DE69232722T2

DE69232722T2 - Verfahren und zusammensetzungen für zelluläre reprogrammierung

Info

Publication number: DE69232722T2
Application number: DE69232722T
Authority: DE
Inventors: Larry J. Smith
Original assignee: University of Nebraska
Current assignee: University of Nebraska
Priority date: 1991-08-23
Filing date: 1992-08-24
Publication date: 2002-12-05
Anticipated expiration: 2012-08-25
Also published as: DE69232722D1; CA2116327C; WO1993003770A1; JP2005320337A; US5654415A; EP0605466A1; ATE221913T1; CA2116327A1; EP2119784A2; EP0605466B1; JPH07508399A; ES2181677T3; EP1271146A1; EP2119784A3; AU2499892A; JP4111463B2; DK0605466T3; EP0605466A4

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren und Zusammensetzungen, die bei der Behandlung von Störungen nützlich sind, bei denen die direkte Ursache für die klinische Störung die Expression eines Differenzierungsprogramms in den primären kranken Zellen ist, welches normalerweise nicht existiert. Derartige Störungen werden nachfolgend als von der gewöhnlichen Form abweichende Programmierungs(AP)-Erkrankungen bezeichnet. Die Erfindung bezieht sich auch auf Verfahren und Zusammensetzungen, die bei der therapeutischen Reprogrammierung von normalen Zellen nützlich sind.
Wie im Folgenden genauer besprochen, bilden die AP-Erkrankungen dieser Erfindung eine neue Krankheitsklassifikation und wird ein neuartiges Pathogenese- Molekularmodell für diese Erkrankungen vorgestellt. Gemäß dem erfindungsgemäßen Molekularmodell ist die grundlegende Krankheit, die bei den AP-Erkrankungen ein Einheitsbild hervorruft, eine spezifische Art einer relationalen Veränderung bei gewissen zellulären. Komponenten, die in die Programmsteuerung involviert sind. Sie ist anders als jeder zuvor beschriebene molekulare krankheitsauslösende Mechanismus. Dieses Modell definiert die Natur der Therapie für diese Erkrankungen, beschränkt das potentielle Set von therapeutisch nützlichen Zielen auf eine relativ kleine Anzahl an Genen und führt zum nicht offensichtlichen Schluss, dass dies die Manipulation von gewissen "normalen" Genen einschließt, ein geeigneter Ansatz für die Behandlung von AP-Erkrankungen ist und somit zu einem einzigartigen Therapieansatz für die AP-Erkrankungen dieser Erfindung führt. Dieses Modell macht die Auswahl von Zielen für eine vorgeschlagene Therapie für jeden Fachmann unkompliziert und zugänglich.
Eine bevorzugte Ausführungsform bezieht sich auf die Reprogrammierung des Zellverhaltens durch die Manipulation von transcriptionellen Regulatoren (TRs). Die Erfindung inkludiert eine Allgemeinbehandlung und Zusammensetzungen für eine solche Behandlung sowie eine in vitro-Manipulation von Zellen vor der Transplantation von solchen Zellen bei einem Wirt in Behandlung.

BESCHREIBUNG DER VERWANDTEN TECHNIK

Jüngste Studien, welche die Verwendung von Antisinn-Oligonucleotiden für die Krebsbehandlung einschließen, wurden von Stein und Cohen, Cancer Res. 48: 2659 (1988), besprochen. Mehrere Arten von Antisinn-Molekülen wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit, die Synthese von gewissen Proteinen zu hemmen, gescreent, wobei sowohl intakte Zellen als auch in vitro-Systeme zur Proteinsynthese verwendet wurden (siehe Ld. und Paoletti, Anti- Cancer Drug Design 2: 325, 1988). Beispielsweise wurde berichtet, dass Mittel mit einer Spezifität für RNA, die aus dem myc-Gen transcribiert wurde, die Wucherung der menschlichen AML-Linie HL60 (Wickstrom, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 1028 (1988) und von normalen T-Lymphocyten (Heikkila, et al., Nature 328: 445 (1987) hemmen, und es wurde berichtet, dass Oligodesoxynucleotide, die zu Cyclin-mRNA komplementär sind, die Teilung von 3T3-Zellen unterdrücken (Jaskulski, et al. 1988).
Vor noch kürzerer Zeit wurde herausgefunden, dass bei der Behandlung von Krebs mit ODNs gegen myb die Wucherung von Leukämiezellen gehemmt wurde, und zwar mit einem gegenüber normalen Zellen geringeren begleitenden Hemmgrad. (Calabretta et al. PNAS, 88, 2351, 1991). Es zeigte sich auch, dass eine vorübergehende Hemmung in einer Leukämiezelllinie zu einem ODN gegen myc führte; es trat jedoch leider eine vergleichbare Hemmung gegenüber normalen Zellen auf (Zon et al-Patent). Dieses Patent offenbart auch die Hemmung einer HIV-Replikation unter Verwendung von auf Virusgene abzielenden ODNs. Belenska et al (Science, 250, 997, 1990) schlugen die Verwendung von doppelsträngigen ODNs vor, welche sich als potentielle therapeutische Mittel für krankheitshervorrufende Gene an TR-Liganden binden. Als Beispiel führen sie die Blockierung der NF-kB-Bindung an einen HIV-Enhancer an. Die Verwendung von Antisinn-Oncogene-tragenden Retrovirenvektoren für die Krebsbehandlung ist bekannt.
Das grundlegende Problem beim vorhergehenden Teil besteht darin, dass er auf der Annahme basiert, dass die Expression von spezifischen Molekularanomalien (geänderte Regulation oder Mutation von endogenen Genen oder Expression von exogenen Genen) in den Krankheitszellen dieser Patienten direkt die klinischen pathologischen Merkmale der AP-Erkrankung hervorruft. Die Folgerung aus einem solchen Denken ist, dass die therapeutischen Strategien auf die Inangriffnahme dieser Molekularanomalien gerichtet sein sollte.
Im Fall von Krebs wurde die in Betracht gezogene Therapie, welche Antisinn- Expressionsvektor-ODNs einschloss, gemäß dem Oncogen/Anti-Oncogen-Krebsmodell auf Oncogene oder gemäß dem Autocrine-Modell auf von Krebszellen exprimierte Wachstumsfaktoren gerichtet. Im Fall von AIDS sind die therapeutischen Strategien, die derartige Mittel einschließen, welche entwickelt werden, auf das Blockieren einer HIV- Expression und/oder Infektion gerichtet. Es sind keine kausalen Mittel als Gegenstück zu den anderen AP-Erkrankungen identifiziert. Folglich sind die sich in Entwicklung befindlichen therapeutischen Ansätze empirischer.
Gemäß dem AP-Erkrankungsmodell ist die grundlegende Pathologie, welche die klinischen pathologischen Merkmale dieser Störungen hervorruft, sowohl relational als auch dynamisch. Im krassen Gegensatz zum Stand der Technik beinhaltet die erfindungsgemäße Therapie die Manipulation von Mustern einer TR-Expression. Die Erfindung liefert einen völlig neuen Ansatz für die Behandlung der ausgewählten Erkrankungen und bietet eine rationale empirische Basis für den Entwurf neuartiger Mittel. Die therapeutische Reprogrammierung von normalem Gewebe unter Einschluss von ODNs ist beispiellos.

