DE69432120T2

DE69432120T2 - Mit chemotherapeutische zusammensetzungenassoziierten genetischen suppressor-elementen

Info

Publication number: DE69432120T2
Application number: DE69432120T
Authority: DE
Inventors: Andrei Gudkov; Igor B Roninson
Original assignee: University of Illinois
Current assignee: University of Illinois
Priority date: 1993-03-09
Filing date: 1994-03-08
Publication date: 2003-12-11
Anticipated expiration: 2014-03-09
Also published as: NO953560D0; NO953560L; JPH08507919A; EP0694068B1; WO1994020618A1; ZA941637B; KR960701202A; EP0694068A1; DE69432120D1; ATE232557T1; KR100267837B1; CA2157770A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

1. Erfindungsgebiet

Die Erfindung bezieht sich auf genetische Faktoren, die mit einer Sensibilität gegenüber chemotherapeutischen Wirkstoffen assoziiert sind. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf Verfahren zur Identifizierung solcher Faktoren sowie auf die Verwendungen solcher Faktoren.

2. Zusammenfassung des verwandten Fachgebietes

Bei der Behandlung von menschlichem Krebs werden eine breite Vielfalt chemotherapeutischer Mittel verwendet. Z. B. offenbart das Lehrbuch CANCER: Principles & Practice of Oncology, 2. Ausgabe (De Vita et al., Herausgeber), J. B. Lippincott Company, Philadelphia, PA (1985) als Hauptantineoplastische Mittel die Pflanzenalkaloide Vincristin, Vinblastin, Vindesin und VM-26; die Antibiotika Actinomycin-D, Doxorubicin, Daunorubicin, Mithramycin, Mitomycin C und Bleomycin; die Antimetaboliten Methotrexat, 5-Fluorouracil, 5-Fluordeoxyuridin, 6-Mercaptopurin, 6-Thioguanin, Cytosinarabinosid, 5-Azacytidin und Hydroxyharnstoff; die Alkylierungsmittel Cyclophosphamid, Melphalan, Busulfan, CCNU, MeCCNU, BCNU, Streptozotocin, Chlorambucil, Bis-Diamindichlorplatin, Azetidinylbenzochinon; und die Mischmittel Dacarbazin, mAMSA und Mitoxantron.
Diese und andere chemotherapeutische Mittel, wie Etoposid und Amsacrin, haben sich als sehr nützlich bei der Behandlung von Krebs erwiesen. Leider werden Tumorzellen resistent gegenüber spezifischen chemotherapeutischen Mitteln, in manchen Fällen sogar gegenüber mehreren chemotherapeutischen Mitteln. Eine solche Wirkstoffresistenz oder Mehrfachwirkstoffresistenz kann theoretisch entweder an dem Vorhandensein genetischer Faktoren, die Resistenz gegenüber den Wirkstoffen verleihen, oder der Abwesenheit genetischer Faktoren liegen, die eine Sensibilität gegenüber den Wirkstoffen verleihen. Der erste Faktor-Typ wurde identifiziert und schließt das Mehrfachwirkstoffresistenzgen mdr-1 ein (siehe Chen et al, 1986, Cell 47: 381-389). Jedoch ist der letztere Faktor-Typ noch sehr unbekannt, zum Teil vielleicht, da die Abwesenheit von Faktoren dazu tendieren würde, ein rezessives Merkmal zu sein.
Eine Identifizierung von Genen, die mit einer Sensibilität gegenüber chemotherapeutischen Mitteln assoziiert sind, ist erwünscht, da die Auffindung solcher Gene sowohl zu diagnostischen als auch therapeutischen Ansätzen für Krebszellen und für wirkstoffresistente Krebszellen sowie zur Verbesserung in der Gentherapie und des rationalen Wirkstoffdesigns führen kann. Kürzlich wurden in dem schwierigen Bereich der Isolierung rezessiver genetischer Elemente, einschließlich eines, das an der Sensibilität gegenüber zytotoxischen Wirkstoffen beteiligt ist, Entwicklungen gemacht. Roninson et al., US Patent Nr. 5,217,889, erteilt am 08. Juni 1993, lehrt ein verallgemeinertes Verfahren, um genetische Suppressorelemente (GSE) zu erhalten, die dominant negative Faktoren sind, die dem Gen, welchem das spezielle GSE entspricht, den Phänotyp des Rezessiv-Typs verleihen (siehe auch Holzmayer et al., 1992, Nucleic Acids Res 20: 711-717). Gudkov et al. (1993, Proc Natl Acad Sci USA 90: 3231-3235) lehren die Isolierung von GSE, die eine Resistenz gegenüber Topoisomerase II-interaktive Wirkstoffe induzieren, von Topoisomerase II cDNA. Jedoch verbleibt ein Bedürfnis zur Identifizierung noch unbekannter Gene oder genetischer Elemente, die mit einer Sensibilität gegenüber chemotherapeutischen Mitteln assoziiert sind, was ein Ziel darstellt, das durch die Tatsache, dass kein geklontes Gen als Ausgangsmaterial zur Herstellung von GSE erhältlich ist, erschwert wird. Vorzugsweise werden solche Gene oder genetischen Elemente an einem üblichen Weg, der mit einer Sensibilität gegenüber mehr als einem chemotherapeutischen Mittel in Verbindung steht, beteiligt sein. Am meisten bevorzugt werden solche Gene oder genetischen Elemente durch direkte Selektion von GSE, die einen Verlust des Wirkstoffsensibilitätsphänotyps verursachen, identifiziert werden.

KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung bezieht sich auf genetische Suppressorelemente (GSE), die Zellen eine Resistenz gegenüber chemotherapeutischen Mitteln verleihen. Diese GSE sind Zufallsfragmente, die von Genen abgeleitet sind, welche mit einer Sensibilität gegenüber chemotherapeutischen. Wirkstoffen assoziiert sind, obgleich die Natur solcher Gene recht überraschend sein kann. Somit wird in einem ersten Aspekt der Erfindung ein GSE bereitgestellt, das eine Nukleotidsequenz, wie sie in Fig. 9 (SEQ ID NO. 15), Fig. 10 (SEQ ID NO. 16) oder Fig. 11 (SEQ ID NO. 17) gezeigt ist, oder ein Komplement davon aufweist.
In einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein synthetisches Peptid bereitgestellt, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die der Aminosäuresequenz entspricht, welche durch ein GSE der Erfindung kodiert wird. In einem dritten Aspekt der Erfindung wird ein synthetisches Oligonukleotid bereitgestellt, das eine Nukleotidsequenz einer Antisense-RNA aufweist, die durch ein GSE der Erfindung kodiert wird.
In einem vierten Aspekt der Erfindung wird die Verwendung eines GSE der Erfindung bereitgestellt, um einer eukaryontischen Zelle eine Etoposidresistenz zu verleihen.
In einem fünften Aspekt der Erfindung wird die Verwendung eines GSE der Erfindung in einem Verfahren zur Isolierung eines Gens, das mit einer Sensibilität gegenüber einem chemotherapeutischen Wirkstoff im Zusammenhang steht, bereitgestellt, das den Schritt des Screenings einer cDNA-Bibliothek mit dem GSE umfasst.
In einem sechsten Aspekt der Erfindung wird die Verwendung eines GSE der Erfindung zur Diagnose einer Resistenz gegenüber einem chemotherapeutischen Wirkstoff in einer Tumorprobe bereitgestellt, wobei die Verwendung den Schritt des Untersuchens der Tumorprobe auf eine Expression eines Gens, das mit dem GSE hybridisiert, umfasst, wobei Wirkstoff-resistente Tumorproben eine verringerte oder keine Expression des Gens aufweisen.
In einem siebten Aspekt der Erfindung wird eine Säugerzelle bereitgestellt, die ein GSE der Erfindung exprimiert.
In einem achten Aspekt der Erfindung wird ein Antikörper bereitgestellt, der gegenüber einem Protein oder Polypeptid reaktiv ist, das durch ein GSE der Erfindung kodiert wird.
In einem neunten Aspekt der Erfindung wird die Verwendung eines GSE der Erfindung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs bereitgestellt.
In einem zehnten Aspekt der Erfindung wird ein GSE der Erfindung zur Verwendung als Pharmazeutikum bereitgestellt.
In einem elften Aspekt der Erfindung wird die Verwendung eines GSE der Erfindung zur Identifizierung von Genen, die mit einer Resistenz gegenüber einem chemotherapeutischen Wirkstoff oder mit dem Altern im Zusammenhang stehen, bereitgestellt.
In einem zwölften Aspekt der Erfindung wird die Verwendung eines GSE der Erfindung zur Herstellung eines Medikaments zur Verbesserung von Chemotherapie bereitgestellt.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt die Nukleotidsequenzen von zwölf GSE, die nicht innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegen, die Zellen eine Etoposid-Resistenz verleihen, und die von Topoisomerase II DNA abgeleitet sind, unter Verwendung einer Einzelgenzufallsfragmentexpressionsbibliothek, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Die gezeigten GSE sind (A) KIon 2 V [SEQ ID NO 1], (B) Klon Σ11 [SEQ ID NO 2], (C) Klon 6 [SEQ ID NO 3], (D) Klon 5 [SEQ ID NO 4], (E) Klon Σ28 [SEQ ID NO 5], (F) Klon Σ2 [SEQ ID NO 6], (G) Klon Σ20 [SEQ ID NO 7], (H) Klon 39 [SEQ ID NO 8], (I) Klon 12S [SEQ ID NO 9], (J) Klon Σ8 [SEQ ID NO 10], (K) Klon ΣVPs2 [SEQ ID NO 11] und n(L) Klon ΣVM [SEQ ID NO 12].
Fig. 2 zeigt ein Schema zum Aufbau von RFEL von NIH 3T3 cDNA. Der Teil A zeigt das Gesamtaufbauschema. Der Teil B zeigt die Normalisierung der eDNA-Fragmente. In dieser Gruppe stellt t gesamte nicht-fraktionierte cDNA dar, s und d stellen die einzelsträngigen und doppelsträngigen Fraktionen, die durch Hydroxyapatit separiert wurden, dar, Zeitpunkte geben die Dauer des Reannealings an und Tubulin, c-myc und c-fos zeigen die Sonden an, die bei der Southern-Hybridisierung mit den gesamten, einzelsträngigen und doppelsträngigen Fraktionen verwendet wurden.
Fig. 3 zeigt die Struktur des LNCX-Vektors und des Adaptors, die beim cDNA-Klonen verwendet wurden. Die Nukleotidsequenzen sind für die ATG- sense [SEQ ID NO 13]- und ATG-antisense [SEQ ID NO 14]-Stränge des Adaptors gezeigt.
Fig. 4 zeigt das Gesamtschema des Selektierens von Zelllinien, die GSE aufweisen, die Resistenz gegenüber einem chemotherapeutischen Wirkstoff verleihen, und des Freisetzens der GSE aus diesen Zellen.
Fig. 5 zeigt die Etoposid-Resistenz, die durch ausgewählte Viren (Teil A) verliehen werden und PCR-Analyse der selektierten und unselektierten Populationen (Teil B).
Fig. 6 zeigt ein Schema zum Umklonieren individueller PCR-amplifizierter Fragmente von Etoposid-resistenten ausgewählten Zellen in den LNCX-Vektor, wie es in Beispiel 4 beschrieben ist.
Fig. 7 zeigt die Resistenz gegenüber 350 ng/ml Etoposid, die den Zellen durch die GSE VPA (Teil A1 und VP9-11 (Teil B) verliehen wird.
Fig. 8 zeigt die Resistenz gegenüber verschiedenen Konzentrationen von Etoposid, die den Zellen durch das GSE Anti-khcs mit einem IPTG- induzierbaren Promotor (Teil A) verliehen wird, und das Schema für diese Selektion (Teil B).
Fig. 9 zeigt die Nukleotidsequenz des GSE Anti-khcs [SEQ ID NO 15].
Fig. 10 zeigt die Nukleotidsequenz des GSE VPA [SEQ ID NO 16].
Fig. 11 zeigt die Nukleotidsequenz des GSE VP9-11 [SEQ ID NO. 17].
Fig. 12 zeigt die Nukleotidsequenz des größten Teils der Kodierungsregion der Maus khcs-cDNA [SEQ ID NO 18].
Fig. 13 zeigt die Punktmatrixaufstellungen einer khcs-Proteinsequenz, die aus der Nukleotidsequenz in Fig. 12 folgt, mit Kinesinsequenzen schwerer Ketten vom Menschen (Teil A), der Maus (Teil B), dem Tintenfisch (Teil C) oder dem Teil der Maus khcs, der durch das Anti-khcs GSE kodiert wird (Teil D).
Fig. 14 zeigt die Effizienz des Plattierens von NIH 3T3-Zellen, die mit dem LNCX-Vektor (durch Kreuze angegeben) oder mit dem LNCX-Vektor, der das Anti-khcs GSE enthält (angezeigt durch Punkte) infiziert sind, in Gegenwart verschiedener chemotherapeutischer Wirkstoffe.
Fig. 15 zeigt eine erhöhte Immortalisierung primärer Mausembryofibroblasten durch Infektion mit dem LNCS-Vektor, der das Anti-khcs GSE enthält, verglichen mit Zellen, die mit dem LNCS-Vektor alleine infiziert sind, oder mit uninfizierten (Kontroll-)Zellen.
Fig. 16 zeigt die quantitative eDNA-PCR-Analyse der Expression des humanen khcs-Gens in verschiedenen unselektierten und Etoposid-selektierten menschlichen HeLa-Zellen. Banden a zeigen Ergebnisse für Klon CS(O), Banden a' für Klon CX(200), Banden b für Klon Σ/11(O), Banden b' für Klon Σ11 (1000), Banden c für Klon 6(O), Banden c' für Klon 6(1000), Banden d für Klon Σ20(O) und Banden d' für Klon Σ20(1000). Die Zahlen in Klammern für jeden Klonnamen geben die Konzentration von Etoposid (ng/ml) an, die in dem Wachstumsmedium vorhanden ist. Die Banden, die eine khcs-Expression anzeigen, sind zusammen mit Banden für eine β&sub2;-Mikroglobulin-Expression als interne Kontrolle gezeigt.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Die Erfindung bezieht sich auf Mittel zur Unterdrückung spezieller Genfunktionen, die mit einer Sensibilität gegenüber chemotherapeutischen Wirkstoffen assoziiert sind. Die Erfindung stellt genetische Suppressorelemente (GSE), wie in Anspruch 1 definiert, bereit, die eine solche unterdrückende Wirkung aufweisen und somit eine Resistenz gegenüber chemotherapeutischen Wirkstoffen verleihen. Die Erfindung stellt ferner Verfahren für die Verwendung von GSE der Erfindung bereit.
GSE der Erfindung können gemäß dem folgenden Verfahren zur Identifizierung von GSE, die eine Resistenz gegenüber einem beliebigen chemotherapeutischen Wirkstoff, gegenüber welchem eine Resistenz möglich ist, verleihen, identifiziert werden. Die durch dieses Verfahren identifizierten GSE (einschließlich der GSE der Erfindung, wie sie durch Anspruch 1 definiert sind) werden homolog zu einem Gen sein, das mit einer Sensibilität gegenüber einem oder mehreren chemotherapeutischen Wirkstoffen assoziiert ist. Zu Zwecken der Erfindung weist der Ausdruck "homolog zu einem Gen" zwei verschiedene Bedeutungen auf, abhängig davon, ob das GSE über einen Antisense- oder Antigenmechanismus oder vielmehr über einen Mechanismus des Wechselwirkens auf Proteinbasis agiert. Im ersteren Fall ist ein GSE, das ein Antisense- oder Antigen-Oligonukleotid oder -Polynukleotid ist, homolog zu einem Gen, wenn es eine Nukleotidsequenz aufweist, die unter physiologischen Bedingungen mit dem Gen oder seinem mRNA-Transkript über Hoogsteen- oder Watson-Crick-Basenpaarung hybridisiert. Im letzteren Fall ist ein GSE, das mit einem Proteinmolekül wechselwirkt, homolog zu dem Gen, das das Proteinmolekül kodiert, wenn es die gleiche Aminosäuresequenz aufweist wie die, die durch ein Teil des Gens, das das Protein kodiert, kodiert wird, oder das das gleiche wäre, aber für konservative Aminosäuresubstitutionen. In jedem Fall wird aus praktischen Gründen bestimmt, ob das GSE homolog zu einem Gen ist, indem bestimmt wird, ob das GSE dazu in der Lage ist, die Funktion des Gens zu inhibieren oder zu verringern.
