８）を示し、そのジェンバンク位置を含む。
図９ｆは、マウスｄＭＴａｓｅ１とマウスｄＭＴａｓｅ２の蛋白質配列の並置を
示す。
【００６６】 本発明はその特定の態様との関連において記載されてきたが、さらなる修飾が
可能であり、そして本出願は発明のあらゆる変更、使用または適合を含むことを
意図し、一般には発明の原理に従い、そして本開示からのそのような逸脱を含み
、発明が属する分野において公知のあるいは慣用の実施の範囲内であるとして、
および前記本質的特徴に適用してよいものとして、そして特許請求の範囲に従う
ことが理解されることになる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 Ａ−Ｂは、ヒトＡ５４９細胞からのデメチラーゼ（ＤＮＡ ｄＭ
Ｔａｓｅ）の精製について説明している。
【図２】 ＡおよびＣは、ＤＮＡ ｄＭＴａｓｅがＲＮＡによって阻害され
る蛋白質であり、ｄｄＣＴＰ、ｍｄＣＴＰによって阻害されないことを示し； ＢおよびＤは、ＤＮＡ ｄＭＴａｓｅ活性の速度論を示している。
【図３】 Ａ−Ｃは、ＤＮＡ ｄＭＴａｓｅ活性の生成物がシトシンであり
、エキソヌクレアーゼまたはグリコシラーゼ活性を示すことを、示している。
【図４】 Ａ−Ｃは、脱メチル化反応が揮発性残基としてメタノールを遊離
することを示し； Ｄは、水からプロトンをトランスファーし、シトシンを再生成することを示し； Ｅ−Ｆは、揮発性生成物がメタノールであることを示している。
【図５】 提案された脱メチル化反応を示している。
【図６】 Ａ−Ｄは、ＤＮＡ ｄＭＴａｓｅの基質特異性を示している。
【図７】 Ａ−Ｄは、ヒトＡ５４９細胞からのｄＭＴａｓｅのクロマトグラ
フによる単離について示している。
【図８】 Ａ−Ｂは、ＭｅＣＰ２のＭＤＢドメインおよびデメチラーゼおよ
びヒトデメチラーゼの予想させるアミノ酸配列間の並置を示し； Ｃは、デメチラーゼによってコードされたｍＲＮＡを示している。
【図９】 Ａ−Ｆは、デメチラーゼのｃＤＮＡおよびそれらの予想アミノ酸
配列、ならびに本発明との相同性（配列番号１−８）を示している。
【図１０】 Ａ−Ｂは、ｄＭＴａｓｅの哺乳動物発現ベクターおよびインビ
トロで翻訳されたｄＭＴａｓｅポリペプチドを示し； Ｃは、インビトロで翻訳されたＤＮＡ ｄＭＴａｓｅがメチル化ＤＮＡから揮発
性メチル基を遊離することを示し； Ｄは、インビトロで翻訳されたＤＮＡ ｄＭＴａｓｅは、メチル化シトシンをシ
トシンにトランスフォームすることを示している。
【図１１】 Ａは、一時的にトランスフェクトされたデメチラーゼがメチル
化ＤＮＡから揮発性残基を遊離することを示し； Ｂは、一時的にトランスフェクトされたデメチラーゼから発現したポリペプチド
を示し； Ｃ−Ｅは、一時的にトランスフェクトされたデメチラーゼが蛋白質依存様式で、
メチル化シトシンをシトシンに変換することを示している。 Ｆは、一時的にトランスフェクトされたデメチラーゼが基質濃度に依存して、メ
チル化シトシンをシトシンに変換することを示している。
【図１２】 Ａは、一時的にトランスフェクトデメチラーゼがトリチル化水
からプロトンのトランスファーを触媒し、シトシンを再生成することを示し； Ｂは、クローン化デメチラーゼがメチル化ＤＮＡからメタノールを遊離すること
を示している。
【図１３】 Ａ−Ｃは、癌細胞がデメチラーゼを発現するのに対して、正常
細胞は発現しないことを、示し； Ｄは、デメチラーゼｍＲＮＡが癌細胞内で高発現することを示している。
【図１４】 Ａは、デメチラーゼ細菌レトロウイルスおよび哺乳動物発現ベ
クターを示し； Ｂは、特異的インヒビターによるデメチラーゼ活性の阻害を示し； Ｃは、デメチラーゼの阻害によるインビトロでの腫瘍発生の阻害を示している。
【図１５】 デメチラーゼアンチセンスベクターの発現を誘導することによ
って、細胞培地内で腫瘍発生が阻害されることを示している。
【図１６】 小分子インヒビターであるイミダゾールによるデメチラーゼの
阻害を示している。
【図１７】 デメチラーゼを阻害することによる、癌増殖の阻害に関するモ
デルを示している。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年２月１４日（２００１．２．１４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ｃ０７Ｋ 16/40 Ａ６１Ｐ 7/06 Ｃ１２Ｎ 9/00 35/00 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｑ 1/25 Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/08 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/25 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ａ６１Ｋ 37/02 33/50 37/48 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，Ｌ Ｕ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ， ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，Ｕ Ｇ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ラムチャンダニ，シャイアム カナダ国オンタリオ エル２ジェイ・２エ イ８，ナイアガラ・フォールズ，ヒルクレ スト・クレセント 5843