KURZFASSUNG DER ERFINDUNG

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Reprogrammierung des Zellverhaltens bereitgestellt, um durch die Manipulation von Mustern einer TR-Expression therapeutische Wirkungen zu erzielen.
Ebenso wird ein Oligonucleotid bereitgestellt, das zur Regulierung einer p53- Expression fähig ist und zwischen 10 und 35 Basen hat, wobei die Basensequenz eine Sequenz SEQ ID NO: 4 und ... umfasst, wenn das Oligonucleotid 20 bis 35 Basen hat, wobei die Basensequenz aus einer aus SEQ ID NO: 4 entnommenen benachbarten Basensequenz besteht, wenn das Oligonucleotid weniger als 20 Basen hat. ... Eine dieses Oligonucleotid umfassende Zusammensetzung ist zur Regulierung der Expression eines TR fähig. Dieser TR wird von den AP-Zellen exprimiert. Die dieses Oligonucleotid umfassende Zusammensetzung ist weiters gekennzeichnet durch die Tatsache, dass sie beim (in der Folge genauer beschriebenen) Reprogrammierungstest dieser Erfindung eine therapeutisch nützliche Veränderung im Zellverhalten aufweist. Es ist anzumerken, dass dieser TR nicht durch HIV codiert wird, wenn die AP-Erkrankung AIDS ist. Im Fall von Krebs ist dieser TR ein (in der Folge genauer besprochenes) erfindungsgemäßes Traitor-Gen und schließt vorzugsweise Oncogene, z. B. fos, myc, myb, rel, jun (in geänderter Form), aus.
Erfindungsgemäß ist ebenso die Verwendung einer dieses Oligonucleotid umfassenden Zusammensetzung bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Individuums mit einer von der gewöhnlichen Form abweichenden Programmierungserkrankung vorgesehen, wobei das Oligonucleotid zur Regulierung von p53 fähig ist, wobei p53 von von der gewöhnlichen Form abweichenden Programmierungszellen exprimiert wird und diese Zusammensetzung beim Reprogrammierungstest eine therapeutisch nützliche Veränderung im Zellverhalten bewirkt.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform, die in der vorliegenden Anmeldung nicht beansprucht wird, besteht in einem Verfahren zur Behandlung eines Individuums mit einer klinischen Störung, welches die Verabreichung einer wirksamen Menge einer Zusammensetzung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem doppelsträngigen ON und einem Antisinn-ON, an dieses Individuum umfasst: Die Zusammensetzung ist zur Regulierung der Expression eines TR fähig. Der TR wird von therapeutisch relevanten Zellen exprimiert und ist weiters gekennzeichnet durch das Aufweisen einer therapeutisch nützlichen Veränderung im Zellverhalten beim erfindungsgemäßen Reprogrammierungstest.
Die hier dargelegte Erfindung verkörpert in erster Linie eine neue Therapieart auf Basis einer Reprogrammierung des zellulären Verhaltens. Die vorliegende Erfindung kann jedoch bei folgenden Verfahren angewendet werden: (1) die Diagnose und/oder Einteilung in Stadien von von der gewöhnlichen Form abweichenden Programmierungserkrankungen durch Analyse der Expression von bestimmten transcriptionellen Regulatoren und deren Varianten in kranken Zellen; und (2) für jedwede gegebene von der gewöhnlichen Form abweichende Programmerkrankung die Verwendung von Testmitteln in vitro zur Bestimmung des optimalen Mittels/der optimalen Mittel für die Behandlung irgendeines bestimmten Patienten.
Diese Verfahren beinhalten ein Verfahren zur Diagnostizierung oder Einteilung in Stadien einer AP-Erkrankung, welches die Identifizierung des relevanten Subsets von TRs, die von AP-Zellen von einem AP-Patienten exprimiert werden, umfasst. Ein weiteres derartiges Verfahren ist ein Verfahren zur Auswahl des wirkungsvollsten Behandlungssystems für eins AP-Erkrankung. Dieses Verfahren umfasst die Identifizierung des relevanten Subsets von TRs, die von AP-Zellen von einem AP-Patienten exprimiert werden. Diese Verfahren werden nachfolgend genauer beschrieben.
Obwohl dies in der vorliegenden Anmeldung nicht beansprucht wird, stellt die Erfindung zusätzlich ein Verfahren zur Behandlung von therapeutisch relevanten Zellen von einem Individuum mit einer klinischen Störung bereit, und zwar vor der Transplantation der Zellen zurück in das Individuum (autologe Transplantat-Ausführungsform). Diese Ausführungsform umfasst folgende Schritte:
a) das Entnehmen von therapeutisch relevanten Zellen vom Individuum und
b) das Aussetzen der therapeutisch relevanten Zelten einer reprogrammierenden Menge eines ON mit einer Sequenz, die zu einer Sequenz von RNA komplementär ist, die aus einem TR-regulierten Gen oder doppelsträngigen ON-Liganden eines in den TR-Zellen vorhandenen transcriptionellen Regulators transcribiert wurde in einer bevorzugten Ausführungsform werden die Zellen aus pränatalem Gewebe oder von einem anderen Spender als dem sich in Behandlung befindlichen Individuum entnommen (allogenes Transplantat).
Die Auswahl des wirkungsvollsten Behandlungssystems für eine AP-Erkrankung bildet eine weitere nicht beanspruchte Ausführungsform dieser Erfindung. Dieses Verfahren beinhaltet die Entfernung und Kultivierung von AP-Krankheitszellen von einem Patienten einer AP-Erkrankung, wobei ein Antisinn-ON für einen TR aus dem relevanten Subset von TRs, die von AP-Zellen von einem AP-Patienten exprimiert werden, oder ein doppelsträngiges ON für die DNA-Bindungsdomäne eines solchen TR spezifisch ist, um die optimale Behandlung zu bestimmen.
Bei der Ausführung der erfindungsgemäßen Verfahren zur Behandlung von AP- Erkrankungen ist die Auswahl der richtigen Ziele entscheidend. Folglich besteht eine wichtige Ausführungsform dieser Erfindung, die in der vorliegenden Anmeldung nicht beansprucht wird, in einem Verfahren zur Auswahl eines Ziels für die Behandlung einer AP- Erkrankung, umfassend (i) die Bestimmung des Subsets von transcriptionellen Regulatoren und ihrer direkten modifizierenden Gene, die vom von der gewöhnlichen Form abweichend programmierten Gewebe, dem entsprechenden normalen Gewebe oder dem konstitutiv selbsterneuernden normalen Gewebe exprimiert werden, oder wahlweise das Durchführen einer ähnlichen Bestimmung für irgendein anderes normales Gewebe, das gemäß dieser Erfindung therapeutisch zu manipulieren ist; (ii) das Hinzufügen oder Abziehen der Expression eines transcriptionellen Regulators/von transcriptionellen Regulatoren oder ihrer direkten modifizierenden Gene von therapeutisch zu reprogrammierenden Zellen und vom geeigneten Kontrollgewebe; (iii) das Erzielen einer Wirkung auf zelluläre Programmierung und Auswahl von potentiellen therapeutischen Mitteln gemäß dem Reprogrammierungstest; (iv) das Testen der Wirkung einer Hinzufügung oder Abziehung der Funktion von bestimmten transcriptionellen Regulatoren, wobei die ausgewählten Mittel verwendet werden (in einem Tiermodellsystem, wenn die therapeutischen Mittel für eine allgemeine Verwendung sind), und (v) das Reduzieren oder Eliminieren jeglicher unerwünschter Nebenwirkungen, die von den potentiellen therapeutischen Mitteln hervorgerufen werden könnten. Diese Ausführungsform wird im Folgenden im Detail beschrieben.
Die Ausnutzung von spezifischen Zelltypunterschieden in einer Ziel-RNA zum Auswählen von differentiell verfügbaren Stellen für eine ON-Bindung bildet eine weitere Ausführungsform dieser Erfindung. Diese Ausführungsform umfasst ein Verfahren zum Zelltyp-abhängigen Abzielen auf spezifische RNA-Transcripte, umfassend das Auswählen eines ON, das zur Anbindung an die RNA fähig ist und zu deren Zerstörung führen kann, und zwar im Gewebe, das therapeutisch zu manipulieren ist, aber nicht im Gewebe, wo durch die Zerstörung dieser RNA Nebenwirkungen hervorgerufen werden. Beispielhaft ist die Verwendung eines auf eine Cyclooxygenase-RNA gerichteten Antisinn-ON, das sich in einem hämopoetischen Gewebe gezielt an diese RNA bindet und sie zerstört, während diese RNA in einem gastrointestinalen Gewebe vermieden wird.
Alle vorhergehenden Ausführungsformen beinhalten die Reprogrammierung des Zellverhaltens, um durch die Manipulation von Mustern einer TR-Expression therapeutische Wirkungen zu erzielen.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

AP-Erkrankungsmodell und Liste

Definition eines "zellulären Programms"

Das mit der Zeit stattfindende koordinierte Aufscheinen eines Zelltypbeschränkten Musters einer Genexpression in Zellen, welches für einen bestimmten Phänotyp und als Resultat für die Bestimmung des Umfangs möglicher zellulärer Reaktionen auf exogene Stimuli sorgt.
Das grundlegende Programm kann als Differenzierungsprogramm betrachtet werden, das wiederum die Unterprogrammreaktionen der Zelle auf umweltbedingte und andere exogene Hinweise steuert, wo die Unterprogramme eine zelluläre Lebensfähigkeit (Apoptose) und Wucherung inkludieren.
Definition einer "von der gewöhnlichen Form abweichenden Programmierungserkrankung" Eine, bei der die direkte Ursache für die klinische Störung die Expression eines Differenzierungsprogramms in den primärern kranken Zellen ist, welches normalerweise nicht existiert. Das heißt, es besteht eine Expression von normalen Genen, die für einen bestimmten differenzierten Phänotyp in abnormen Kombinationen sorgen. Das Ergebnis besteht darin, dass diese kranken Zeilen fähig werden, krankheitsauslösende Verhaltensweisen, welche die zelluläre Differenzierung, Lebensfähigkeit und Wucherung umfassen, zu exprimieren. Diese Eigenschaften der primären kranken Zellen können auch in ihrer Gewebeumgebung eine pathologische Veränderung hervorrufen.
Der Begriff "direkte Ursache" in Bezug auf die Pathogenese ist von den "Risikofaktoren" zu unterscheiden. Typischerweise wird eine AP-Erkrankung mit zahlreichen Risikofaktoren in Zusammenhang gebracht, welche in unterschiedlichen Kombinationen das Auftreten der Erkrankung zu "verursachen" scheinen. In der Tat verursachen sie jedoch die Veränderungen im Muster einer Transcriptionsregulator (TR)- Expression und in der Chromatindomänen-Verfügbarkeit, die wiederum die Erkrankung verursacht. Dies ist bedeutend, da Programme sich entwickeln und von jedweden Risikofaktoren, die bei ihrer Einleitung eine Rolle spielen, unabhängig werden körnen. Risikofaktoren umfassen mutagene Ereignisse, Viren, chromosomale Anomalien, genetische Vererbung und Ernährung.
Von der gewöhnlichen Form abweichende Programmierungsstörungen können entweder als hyperplastische oder als hypoplastische (degenerative) Erkrankung oder als Kombination aus beiden in Erscheinung treten.
Beispiele für Erkrankungen, wo der von der gewöhnlichen Form abweichende Programmphänotyp exprimiert wird:
Krebs
Myeloproliferative Erkrankungen
- Polycythaemia vera
- Myeloische Metaplasie ungeklärten Ursprungs
- Essentielle Thrombocytose
Myelodysplasien
- Refraktäre Anämie
- Refraktäre Anämie mit Ring-Sideroblasten
- Refraktäre Anämie mit überschüssigen Blasten
- Refraktäre Anämie mit überschüssigen Blasten im Übergang
Atherosklerose
mit AIDS in Verbindung stehender Komplex
AIDS