Das Verfahren umfasst den Schritt des phänotypischen Screenings einer Zufallsfragmentexpressionsbibliothek gesamter cDNA oder genomischer DNA, um Klone zu identifizieren, die Resistenz gegenüber einem chemotherapeutischen Wirkstoff verleihen. Vorzugsweise wird die Zufallsfragmentbibliothek gesamter cDNA oder genomischer DNA in einen retroviralen Expressionsvektor geklont. Retroviruspartikel, die die Bibliothek enthalten, werden verwendet, um Zellen zu infizieren, und die infizierten Zellen werden auf ihre Fähigkeit getestet, in einer Konzentration eines chemotherapeutischen Wirkstoffes, die uninfizierte Zellen tötet, zu überleben. Vorzugsweise werden die Inserts im Bereich von ungefähr 100 bp bis ungefähr 700 bp oder mehr bevorzugt von ungefähr 200 bp bis ungefähr 500 bp sein. Am meisten bevorzugt wird die Zufallsfragmentbibliothek eine normalisierte Bibliothek sein, die ungefähr eine gleiche Anzahl an Klonen enthält, die jedem Gen entsprechen, das in dem Zelltyp exprimiert wird, aus welchem es hergestellt wurde, ohne Berücksichtigung des Expressionslevels irgend eines Gens. Jedoch ist die Normalisierung der Bibliothek nicht notwendig zur Isolierung von GSE, die homolog sind zu reichlich oder moderat exprimierten Genen. Wenn eine klonale Population an Zellen, die gegenüber dem chemotherapeutischen Wirkstoff resistent sind, isoliert wurde, wird der das GSE kodierende Bibliotheksklon aus den Zellen freigesetzt. Auf dieser Stufe kann das Insert der Expressionsbibliothek auf seine Nukleotidsequenz hin untersucht werden. Alternativ kann der freigesetzte Bibliotheksklon in zusätzlichen Transfektions- oder Infektions- und Selektionsassays vor der Nukleotidsequenzbestimmung ferner auf seine Fähigkeit hin getestet werden, gegenüber chemotherapeutischen Wirkstoffen Resistenz zu verleihen. Die Bestimmung der Nukleotidsequenz führt natürlich zur Identifizierung des GSE. Dieses Verfahren ist ferner in den Beispielen 2-5 veranschaulicht.
Gene, die mit einer Sensibilität gegenüber chemotherapeutischen Wirkstoffen assoziiert sind, einschließlich jenen, die zuvor nicht gefunden wurden, können in dem folgenden Verfahren identifiziert und geklont werden. GSE oder Teile davon können als Sonden verwendet werden, um cDNA ganzer Länge oder genomische Bibliotheken zu screenen, um ihr Ursprungsgen zu identifizieren. In manchen Fällen werden sich Gene, die mit einer Sensibilität gegenüber chemotherapeutischen Wirkstoffen assoziiert sind, als ziemlich überraschend herausstellen. Z. B. weisen GSE, die eine Etoposid-Sensibilität aufheben, eine besonders überraschende Natur auf. Das Target für Etoposid ist Topoisomerase II, ein DNA-entwindendes Enzym. GSE, die aus Zufallsfragmenten von Topoisomerase II DNA hergestellt sind, verleihen eine Resistenz gegenüber Etoposid. Demgemäß würde erwartet werden, dass die meisten GSE, die eine Etoposid-Resistenz verleihen, von DNA, die Topoisomerase II kodiert, abgeleitet sind. Überraschenderweise ist dies überhaupt nicht der Fall. Von drei erhaltenen Etoposid-Resistenz-verleihenden GSE waren zwei von zuvor nicht identifizierten DNA-Sequenzen abgeleitet. Ein drittes solches GSE war von dem Kinesingen mit schwerer Kette abgeleitet. Vor diesem Fund wurde nicht vermutet, dass Kinesin auf irgend eine Weise mit einer Etoposid-Sensibilität im Zusammenhang stehen würde. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass das Verfahren eine Menge neuer und überraschender Informationen über die genetische Basis für eine Resistenz gegenüber chemotherapeutischen Wirkstoffen bereitstellt. Zusätzlich dazu verursachte ein Kinesin-abgeleitetes GSE, das eine Resistenz gegenüber Etoposid verleiht, zelluläre Auswirkungen, die darauf hinweisen, dass Kinesin in den programmierten Zelltod involviert sein kann. Wenn dies tatsächlich der Fall ist, dann stellt das Verfahren wertvolle Informationen über die genetische Basis für das Altern und den Zelltod bereit. Dies kann wichtige Auswirkungen auf die Untersuchung von in die Entwicklung involvierten Genen haben, da GSE, die zur Identifizierung von Genen verwendet werden, die mit einer chemotherapeutischen Wirkstoffresistenz oder mit dem Altern assoziiert sind, auch als Transgene in Embryonen exprimiert werden können, um die Rolle solcher Gene bei der Entwicklung zu bestimmen. Das Verfahren und seine Verwendung zur Untersuchung von Genen, die dadurch identifiziert werden, und ihre zellulären Auswirkungen sind ferner in den Beispielen 6-8 veranschaulicht.
GSE, die eine optimierte Suppressoraktivität für ein Gen aufweisen, das mit einer Sensibilität gegenüber einem chemotherapeutischen Wirkstoff assoziiert ist, können durch ein Verfahren erhalten werden, in welchem ein anfängliches GSE durch das erste oben beschriebene Verfahren erhalten wird. Dann wird das Gen, von welchem das GSE abgeleitet ist, identifiziert und durch das zweite oben beschriebene Verfahren geklont. Dieses Gen wird dann Zufallsfragmentiert und in einen Expressionsvektor, vorzugsweise einen retroviralen Vektor, geklont, um eine Zufallsfragmentexpressionsbibliothek, die ausschließlich von dem Gen von Interesse abgeleitet ist, zu erhalten. Diese Bibliothek wird dann in Säugerzellen transferiert und darin exprimiert, die in Gegenwart des geeigneten chemotherapeutischen Wirkstoffes selektiert werden. Aus praktischen Gründen wird eine solche Bibliothek eine viel größere Varietät an von dem Gen von Interesse abgeleiteten GSE enthalten, als es bei einer Zufallsfragmentbibliothek, die aus gesamter cDNA hergestellt ist, der Fall ist. Folglich wird die Wahrscheinlichkeit, optimierte GSE, wie es durch eine maximierte Resistenz gegenüber einem chemotherapeutischen Wirkstoff bestimmt ist, aus dem Einzelgenzufallsfragmentbibliotheks-Ansatz zu erhalten, in Beispiel 1 detaillierter gezeigt.
Die Erfindung schließt ferner synthetische Peptide und Oligonukleotide ein, wie sie in den Ansprüchen 2 und 3 definiert sind, welche in der Lage sind, die Funktion der mit einer Sensibilität gegenüber chemotherapeutischen Wirkstoffen assoziierten Genen zu inhibieren. Synthetische Peptide gemäß der Erfindung weisen Aminosäuresequenzen auf, die den Aminosäuresequenzen entsprechen, welche durch GSE der Erfindung kodiert werden. Synthetische Oligonukleotide gemäß der Erfindung weisen Nukleotidsequenzen auf, die den Nukleotidsequenzen der GSE gemäß der Erfindung entsprechen. Wenn ein GSE gefunden und sequenziert ist und seine Orientierung bestimmt ist, ist es leicht, ein Oligonukleotid, das der Nukleotidsequenz des GSE (für Antisense- orientierte GSE) entspricht oder eine Aminosäuresequenz, die durch das GSE kodiert wird (für Sense-orientierte GSE), herzustellen.
Wie es hierin verwendet wird, schließt der Ausdruck Oligonukleotid modifizierte Oligonukleotide mit Nuklease-Resistenz- Internukleotidverknüpfungen ein, wie Phosphorothioat-, Methylphosphonat-, Phosphorodithioat-, Phosphoramidat-, Phosphotriester-, Sulfon-, Siloxan-, Carbonat-, Carboxymethylester-, Acetamidat-, Carbamat-, Thioether-, verbrückte Phosphoramidat-, verbrückte Methylenphosphonat- und verbrückte Phosphorthioat-Internukleotidverknüpfungen. Die Synthese von Oligonukleotiden, die diese modifizierten Verknüpfungen enthalten, sind im Fachgebiet wohlbekannt. (Siehe z. B. Uhlmann und Peyman, 1990, Chem Rev 90: 543-584 (1990); Schneider und Banner, 1990, Tetrahedron Lett 31: 335). Der Ausdruck Oligonukleotide schließt auch Oligonukleotide ein, die modifizierte Basen oder modifizierte Ribose- oder Deoxyribosezucker aufweisen.
Die Erfindung stellt auch einen diagnostischen Assay für Tumorzellen, welche aufgrund der Abwesenheit einer Expression oder Unterexpression eines speziellen Gens resistent gegenüber einem oder mehreren chemotherapeutischen Wirkstoffen sind, bereit. Indem die hierin beschriebenen Verfahren verwendet werden, wird ein solches Gen identifiziert und geklont. Um zu bestimmen, ob die Abwesenheit einer Expression oder Unterexpression eines solchen Gens eine natürlich auftretende ist und somit eine medizinisch bedeutende Basis für eine Resistenz gegenüber einem chemotherapeutischen Wirkstoff ist, können menschliche Tumorzellen mit cytotoxischen Mengen eines geeigneten chemotherapeutischen Wirkstoffes behandelt werden, um auf spontane Wirkstoffresistenzmutanten zu selektieren. Diese Mutanten können dann auf ihre Expressionslevel des speziellen Gens von Interesse bestimmt werden. Die Abwesenheit einer Expression oder eine beträchtlich verringerte Expression zeigt einen natürlichen Mechanismus einer Resistenz gegenüber einem chemotherapeutischen Wirkstoff an. Demgemäß kann eine solche verringerte oder nicht vorhandene Expression die Basis für einen diagnostischen Assay für Tumorzellresistenz gegenüber einem chemotherapeutischen Wirkstoff oder Wirkstoffen von Interesse sein. Eine erste Ausführungsform eines diagnostischen Assays gemäß diesem Aspekt der Erfindung verwendet ein Oligonukleotid oder Oligonukleotide, das/die homolog zu der Sequenz des Gens ist/sind, für welche die Expression gemessen werden soll. In dieser Ausführungsform wird RNA von einer Tumorprobe extrahiert und RNA, die spezifisch für das interessierende Gen ist, wird durch standardgemäße Filterhybridisierungsverfahren, einen RNase-Protektonsassay oder mittels quantitativer cDNA-PCR quantifiziert. (Siehe Noonan et al. 1990, Proc Natl Acad Sci USA 87: 7160-7164). In einer zweiten Ausführungsform eines diagnostischen Assays gemäß diesem Aspekt der Erfindung werden Antikörper gegen ein synthetisches Peptid hervorgerufen, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch ist mit einem Teil des Proteins, das durch das interessierende Gen kodiert wird. Diese Antikörper werden dann in einem konventionellen quantitativen Immunoassay verwendet (z. B. RIA oder immunohistochemische Assays), um die Menge des interessierenden Genproduktes zu bestimmen, das in einer Proteinprobe, die von den zu testenden Tumorzellen extrahiert wurde, oder an der Oberfläche oder an Stellen innerhalb der zu testenden Tumorzellen vorhanden ist.
