DE68921315T2 - Verfahren zur Herstellung synthetischer Oligonukleotide, die spezifisch an Bestimmungsstellen auf Duplex-DNA-Molekülen binden durch Formen eines kolinearen Triplex, die synthetischen Oligonukleotide und Verfahren zu ihrer Herstellung. - Google Patents

Verfahren zur Herstellung synthetischer Oligonukleotide, die spezifisch an Bestimmungsstellen auf Duplex-DNA-Molekülen binden durch Formen eines kolinearen Triplex, die synthetischen Oligonukleotide und Verfahren zu ihrer Herstellung.

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Description

  • Die Erfindung wurde teilweise durch eine Beihilfe oder einen Preis vom National Institute of Health unterstützt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein ein Verfahren zur Herstellung synthetischer Oligonukleotide, die mit der Haupt- Vertiefung eines Duplex DNA binden, um ein kolineares Triplex zu bilden. Sie betrifft auch synthetische Oligonukleotide, die mit dem Purin-Anteil eines DNA Duplex binden. Sie beschreibt außerdem ein Verfahren zur Regulation und Verhinderung eines zellularen Anwachsens durch Applikation eines synthetischen Oligonukleotids, das geeignet ist, zur Bildung eines kolinearen Triplex mit einem DNA Duplex zu binden.
  • Es ist seit einiger Zeit bekannt, daß das Polynukleotid PolydT mit dem PolydA-PolydT Duplex zur Bildung eines kolinearen Triplex bindet (Arnott, S. & Selsing E. (1974) J. Molec. Biol. 88, 509). Die Struktur dieses Triplex wurde durch eine Röntgen-Faser-Strahlungs-Analyse abgeleitet und dazu bestimmt, ein kolineares Triplex (Arnott, S. & Selsing E. (1974) J. Molec. Biol. 88, 509) zu sein. Der PolydT-Anteil wurde in der parallelen Ausrichtung zu dem PolydA-Anteil des zugrundeliegenden Duplex gebunden. Das PolydT-PolydA-PolydT Triplex wird durch T-A Hoogstein-Basen-Paarung stabilisiert, die zwischen A in dem Duplex und dem dritten Anteil von PolydT paart. Diese Wechselwirkung plaziert notwendigerweise den dritten Anteil, der als ein Ligand bezeichnet wird, in der Hauptvertiefung des zugrundeliegenden Duplex. Die Bindungsstelle in der Hauptvertiefung wird auch als Bestimmungsstellenfolge bezeichnet.
  • Auf ähnliche Weise wurde gezeigt, daß PolydG durch eine Triplexformation mit dem Duplex PolydG-PolydC bindet, vermutlich durch G-G Paarung in der Haupt-Helixvertiefung des zugrundeliegenden Duplex, (Riley M., Mailing B. & Chamberlin M.N. (1966) J. Molec. Biol. 20, 359). Dieses Assoziationsmuster ist wahrscheinlich ähnlich dem Muster der G-G-C Triplett-Formation, die in tRNA Kristallen (Cantor C. & Schimmel P., (1988) Biophysical Chemistry vol I, p. 192 -195) zu beobachten ist.
  • Triplexe der Form PolydA-PolydA-PolydT und PolydC-PolydG-PolydC wurden ebenfalls entdeckt (Broitman S., Im D.D. & Fresco J.R. (1987) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84, 5120 und Lee J.S., Johnson D.A. & Morgan A.R. (1979) Nucl. Acids Res. 6, 3073). Außerdem wurde auch das gemischte Triplex PolydCT-PolydGA-PolydCT beobachtet. (Parseuth D. et al. (1988) Proc. Nat. Acad Sci. USA 85, 1849 und Moser H.E. & Dervan P.B. (1987) Science 238, 645). Diese Komplexe jedoch haben gezeigt, daß sie schwach sind oder nur bei Säure-pH auftreten.
  • Parallele deoxyribo-oligonukleotide Isomere, die in der parallelen Ausrichtung binden, wurden synthetisch hergestellt (Moser H.E. & Dervan P.E. (1987) Science 238, 645-650 und Rajagopol P. &. Feigon J. (1989) Nature 339, 637-640). In Beispielen, in denen die Bindungsstelle symmetrisch war und entweder das parallele oder antiparallele Triplex gebildet haben könnte, (OligodT bindend an einer OligodA-OligodT Duplex-Bestimmungsstelle), bildete sich das resultierende Triplex in der parallelen Ausrichtung (Moser H.E.. & Dervan P.E. (1987) Science 238, 645-650 und Praseuth D. et al. (1988) PNAS 85, 1349-1353), so wie er durch eine Röntgenbestrahlungs- Analyse aus dem PolydT-PolydA-PolydT Triplex abgeleitet worden wäre.