Molekularmodell

Gemäß dem hierin dargelegten Molekularmodell ist die grundlegende Krankheit, die bei den AP-Erkrankungen ein Einheitsbild hervorruft, eine spezifische Art einer relationalen Veränderung bei gewissen zellulären Komponenten, die in die Programmsteuerung involviert sind. Sie ist anders als jeder zuvor beschriebene molekulare krankheitsauslösende Mechanismus. Dieses Modell definiert die Natur einer neuartigen Therapie für diese Erkrankungen, beschränkt das potentielle Set von therapeutisch nützlichen Zielen auf eine relativ kleine Anzahl an Genen und führt zum nicht offensichtlichen Schluss, dass die Manipulation von gewissen "normalen" Genen ein geeigneter Ansatz für die Behandlung von AP-Erkrankungen ist, auf diese Weise macht das Modell die Umsetzung der vorgeschlagenen Therapie in die Praxis für jeden Fachmann unkompliziert und zugänglich.
Im Speziellen besteht die wesentliche molekulare Pathologie bei den AP- Erkrankungen aus Veränderungen in den untereinander abhängigen Mustern einer TR- Expression und/oder der Chromatindomänen-Verfügbarkeit für die Transcription. Diese relationalen Änderungen sorgen wiederum für die Expression von abnormen zellulären Programmen unter Einschluss einer zellulären Differenzierung, welche krankheitsauslösend sind. Ein bestimmter TR oder gewisse Moleküle, die in die Steuerung eines Domänenstatus involviert sind, können strukturell abnorm sein. Dies sind jedoch nicht notwendigerweise für eine therapeutische Intervention nützliche Ziele.
Die Grundsätze des Modells, die für die Entwicklung einer spezifischen Therapie relevant sind:
A) Jene, die sowohl für eine normale als auch für eine von der gewöhnlichen Form abweichende Programmierung gelten:
1) Das Muster einer Domänen-Verfügbarkeit bestimmt den möglichen Umfang von Genen, die in der Zelle exprimiert werden können, und beschränkt daher den Umfang von zellulären Programmen, die exprimiert werden können.
2) Das Muster einer TR-Expression ist das molekulare Äquivalent eines Programmiercodes. Mittels Analogie mit Sprache regulieren bestimmte Kombinationen von TR (Buchstaben), die als Einheit (Wörter) funktionieren, die Expression von Gensets in koordinierter Weise, während das vollständige Set von TR-Kombinationen, die in irgendeiner gegebenen Zelle (Satz) verwendet werden, bestimmt, welchen der möglichen Phänotypen die Zelle exprimieren wird, und daher den Gesamtcharakter des Differenzierungsprogramms der Zelle (siehe Tabelle I hinsichtlich mehr Details, wobei Krebs als Beispiel verwendet wird).
3) Nur ein Subset der Gesamtanzahl an TRs, die in die Steuerung der zellulären Differenzierung für den gesamten Organismus involviert sind, wird in jedwedem gegebenen Zelltyp exprimiert und ist von der Anzahl her klein.
4) Ähnliche Wirkungen auf bestimmte Muster einer Genexpression (Programmierung) können durch mehr als eine spezifische Kombination von TR (Synonyme) erzielt werden.
5) Die spezifischen funktionellen Konsequenzen aus der Expression eines bestimmten TR ist Kontext-abhängig. Das heißt, ihre Wirkungen auf die zelluläre Programmierung hängt sowohl davon ab, welchen anderen TR er zwecks Regulierung eines bestimmten Sets von Genen kombiniert (in welchen Wörtern er aufscheint), und vom Gesamtset einer anderen TR-Kombination, die von der Zelle exprimiert wird (der Satz).
B) Gültig für AP-Zellen, aber nicht für normale Zellen:
1) Die Kombinationen von TR, die in AP-Zellen zu sehen sind, sind anders als jene, die in irgendeiner normalen Zelle zu sehen sind (der Satz wird nicht von irgendeiner normalen Zelle exprimiert).
2) Die spezifischen funktionellen Konsequenzen irgendeines gegebenen bestimmten TR, der in einer AP-Zelle exprimiert wird, werden daher anders sein als die Konsequenzen, die in einer normalen Zelle zu sehen sind.
3) AP-Zellen exprimieren daher ein zelluläres Differenzierungsprogramm, das anders als jedwedes normale Differenzierungsprogramm ist. Als Ergebnis exprimieren AP-Zellen krankheitsauslösende Verhaltensweisen, die von ihren geänderten Differenzierungs-, Lebensfähigkeits- und Wucherungscharakteristika herrühren.
4) Folglich können gleichwertige Manipulationen der Expression eines gegebenen TR in normalen Zellen versus von der gewöhnlichen Farm abweichend programmierten Zellen differentielle Wirkungen auf das zelluläre Verhalten hervorrufen. Dies kann die Basis für eine therapeutische Intervention bilden.
5) Es ist zu erwarten, dass das Subset von TRs, die von irgendeiner AP-Zelle exprimiert werden, einen TR, der nicht von den entsprechenden normalen Zellen exprimiert wird, einschließt und/oder umgekehrt. Diese TRs innerhalb der AP-Zellen werden normale TRs sein, die ektopisch exprimiert oder modifiziert (alternierende Spleiß-Promotor-Verwendung oder Post-Translationsmodifikation) oder mutiert werden, und zwar zu einem TR mit geänderten Bindungseigenschaften.

Natur der Ziele

TRs sind die primären Ziele für therapeutische Manipulationen auf Basis des Modells. Sie können direkt oder indirekt durch Moleküle wie Tyrosinkinase manipuliert werden, die einen TR durch strukturelle Änderungen wie eine Phosphorylierung wirksam von einem Typ in einen anderen verwandeln können.

Natur der therapeutischen Intervention

Die Grundlage der neuartigen Therapie besteht darin, das Muster der Genexpression in AP-Zellen durch Änderung des Musters der TR-Expression differentiell zu ändern. Das Modell legt fest, dass die spezifischen funktionellen Konsequenzen der Expression irgendeines gegebenen TR Kontext-abhängig sind. Daraus folgt, dass derselbe TR, der sowohl in normalen als auch in AP-Zellen vorhanden ist, in derselben Weise manipuliert und eine andere Auswirkung auf das zelluläre Verhalten erzielt werden kann.
Auf einen nur von den AP-Zellen exprimierten TR kann jedoch auch abgezielt werden. Das Endergebnis ist, dass das Muster einer Genexpression in den AP-Zellen zumindest einen beträchtlichen Teil seiner krankheitshervorrufenden Aktivität verliert. Dies kann sich auf zahlreiche mögliche Arten ausdrücken, einschließlich eines Tods der AP- Zellen, einer Veränderung ihres Differenzierungsstatus mit begleitender Veränderung der Produktion von krankheitshervorrufenden Faktoren oder Verlust an wucherndem Potential.
Die Anzahl an transcriptionellen Regulatoren, die in jedwedem gegebenem. Zelltyp manipuliert werden müssen, ist sehr gering. Es wird geschätzt, dass im menschlichen Genom 30.000 bis 100.000 Gene über 3 · 10&sup9; bp DNA verteilt sind. Es kann gezeigt werden, dass in jedwedem gegebenem Zelltyp ungefähr 10.000 Gene exprimiert werden. Mehr als 90% davon werden von vielen Zelltypen exprimiert, und der Großteil davon wird als "konstitutive Gene" bezeichnet.
Typischerweise beläuft sich die Anzahl der Gene, von denen gezeigt werden kann, dass sie in jedwedem gegebenem Zelltyp differentiell exprimiert werden, nur auf einige hundert. Es sind diese Gene, die beispielsweise den Unterschied zwischen Leberzellen und Gehirnzellen ausmachen. Der Großteil davon ist direkt in die Ausführung der Funktionen, die den Zelltyp kennzeichnen, involviert. Leberzellen beispielsweise exprimieren einen großen Umfang von Enzymen, die in die Säuberung des Körpers von vielen Arten von Chemikalien involviert sind. Die Gene, die für die Zwecke dieses Patents von Interesse sind, bilden das kleine Subset von Genen, die Moleküle codieren, die in die differentielle Regulation von Zelltyp-spezifischen Genen involviert sind. Insbesondere transcriptionelle Regulatoren und ihre direkten Modulatoren. Letztere schließen beispielsweise gewisse Tyrosinkinasen ein, die einen bestimmten transcriptionellen Regulator modifizieren und ihn tatsächlich in einen funktionell unterschiedlichen transcriptionellen Regulator umwandeln können. (Berk Biochem Biophys. Actn. 1009, 103, 19139) Für die Zwecke dieser Erfindung werden transcriptionelle Regulatoren als Moleküle definiert, die sich an von verschiedenen Genen variabel exprimierte spezifische DNA-Sequenzen und/oder andere transcriptionelle Regulatoren binden, von denen sich zumindest einer an spezifische DNA-Sequenzen binden muss. Als Ergebnis kontrollieren sie die Stärken der Genexpressionen mittels Modulation der RNA-Polymerase-Aktivität. Die transcriptionellen Regulatoren können entweder endogenen oder exogenen Ursprungs sein. Sie können entweder normal oder mutiert sein.
Die Fähigkeit von transcriptionellen Regulatoren, miteinander variabel zu interagieren, schafft die Grundlage für ein kombiniertes Regulationssystem. Dies erlaubt einer sehr geringen Anzahl an transcriptionellen Regulatoren, die Expression einer großen Anzahl an Genen in verschiedenen Mustern zu kontrollieren. Bestimmte Gensets werden zu irgendeiner gegebenen Zeit von einem gewissen Subset der transcriptionellen Relgulatoren, die von der Zelle exprimiert werden, kontrolliert. Jedes transcriptionelle Regulator-Subset ist daher ein Programmiercode oder eine Instruktion oder ein "Wort", das die Expression eines bestimmten Gensets lenkt. Das gesamte Muster einer Genexpression, die von einem gegebenen Zelltyp exprimiert wird, kann als Satz betrachtet werden, da nur gewisse Wörter zusammen aufscheinen können.
Eine allgemeine Rolle der kombinierten Regulation, welche in die eukaryontische Genexpression involviert ist, wurde zuvor von mehreren Forschern als gegeben angenommen. (Scherrer und Marcand J. Cell Phys 72, 181, 1968; Sherrer Adv. Esp. Med. Biol. 44; 169, 1924; Gierer Cold Spring Harbor Symp Quant Biol 38; 951, 1973; Stubblefield J. Theor Biol 118, 129, 1986, Bodnar J. Theor Biol 132, 479, 1988) Lin und Riggs (Cell 4, 107, 1975) zeigten unter Anwendung von biophysikalischen Argumenten die Unmöglichkeit auf, in einer Eukaryontenzelle für jedes Gen einen eigenen Regulator zu haben. Kombinierte Regulationsmodelle einer eukaryontischen Genexpression setzen im Allgemeinen zusätzlich zur Transcription multiple Regulationsstufen voraus. Im Prinzip zeigen diese Modelle, wie theoretisch 100.000 Gene von so wenig wie 50 Regulatormolekülen gezielt kontrolliert werden könnten, von welchen nur ein kleines Subset auf der Stufe der transcriptionellen Regulatoren, wie sie hier definiert sind, funktionieren würde. Bodnar J. Theor. Biol. 132, 479, 1988.
Es wird geschätzt, dass sich die tatsächtliche Anzahl an menschlichen transcriptionellen Regulatoren in der Größenordnung vom irgendwo über 100 bewegt. (Tabelle II listet jene auf, die in der Literatur beschrieben worden sind.) Von vielen ist allerdings bekannt, dass sie nur in gewissen Zelltypen exprimiert werden. Da nur einige hundert Gene die Unterschiede zwischen bestimmten differenzierten Zelltypen bestimmen und die große Mehrzahl von ihnen die bestimmten funktionellen Merkmale der Zelle bestimmt, kann nur eine sehr kleine Anzahl von ihnen Regulator-Genprodukte sein.
Daraus folgt, dass die Anzahl an Regulatoren, die zwecks Erzielung der von dieser Erfindung film jedwede gegebene Anwendung festgesetzten Wirkungen manipuliert werden müssen, gering ist und mit vergleichsweise mäßigem Aufwand verwaltet werden kann. Aus dem Begriff der kombinierten Regulation ergibt sich außerdem, dass nicht alle von einem gegebenen Zelltyp exprimierten transcriptionellen Regulatoren bekannt sein müssen, bevor diese Erfindung ausgeübt werden kann.
Der vorliegende Erfinder fand heraus, dass spezifische Antisinn-p53-Oligonucleotide die Wucherung hemmen können, was die Blockierung der Stammzellen-Selbsterneuerung einschließt, und schließlich primäre menschliche Leukämieblasten abtöten können, wobei sie keinerlei ähnliche Wirkungen auf frische normale Knochenmarkzellen ausüben. Dieses nicht offensichtliche Ergebnis weist darauf hin, dass die interaktiven Mechanismen des Detektierens, Interpretierens und Reagierens auf Umweltinformationsmoleküle, die in die Regulation der Zelldifferenzierung und Wucherung und Lebensfähigkeit in AP-Zellen involviert sind, hinsichtlich ihrer dynamischen Wechselwirkungen (unter Einschluss von Signaltransduktion und -interpretation) solcherart vom Normalen abgeändert werden, dass die Hemmung eines einzelnen Gens oder eines Sets von Genen, die in diesen Vorgang involvierte Proteine codieren, durch Antisinn-Oligonucleotide ausreicht, um die Auswirkung der Informationsmoleküle zu ändern, so dass eine Veränderung der zellulären Programmierung wie des Zelltod- oder Zellwachstumshemmungsprogramms gezielt in AP- Zellen eingebracht werden kann. Der Begriff "Traitor-Gene" wird hierin verwendet, um jene Gene in AP-Zellen zu beschreiben, die als Ziele geeignet sein können, und zwar zur Hemmung mit Antisinn-Molekülen gemäß der vorliegenden Erfindung. Geeignete Ziel- oder Traitor-Gene können selbst entweder funktionell abnorm oder normal sein, funktionieren allerdings dahingehend, um die pathologischen Phänotyp-AP-Zellen als Teil eines abnormen Musters einer Genexpression zu bewahren. Eine derartige Behandlung führt über einen ausgewählten Dosierungsbereich zu einer differentiellen Programmierung von AP-Zellen, jedoch nicht von ihren normalen Gegenstücken. In der bevorzugten Ausführungsform sind die Traitor-Gene, auf die abzuzielen ist, TRs.
Die zu verwendende Oligonucleotid-Konzentration kann variieren, und zwar in Abhängigkeit von einer Anzahl an Faktoren einschließlich des Typs der im Mark vorhandenen Krebszellen, des Typs und der Spezifität des bestimmten ausgewählten Antisinn-Oligonucleotids/der bestimmten ausgewählten Antisinn-Oligonucleotide und der relativen Toxizität des Oligonucleotids für normale Zellen. Obwohl der vorliegende Erfinder bei Oligonucleotid-Konzentrationen in einem extrazellulären Fluid, die so gering wie 1 Nanomol waren, eine signifikante AP-Zellprogrammierung beobachtete, wurde im untenstehend beschriebenen Modellsystem eine optimale Hemmung bei Konzentrationen von zumindest 10 Nanomol beobachtet. Das obere Limit des Dosierungsbereichs wird durch Toxizität und therapeutische Wirksamkeit vorgegeben und überschreitet im Allgemeinen nicht 5 Mikromol. Mit Hilfe der in der vorliegenden Offenbarung dargelegten Techniken sollte der Fachmann in der Lage sein, die in einem gegebenen Fall zu verwendende optimale Konzentration zu bestimmen.