GSE der Erfindung können als dominante selektierbare Marker verwendet werden, die bei Genkotransferstudien nützlich sind. Da GSE gemäß der Erfindung Resistenz gegenüber chemotherapeutischen Wirkstoffen verleihen, kann die Gegenwart eines Vektors, der das GSE exprimiert, durch das Wachstum einer Vektor-transformierten Zelle in einer Konzentration des geeigneten zytotoxischen Wirkstoffes, der in Abwesenheit des GSE zytotoxisch wäre, leicht selektiert werden. GSE gemäß der Erfindung sind insbesondere gut geeignet als dominante selektierbare Marker, da es ihre kleine Größe erlaubt, dass sie leicht zusammen mit einem zu kotransferierenden Gen selbst in virale Vektoren inkorporiert werden können, die eine begrenzte Packungskapazität aufweisen.
GSE der Erfindung stellen auch in vivo-selektierbare Marker bereit, die sowohl in der Gentherapie als auch bei der Verbesserung der Effektivität von Chemotherapie nützlich sind. Für die Gentherapie können GSE gemäß der Erfindung auf einem Vektor in humane CD34&spplus;-Blutvorläuferzellen von einem Patienten zusammen mit einem therapeutischen Gen, das, wenn es exprimiert wird, eine genetische Störung lindert, transferiert werden. Die Zellen können in vitro auf eine Resistenz gegenüber einem geeigneten chemotherapeutischen Wirkstoff selektiert werden, wobei ein erfolgreicher Transfer des GSE und damit auch des therapeutischen Gens sichergestellt ist. Die Vorläuferzellen, die das GSE und therapeutische Gen enthalten, können dann dem Kreislauf des Patienten zurückgeführt werden. Schließlich können die Zellen, die das GSE und therapeutische Gen enthalten, in vivo selektiert werden, indem der geeignete chemotherapeutische Wirkstoff (gegenüber welchem das GSE Resistenz verleiht) in einer Konzentration verabreicht wird, welche für normale Blutzellen zytotoxisch ist. Auf diese Weise werden solche Zellen, die das GSE und das therapeutische Gen aufweisen, das Blut des Patienten wieder besiedeln.
Für eine Verbesserung von Chemotherapie kann ein GSE gemäß der Erfindung alleine oder mit einem anderen Gen auf einem Expressionsvektor in CD34&spplus;- Blutvorläuferzellen von einem Krebspatienten transferiert werden. Dann wird eine in vitro-Selektion der Vorläuferzellen, die das GSE tragen, unter Verwendung des geeigneten chemotherapeutischen Wirkstoffes durchgeführt. Die selektierten Zellen werden dann dem Kreislauf des Patienten rückgeführt und man lässt ihnen Zeit, um das Blut wieder zu besiedeln. Nach einer geeigneten Zeitdauer kann eine aggressive Chemotherapie durchgeführt werden, unter Verwendung von viel höheren als normalen Konzentrationen eines geeigneten chemotherapeutischen Wirkstoffes (gegenüber welchem das GSE Resistenz verleiht), da aufgrund einer GSE-Expression in solchen Zellen toxische Nebenwirkungen im Immunsystem vermieden werden.
In einem dieser therapeutischen Zusammenhänge kann es erwünscht sein, dass das GSE in den Vorläuferzellen (und darauffolgend in den Blutzellen) nur exprimiert wird, wenn seine Expression nützlich ist, d. h. während einer in vivo- Selektion oder Chemotherapie. Um dies zu erreichen, kann ein induzierbarer Promotor verwendet werden, um das GSE zu exprimieren. Dann wird den Zellen das geeignete Induktionsmittel vor und während der in vitro-Selektion und wieder vor und während der in vivo-Selektion oder Chemotherapie zugegeben. Solange das Induktionsmittel im menschlichen Körper nicht normal vorhanden ist, wird das GSE zu einer anderen Zeit nicht exprimiert werden.
GSE der Erfindung stellen einen Ausgangspunkt für das rationale Design von pharmazeutischen Produkten bereit, die einer Resistenz von Tumorzellen gegenüber chemotherapeutischen Wirkstoffen entgegenwirken können. Die Proteinsequenz, die von Genen kodiert wird, von welchen die GSE abgeleitet sind, können aus der cDNA-Sequenz gefolgert werden, und die Funktion der entsprechenden Proteine kann bestimmt werden, indem eine Homologie mit bekannten Genen gesucht wird, oder indem bekannte funktionale Motive in der Proteinsequenz gesucht werden. Wenn diese Assays die Proteinfunktion nicht angeben, kann sie durch die phänotypischen Wirkungen der GSE, die das Gen unterdrücken, gefolgert werden. Solche Wirkungen können auf zellulärem Level durch Analyse verschiedener Wachstums-vermittelter, morphologischer, biochemischer oder antigener Veränderungen, die mit einer GSE-Expression assoziiert sind, untersucht werden. Die GSE-Wirkungen auf Organismus-Level können auch untersucht werden, indem die entsprechenden GSE als Transgene in transgene Tiere (z. B. Mäuse) eingeführt werden und Entwicklungsanomalien, die mit einer GSE-Expression assoziiert sind, analysiert werden. Die Genfunktion kann auch durch Expression der cDNA mit voller Länge des entsprechenden Gens anstelle des GSE von einem starken Promotor in Zellen oder transgenen Tieren und durch Untersuchen der Veränderungen, die mit einer Überexpression des Gens assoziiert sind, untersucht werden.
Volllängen- oder Teil-cDNA-Sequenzen können auch verwendet werden, um eine Proteinsynthese in einem zweckmäßigen prokaryontischen oder eukaryontischen Expressionssystem zu lenken, und die erzeugten Proteine können als Immunogene verwendet werden, um polyklonale oder monoklonale Antikörper zu erhalten. Diese Antikörper können verwendet werden, um die Proteinlokalisierung zu untersuchen, und können als spezifische Inhibitoren der Proteinfunktion sowie für diagnostische Zwecke verwendet werden.
Insbesondere sollten Antikörper, die gegen ein synthetisches Peptid, das durch ein Teil des Komplements der Sequenz des GSE Anti-khcs kodiert wird, oder die entsprechende Region des humanen KHCS-Proteins gerichtet sind, insbesondere nützlich sein, wie auch Antikörper, die gegen eine Aminosäuresequenz gerichtet sind, die durch ein Teil der VPA oder VP9-11 GSE kodiert wird (siehe Fig. 9-11).
Wenn die biochemische Funktion eines Gens, das in eine Wirkstoffsensibilität involviert ist, verstanden wird, ist es leicht, pharmazeutische Mittel vorzuschlagen, um die Funktion eines solchen Gens zu stimulieren oder nachzuahmen und somit die zytotoxische Reaktion auf Antikrebswirkstoffe zu verbessern. Z. B. kann, wenn das Gen für ein Enzym kodiert, welches eine bestimmte Verbindung erzeugt, eine solche Verbindung chemisch synthetisiert und in Kombination mit zytotoxischen Wirkstoffen verabreicht werden. Wenn ein pharmazeutischer Ansatz ausgehend von der Proteinfunktion nicht offensichtlich ist, kann man in der Lage sein, die Genexpression auf Transkriptionsebene hochzumodulieren. Dies kann durchgeführt werden, indem die Promotorregion des entsprechenden Gens geklont wird und die Promotorsequenz auf das Vorhandensein von cis-Elementen, die dafür bekannt sind, eine Reaktion gegen spezifische biologische Stimulatoren bereitzustellen, analysiert wird.
Der einfachste Weg, um die Expression eines Wirkstoffsensibilitätsgens zu erhöhen, welches mittels des GSE-Ansatzes identifiziert wurde, wäre, eine Volllängen-cDNA für ein solches Gen in einen retroviralen Vektor zu insertieren. Ein solcher Vektor wird in Form eines rekombinanten Retrovirus in vivo Tumorzellen zugeführt, und durch Integration solche Zellen gegenüber dem entsprechenden chemotherapeutischen Wirkstoff sensitivieren. Eine ähnliche Strategie für ein selektives Zuführen eines Wirkstoffsensibilitätsgens in Rattenhirntumore, gefolgt von einer Heilbehandlung mit dem entsprechenden Wirkstoff, wurde von Culver et al. beschrieben (1992, Science 256: 1550-1552). Das selektive Zuführen zu Tumorzellen kann auf Basis der Selektivität einer Retrovirus-vermittelten Transduktion für sich teilende Zellen erreicht werden. Alternativ kann die Selektivität erreicht werden, indem die Expression des Wirkstoffsensibilitätsgens ausgehend von einem Gewebe- oder Tumor-spezifischen Promotor durchgeführt wird, wie z. B. dem Promotor des karzinoembryonalen Antigen-Gens.
Die aus der cDNA-Sequenz bestimmte Proteinstruktur kann auch für ein Computerunterstütztes Wirkstoffdesign verwendet werden, um neue Wirkstoffe zu entwickeln, die dieses Protein auf gleiche Weise wie die bekannten Antikrebswirkstoffe beeinflussen. Das gereinigte Protein, das in einem zweckmäßigen Expressionsystem erzeugt wird, kann auch als wichtige Komponente eines biochemischen in vitro-Screeningsystems für neue Verbindungen mit Antikrebsaktivität verwendet werden. Demgemäß sind Säugerzellen, die GSE gemäß der Erfindung, die Resistenz gegenüber einem chemotherapeutischen Wirkstoff verleihen, nützlich, um auf Verbindungen zu screenen, die die Möglichkeit bereitstellen, Wirkstoffresistenz zu überwinden.
Die folgenden Beispiele sind dazu gedacht, bestimmte bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung zu veranschaulichen und sind nichtlimitierender Art.