Claims (29)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 癌細胞において過剰発現される、約４０ｋＤａを有するＤＮＡ
    デメチラーゼ酵素および／またはその類似体。
  2. 【請求項２】 配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：）１および３に記載された
    配列からなるヒトデメチラーゼをコードするｃＤＮＡ。
  3. 【請求項３】 配列番号５および７に記載されたマウスデメチラーゼをコード
    する、請求項２記載のｃＤＮＡに類似のｃＤＮＡ。
  4. 【請求項４】 細胞中インビトロにおいてまたはインビボにおいて、ヒト、動
    物および植物においてＤＮＡのメチル化パターンを変更するための、請求項２ま
    たは３記載のデメチラーゼのｃＤＮＡの発現の使用。
  5. 【請求項５】 デメチラーゼのｃＤＮＡの発現が哺乳類プロモーターの指示下
    である、請求項４記載の使用。
  6. 【請求項６】 プロモーターがＣＭＶである、請求項５記載の使用。
  7. 【請求項７】 デメチラーゼのｃＤＮＡの発現が、植物においてメチル化を変
    更して植物の発生の状態を変更して植物における外来遺伝子の発現を可能にする
    ための植物特異的プロモーターの下である、請求項４記載の使用。
  8. 【請求項８】 デメチラーゼのｃＤＮＡの発現が、治療プロセスのために癌細
    胞中でデメチラーゼを阻害するためのアンチセンス方向中にある、請求項４記載
    の使用。
  9. 【請求項９】 哺乳類におけるデメチラーゼのｃＤＮＡの発現が、それらの分
    化の状態を変更し、そして治療用に幹細胞を生じ、動物クローニング用に細胞を
    生じ、そして外来遺伝子の発現を改良することである、請求項９記載の使用。
  10. 【請求項１０】 大量のデメチラーゼの生成のための、バクテリアまたは昆虫
    細胞における請求項２または３記載のデメチラーゼのｃＤＮＡの発現の使用。
  11. 【請求項１１】 脊椎動物、昆虫またはバクテリアの細胞における蛋白質生成
    のための、請求項２または３記載のデメチラーゼのｃＤＮＡの発現の使用。
  12. 【請求項１２】 デメチラーゼに対する抗体を生成するための、請求項１１記
    載の使用。
  13. 【請求項１３】 アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムをデザイ
    ンするための鋳型としての、請求項２または３記載のデメチラーゼのｃＤＮＡの
    発現の使用。
  14. 【請求項１４】 デメチラーゼに対するポリクローナルまたはモノクローナル
    抗体を生成するための、請求項２記載のデメチラーゼの予測されたペプチド配列
    の使用。
  15. 【請求項１５】 診断および治療の目的のためにデメチラーゼと相互作用する
    蛋白質を同定するための、酵母における２ハイブリッド系における、請求項２ま
    たは３記載のデメチラーゼのｃＤＮＡの発現の使用。
  16. 【請求項１６】 治療および生物工学のためおよびｘ線結晶構造を得るための
    デメチラーゼ阻害剤の高処理量スクリーニングのために大量のデメチラーゼを生
    成するための、バクテリア、脊椎動物または昆虫細胞中における、請求項２また
    は３記載のデメチラーゼのｃＤＮＡの発現の使用。
  17. 【請求項１７】 工程： ａ）メチル化ＤＮＡサンプル中に存在するメチル−シトシンをＤＮＡ中に存在
    するシトシンに変換してメチル基を揮発させるために、転写されて翻訳された請
    求項２または３記載のデメチラーゼを用い；そして ｂ）活性なデメチラーゼ阻害剤の指標として揮発メチル基の不在または微量の
    揮発メチル基を測定すること からなる、治療剤および抗癌剤としての脱メチル化阻害剤の高処理量スクリーニ
    ングのための揮発アッセイ。