"Hardware" für die Umsetzung in die Praxis

Unter Anwendung von etablierten Techniken, Analysen und Mitteln sind die folgenden Fähigkeiten leicht zu erzielen. Sie können von jedem Fachmann eingesetzt werden, um die primäre und die untergeordnete Erfindung in die Praxis umzusetzen.
1) Analysen hinsichtlich der transcriptionellen Regulatoren und ihrer direkten modifizierenden Gene.
Bevorzugte Analysen: RNA-in situ-Hybridisierung (Lum Biotech. 4, 32, 1986) oder PCR (Block, Biochem 30, 2735, 1991) oder Stoffwechselmarkierung (Ausubel et al (Hgb.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley NY, 1989 (halbjährlich aktualisiert) zum Detektieren einer Expression auf Proteinebene.
Zwecke:
Die Erstellung des Subsets der bekannten transcriptionellen Regulatoren oder ihrer direkten modifizierenden Gene, die von einem bestimmten Zelltyp exprimiert werden. Dies dient den folgenden Funktionen:
a) die Bestimmung des Subsets von transcriptionellen Regulatoren oder ihrer direkten modifizierenden Gene, die bei der Umsetzung in die Praxis zu manipulierende Ziele sind;
b) die Bewertung der Wirksamkeit von potentiellen therapeutischen Mitteln bei der Hinzufügung oder Abziehung der Expression eines bestimmten transcriptionellen Regulators oder seiner direkten Modifikatorzellen;
c) die Diagnose und/oder die Einteilung in Stadien einer bestimmten, von der gewöhnlichen Form abweichenden Programmerkrankung;
d) die Bestimmung des optimalen therapeutischen Mittels/der optimalen therapeutischen Mittel in der klinischen Praxis, wenn es für eine gegebene Erkrankung mehr als eine Möglichkeit gibt.
2) Mittel für das Hinzufügen oder Abziehen der Expression von bestimmten transcriptionellen Regulatoren oder deren direkter modifizierender Gene in therapeutisch zu manipulierenden Zellen.
a) Antisinn-Oligonucleotide (Zon, Pharmaceut. Res., 5, 539, 1988).
Diese Mittel können zum Abziehen der Expression bestimmter Gene aus Zellen verwendet werden.