Beispiel 1

Entwicklung von GSE für humane Topoisomerase II

Topoisomerase II ist ein DNA-entwindendes Enzym, das als Target für viele Antikrebswirkstoffe einschließlich Etoposid, Doxorubicin und Amsacrin dient. Das Enzym wirkt normalerweise durch Doppelstrang-DNA-Spaltung, gefolgt von Strangdurchgang und Wiederverbinden der Brüche. Antikrebswirkstoffe verursachen ein Einfangen des Enzyms in Komplexen, in welchen die Doppelstrangbrüche durch das Enzym zusammengehalten sind, was zu einem letalen Schaden bei Replikationszellen führt. Manche Zelllinien, die resistent gegenüber Antikrebswirkstoffen sind, welche mit Topoisomerase II wechselwirken, weisen eine verringerte Expression dieses Enzyms auf.
Eine Zufallsfragmentselektion von GSE erfordert einen Transfer der Expressionsbibliothek in eine sehr große Anzahl an Empfängerzellen. Daher wurde zur Herstellung einer Zufallsfragmentbibliothek, die GSE zu Topoisomerase II enthält, das effiziente retrovirale Vektorsystem gewählt. Überlappende cDNA-Klone, die die gesamte Kodierungsseduenz für Topoisomerase II umspannen, wurden gemischt und auf 250-350 bp- Fragmente durch DNase I in Gegenwart von Mn&spplus;&spplus;-Ionen Zufallsfragmentiert und Fragmentenden wurden mit T4 DNA-Polymerase und Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I aufgefüllt. Nach Ligation mit einem synthetischen Adaptor, der Translationsinitiierungs- und Terminationskodons bereitstellt, wurde das Fragment unter Verwendung Adaptor-abgeleiteter Primer durch FCR amplifiziert. Die amplifizierte Mischung wurde mit dem LNCX-retroviralen Vektor geklont, der ein neo-Gen enthält (siehe Miller und Rosman, 1989, Biotechniques 7: 980-986).
Es wurde eine Zufallsfragmentbibliothek mit 20.000 unabhängigen Klonen erhalten und verwendet, um amphotrope und ecotrope Virus-verpackende Zelllinien, die von NIH 3T3-Zellen abgeleitet sind, zu transfizieren, um eine Ping-Pong-Replikations-vermittelte Amplifikation des Virus zu bewirken (siehe z. B. Bodine et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3738-3742). Dies führte zu einer Zufallsfragmentexpressionsbibliothek (RFEL), wobei ein Set rekombinanter Retroviren eine repräsentative Mischung an Inserts, die von Topoisomerase II-Gensequenzen abgeleitet sind, enthielt.
Die Einheitlichkeit der Sequenzrepräsentation in RFEL wurde wie folgt aufgezeichnet. NIH 3T3-Zellen wurden mit Virus-enthaltendem Überstand infiziert, gefolgt von einer PCR-Amplifikation integrierter proviraler Insertsequenzen in Gegenwart von [³²P] alpha-dNTP 24 Stunden später. Eine Aliquote der PCR-amplifizierten Mischung wurde einer Gelelektrophorese unterzogen, um die Abwesenheit predominanter Banden zu etablieren. Eine andere Aliquote wurde als Sonde für einen Southern Blot von Topoisomerase II cDNA, verdaut mit mehreren häufig schneidenden Restriktionsenzymen, verwendet. Es wurde eine repräsentative Sequenzmischung erhalten, wie es durch die Abwesenheit einer predominanten Bande im ersten Test und eine einheitliche Hybridisierung mit allen Fragmenten im zweiten Test ausgedrückt wurde.
Dann wurde eine RFEL verwendet, um HeLa-Zellen zu infizieren, und die infizierten Zellen wurden mit G418 selektiert. Kolonien von G418-resistenten Zellen mit jeweils ungefähr 50-70 Zellen wurden dann Etoposid bei einer Konzentration von 200 pg/ml ausgesetzt. Ungefähr 50 von 10.000 G418- resistenten Kolonien waren Etoposid-resistent, verglichen mit einer Häufigkeit von < 10&supmin;&sup4; wenn Retroviren ohne Insert als Kontrolle verwendet wurden. Von Etoposid-resistenten Kolonien wurden Zelllinien isoliert. Amphotrope und ecotrope Verpackungszelllinien, die eine RFEL erzeugen, wurden auch auf Etoposid-Resistenz selektiert. Virus von Etoposid-resistenten Verpackungszelllinien wurde verwendet, um HeLa-Zellen zu infizieren, welche dann mit G418 selektiert wurden. G418-resistente infizierte Zellen wurden mit drei Topoisomerase II-interagierenden Antikrebswirkstoffen behandelt: Etoposid, Teniposid und Amsacrin. Ein großer Anteil der infizierten Zellen war resistent gegenüber allen drei Wirkstoffen, womit gezeigt wurde, dass eine Etoposid-Selektion von Maus-Verpackungszelllinien zur Bildung von GSE geführt hat, die sowohl in humanen als auch Mauszellen aktiv sind. Diese infizierten Zellen wurden auch verwendet, um Zelllinien zu etablieren. RFEL- abgeleitete Inserts wurden durch PCR von Etoposid-resistenten Zelllinien gewonnen und in einen LNCX-Vektor rückgeklont. Die neu entstandenen Klone wurden dann einzeln durch Transfektion in HeLa-Zellen auf die Fähigkeit getestet, eine Resistenz gegenüber Etoposid zu verleihen, um die GSE- Aktivität der entsprechenden Inserts zu bestätigen.
Eine Sequenzanalyse von 26 verschiedenen isolierten Klonen ergab, dass 16 davon in Antisense- und 10 in Sense-Orientierung insertiert waren. Von den 12 bestätigten GSE waren 7 Sense und 5 Antisense, wie es in Tabelle I gezeigt ist. Die Sequenzen der bestätigten GSE sind in Fig. 1 gezeigt. Die Sense-orientierten Inserts von den bestätigten GSE kodieren 37-99 Aminosäure-lange Topo II-abgeleitete Peptide, initiiert entweder von dem durch den Adaptor bereitgestellten ATG-Kodon oder von einem internen ATG- Kodon mit dem offenen Leserahmen von Topoisomerase II, lokalisiert nahe an dem 5'-Ende des Inserts in einem geeigneten Kontext für eine Translationsinitiierung. Vier der bestätigten Antisense-GSE kommen von dem 3'-Drittel der cDNA und eines kommt von dem 5'-Ende der cDNA, einschließlich der Translationsstartstelle. Von den Sense-orientierten GSE waren fünf von dem zentralen Bereich des Proteins abgeleitet, der die aktive Stelle Tyrosin-804, die kovalent an DNA bindet, und die "Leucinzipper"- Region, die in die Dimerisierung von Topoisomerase II involviert ist, einschließt. Ein GSE-Peptid ist von dem Bereich in Nähe des N-Terminus abgeleitet und ein anderes von dem Bereich in Nähe des C-Terminus des Proteins; keine bekannten funktionalen Stellen sind mit einem der beiden Segmente assoziiert.
Diese Ergebnisse zeigen, dass GSE, die gemäß verschiedenen Mechanismen zur Verleihung einer Etoposid-Resistenz agieren, aus einer Zufallsfragmentbibliothek von DNA, die Topoisomerase II kodiert, erzeugt werden können. Außerdem zeigen diese Ergebnisse, dass GSE, die von einer Säugerspezies erzeugt werden, in einer anderen Säugerspezies wirksam sein können. Tabelle I Bestätigte Topoisomerase II-abgeleitete GSE
a Position in der cDNA-Sequenz von Topoisomerase II; die Reste sind nummeriert wie in Tsai-Pflugfelder et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7177-7181.
b Position des Peptids, kodiert durch Sense-orientierte GSE in der Aminosäuresequenz von Topoisomerase II; von der Translation wird angenommen, dass sie von dem ersten ATG-Kodon in dem korrekten offenen Leserahmen initiiert wird.

Beispiel 2

Bildung einer normalisierten Zufallsfragment-cDNA-Bibliothek in einem retroviralen Vektor