  • Untersuchungen mit Oligonukleotiden, die das unnatürliche Alpha- Anomer der Nukleotiden-Untereinheit enthalten, haben gezeigt, daß sich ein antiparalleles Triplex bilden kann (Praseuth D. et al. (1988) PNAS 85, 1349-1353). Da jedoch die Alpha-Deoxyribonukleotiden Einheiten von DNA inhärent bezüglich der natürlichen Beta- Untereinheiten umgekehrt werden, folgt notwendigerweise ein durch Alpha-Oligonukleotide gebildetes antiparalleles Triplex aus den Beobachtungen von parallelen Triplex-Formationen durch die natürlichen Beta-Oligonukleotiden. Zum Beispiel bilden Alpha- Deoxyribo-Oligonukleoide parallele und weniger antiparallele Watson- Crick Helices mit einem komplementären Anteil des Beta-DNA Isomer.
  • Es wurdc gezeigt, daß ein DNA Oligonukleotid durch eine Triplexformation mit einer Duplex DNA Bestimmungsstelle in einem Gensteuerbereich binden kann. Dadurch wird die Auslösung der Appliktion unterdrückt (Cooney M. et. al. (1988) Science 241, 456). Dieses war eine wichtige Beobachtung, da die Duplex DNA Bestimmungsstelle keine einfache Wiederholungsfolge war.
  • Die vorliegende Erfindung schafft ein neues Verfahren zur Bildung synthetischer Oligonukleotide, die fest und besonders an jeder Duplex DNA Bestimmungsstelle binden. Wenn die Besümmungsstelle als ein regulierendes Protein dient, kann das Verfahren benutzt werden, synthetische Oligonukleotide zu schaffen, die als Klasse von Arzneimittelmolekülen verwendet werden können, um selektiv die Unterdrückung der individuellen Gene zu manipulieren.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines synthetischen Oligonukleotids geschaffen, das an Bestimmungsstellen auf Duplex-DNA-Molekülen bindet, und zwar durch Formen eines kolineraren Triplex durch Bindung mit der Haupt- Vertiefung, das folgende Schritte enthält:
  • Aus einem genomischen Duplex-DNA wird eine Nukleotid- Bestimmungsstellenfolge mit mehr als 20 Nukleotiden identifiziert, die entweder etwa wenigstens 65% Grundanteile von Purin oder etwa wenigstens 65% Grundanteile von Pyrimidin enthalten; und
  • die synthetischen, zu der identifizierten Bestimmungsstellenfolge komplementären Oligonukleotide werden künstlich hergestellt, wobei die synthetischen Oligonukleotide ein G aufweisen, wenn die komplementäre Lage in dem Duplex-DNA ein GC-Basenpaar hat, und ein T aufweisen, wenn die komplementäre Lage in dem Duplex-DNA ein AT-Basenpaar hat.
  • Die vorliegende Erfindung schafft ebenso ein synthetisches Oligonukleotid, das bestimmt und geeignet ist, an identifizierten Bestimmungsstellen in Duplex DNA zu binden, um ein kolineares Triplex zu bilden, wenn die Bestimmungsstellen entweder ungefähr wenigstens 65% Purin-Grundanteile oder ungefähr wenigstens 65 % Pyrimidin-Grundanteile enthalten, mit folgenden Merkmalen:
  • Eine Nukleotidfolge mit etwa 20 - 40 Nukleotiden;
  • die Nukleotidfolge enthält G und T, wobei G anwesend ist, wenn die komplementäre Lage in dem Duplex-DNA ein GC-Basenpaar ist, und T anwesend ist, wenn die komplementäre Lage in dem Duplex-DNA ein AT-Basenpaar ist; und
  • die Folge wird aus einem Oligonukleotid ausgewählt, das bei 3' bis 5' ausgerichtet ist und antiparallel mit dem ungefähr wenigstens 65% Purinateil in den Duplex-DNA-Bestimmungsstellen bindet und ein Oligonukleotid enthält, das bei 5' bis 3' ausgerichtet ist, und parallel mit dem ungefähr wenigstens 65% Purin-Anteil in den Duplex-DNA- Bestimmungsstellen bindet.
  • In den bevorzugten Ausführungsformen kann das synthetische Oligonukleotid wenigstens ein T enthalten, das durch X, I, und halogenierte Ableitungen von X und I ersetzt ist. Außerdem kann wenigstens ein G durch halogenierte Ableitungen von G ersetzt werden.