Entwurf von "Test"-Antisinn-Oligonucleotiden

i) Unter Anwendung eines Computer-Programms wie "Oligo" (Rychik und Rhoads, Nucl. Acids Res., 17, 8543, 1989) ist ein Set vorn Antisinn-Oligonucleotiden auszuwählen, die sich an das RNA-Ziel nach Wahl binden und die folgenden Charakteristika haben: (1) Länge zwischen 10 und 35 Basen, wobei im Allgemeinen 20 verwendet werden; (2) vernachlässigbare Selbstwechselwirkung (Selbstdimer und Haarnadeln) unter physiologischen Bedingungen; (3) Schmelztemperatur: ≥ 40ºC unter physiologischen Bedingungen, und (4) nicht mehr als 40% des Oligonucleotids ist eine Guanin- oder Cytosinreihe);
ii) Unter Anwendung einer Referenz wie Genbank ist sicherzustellen, dass das Antisinn- Oligonucleotid eine ≤ 85%ige Homologie mit den RNA-Transcripten anderer Gene hat. Eine Ausnahme hiervon liegt dort vor, wo ein Antisinn-Oligonucleotid auf Basis seiner Fähigkeit zur Bindung an mehr als ein Mitglied einer Familie von transcriptionellen Regulatoren (wie den Homöobox-Genen) auf Basis der Sequenzhomologie ausgewählt wird.
b) Erstellung eines "therapeutischen Prototyp"-Antisinn-Oligonucleotids aus einem Set von Test-Antisinn-Oligonucleotiden. Diese Prototypverbindungen werden bei der Umsetzung in die Praxis verwendet.
i) Synthetisieren von Test-Antisinn-Oligonucleotiden unter Anwendung von Standardvorgängen, beispielsweise jenen zur Herstellung von Phosphorothioaten (Vu et al. Tetrahedron Lett, 32, 3005, 1991).
ii) Unter Anwendung von Analysen hinsichtlich der transcriptionellen Regulatoren oder ihrer direkten modifizierenden Gene sind therapeutische Prototyp-Antisinn- Oligonucleotide aus dem Set von Testverbindungen auszuwählen, und zwar auf Basis des Abschaltens der Expression des Zielgens in den Zelltypen, die therapeutisch zu manipulieren sind. In der Praxis könnte dasselbe Set von Prototyp-Mitteln, die zum Abschalten einer Zielgenexpression in einer Vielfalt von Zelltypen in der Lage sind, bei der Umsetzung in die Praxis, nachfolgender Schritt 2, für multiple therapeutische Ziele eingesetzt werden.
b) Synthetische doppelsträngige Oligonucleotide, die für die DNA- Bindungsdomäne eines oder mehrerer transcriptioneller Regulatoren Liganden sind. (Wu et al. Gene, 89, 203, 1990)
Therapeutische Prototypmittel dieses Typs, die bei der Umsetzung in die Praxis zu verwenden sind, entsprechen tatsächlichen Gensequenzen, von denen gezeigt sein wird, dass sich der transcriptionelle Regulator/die transcriptionellen Regulatoren unter Anwendung von Standardtechniken wie der Gelmobilitätsverschiebungsanalyse an sie bindet bzw. binden. (Ausubel et al (Hgb.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley NY, 1989 (halbjährlich aktualisiert).)
c) Expressionsvektoren
In der bevorzugten Ausführungsform wird ein rekombinierter Virusvektor verwendet (Miller und Rosman, Biotech, 7, 980, 1989), der die vollständige codierende Sequenz des transcriptionellen Regulators oder seines direkten modifizierenden Gens trägt. Dies sorgt für eine Expression des Regulators oder modifizierenden Gens in den Zellen, die von Interesse sind. Er bzw. es wird unter Anwendung von Standardverfahren gestattet und getestet. (Ausubel et al, supra). Wahlweise trägt der Virusvektor eine genügend lange Antisinn-Sequenz zu einem derartigen Regulator oder modifizierenden Gen, um in den Zellen, die von Interesse sind, für die Blockierung der Expression des Zielgens zu sorgen.
3) Herstellung von Gewebe
Das bevorzugte Gewebe ist ein primäres Explantat oder wird früh durchgeleitet. Es wird unter Anwendung von chirurgischen Standardverfahren erhalten. Die Gewebeverarbeitung für eine Kultur und/oder ein Heterotransplantat erfolgt gemäß etablierter Verfahren. Auf die Kulturbedingungen für die ungeordneten Zellen aus den verschiedenen, von der gewöhnlichen Form abweichenden Programmerkrankungen oder ihren normalen Gegenstücken wird in Tabelle III Bezug genommen. Diese Querverweise liefern auch Informationen über den Erhalt und die Verarbeitung der geeigneten Zellen.
Anwendungen zur Bereitstellung des Ausgangsmaterials für:
a) die Bestimmung des Subsets der bekannten transcriptionellen Regulatoren oder ihrer direkten modifizierenden Gene, die von einem bestimmten Zelltyp exprimiert werden.
b) die Ausübung der untergeordneten Erfindungen: das heißt, die Diagnose und Einteilung in Stadien einer von der gewöhnlichen Form abweichenden Programmerkrankung oder zur Auswahl einer optimalen Behandlung in der klinischen Praxis.
c) die Bewertung von möglichen nachteiligen Auswirkungen der Behandlungen von von der gewöhnlichen Form abweichenden Programmerkrankungen auf Kulturen der drei großen konstitutiv selbsterneuernden Gewebeteile (Knochenmark, gastrointestinales Epithel und Haut). Diese Kulturen werden auch bei einigen Umsetzungen in die Praxis, welche therapeutische Manipulationen von normalem Gewebe beinhalten, eingesetzt. Kulturbedingungen, Tabelle IV.
d) Die anderen bei der Umsetzung in die Praxis zu verwendenden Kulturen und Heterotransplantate.
4) Unterscheidung von normalen versus bösartigen Zellen in einer gemischten Population.
In situ-Standard-Hybridisierungsverfahren zur Detektion von chromosom- und/oder translokationsspezifischen Veränderungen werden eingesetzt. (Trask Trends in Genet. 7, 149, 1991).
5) Erstellung von Analysen zur Erzielung von Wirkungen aus der Manipulation einer transcriptionellen Regulatorfunktion oder ihrer direkten modifizierenden Gene auf die zelluläre Programmierung.
a) Von der gewöhnlichen Form abweichendes Programmerkrankungsgewebe Definitionsgemäß exprimieren die bei diesen Störungen betroffenen Zellen abnorme Muster einer Genexpression, welche die charakteristischen klinisch-pathologischen Merkmale hervorrufen. Davon können beide unter Anwendung etablierter molekularer und zellulärer Techniken überwacht werden. Die spezifischen Parameter, die für alle als Beispiel angeführte Arten einer von der gewöhnlichen Form abweichenden Programmerkrankung zu analysieren sind, werden in Tabelle III gezeigt.
b) Normales Gewebe
Die Reprogrammierung eines normalen Zellverhaltens, wobei die relevanten Programme die Differenzierung, Wucherung und Lebensfähigkeit sind, könnten einer Vielfalt von therapeutischen Anwendungen dienen. Diese würde gewisse in vitro- und Allgemeinbehandlungen einschließen, ohne auf diese beschränkt zu sein: (1) Erweiterung der normalen Zellanzahlen in vitro vor der Transplantation; (2) Förderung des Wachstums von gastrointestinalen Zellen bei der Behandlung von Magengeschwüren und einer entzündlichen Darmkrankheit; (3) Leberregeneration beispielsweise nach der teilweisen Zerstörung durch ein Virus oder toxische Chemikalien; (4) Ausdehnung von einer oder mehreren hämopoetischen Zelllineagen für eine Vielfalt von klinischen Zwecken einschließlich eines Wiederaufbaus der Immunfunktion bei Immundefizienzen, wobei den Wirkungen von für das Knochenmark toxischen Mitteln entgegengewirkt wird, und bei der Bekämpfung von Infektionen.
All diese Veränderungen in der normalen zellulärem Programmierung können unter Anwendung etablierter Techniken leicht bewertet werden.

B) Umsetzung in die Praxis

Schritt 1) Bestimmung des Subsets von transcriptionellen Regulatoren und ihrer direkten modifizierenden Gene, exprimiert vom von der gewöhnlichen Form abweichend programmierten Gewebe, dem entsprechenden normalen Gewebe und dem konstitutiv selbsterneuernden normalen Gewebe. Wahlweise Ausführung einer ähnlichen Bestimmung für irgendein anderes normales Gewebe, das gemäß dieser Erfindung therapeutisch zu manipulieren ist.
Schritt 2) Hinzufügung oder Abziehung der Expression eines transcriptionellen Regulators/von transcriptionellen Regulatoren oder ihrer direkten modifizierenden Gene von Zellen, die therapeutisch zu reprogrammieren sind, und vom geeigneten Kontrollgewebe, wie zuvor spezifiziert.
a) Hinzufügung - Verwendung eines Expressionsvektors zur Einfügung eines exprimierbaren Gens für einen bestimmten transcriptionellen Regulator oder ein direktes modifizierendes Gen eines transcriptionellen Regulators in von der gewöhnlichen Form abweichend programmierte Zellen. Das eingefügte Gen wird eines sein, das von den entsprechenden normalen Zellen, aber nicht von den von der gewöhnlichen Form abweichend programmierten Zellen exprimiert wird.
b) Abziehung -
i) kann erzielt werden durch die Verwendung von Antisinn-Oligonucleotiden, die auf die RNA eines bestimmten transcriptionellen Regulators oder eines direkten Modulators gerichtet sind, oder von doppelsträngigen Oligonucleotid-Liganden für eine DNA-Bindungsdomäne eines oder mehrerer transcriptioneller Regulatoren. Die Verwendung eines Prototyp-Antisinn-Oligonucleotids/von Prototyp-Antisinn- Oligonucleotiden oder von doppelsträngigen Oligonucleotiden blockiert die Funktion eines spezifischen transcriptionellen Regulators/von spezifischen transcriptionellen Regulatoren in von der gewöhnlichen Form abweichend programmierten Zellen oder normalen Zellen, die durch eine Reprogrammierung therapeutisch zu manipulieren sind. Wahlweise ist ein Antisinn-Oligonucleotid zu verwenden, das auf ein direktes modifizierendes Gen eines transcriptionellen Regulators gerichtet ist.
ii) Unter Verwendung eines Expressionsvektors, der eine Antisinn-DNA trägt, die auf einen bestimmten transcriptionellen Regulator oder ein direktes modifizierendes Gen eines transcriptionellen Regulators gerichtet ist, ist das neue Gen in von der gewöhnlichen Form abweichend programmierten Zellen zu installieren. Die therapeutische Wirkung wird zuvor durch die Verwendung eines Antisinn-Oligonucleotids bestimmt.
Schritt 3) REPROGRAMMIERUNGSTEST:
Unter Anwendung der in der "Hardware for Reduction to Practice" beschriebenen Verfahren und Vorgänge und unter Anwendung; der in den Tabellen III und IV gegebenen Informationen sind die folgenden Funktionen durchzuführen.
a) Anwendung von geeigneten Kulturbedingungen für normale Zellen, die therapeutisch zu reprogrammieren sind, oder für eine AP-Erkrankung, die AP-Zellen plus der entsprechenden normalen Zellen und konstitutiv selbsterneuernde normale Gewebeteile (gastrointestinal, Knochenmark, Haut);
b) Für eine AP-Erkrankung: Analyse von einem oder mehreren krankheitsauslösenden Merkmalen von AP-Zellen wie jenen, die in Tabelle III gezeigt sind, gemäß etablierter Verfahren;
c) Behandlung von Kulturen mit einem Prototypmittel mit Reprogrammierungspotential (als Oligonucleotide zu TR, als Oligonucleotid- Liganden für TR oder Expressionsvektoren).
d) Erzielung von Veränderungen bei der Programmierung und Auswahl jener Mittel, die therapeutisch nützlich sind, zum Beispiel:
1) Krebs, myelodysplastisches und myeloproliferatives Syndrom und Atherosklerose - Abtöten von AP-Zellen;
2) AIDS, Regeneration von CD4&supmin;Lymphocyten;
3) Ausdehnung von normalen hämopoetischen Stammzellen für ein Knochenmarktransplantat.
Schritt 4) Testen der Wirkung von Hinzufügung oder Abziehung der Funktion von bestimmten transcriptionellen Regulatoren unter Verwendung der Mittel, die in einem Tiermodellsystem ausgewählt werden, wenn die therapeutischen Mittel für eine allgemeine Verwendung sind.
Wegen des Bedarfs an einem hohen Grad an Zielhomologie mit dem entsprechenden menschlichen transcriptionellen Regulator oder dessen direkten Modulator werden die Tiere notwendigerweise fast immer nicht menschliche Primaten sein.
Im Fall von Bewertungsmitteln für die Behandlung von von der gewöhnlichen Form abweichenden Programmierungserkrankungen kann das Tier entweder von der Krankheit befallen sein und können sowohl die Wirksamkeit der Behandlung als auch die Nebenwirkung dokumentiert werden oder kann das Tier normal sein und können nur die Nebenwirkungen getestet werden.
Schritt 5) Jedwede unerwünschte Nebenwirkungen, die durch die potentiellen therapeutischen Mittel erzeugt werden könnten, können auf mehrere mögliche Arten verringert oder ausgeschaltet werden, von denen alle unter Anwendung einer existierenden Technologie implementierbar sind.
a) Antisinn-Oligonucleotide
Fig. I zeigt, dass es Zelltyp-spezifische Unterschiede bei den Wirkungen von bestimmten Antisinn-Oligonucleotiden, welche auf verschiedene Stellen an spezifischen RNA-Transcripten abzielen, auf das Zellverhalten gibt. Derartige Unterschiede können zur Auswahl von Antisinn-Oligonucleotiden eingesetzt werden, welche die gewünschten therapeutischen Wirkungen mit minimalen unerwünschten Nebenwirkungen erzeugen.
b) Doppelsträngige Oligonucleotid-Liganden
Typischerweise können sich mehr als ein transcriptioneller Regulator an dieselbe doppelsträngige DNA-Sequenz binden, allerdings mit variablen Affinitäten. Es ist daher möglich, die konkurrierende Inhibitorwirkung eines solchen Mittels im Verhältnis zum potentiellen Set von transcriptionellen Zielregulatoren zu ändern, indem Basenänderungen eingeführt werden. Diese können Fehlpaarungen einschließen. Die Schmelztemperatur der beiden resultierenden Stränge muss jedoch unter physiologischen Bedingungen ≥40ºC sein. Die Wirkung von solchen Veränderungen kann daher einen günstigeren therapeutischen Index erzeugen.
c) Expressionsvektoren
Die Stärken von Expression und Wirksamkeit eines Gentransfers können leicht durch Veränderungen in der Virushülle und/oder der Promotor/Enhancer-Kombination, die zur Erzielung einer Genexpression verwendet werden, auf gewebespezifischer Basis angepasst werden.