Wie es in Fig. 2 gezeigt ist, wurde eine normalisierte cDNA-Population hergestellt, indem eine Modifikation des Protokolls von Patanjali et al. (1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1943-1947) verwendet wurde. Poly(A)&spplus; RNA wurde von NIH 3T3-Zellen extrahiert. Um mRNA für verschiedene Gene, die in verschiedenen Stadien des Zellwachstums exprimiert werden, zu erhalten, wurde eine Hälfte der RNA von einer schnell wachsenden Kultur und die andere Hälfte von ruhigen Zellen, die eine vollständige Monoschichtkonfluenz erreicht hatten, isoliert. Um eine Überrepräsentation der 5'-Endsequenzen in einer Zufalls-geprimten cDNA-Population zu vermeiden, wurde RNA fragmentiert, indem sie auf eine mittlere Größe im Bereich von 699-1.000 Nukleotide zerteilt wurde. Diese RNA-Fragmente wurden dann zur Herstellung Zufalls-geprimter doppelsträngiger cDNA verwendet. Diese Zufalls-geprimte cDNA wurde dann an einen synthetischen Adaptor, der ATG-Kodons in allen drei möglichen Leserahmen und in einem geeigneten Kontext für eine Translationsinitiierung bereitstellte, ligiert. Die Struktur des Adaptors (siehe Fig. 3) bestimmte seine Ligation an die Blunt-End-Fragmente der cDNA auf eine solche Weise, dass jedes Fragment von Initiierungskodons startete, unabhängig von seiner Orientierung. Der Adaptor wurde nicht mit Terminationskodons im entgegengesetzten Strang versetzt, da der Klonierungsvektor pLNCX solche Kodons direkt stromabwärts der Klonierungsstelle enthielt. Dieser Vektor wurde von Miller und Rosman (1989, Biotechniques 7: 980-986) beschrieben. Die prozessierte Mischung wurde durch PCR unter Verwendung des "Sense"-Stranges des Adaptors als PCR- Primer amplifiziert, im Gegensatz zu dem Verfahren von Patanjali et al., die das Klonieren der initialen cDNA-Präparation in einen Phagenvektor verwendeten und dann Vektor-abgeleitete Sequenzen als PCR-Primer verwendeten, um die cDNA-Population zu amplifizieren. Die PCR wurden in 12 separaten Reaktionen durchgeführt, die anschließend vereinigt wurden, um eine zufällige Über- oder Unteramplifikation spezieller Sequenzen zu minimieren, und um die Ausbeute des Produktes zu erhöhen. Die PCR-amplifizierte Mischung wurde durch Gelelektrophorese größenfraktioniert und 200-500 bp-Fragmente, im Gegensatz zu Pantanjalis Fragmentgrößenbereich von 400 bis 1.600 bp, wurden auf darauffolgende Manipulationen selektiert.
Für eine Normalisierung wurde die cDNA-Präparation denaturiert und reannealed unter Verwendung verschiedener Zeitpunkte für das Reannealing, wie es von Patanjali et al., supra, beschrieben wurde, und wie es in Fig. 2 gezeigt ist. Die einzelsträngigen und doppelsträngigen DNA von jeder reannealten Mischung wurden durch Hydroxyapatitchromatographie separiert. Die einzelsträngigen DNA-Fraktionen jedes Zeitpunktes des Reannealens wurden PCR-amplifiziert unter Verwendung des Adaptor-abgeleiteten Primers und wurden durch Souther-Hybridisierung auf das relative Vorhandensein verschiedener mRNA-Sequenzen hin analysiert. Die Fraktion, die ähnliche Anteile an Tubulin, c-myc und c-fos cDNA-Sequenzen enthielt (siehe Fig. 2), entsprechend der halb- bzw. niedrigexprimierten Gene, wurde für die Präparation der Bibliothek verwendet.
Die normalisierte cDNA-Präparation wurde in die ClaI-Stelle des MoMLV- basierenden retroviralen Vektors pLNCX geklont, welcher das neo (G418- Resistenz)-Gen trägt, welches von dem in dem retroviralen langen terminalen Repeat (LTR) enthaltenen Promotor transkribiert wird, und welcher die insertierte Sequenz von einem starken Promotor des Cytomegalovirus (CMV) exprimiert (siehe Fig. 3). Die Ligationsmischung, aufgeteilt in fünf Anteile, wurde für fünf aufeinanderfolgende Transformationen im großen Maßstab von E.coli verwendet. Die transformierten Bakterien wurden auf insgesamt 500 Agarplatten (150 mm Durchmesser) angelegt und die Plasmidpopulation (18 mg gesamt) wurde von den vom Agar gewaschenen Kolonien isoliert. Insgesamt wurden ungefähr 5 · 10&sup7; Klone erhalten, wobei mehr als 60% davon die Inserts normalisierter cDNA trugen, wie es durch PCR-Amplifikation von Inserts von 50 zufällig ausgewählten Kolonien abgeschätzt wurde. Diese Ergebnisse demonstrieren die Durchführbarkeit des Generierens einer normalisierten cDNA-Bibliothek von sogar 3 · 10&sup7; rekombinanten Klonen in einem retroviralen Plasmidexpressionsvektor.

Beispiel 3

Transduktion einer Bibliothek retroviralen Zufallsfragments in Virus-verpackenden Zelllinien und NIH 3T3 Zellen

Die gemäß Beispiel 2 hergestellte Plasmidbibliothek wurde durch Transfektion in Virus-verpackende Zellen (Derivate von NIH 3T3), welche retrovirale Virionproteine exprimieren, in eine Mischung retroviraler Partikel umgewandelt. Beispiele solcher Zelllinien wurden von Markowitz et al. beschrieben (1988, Virology 167: 400-406). Ecotrope und amphotrope Virus-verpackende Zelllinien, GP + E86 bzw. GP + envAm12 wurden in einem Verhältnis von 1 : 1 gemischt und 10&sup7; Zellen dieser Mischung wurden mit der Plasmidbibliothek unter Standard-Calciumphosphat-Kopräzipitationsbedingungen transfiziert. Diese Transfektion führte zum Verpacken und Sekretieren ecotroper und amphotroper Viruspartikel, die sich leicht über die Verpackungszellpopulation verteilen, da ecotrope Viren in der Lage sind, amphotrope Verpackungszellen zu infizieren und umgekehrt. Die Ausbeute des Virus, gemessen durch die Anzahl an G418-resistenten Kolonien, die nach der Infektion von NIH 3T3- Zellen erhalten wurde, erreichte 10&sup5; infektiöse Einheiten pro 1 ml Medium während des Stadiums transienter Transfektion (1-3 Tage), nahm dann ab (4-8 Tage) und erhöhte sich dann schnell aufgrund der Expression proviraler Genome, die in den meisten der Verpackungszellen stabil integriert wurden. Die Ausbeute des Virus 9-2 Tage nach der Transfektion erreichte > 10&sup6; pro 1 ml Mediumüberstand. In diesem Stadium zeigte die Bibliothek eine ziemlich gleiche Repräsentation verschiedener Fragmente, aber in späteren Stadien begannen einzelne Virus-produzierende Klone in der Population vorzuherrschen, was zu einer ungleichen Repräsentation eDNA-abgeleiteter Inserts führte. Die Einheitlichkeit der Sequenzrepräsentation in der retroviralen Population wurde durch schnelle Extraktion von DNA von Zellen, die mit dem Virus-enthaltenden Überstand infiziert waren, gefolgt von PCR-Amplifikation der Inserts, beobachtet. Die Inserts wurden zuerst durch die Produktion eines kontinuierlichen Ausstriches in Ethidiumbromid-gefärbtem Agarcosegel und dann durch Southern-Hybridisierung mit verschiedenen Sonden, einschließlich Topoisomerase II, c-myc und Tubulin, analysiert. Solange jedes Gen durch einen Ausstrich multipler Fragmente repräsentiert wurde, wurde die Repräsentativität der Bibliothek als zufriedenstellend betrachtet.
In anderen Experimenten wurden für eine Transduktion der Zufallsfragmentierten normalisierten cDNA-Bibliothek in NIH 3T3-Zellen ohne Verlust von Repräsentativität NIH 3T3-Zellen entweder mit einem Virus, der im transienten Stadium der Transfektion (Tage 1-3) erzeugt wurde oder mit dem Hochtiter-Virus, der 10-12 Tage nach der Transfektion erhalten wurde, infiziert. Im letzteren Fall enthielten 100 ml viraler Suspension mehr als 108 infektiöse Einheiten. In dem Fall des "transienten" Virus wurden NIH 3T3- Zellen mit mindestens 10&sup7; rekombinanten Retroviren infiziert, indem 500 ml Medium von Virus-erzeugenden Zellen (fünf Runden Infektion, 100 ml Medium jeweils) verwendet wurden. Diese Ergebnisse demonstrieren die Durchführbarkeit der Umwandlung einer großen und komplexen Zufallsfragmentbibliothek in retrovirale Form und das Zuführen derselben in eine nicht-verpackende Zelllinie ohne den Verlust von Komplexität.

Beispiel 4

Isolierung von GSE, die Resistenz gegenüber dem chemotherapeutischen Wirkstoff Etoposid verleihen

Das Gesamtschema für die Selektion auf GSE, die eine Etoposid-Resistenz verleihen, ist in Fig. 4 veranschaulicht. Diese Selektion wurde direkt auf Virus-erzeugende Verpackungszellen durchgeführt, mit der Erwartung, dass Zellen, deren resistenter Phänotyp durch die GSE-Expression verursacht wird, Viruspartikel, die ein solches GSE tragen, produzieren würden. Die Mischung amphotroper und ecotroper Verpackungszellen wurde mit der cDNA-Bibliothek in den LNCX-Vektor, der gemäß Beispiel 2 hergestellt wurde, transfiziert und man ließ den Virus für 9 Tage über die Population verteilen. Eine Analyse eines kleinen Teils der Population für G418-Resistenz zeigte, dass praktisch 100% der Zellen den neo-enthaltenden Provirus trugen. Die Zellen wurden dann für 15 Tage 350 ng/ml Etoposid ausgesetzt, und dann ließ man sie ohne Wirkstoff für zwei weitere Wochen wachsen. Kein Unterschied wurde zwischen der Anzahl an Kolonien, die in dem Experiment und in der Kontrolle nach Etoposid- Selektion erhalten wurden (nicht infizierte Zellen oder mit dem Insert-freien LNCX-Virus infizierte Zellen), beobachtet. Der in dem Mediumüberstand der überlebenden Zellen vorhandene Virus wurde dann verwendet, um NIH 3T3- Zellen zu infizieren, gefolgt von Etoposid-Selektion unter Verwendung im Wesentlichen des gleichen Protokolls. NIH 3T3-Zellen, die mit dem Bibliothek- abgeleiteten Virus infiziert waren, hergestellt durch Verpackungszelllen, die mit Etoposid selektiert wurden, zeigten eine bedeutende Erhöhung der Anzahl Etoposid-resistenter Zellen im Vergleich zu den Kontrollzellen, die mit dem Insert-freien LNCX-Virus infiziert waren, was die Gegenwart biologisch wirksamer GSE in der vorselektierten Viruspopulation anzeigt (siehe Fig. 5A).
Die in den Etoposid-selektierten NIH 3T3-Zellen enthaltenen proviralen Inserts wurden durch PCR analysiert. Diese Analyse (siehe Fig. 5B) zeigte eine Anreicherung für spezifische Fragmente im Vergleich zu der unselektierten Population der infizierten Zellen. Individuelle PCR-amplifizierte Fragmente wurden in den LNCX-Vektor in der gleichen Position und Orientierung wie in dem Originalplasmid zurückgeklont, wie es in Fig. 6 veranschaulicht ist. Insgesamt 42 provirale Inserts, nach Etoposid-Selektion angereichert, wurden so zurückgeklont und entweder in Chargen oder einzeln auf die Fähigkeit getestet, nach retroviraler Transduktion in NIH 3T3-Zellen eine erhöhte Etoposid-Resistenz zu verleihen. Es wurde gefunden, dass drei nicht identische Klone Etoposid-Resistenz induzieren, was zeigt, dass sie biologisch wirksame GSE enthielten. Durch diese Klone induzierte Etoposid-Resistenz ist in den Fig. 7 und 8 veranschaulicht. Diese GSE wurden Anti-khcs, VPA und VP9- 11 genannt.
Die Fähigkeit eines dieser GSE (Anti-khcs), Etoposid-Resistenz zu induzieren, wurde ferner dokumentiert, indem das Isopropyl-β-D-Thiogalactcopyranosid (IPTG)-induzierbare Promotor/Aktivatorsystem verwendet wurde, wie es von Baim et al. beschrieben wurde (1991, Proc. Natl. Acad. 56 USA 88: 5072- 5076). Die Komponenten dieses Systems schließen einen Enhancer- abhängigen Promotor, in cis kombiniert mit multiplen Repeats des bakteriellen lac-Operators, und ein LAP265-exprimierendes Gen, ein artifizielles regulatorisches Protein, das von dem lac-Repressor abgeleitet ist und einen transkriptionalen Aktivator vom Säuger ein. Das Anti-khcs GSE wurde in plasmatischen pX6.CLN geklont, welcher den von Baim et al., supra induzierbaren Promotor (ein Geschenk von Dr. T. Shenk) enthielt, der die Inserts von einem Enhancer-losen SV40 frühen Genpromotor exprimiert, ergänzt mit 21 Repeats der lac-Operatorsequenz. Das resultierende Plasmid, das keine selektierbaren Marker enthält, wurde zusammen mit dem das neo- Gen enthaltenden LNCX-Plasmid in NIH 3T3-Zellen kotransfiziert. Die Massenpopulation G418-selektierter Transfektanten wurde zusammen mit Kontrollzellen, die mit dem Insert-freien Vektor transfiziert waren, zunehmenden Konzentrationen von Etoposid in Gegenwart oder in Abwesenheit von 5 mM IPTG ausgesetzt. Obwohl das Kotransfektionsprotokoll gewöhnlich zur Integration des GSE in nur eine Fraktion der G418-resistenten Zellen führt, führte eine Transfektion mit Anti- khcs zu einer eindeutig erhöhten Etoposid-Resistenz, welche abhängig von IPTG war (siehe Fig. 8).