  • Zusätzliche A usführungsformen enthalten Substitutionen auf dem synthetischen Oligonukleotid. Zum Beispiel kann der Grundanteil an der 2'Furanose-Position substituiert werden durch eine nichtgeladene umfangreiche Gruppe, und die Hauptkette des synthetischen Oligonukleotid kann ein analoges Phosphodiester sein, das durch zellulare Nukleasen nicht vollständig hydrolysiert wird. Zusätzlich kann ein Verbinder an dem 3'und/oder 5'-Terminus des synthetischen Oligonukleotid fixiert werden. Der Verbinder schafft ein Verfahren zum Zuordnen der modifizierenden Gruppen zu dem Oligonukleotid. Die modifizierenden Gruppen können Interkalatoren, Vertiefungs- bindende Moleküle, kationische Amine und kationische Polypeptide sein.
  • In der vorliegenden Anmeldung wird außerdem ein Verfahren zur Verhinderung des Anwachsens von Zellen beschrieben, das folgende Schritte enthält:
  • Applikation von synthetischen Oligonukleotiden in einer ausreichenden Menge für eine zellulare Aufnahme und Bindung mit den Bestimmungsstellen, wobei diese Bestimmungsstellen in dem DNA Bereich liegen, der an den RNA Applikationsursprung angrenzt. Dieser Vorgang kann benutzt werden, um das Anwachsen von Krebszellen und Krankheitserregern zu hemmen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird dieser Vorgang benutzt, einen HIV-I-Virus durch Bindung eines synthetischen Oligonukleotids an den Virus LTR- Bereich zu hemmen.
  • In der vorliegenden Anmeldung wird auch ein Verfahren zur Änderung der relativen Anteile des strukturellen Proteininhaltes eines Hautgewebes durch Applikation eines synthetischen Oligonukleotids in einer ausreichenden Menge für eine zellulare Aufnahme und Bindung an den Bestimmungsstellen für Kollagen-Gene beschrieben.
  • Andere und weitere Aufgaben, Merkmale und Vorteile ergeben sich aus der folgenden Beschreibung der derzeit bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung. Diese dienen zum Zwecke der Offenbarung im Zusammenhang mit der begleitenden Zeichnung. Inhalt der Zeichnung:
  • Fig. 1A zeigt die Oberflächen-Morphologie eines kolineraren Triplex. Es ist eine computererzeugte Übertragung der Struktur einer Duplex DNA Bestimmungsstelle und zeigt sowohl die kanonikale B und A Helixform. Beim Binden eines Oligonukleotid-Ligand erfährt die Bestimmungsstelle einen Übergang von der B zu der A Form, wodurch ein Anstieg in der Tiefe der Haupt-Helixvertiefung (M) entsteht. In einem kolinearen Triplex wickelt sich das Oligonukleotid um die A Form Helix Bestimmungsstelle und nimmt dabei die Haupt-Vertiefung ein. Die Bindung der Vertiefung wurde dadurch hervorgehoben, daß das gebundene Oligonukleotid als eine streifenähnliche Absonderung dargestellt wurde.
  • Fig.1B zeigt die Ausrichtung des Anteils in einem kolinearen Triplex. Das Oligonukleotid-Ligand bindet mit der Duplex-Bestimmungsstelle, und zwar in der parallelen Ausrichtung relativ zu der Anteils- Ausrichtung (Purin-reicher).
  • Fig.2 zeigt das Muster des Oligonukleotid-Wasserstoff, der mit der Duplex-Bestimmungsstelle bindet: G zu GC Stellen, T zu AT Stellen. Fig.2A ist eine computersimulierte Übertragung des bevorzugten Musters der Wasserstoff-Bindung zwischen G in dem Ligand und G in dem GC Basenpaar an der entsprechenden Stelle innerhalb des ausrichtenden Anteils der Duplex-Bestimmungsstelle. Fig.2B ist eine äquivalente Simulation der Bindung von T zu dem A eines AT Basenpaares an seinen entsprechenden Stellen innerhalb des ausrichtenden Anteils der Duplex-Bestimmungsstelle. Die T-AT Assoziation ist identisch mit der klassischen "Hoogstein Basenpaarung", während die G-GC Assoziation im wesentlichen das quanine Gegenstück davon ist und an 06 bindendes N3 enthält. Feste Keile bestimmen die Stelle, an der ein derartiger Querschnitt durch ein Triplex an dem entsprechenden Querschnitt über ihm fixiert wird. Offene Keile bestimmen die Stelle, an der ein derartiger Querschnitt durch ein Triplex an dem entsprechenden Querschnitt darunter fixiert wird. Wie zu sehen, ist die durch die beiden Bindungsmöglichkeiten bestimmte Bindungsfahigkeit nahezu identisch. Es ist ebenso wichtig, festzustellen, daß das favorisierte Muster einer Bindungsformation zwischen G und GC oder T und AT (Pfeile) durch ein jegliches anderes Muster einer Basen-Basenassoziation bei einem neutralen pH nicht nachgeahmt werden kann (C kann G unter Säure-Bedingungen nachahmen).