Demonstration der Umsetzung in die Praxis mit einem PS-Ziel

Schritt 1 -

Es ist bekannt, dass p53 unter Anwendung der Stoffwechselmarkierungstechnik durch primäre menschliche Leukämieblastenzellen exprimiert wird (Smith, et al., J. Exp. Med. 164 751, 1986.)

Schritt 2 -

Ein auf eine p53-RNA gerichtetes Phosphorothoat-Antisinn ... Oligonucleotid wurde unter Verwendung eines Applied Biosystems, Inc. (ABI)-DNA- Synthetisierers (Modell 380B) gemäß den Protokollen des Herstellers zubereitet. Ein Antisinn-Oligonucleotid gegen das HIV-rev-Gen wurde als negative Kontrolle eingesetzt. Die Sequenz ist in der Sequenzauflistung nachstehend als SEQ ID NO: 4 dargestellt. Sie wurde zur Behandlung von primären menschlichen Leukämieblasten, normalem menschlichem Knochenmark, normalen menschlichen zirkulierenden T-Lymphocyten, normalem adultem menschlichem gastrointestinalem Epithel, normalem menschlichem fetalem gastrointestinalem Epithel und Rhesusaffen-T-Lymphocyten eingesetzt. Die Zerstörung von p53-RNA durch die Antisinn-p53-Oligonucleotide wurde unter Anwendung von PCR- und/oder Dot-Blotting dokumentiert.

Schritt 3 -

Die folgenden Wirkungen der Antisinn-p53-Oligonucleotide auf die zelluläre Programmierung waren aus den erzielten Ergebnissen ersichtlich.
1) Sie können irreversibel die Wucherung von menschlichen Krebszellen blockieren, die Stammzellenselbsterneuerung blockieren oder menschliche Krebszeilen abtöten. Dies in Verbindung mit dem Fehlen von toxischen Wirkungen auf normales Gewebe zeigt an, dass diese Mittel bei der Behandlung von Krebs eine Rolle spielen körnen. (Siehe Tabellen V-VII).
2) Sie fördern die Wucherung von gastrointestinalem Epithel, was eine Rolle bei der Behandlung eines Magengeschwürs und einer entzündlichen Darmkrankheit anzeigt (Fig. I). Die unterdrückende Wirkung dieser Mittel auf die Wucherung von reifen Lymphocyten (Tabelle IX) unterstützt auch deren Rolle bei Erkrankungen wie der entzündlichen Darmkrankheit, die eine Autoimunitätskomponente haben.
3) Die Daten zeigen auch, dass es Zelltyp-spezifische Unterschiede bei den Reaktionen auf Antisinn-Oligonucleotide gibt, die auf verschiedene Stellen an den RNA- Transcripten desselben Gens abzielen (Fig. I). Dies schafft eine Basis für die Optimierung von therapeutischen Wirkungen und die Minimierung von unerwünschten Nebenwirkungen.
4) Diese Ergebnisse unterstützen das allgemeine Prinzip, dass auf einen transcriptionellen Regulator gerichtete Antisinn-Oligonucleotide zur in vitro- Ausbreitung von bestimmten normalen adulten oder fetalen Gewebeteilen verwendet werden können, die danach für verschiedene medizinische Zwecke einschließlich der Transplantation eingesetzt werden könnten (Figur. I).
5) Die Zelltyp-Abhängigkeit der Wirkungen von bestimmten auf einen transcriptionellen Regulator gerichteten Antisinn-Oligonucleotiden unterstützt das zelluläre Programmmodell im Allgemeinen und das von der gewöhnlichen Form abweichende Programmmodell im Besonderen.

Schritt 4 -

Die Fähigkeit der Antisinn-p53-Oligonucleotide zur Erkennung der p53-RNA von Rhesusaffen wurde demonstriert, indem sowohl für Rhesus- als auch menschliche Zellen eine ähnliche hemmende Wirkung auf die Wucherung von reifen T-Zellen gezeigt wurde (Tabelle IX).
Zwei Rhesusaffen, die 8,9 kg und 6,8 kg wogen, wurden 52,5 mg und 75,8 mg des OL(1)p53-Antisinn-Oligonucleotids (SEQ ID NO: 4), welches radiomarkiert wurde, über vier Stunden eingeflößt. In Übereinstimmung mit den Nagetierdaten zeigte die Gewebeverteilungsanalyse im Vergleich mit den für eine Blockierung der p53-Expression erforderlichen Stärken eine beträchtliche Oligonucleotid-Aufnahme. Ausscheidungsstudien zeigten eine Retention des eingeflößten Mittels für mehr als zwei Wochen. Während dieser Zeit und in der Folge wurden die Tiere gründlich auf Anzeichen einer Toxizität überwacht, wobei keinerlei gesehen wurden.

Schritt 5 -

Da in den Affen keinerlei inakzeptablen Nebenwirkungen erzeugt wurden, war eine Modifizierung der Antisinn-Oligonucleotide nicht notwendig.
Das zur Ausführung der Erfindung ausgewählte Antisinn-Oligonucleotid kann irgendeines von den Typen sein, die von Stein und Cohen, Cancer Research 48: 2569-2668 (1988), beschrieben wurden und ohne Einschränkung nicht modifizierte Oligodesoxynucleotide, Ethyl- oder Methylphosphonat-modifizierte Oligodesoxynucleotide, Phosphorothioat-modifizierte Oligonucleotide, Dithioate sowie andere Oligonucleotid- Analoga einschließlich jener, die Ribozymstrukturen inkorporieren, und Oligoribonucleotide wie jene, die von Inove et al., Nucleic Acids Res. 1: 6131 (1987) beschrieben wurden, und Chimären-Oligonucleotide, die zusammengesetzte RNA-, DNA-Analoga sind (Inove, et al. FEBS Lett. 2115: 327 (1987), einschließen. Oligonucleotide mit einem lipophilen Rückgrat, beispielsweise Methylphosphonat-Analoga mit Ribozymstrukturen, können sich unter gewissen Umständen als vorteilhaft erweisen; diese Moleküle können eine längere Halbwertszeit in vivo haben, da die lipophile Struktur die Geschwindigkeit der Nierenclearance verringern kann, während die Ribozymstruktur eine Furchungsteilung der Ziel-RNA fördert. Gerlach, Nature 334: 585 (1988).
Die Oligonucleotide können in pharmazeutische Zusammensetzungen formuliert und unter Anwendung eines therapeutischen Systems, das mit der bestimmten Formulierung kompatibel ist, verabreicht werden. Wie weiter untenstehend beschrieben, sollte ein Fachmann in der Chemotherapie mit Hilfe der vorliegenden Offenbarung in der Lage sein, für jedwede aus einer Anzahl von die Verbindungen enthaltenden, geeigneten Zusammensetzungen passende Dosierungen und Verabreichungsaufstellungen abzuleiten. Somit schließen pharmazeutische Zusammensetzungen innerhalb des Gebiets der vorliegenden Erfindung Zusammensetzungen ein, worin der aktive Bestandteil in einer wirksamen Menge enthalten ist, um die Zellen des Karzinoms abzutöten, ohne für den Patienten eine inakzeptable Toxizität hervorzurufen. Eine bevorzugte Dosierung umfasst jedoch das, was ausreicht, um eine wirksame Blutkonzentration zwischen etwa 1 und etwa 5 Mikromol zu erzielen. Obwohl ein bevorzugter Bereich obenstehend beschrieben wurde, kann die Bestimmung der zur Behandlung jedes Tumortyps wirksamen Mengen vom Fachmann für die chemotherapeutische Verabreichung bestimmt werden.
Zusätzlich zu den Antisinn-Oligonucleotid-Verbindungen können die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen irgendeinen aus einer Anzahl von geeigneten Trägern und Hilfsstoffen enthalten, welche die Verarbeitung der aktiven Verbindungen zu Zubereitungen, die pharmazeutisch zu verwenden sind, erleichtern. Vorzugsweise werden die Zubereitungen für eine parenterale Verabreichung ausgelegt. Für eine orale oder rektale Verabreichung ausgelegte Zusammensetzungen werden jedoch auch als zum Gebiet der vorliegenden Erfindung gehörig angesehen. Bevorzugte Zusammensetzungen umfassen etwa 0,1 bis etwa 1 Gew.-% der aktiven Bestandteile.
Für eine parenterale Verabreichung geeignete Formlierungen schließen wässrige Lösungen der aktiven Verbindungen in wasserlöslicher oder wasserdispergierbarer Form ein. Wahlweise können Suspensionen der aktiven Verbindungen in geeigneten lipophilen Trägern verabreicht werden. Die Formulierungen können Substanzen enthalten, welche die Viskosität erhöhen, beispielsweise Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbit und/oder Dextran. Gegebenenfalls kann die Formulierung auch Stabilisierungsmittel enthalten. Zusätzlich können die erfindungsgemäßen Verbindungen auch in Liposomen eingekapselt verabreicht werden. Das Oligonucleotid kann in Abhängigkeit von seiner Löslichkeit sowohl in der wässrigen Schicht als auch in der Lipidschicht oder in etwas, das im Allgemeinen als liposomische Suspension bezeichnet wird, vorhanden sein. Die hydrophobe Schicht umfasst im Allgemeinen, aber nicht ausschließlich Phospholipide wie Lecithin und Sphingomyelin, Steroide wie Cholesterin, mehr oder weniger ionogene Tenside wie Diacetylphosphat, Stearylamin oder Phosphatidsäure und/oder andere Materialien einer hydrophoben Natur.