Beispiel 5

Sequenzanalyse von GSE, die Resistenz gegenüber dem chemotherapeutischen Wirkstoff Etoposid verleihen

Die wie in Beispiel 4 geklonten GSE Anti-khcs, VPA und VP9-11 wurden durch das Standard-Dideoxysequenzierverfahren sequenziert, und die erhaltenen Sequenzen sind in den Fig. 9-11 gezeigt. Die Nukleotidsequenzen der "Sense"- und "Antisense"-Stränge sowie Aminosäuresequenzen der durch diese Stränge kodierten Peptide wurden auf Homologie zu den Nukleinsäure- und Proteinsequenzen, die in der National Center for Biotechnology Information Datenbank vorhanden sind, analysiert, indem das BLAST- Netzwerkprogramm zur Homologiesuche verwendet wurde. Für die GSE VPA und VP9-11 wurde keine wesentliche Homologie mit irgend einer Sequenz detektiert. Im Gegensatz dazu zeigte die Sequenz, die dem "Antisense"-Strang des Anti-khcs GSE entspricht, eine starke Homologie zu mehreren Genen, die schwere Ketten von Kinesinen kodieren, die eine Familie von Mikrotubulusmotorproteinen sind, die in der intrazellulären Bewegung von Organellen oder Makromolekülen entlang der Mikrotubuli eukaryontischer Zellen involviert sind. Für diese Proteinfamilie wurde von Endow ein Überblick gegeben (1991, Trends Biochem. Sci. 16: 221-225). Es wurde gefunden, dass die größte Homologie zum humanen Kinesin-Schwerketten (KHC)-Gen war, wie es von Navone et al. beschrieben ist (1992, J. Cell Biol. 117: 1263- 1275). Anti-khcs kodiert daher Antisense-RNA für ein Maus-khc-Gen, welches wir khcs für khc, welches mit der Sensibilität (gegenüber Wirkstoffen) oder dem Altern assoziiert ist, nennen. Wir bezeichnen das Kinesin-Molekül, das durch den Partner des Khcs-Proteins mit Kinesin-Leichtketten, gebildet wird, als Kinesin-S. um es von den anderen in Säugerzellen vorhandenen Kinesinen zu unterscheiden. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass eine Selektion chemotherapeutischer Wirkstoffe für GSE zum Auffinden neuer genetischer Elemente führen kann und auch Rollen von Genen bei der Wirkstoffsensibilität zum Vorschein bringen kann, die niemals zuvor angenommen worden waren.

Beispiel 6

Klonieren und Analyse des Gens, von welchem das Anti-khcs GSE-Gen erhalten wurde

Das in Beispiel 4 isolierte Anti-khcs GSE wurde als Sonde verwendet, um 400.000 Klone von jeder aus zwei cDNA-Bibliotheken in dem lambda gt10- Vektor zu screenen. Diese Bibliotheken wurden durch konventionelle Vorgehensweisen aus der RNA von Maus BALB/c 3T3-Zellen hergestellt, entweder unsynchronisiert oder bei Go -> G1-Transition, wie es von Lau und Nathans beschrieben ist (1985, EMBO J. 4: 3145-3151 und 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 11 82-1 186, ein Geschenk von Dr. Lau). Ein Screening der ersten Bibliothek führte zu keinen hybridisierenden Klonen, es wurde aber gefunden, dass zwei verschiedene Klone von der zweiten Bibliothek Anti-khcs- Sequenzen enthielten. Diese Klone wurden gereinigt und sequenziert. Die Sequenzanalyse zeigte, dass wir den Hauptteil an Maus khcs cDNA, 796 Kodons entsprechend, isoliert hatten (die menschliche KHC cDNA vollständiger Länge kodiert 963 Aminosäuren). Diese Sequenz ist in Fig. 12 gezeigt. Die fehlenden 5'- und 3'-terminalen Sequenzen werden gegenwärtig unter Verwendung der "Anker-PCR"-Technik, wie sie von Ohara et al. beschrieben ist (1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5763-5677), isoliert.
Die Punktmatrixaufstellung des sequenzierten Teils des khcs-Proteins mit vor kurzem geklonten KHC-Proteinen vom Menschen (siehe Navone et al., 1992, J. Cell. Biol. 117: 1263-1275), der Maus (siehe Kato, 1991, J. Neurosci. 2: 704-711) und dem Tintenfisch (siehe Kosik et al., 1990, J. Biol. Chem. 265: 3278-3283) ist in Fig. 13 gezeigt. Der dem Anti-khcs GSE entsprechende Teil ist in Fig. 9 gezeigt. Das khcs-Gen ist am meisten homolog zu dem humanen Gen (97% Aminosäureübereinstimmung), was darauf hinweist, dass das humane KHC (KHCS)-Gen funktional äquivalent zu dem Maus khcs ist. Die Aufstellung zeigt auch, dass das Anti-khcs GSE dem Bereich entspricht, der zwischen verschiedenen Kinesinen am meisten abweicht. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass das Anti-khcs GSE ein Antisense-orientiertes GSE- Fragment mit einer gegenüber dem Kinesin-S und nicht gegenüber den anderen Maus-Kinesinen inhibitorischen Wirkung ist. Dies weist auf die Möglichkeit hin, dass die Unterdrückung anderer Mitglieder der Kinesinfamilie eine nachteilige Wirkung auf das Zellwachstum hat, was somit zu einer selektiven Isolierung der spezifischsten Sequenz innerhalb des khcs-Gens führt.

Beispiel 7

Bestimmung der Wirkstoff-Kreuzresistenz, die durch eine Resistenz gegenüber Etoposid verliehen wird

Um das Wirkstoffspektrum zu bestimmen, gegenüber welchem das Anti-khcs GSE Resistenz verleiht, haben wir eine stabile Population ecotroper Verpackungszellen, die den LNCX-Virus mit dem Anti-khcs-Insert erzeugen, entwickelt. Dieser Virus wurde verwendet, um NIH 3T3-Zellen zu infizieren. Zwei Tage nach der Infektion wurden die Zellen auf ihre Resistenz gegenüber mehreren verschiedenen Wirkstoffen analysiert, verglichen mit Kontrollzellen, die mit dem LNCX-Vektorvirus infiziert waren, wobei der Standardplatingeffizienzassay verwendet wurde. Fig. 14 zeigt eines der drei Sets an Experimenten, die mit diesem Assay mit verschiedenen Wirkstoffen durchgeführt wurden. Mit dem Anti-khcs-Virus infizierte Zellen zeigten eine deutliche Erhöhung ihrer Resistenz gegenüber Etoposid und Adriamycin verglichen mit Kontroll-NIH 3T3-Zellen, die mit dem Kontroll-LNCX-Virus infiziert waren. Mit Colchicin, Cisplatin, Camptothecin oder Actinomycin D wurden keine Veränderungen der Resistenz beobachtet. Diese letzteren Ergebnisse blieben jedoch vorläufig, da dieser Assay, bei welchem die gesamten unselektierten Virus-infizierten Populationen analysiert werden, relativ unempfindlich ist, verglichen mit der Analyse stark exprimierender individuell selektierter Klone. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass eine Selektion von GSE, die eine Resistenz gegenüber einem chemotherapeutischen Wirkstoff verleihen, zu GSE führen kann, die eine Resistenz gegenüber zusätzlichen chemotherapeutischen Wirkstoffen verleihen.