  18. 【請求項１８】 工程： ａ）メチル化ＤＮＡ中に存在するメチル−シトシンのＤＮＡ中に存在するシト
    シンへの変換およびメタノールとして放出されるメチル基の揮発を測定すること
    により患者サンプル中のデメチラーゼ活性を測定し；そして ｂ）上記患者サンプル中の癌の指標として揮発メチル基の存在または微量の揮
    発メチル基を測定すること からなる、患者サンプル中の癌の診断のための揮発アッセイ。
  19. 【請求項１９】 癌治療、患者ＤＮＡ中の異常なメチル化パターンの回復、ま
    たは患者ＤＮＡ中のメチル化パターンを変化させるための、医薬の製造のための
    、請求項１または２記載のＤＮＡデメチラーゼのアンタゴニストまたは阻害剤の
    使用。
  20. 【請求項２０】 アンタゴニストが、５０ｎＭのＫｉにおいてデメチラーゼを
    阻害する二本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項１９記載の使用。
  21. 【請求項２１】 オリゴヌクレオチドが 【化１】 である、請求項２０記載の使用。
  22. 【請求項２２】 阻害剤が、抗−ＤＮＡデメチラーゼ抗体またはＤＮＡデメチ
    ラーゼのアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは小分子からなる、請求項１９記
    載の使用。
  23. 【請求項２３】 メチル化パターンの変化がサイレント遺伝子を活性化する、
    請求項１９または２２記載の使用。
  24. 【請求項２４】 サイレント遺伝子の活性化が遺伝的欠陥の修正を許容する、
    請求項２３記載の使用。
  25. 【請求項２５】 遺伝的欠陥がβ−地中海貧血または鎌状細胞貧血である、請
    求項２４記載の使用。
  26. 【請求項２６】 ＤＮＡ上のメチル基をインビトロにおいて除去するための、
    請求項１記載のデメチラーゼの使用。
  27. 【請求項２７】 細胞の分化状態を変更することにより遺伝子治療、幹細胞選
    択または細胞クローニングを可能にする、請求項１記載のデメチラーゼまたは請
    求項２記載のそのｃＤＮＡの使用。
  28. 【請求項２８】 ベクター媒介遺伝子治療を用いて癌細胞内のメチル化を阻害
    するための、請求項１記載のデメチラーゼまたは請求項２記載のそのｃＤＮＡの
    使用。
  29. 【請求項２９】 患者からのサンプル中の請求項１記載のＤＮＡデメチラーゼ
    の発現レベルを決定するが、その際ＤＮＡデメチラーゼの過剰発現が癌細胞の指
    標である、患者における癌の診断のためのアッセイ。
JP2000520577A 1997-11-12 1998-11-12 Ｄｎａデメチラーゼおよびその治療および診断用途 Pending JP2001522607A (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA 2220805 CA2220805A1 (en) 1997-11-12 1997-11-12 Dna demethylase, therapeutic and diagnostic uses thereof
CA2,220,805 1997-11-12
CA 2230991 CA2230991A1 (en) 1998-05-11 1998-05-11 Dna demethylase, therapeutic and diagnosic uses thereof
CA2,230,991 1998-05-11
PCT/CA1998/001059 WO1999024583A1 (en) 1997-11-12 1998-11-12 Dna demethylase, therapeutic and diagnostic uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2001522607A true JP2001522607A (ja) 2001-11-20