TABELLE I

Analogie mit Sprache

Die folgende Analogie mit Sprache veranschaulicht die wesentliche Natur des in der Patentanmeldung vorgelegten Modells eines klinischen Karzinoms und das Grundprinzip für die Verwendung von gegen die angezeigten Ziel- oder Traitor-Gene gerichteten Antisinn- Oligonucleotiden als therapeutische Mittel. Es sollte klar sein, dass dies ein neuartiger, erfinderischer und nützlicher Ansatz ist.

REGELN:

Biologie Sprachäquivalent

Die Instruktionen für ein bestimmtes Muster einer Genexpression (Programm), wobei die Schlüsselprogramme Differenzierung, Lebensfähigkeit und Wucherung sind Wort
Transcriptionelle Regulatoren (oder irgendeiner von den anderen Regulatoren-Typen, die als Ziel- oder Traitor-Gene aufgelistet sind) Buchstaben
Programmierter Zelltod unsinnige Buchstabenkombination
Bösartige Zellen haben andere Programminstruktionen als entsprechende normale Zellen und normale Zellen im Allgemeinen bösartige Zellen drücken einzigartige Wörter aus
Normale Zellen exprimieren in verschiedenen Differenzierungsstufen andere Programminstruktionen als andere Zelltypen verschiedene normale Zelltypen haben ihr eigenes Vokabular
Alle oder fast alle von bösartigen Zellen verwendeten Buchstaben sind Zellen die Alphabete von normalen und bösartigen Zellen sind im Wesentlichen
strukturell normal und scheinen in normalen Zellen auf dieselben
Bei der Entfaltung von bestimmten Programmen verändert sich das exprimierte Muster von Regulatoren Zellen exprimieren in verschiedenen Programmstufen verschiedene Wörter
Anmerkung: Die in den folgenden Beispielen verwendeten Wörter haben nur eine lose Korrelation mit den eigentlichen zellulären Verhaltensweisen oder Programmen. Hypothetisches Beispiel

Anmerkungen - Tabelle I (Fortsetzung)

1. ANALOGIE MIT GRUNDLEGENDEN KLINISCH-PATHOLOGISCHEN MECHANISMEN

a) "T" und "P" könnten im normalen Zelltyp 2, aber nicht im bösartigen Typ 1 als analoge Antioncogene betrachtet werden, da sie für ein bösartiges Fortschreiten gelöscht werden müssen. Das heißt, das Wort "stop" ist in das Wort "swarm" zu ändern. Diese Deletionen müssen zusammen mit der Deletion von "o" und der Hinzufügung vom "w", "a", "r" und "m" auftreten. Derselbe Buchstabe "p" scheint jedoch in der hochgradig bösartigen Zelle vom Typ 1 auf, während "t" in der schwachen Form aufscheint. Dies passt zu den Beobachtungen, dass Antioncogene von einer allgemeinen Deletion in menschlichen Karzinomen weit entfernt sind, dass multiple gentische Veränderungen in eine Karzinogenese involviert zu sein scheinen und dass sich klinische Karzinome typischerweise phänotypisch entwickeln.
b) "m" und "w'" könnten als analog zu "Oncogenen" angesehen werden, da sie für die Entwicklung von "stop" zu "swarm" erforderlich sind und in anderen normalen adulten Zellen nicht exprimiert werden. Wahlweise könnten "m" und "w" normalerweise nur in der embryonal-fetalen Entwicklungsstufe exprimiert werden.
c) "s" wird in den bösartigen Formen der Zellen vom Typ 1 exprimiert (ektopische Expression), obwohl es normalerweise in Fyp 2, aber nicht in Typ 1 exprimiert wird.

II. ANALOGIE MIT EINER ANTISINN-OLIGONUCLEOTID- BEHANDLUNGSSTRATEGIE

a) Die Hemmung einer "t"-Expression tötet schwache Zellen vom Typ 1 ab, jedoch nicht normale Zellen der Typen 1 und 2, da "start" zu "sar" wird, was kein Wort ist, "retard" und "stop" jedoch zu "read" bzw. "sop" werden, welche jeweils Wörter sind.
b) Das Blockieren von "m", aber nicht von "w" tötet den bösartigen Zelltyp 2 in der schwachen Phase ab, da "swarm" minus "m" zu "swar" wird, was kein Wort ist; "swarm" minus "w" jedoch zu "rams", einem Wort, wird.
d) Das Ausstoßen von "a" tötet die schwachen Grade 1 und 2 und der hohen Grad 1 ab, tötet allerdings auch den normalen Zelltyp 1 ab. So könnte eine Antisinn- Hemmung von "a" für die Säuberung von Knochenmark vom bösartigen Zelltyp 1 oder 2 nützlich sein, allerdings nicht für eine Allgemeinbehandlung.
e) Die Deletion von "r" würde den normalen Zelltyp 1 nicht abtöten ("retard" wird zu "date"), würde jedoch drei der vier bösartigen Zelltypen abtöten. Die Ausnahme ist der schwache Grad 1, wo "start" zu "sat" wird.
f) Die Entfernung von "e" tötet den normalen und hochgradigen Typ 1 ab, so dass nicht zu erwarten wäre, dass dieser ein gutes Ziel für eine Allgemeintherapie ist.
g) Unter den verbleibenden Buchstaben führt die Eliminierung von "d" oder "g" nicht zum Tod von irgendeinem Zelltyp: die Entfernung von "s" tötet den hohen Grad 1 ab, aber keinen der anderen Zelltypen, in denen es aufscheint; die Blockierung von "o" tötet beide bösartige Formen des Typs 2 ab; und die Hemmung von "p" tötet den hohen Grad 1, aber nicht den normalen Typ 2, ab. TABELLE II Menschliche transcriptionelle Regulatoren TABELLE II (Fortsetzung) TABELLE II (Fortsetzung) TABELLE II (Fortsetzung) TABELLE II (Fortsetzung) TABELLE II (Fortsetzung) TABELLE II (Fortsetzung) TABELLE II (Fortsetzung) TABELLE II (Fortsetzung) TABELLE II (Fortsetzung) TABELLE II (Fortsetzung) TABELLE II (Fortsetzung) TABELLE II (Fortsetzung) TABELLE II (Fortsetzung) TABELLE III Erzielung von Merkmalen einer von der gewöhnlichen Form abweichenden Programmierung in Zusammenhang mit pathologischen Wirkungen TABELLE III (Fortsetzung) TABELLE III (Fortsetzung) TABELLE III (Fortsetzung)

TABELLE IV

Repräsentative Referenzen hinsichtlich der Gewebekultur für primäres normales menschliches Gewebe

Gewebe Referenz

gastrointestinal (und eine Vielfalt von anderen Epithel- und Mesenchymzelltypen) a) Moyer und Gendelman, J. Leuk. Biol. 49, 499, 1991.
b) Moyer, J. Tiss. Cult. Meth. 13, 107, 1991.
Knochenmark Eaves, et al., J. Tissue Cult. Meth. 13, 55, 1991.
Hämopoetische Stammzellen a) Messner, et al., Blood, 70, 1425, 1987.
b) Bernstein, et al., Blood, 77, 2316, 1991.
c) Caux, et al., Blood., 75, 2292, 1990.
Leber Gomez-Lechan, et al., In Vitro Cell. Dev. Biol. 26, 67, 1990.

TABELLE V

Wirkung von p53 a.s. ODNs auf das in vitro-Wachstum von teilweise gereinigten Blasten aus dem peripheren Blut von Patienten mit akuter nicht lymphocytärer Leukämie. Die Werte stellen dreifache Kulturen aus sieben getrennten Versuchen, und zwar von a bis g, dar, einschließlich sechs verschiedener Patienten entweder bei der Darstellung oder beim Rückfall. Periphere Blutleukämieblasten wurden mittels Ficoll-Hypaque-Trennung und Schaf-Erythrozyten-T-Zellen-Rosettenbildung isoliert. Die Zellen wurden bei 5 · 10&sup5;/ml wie beschrieben in einem Medium plattiert ( ). Die Kontrollkulturen enthielten entweder keine a.s. ODNs (Kontrolle) oder a.s. ODN zu rev (HIV). A.s. ODNs wurden 24 Stunden nach dem Plattieren hinzugegeben. In A. wurde an den Tagen 5, 10 und 15 Aliquote aus der Kultur entfernt und hinsichtlich des Trypanblau-Ausschlusses gezählt. In B. wurden die Zelten am Tag 10 entfernt, zwecks Entfernung von a.s. ODN gewaschen, bei 5 · 10&sup5;/ml replattiert und 5 Tage später (Tag 15) gezählt. n.d. = nicht ausgeführt. TABELLE V (Fortsetzung)
* Buick, et ab, Blood 54, 95, 1979.

TABELLE VI

Wirkung von p53 a.s. ODNs auf die in vitro-Koloniebildung (CFU-L) von entweder am Tag 0 oder 7 entfernten Zellen der beiden in Tabelle V beschriebenen Kulturen (f und g). Die Werte stellen einen Mittelwert ± SD von dreifachen Kulturen dar. Die Kontrollen waren wie in Tabelle V beschrieben. Die Zellen wurden gemäß B. Lange (*) bei 1 · 10&sup5;/ml gezüchtet. Ein Bruchteil der Zellen aus den Tag 7-Kolonien wurde gewaschen und bei 1 · 10&sup5;/ml replattiert, und zwar wie beschrieben (*) bei Fehlen von a.s. ODN. Eine Kolonie wurde als > 20 Zellen definiert; Tag 7-Kontrollkolonien variierten von 70 bis 240, Tag 14-Kolonien variierten von 13 bis 55. nd = nicht ausgeführt. TABELLE VI (Fortsetzung)
* Lange, et al., Blood 70, 192, 1982.