Beispiel 8

Bestimmung zellulärer Auswirkungen von GSE, die eine Resistenz gegenüber Etoposid verleihen

Der Virus, der das Anti-khcs GSE trägt, wurde auf seine Fähigkeit getestet, die Lebensdauer primärer Mausembryofibroblasten (MEF) zu erhöhen. MEF wurden von 10 Tage alten Mausembryonen durch Standardtrypsinisierungsverfahren hergestellt, und alternde Zellen wurden bei verschiedenen Durchläufen vor einer Krisis eingefroren. Alternde MEF, zwei Wochen vor einer Krisis, wurden mit einem LNCX-Vektor, der rekombinante Retroviren trägt, entweder ohne ein Insert oder mit Anti-khcs, infiziert. Fig. 15 zeigt MEF-Zellkolonien zwei Wochen nach der Krisis. Verglichen mit uninfizierten MEF-Zellen oder Zellen, die mit einem Kontroll-LNCX-Virus infiziert waren, zeigten Zellen, die mit dem Anti-khcs infiziert waren, eine stärkere Vergrößerung des Anteils der Zellen, die die Krisis überlebten. Post-Krisiszellen, die mit dem Anti-khcs Virus infiziert waren, zeigten keine mikroskopisch sichtbaren Merkmale neoplastischer Transformation. Diese Ergebnisse zeigen, dass Anti-khcs die Immortalisierung normaler alternder Fibroblasten fördert. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die normale Funktion von Kinesin-S mit der Induktion von programmiertem Zelltod assoziiert sein kann, welcher nach einer Behandlung mit bestimmten zytotoxischen Wirkstoffen oder im Verlauf des zellulären Alterns auftritt.
Diese Ergebnisse zeigen auch, dass die Isolierung von GSE, die eine Resistenz gegenüber chemotherapeutischen Wirkstoffen verleihen, Einsicht in zelluläre Gene und Prozesse, die in die Zellwachstumsregulierung involviert sind, bereitstellen kann.

Beispiel 9

Bestimmung der Rolle einer verringerten khcs-Genexpression in natürlich auftretenden Mechanismen einer Wirkstoffresistenz

Um zu testen, ob eine verringerte khcs-Genexpression mit irgend welchen natürlich auftretenden Mechanismen einer Wirkstoffresistenz assoziiert ist, wurde eine Assay entwickelt, um khcs-mRNA-Level durch cDNA-PCR zu messen. Dieser Assay ist eine Modifikation des von Noonan et al. für die Bestimmung einer mdr-1-Genexpression beschriebenen quantitativen Assays (1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 7160-7164). Die Oligonukleotidprimer hatten die Sequenzen AGTGGCTGGAAAACGAGCTA [SEQ. ID. NO. 19] und CTTGATCCCTTCTGGTTGAT [SEQ. ID. No. 20]. Diese Primer wurden verwendet, um ein 327 bp-Segment von Maus khcs-cDNA, entsprechend dem Anti-khcs-GSE, zu amplifizieren. Diese Primer amplifizierten das Maus-cDNA- Templat effizient, aber nicht die genomische DNA, was anzeigt, dass sie mindestens ein Intron in der genomischen DNA überspannten. Unter Verwendung dieser Primer bestimmten wir, dass khcs-mRNA in dem Maus- Muskelgewebe in einem höheren Level als in der Niere, Leber oder der Milz exprimiert wird.
In einem anderen Experiment wurde ein Paar von Primern, die ein homologes Segment der humanen KHCS cDNA amplifizieren, selektiert, basierend auf der von Navone et al. veröffentlichten bekannten humanen KHC-Sequenz (1992, J. Cell. Biol 117: 1263-1275). Die Sequenzen dieser Primer sind AGTGGCTTGAAAATGAGCTC [SEQ. ID. NO. 21] und CTTGATCCCTTCTGGTAGATG [SEQ. ID. NO. 22], und sie amplifizieren ein 327 bp-cDNA-Fragment. Diese Primer wurden verwendet, um Veränderungen in der khcs-Genexpression in verschiedenen unabhängig isolierten Populationen humaner HeLa-Zellen zu testen, die jeweils auf eine spontan erworbene Etoposid-Resistenz selektiert wurden. β&sub2;-Mikroglobulin-cDNA- Sequenzen wurden als interne Kontrolle amplifiziert. Fig. 16 zeigt die Ergebnisse des cDNA-PCR-Assays auf die folgenden Populationen: CX(O), HeLa-Population, infiziert mit dem LNCX-Vektorvirus und mit G418 selektiert; CX (200), die gleichen Zellen, die auf Resistenz gegenüber 200 ng/ml Etoposid selektiert wurden; Σ11(O), 6(O) und Σ21(O), Populationen, die nach einer Infektion von HeLa-Zellen mit rekombinanten Retroviren, die verschiedene GSE tragen, abgeleitet von Topoisomerase α cDNA, erhalten wurden, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, und mit G418 selektiert wurden; Σ11(1000), 6(1000) und Σ21 (1000), die gleichen Populationen, die auf eine Resistenz gegenüber 1 ug/ml Etoposid selektiert wurden. Wie es in Fig. 16 gezeigt ist, war die Ausbeute an für das khcs-Gen spezifischem PCR-Produkt in jeder der Etoposid-selektierten Populationen beträchtlich niedriger als in den Kontrollzellen. Dieses Ergebnis zeigt, dass eine Verringerung der khcs- Genexpression ein üblicher natürlicher Mechanismus für Wirkstoffresistenz ist.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: Board of Trustees of the University of Illinois
(B) STRASSE: 352 Henry Administration Building, 506 South Wright Street
(C) STADT: Urbana
(D) STAAT: Illinois
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL (ZIP): 61801
(G) TELEFON:
(H) TELEFAX:
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Gene und genetische Elemente, die mit einer Sensibilität gegenüber chemotherapeutischen Wirkstoffen assoziiert sind
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 22
(iv) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) TYP: Floppy Disk
(B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOSIMS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release # 1.0, Version # 1.25 (EPA)
(v) GEGENWÄRTIGE ANMELDUNGSDATEN: ANMELDUNGSNUMMER: PCT/US 94/
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 164 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANG: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTI-SENSE: JA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 213 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANG: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTI-SENSE: JA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 181 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANG: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTI-SENSE: JA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 224 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANG: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTI-SENSE: JA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 329 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANG: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTI-SENSE: JA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 194 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANG: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTI-SENSE: JA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 206 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANG: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTI-SENSE: JA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 194 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANG: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTI-SENSE: JA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 242 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANG: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTI-SENSE: JA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 341 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANG: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTI-SENSE: JA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 220 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANG: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTI-SENSE: JA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 170 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANG: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTI-SENSE: JA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANG: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTI-SENSE: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 23 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANG: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTI-SENSE: JA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 15:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 327 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANG: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTI-SENSE: JA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 250 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANG: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 17:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 208 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANG: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 18:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 2389 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANG: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTI-SENSE: JA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 19:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANG: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTI-SENSE: JA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 19:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 20:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGE: 20 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANG: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTI-SENSE: JA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 20:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 21:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANG: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTI-SENSE: JA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 21:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 22:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANG: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTI-SENSE: JA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 22:

Claims

1. GSE mit einer Nukleotidsequenz, wie sie in Fig. 9 (SEQ ID NO. 15), Fig. 10 (SEQ ID NO. 16) oder Fig. 11 (SEQ ID NO. 17) gezeigt ist, oder die komplementär dazu ist.

2. Synthetisches Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die der Aminosäuresequenz entspricht, für die ein GSE gemäß Anspruch 1 kodiert.

3. Synthetisches Oligonukleotid, mit einer Nukleotidsequenz einer Antisense- RNA, für die ein GSE gemäß Anspruch 1 kodiert.

4. Verwendung eines GSE gemäß Anspruch 1, um einer eukaryontischen Zelle in vitro eine Etoposid-Resistenz zu verleihen.

5. Verwendung eines GSE gemäß Anspruch 1 in einem Verfahren zur Isolierung eines Gens, das mit einer Sensibilität gegenüber einem chemotherapeutischen Wirkstoff im Zusammenhang steht, umfassend den Schritt des Screenings einer cDNA-Bibliothek mit dem GSE.

6. Verwendung eines GSE gemäß Anspruch 1 zur Diagnose von Resistenz gegen einen chemotherapeutischen Wirkstoff in einer Tumorprobe, wobei die Verwendung den Schritt des Untersuchens der Tumorprobe auf die Expression eines Gens, das mit dem GSE hybridisiert, umfasst, wobei Wirkstoff-resistente Tumorproben eine verringerte oder keine Expression des Gens aufweisen.

7. Säugerzelle, die ein GSE gemäß Anspruch 1 exprimiert.

8. Antikörper, der gegenüber einem Protein oder Polypeptid, für das ein GSE gemäß Anspruch 1 kodiert, reaktiv ist.

9. Verwendung eines GSE gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Krebs.

10. GSE nach Anspruch 1 zur Verwendung als ein Pharmazeutikum.

11. Verwendung eines GSE gemäß Anspruch 1, um Gene zu identifizieren, die mit einer Resistenz gegen einen chemotherapeutischen Wirkstoff oder mit dem Altern im Zusammenhang stehen.

12. Verwendung eines GSE gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Verbesserung von Chemotherapie.

13. Verwendung nach Anspruch 12, wobei das Medikament Blutvorläuferzellen umfasst, die gegen einen chemotherapeutischen Wirkstoff resistent sind.