Family

ID=25679813

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000520577A Pending JP2001522607A (ja) 1997-11-12 1998-11-12 Ｄｎａデメチラーゼおよびその治療および診断用途

Country Status (5)

Country Link
US (1) US7098012B1 (ja)
EP (1) EP1029058A1 (ja)
JP (1) JP2001522607A (ja)
AU (1) AU1138699A (ja)
WO (1) WO1999024583A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019022578A3 (ko) * 2017-07-28 2019-04-11 서울대학교산학협력단 식물 유래 dna 탈메틸효소를 이용한 동물세포에서의 인터페론의 발현 수준의 증가용 조성물, 항바이러스용 조성물, 및 이를 이용한 방법

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1009802B1 (en) 1997-02-12 2004-08-11 Eugene Y. Chan Methods for analyzimg polymers
US6927065B2 (en) 1999-08-13 2005-08-09 U.S. Genomics, Inc. Methods and apparatus for characterization of single polymers
EP1354064A2 (en) 2000-12-01 2003-10-22 Visigen Biotechnologies, Inc. Enzymatic nucleic acid synthesis: compositions and methods for altering monomer incorporation fidelity
FR2836831B1 (fr) * 2002-03-07 2004-06-25 Centre Nat Rech Scient Combinaison chimiotherapie et antisens de la dna demethylase
AU2003243859A1 (en) * 2002-06-20 2004-01-06 Mcgill University Oligonucleotide inhibitors of mbd2/dna demethylase and uses thereof
EP1941060B1 (en) * 2005-10-28 2012-02-29 The University of North Carolina At Chapel Hill Protein demethylases comprising a jmjc domain
WO2011047269A2 (en) * 2009-10-15 2011-04-21 The University Of North Carolina At Chapel Hill Elongator proteins and use thereof as dna demethylases
US9170193B2 (en) 2013-06-06 2015-10-27 General Electric Company Detecting coolant leaks in turbine generators
US9097657B2 (en) 2013-07-23 2015-08-04 General Electric Company Leak detection of stator liquid cooling system

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100392057B1 (ko) * 1993-11-30 2003-10-30 맥길 유니버시티 세포의 CpG 디뉴클레오티드 내의 시토신의 메틸화를 감소하는 방법

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019022578A3 (ko) * 2017-07-28 2019-04-11 서울대학교산학협력단 식물 유래 dna 탈메틸효소를 이용한 동물세포에서의 인터페론의 발현 수준의 증가용 조성물, 항바이러스용 조성물, 및 이를 이용한 방법

Also Published As

Publication number Publication date
AU1138699A (en) 1999-05-31
US7098012B1 (en) 2006-08-29
EP1029058A1 (en) 2000-08-23
WO1999024583A1 (en) 1999-05-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wang et al. Expression and characterization of a novel thyroid hormone-sulfating form of cytosolic sulfotransferase from human liver
King et al. Expression of UDP-glucuronosyltransferases (UGTs) 2B7 and 1A6 in the human brain and identification of 5-hydroxytryptamine as a substrate
Levesque et al. Isolation and characterization of UGT2B15 (Y85): a UDP glucuronosyltransferase encoded by a polymorphic gene
Kuuranne et al. Glucuronidation of anabolic androgenic steroids by recombinant human UDP-glucuronosyltransferases
Her et al. Human hydroxysteroid sulfotransferase SULT2B1: two enzymes encoded by a single chromosome 19 gene
Fuks et al. Dnmt3a binds deacetylases and is recruited by a sequence-specific repressor to silence transcription
Cheng et al. Studies on the substrate specificity of human intestinal UDP-glucuronosyltransferases 1A8 and 1A10
US7452664B2 (en) Methods for identifying agents which alter histone protein acetylation
US6184211B1 (en) Inhibition of DNA methyltransferase
US6117975A (en) Melanocortin receptor polypeptides MC-3, MC-4, and MC-5
AU642501B2 (en) Steroid 5alpha-reductases
EP0973895B1 (en) Transcription factor islet-brain 1 (ib1)
DePinho et al. Myc family of cellular oncogenes
JP2001522607A (ja) Ｄｎａデメチラーゼおよびその治療および診断用途
WO1999057322A2 (en) Genotyping the human udp-glucuronosyltransferase 1 (ugt1) gene
EP0631584A1 (en) Cancer diagnosis and therapy
JP2001521400A (ja) ケラチノサイト由来カリクレイン
WO2000052173A2 (en) Cloned human sphingosine kinase homologues
JP2001509026A (ja) 新規なヒトメタロチオネイン
JP2002521067A (ja) ヒトのｕｄｐ−グルクロノシルトランスフェラーゼ２ｂ４（ｕｇｔ２ｂ４）、２ｂ７（ｕｇｔ２ｂ７）及び２ｂ１５（ｕｇｔ２ｂ１５）遺伝子の遺伝子型決定
US5985635A (en) Nucleic acids encoding novel human serine/threonine protein kinases
US6599700B1 (en) Methods for detection of transition single-nucleotide polymorphisms
JP4252311B2 (ja) 増大した触媒効率を有するブチリルコリンエステラーゼポリペプチド改変体およびその使用方法
WO2000061813A1 (en) A second mammalian tankyrase
JP2001506850A (ja) 脂肪細胞特異的分化関連タンパク質