TABELLE VII

Wirkung von p53 a.s. ODN auf das in vitro-Wachstum von normalem Knochenmark. Die Werte stellen den kumulativen Mittelwert ± SD von dreifachen Kulturen aus drei getrennten Versuchen dar. Einkernige Zellen wurden mittels Ficoll-Hypaque-Trennung isoliert. Die Zellen wurden bei 2 · 10&sup6;/ml wie beschrieben (*) in einem Medium plattiert, abgesehen davon, dass Pferdeserum durch menschliches ersetzt wurde. Die Kontrollkulturen enthielten entweder kein a.s. ODN oder a.s. ODN zu rev (HIV). A.s. ODNs wurden 24 Stunden nach dem Plattieren hinzugegeben. An den Tagen S und 10 wurden Aliquote aus der Kultur entfernt und hinsichtlich des Trypanblau-Ausschlusses gezählt.
* Bayever, et al., Exp. Cell Rev. 179, 168, 1988.

TABELLE VIII

Wirkung von p53 a.s. ODNs auf die in vitro-Koloniebildung von hämopoetischen Vorläufern, die am Tag 7 aus drei der in Tabelle VI beschriebenen normalen Knochenmarkkulturen entfernt wurden. Die Werte stellen den kumulativen Mittelwert ± SD von dreifachen Kulturen dar. Die Kontrollen waren wie in Tabelle V beschrieben. Die Zeilen wurden wie beschrieben (*) gezüchtet, abgesehen davon, dass sie bei 1 · 10&sup5;/ml plattiert wurden. Ein Bruchteil der Zellen aus den Tag 7-Kolonien wurde wie beschrieben (*) für den CFU-Mix und BFU-E gewaschen und bei 5 · 10&sup4;/ml replattiert, oder bei 1 · 10&sup5;/ml für den CFU-GM. Eine Kolonie wurde als > 20 Zellen definiert. Alle Kolonien wurden bei Fehlen von a.s. ODNs gezüchtet.
* Messner, et al., Blood 70, 1425, 1987.
Caux, et al., Blood 75, 2292, 1990.

TABELLE IX

Verfahren für nicht menschliche periphere Blut-T-Zellstudien beim Primaten:
1. Heparinisiertes Blut wurde mit HBSS um ein Drittel verdünnt, über Ficoll-Hypaque geschichtet und mit 1600 upm 40 Minuten lang bei 20ºC zentrifugiert.
2. Einkernige Übergangsflächenzellen wurde gewonnen und zweimal mit HBSS gewaschen, in RPMI 1640 mit 10% FCS zu 1 · 10&sup6;/ml resuspendiert, und zwar bei Vorhandensein von PHA (10 ug/ml).
3. Die Zellen wurden bei 37ºC 72 bis 96 Stunden lang in 5% CO&sub2; inkubiert.

TABELLE IX (Fortsetzung)

4. Die Zellen wurden geerntet, gewaschen und bei 5 · 10&sup5;/ml in einem Medium, bestehend aus RPMI 1640 mit 10% FCS und 10% IL-2, replattiert.
5. Nach einer 24-stündigen Inkubation wurde das a.s. ODN in einer 10 uM- Konzentration zur Kultur hinzugefügt.
6. In Intervallen von 2 bis 3 Tagen wurde eine Aliquote entfernt und hinsichtlich des Trypanblau-Ausschlusses gezählt.
Am "Tag 4" wurden die Zellen entfernt, von Oligo freigewaschen und bei 2 · 10&sup5;/ml replattiert.
Replattierte Zellen → einzelne Zellen → * (Tag 4 = jeweils 2 · 10&sup5;) TABELLE IX (Fortsetzung)
Obwohl die vorliegende Erfindung in Zusammenhang mit einer bevorzugten Ausführungsform und spezifischen Beispielen beschrieben wurde, soll die Beschreibung sie nicht einschränken. Ein durchschnittlicher Fachmann kann mit Hilfe der vorliegenden Offenbarung in der Lage sein, verschiedene Veränderungen, Ersetzungen von Äquivalenten und andere Änderungen an den dargelegten Verfahren und Zusammensetzungen auszuführen. Daher sollte der von der Patenturkunde gewährte Schutz außer durch die Sprache der untenstehend dargelegten Ansprüche nicht eingeschränkt sein.

"SEQUENZAUFLISTUNG"

(1) Allgemeine Informationen:

(i) Anmelder: BOARD OF REGENTS OF THE UNIVERSITY OF NEBRASKA
(ii) Titel der Erfindung: Verfahren und Zusammensetzungen für die therapeutische zelluläre Reprogrammierung
(iii) Anzahl an Sequenzen: (5)
(iv) Korrespondenzadresse:
(A) Adressat: John P. Floyd, Esq.
(B) Straße: 200 Roger Webster
(C) Stadt: Williamsburg
(D) Bundesstaat: Virginia
(E) Staat: U.S.A.
(F) Postleitzahl: 23187-3609
(v) Computerlesbare Form:
(A) Art des Datenträgers: Floppy Disk, 5,25 Inch, 360Kb Speicher
(B) Computer: IBM-compatible, 486/3 3
(C) Betriebssystem: MS-DOS 5.0
(D) Software: WordPerfect 5.1
(vi) Laufende Anmeldungsdaten:
(A) Anmeldenummer: nicht verfügbar
(B) Anmeldedatum: nicht verfügbar
(C) Klassifikation: nicht verfügbar
(vii) Frühere Anmeldungsdaten: keine
(viii) Informationen zum Anwalt/Vertreter:
(A) Name: FLOYD, John P.
(B) Registrierungsnummer: 19528
(C) Referenz-/Registernummer: 63032PCT
(ix) Informationen zur Telekommunikation:
(A) Telefon: (804) 220-0930
(B) Telefax: (804) 220-0930

(2) Informationen zu SEQ ID NO 1:

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 20 Nucleotidbasen
(B) Typ: Nuclein
(C) Strängigkeit: einzelsträngig
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: andere Nucleinsäure
(A) Beschreibung: Oligonucleotid
(iii) Hypothetisch: nein
(iv) Antisinn: ja (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 1:

(2) Informationen zu SEQ ID NO 2:

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 20 Nucleotidbasen
(B) Typ: Nuclein
(C) Strängigkeit: einzelsträngig
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: andere Nucleinsäure
(A) Beschreibung: Oligonucleotid
(iii) Hypothetisch: nein
(iv) Antisinn: ja (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 2:

(2) Informationen zu SEQ ID NO 3:

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 20 Nucleotidbasen
(B) Typ: Nuclein
(C) Strängigkeit: einzelsträngig
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: andere Nucleinsäure
(A) Beschreibung: Oligonucleotid
(iii) Hypothetisch: nein
(iv) Antisinn: ja (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 3:

(2) Informationen zu SEQ ID NO 4:

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 20 Nucleotidbasen
(B) Typ: Nuclein
(C) Strängigkeit: einzelsträngig
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: andere Nucleinsäure
(A) Beschreibung: Oligonucleotid
(iii) Hypothetisch: nein
(iv) Antisinn: ja (xii) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 4:

(2) Informationen zu SEQ ID NO 5:

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 20 Nucleotidbasen
(B) Typ: Nuclein
(C) Strängigkeit: einzelsträngig
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: andere Nucleinsäure
(A) Beschreibung: Oligonucleotid
(iii) Hypothetisch: nein
(iv) Antisinn: ja (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 5:

Claims

1. Oligonucleotid, das zur Regulierung einer p53-Expression fähig ist und zwischen 10 und 35 Basen hat, wobei die Basensequenz eine Sequenz SEQ ID NO: 4 umfasst, wenn das Oligonucleotid 20 bis 35 Basen hat, und wobei die Basensequenz eine aus SEQ ID NO: 4 entnommene benachbarte Basensequenz umfasst, wenn das Oligonucleotid weniger als 20 Basen hat.

SEQ ID NO: 4:

5'-CCCTGCTCCC CCCTGGCTCC-3'

2. Oligonucleotid, wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei das Oligonucleotid zwischen 20 und 30 Basen hat.

3. Oligonucleotid, wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei das Oligonucleotid etwa 20 Basen hat.

4. Oligonucleotid, wie in einem der vorhergehenden Ansprüche beansprucht, wobei die Basensequenz die Sequenz SEQ ID NO: 4 umfasst.

5. Oligonucleotid, wie in einem der vorhergehenden Ansprüche beansprucht, wobei das Oligonucleotid ein modifiziertes Rückgrat hat.

6. Oligonucleotid, wie in Anspruch 5 beansprucht, wobei die Modifikation ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Ethylphosphonat-modifizierten Oligonucleotiden, Methylphosphonat-modifizierten Oligonucleotiden, Phosphorothioat-modifizierten Oligonucleotiden und Dithioat-Oligonucleotiden.

7. Oligonucleotid, wie in einem der vorhergehenden Ansprüche beansprucht, wobei das Oligonucleotid unter physiologischen Bedingungen eine vernachlässigbare Selbstwechselwirkung und einen Schmelzpunkt gleich oder größer als 40ºC aufweist.

8. Vektor, der zur Expression eines wie in einem der vorhergehenden Ansprüche definierten Oligonucleotids fähig ist.

9. Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend das wie in einem der Ansprüche 1 bis 7 definierte Oligonucleotid, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Individuums mit einer von der gewöhnlichen Form abweichenden Programmierungserkrankung, wobei das Oligonucleotid zur Regulierung von p53 fähig ist, wobei p53 durch von der gewöhnlichen Form abweichende Programmierungszellen exprimiert wird und diese Zusammensetzung beim Reprogrammierungstest eine therapeutisch nützliche Veränderung des Zellverhaltens bewirkt.