  • 2C und 2D sind entsprechende Bindungsmuster, die dann entstehen, wenn das G eines GC Basenpaares oder A eines AT Paares aus dem ausrichtenden Anteil des Bestimmungsstellen-Duplex entsteht. In diesem Augenblick sind die Regeln der Oligonukleiotid-Folge selektiv dieselben (d.h. G bei einem GC Paar, T bei einem AT Paar). Jedoch entsteht eine G Bindung N3 an N9, und T bindet in den "umgekehrten Hoogstein"-Weg, wodurch beide die gesamte Parallelausrichtung des Bindungs-Linganden und den ausrichtenden Anteil der Bestimmungsstelle behalten.
  • Fig.3 zeigt ein Verfahren zur Verbesserung des Musters der Oliginukleotid-Wasserstoffbindung mit der Duplex-Bestimmungsstelle: Xanthin bindet an den AT Stellen. Die computererzeugte Simulation in Fig.3 ist wie in Fig.2, mit der Ausnahme, daß der Effekt der Substitution von Xanthin (X) für T dargestellt ist. Wie zu sehen ist, binden sowohl in der "Hoogstein" Bindung (3A und 3B) und dem "Umgekehrten Hoogstein" (3C und 3D) Bindungsmode X und T äquivalent an ein zugrundeliegendes AT Basenpaar. Der Hauptunterschied zwischen den beiden ist, daß X nahezu identisch ist mit den G Rückständen, die es in einem Oligonukleotid-Liganden flankieren können, und zwar mit Rücksicht auf die Grundstoffgröße und -form und mit Rücksicht auf die Ausrichtung seiner Phosphodiester-Komponente in der Oligonukleotid-Bindungsstelle. Eine Modellbildung sagt voraus, daß eine solche Erhöhung der Oligonukleotid-Kontinuität die Bindungsaffinität und die Artspezifität der Stellen aller Oligonukleotide, in denen T durch X ersetzt ist, erhöht.
  • Fig.4 zeigt die Familie geänderter Phosphodieseter-Verbindungen, die mit einer kolinearen Triplexformation kompatibel sind. Einige der homologen des Phosphat innerhalb der Hauptkette eines Oligonukleotids sind dargestellt. In jedem Fall sind Beispiele angeführt, die durch eine einfache Modifikation der durch einen Standardcomputer unterstützten festen Phasenverfahren aufbereitet werden können. In den Beispielen sind A-C Thiophosphatverbindungen, E ein Methylphosphonat, F ein Phophoramidit und G ein Phosphotriester.
  • Fig.5 zeigt die Bildung von hybriden Oligonukleotiden mittels einer Kopplung durch eine 5'-Aminverbindung. In diesem Fall wird eine Hexylaminverbindung beschrieben. Diese Verbindung kann als der letzte Rückstand eines Oligonukleotid fixiert werden, indem dieselbe Phophoramidit-Chemie angewendet wird, die benutzt wird, die DNA Grundanteile zu poiymerisieren. Nach der Reinigung des Verbindermodifizierten Oligonukleotids können Gruppen, die selektiv mit einem primären Alkyl Amin reagieren, hinzugefügt werden. Diese Gruppen enthalten die Isothiocynatableitung von Eosin (EITC) oder ein 9 Amino Acridin (AlT) oder irgendeine Zahl von anderen kleinen Molekülen. Im wesentlichen ist eine identische Chemie verfügbar, um eine Thiol- Gruppe an dem 5'-Terminus zu fixieren.
  • Fig.6 zeigt eine Dosis-abhängige Hemmung von HIV-1 mRNA durch Oligonukleotid vermittelte DNA Triplexe. U937/HIV-1 Zellen [(ATCC CRL 1593; American Type Culture Collection, Rockville, MD), das mit der HTLV-IIIB Prototypverformung von HIV-1 infiziert und unter Bedingungen kultiviert ist, wo 90 % der Zeilen lebensfähig geblieben sind, und HIV-1 mRNA enthielten, wie gezeigt durch eine in situ Hybridisierung mit der ³&sup5;S bezeichneten Probe das LTR von HIV-1 (NEP 200, DuPont, Wilmington, DE)], jeweils mit einem Oligonukleotid bei Konzentrationen von 0, 2, 6, 10 und 20 uM inkubiert. Oligonukleotid wurde in Kultur-Überständen bei der Initiation der Inkubation hinzugefügt und dann wieder nach zwei Stunden. Zellen wurden nach 4 Stunden Inkubation geerntet und mit PBS gewaschen, und zwar vor der Ernte eines totalen zellularen RNA unter Verwendung von RNAzol (Cinna/Biotecx Laboratories International, Inc., Friendswood, TX). 2-gefaltete Reihenverdünnungen wurden aus jeder RNA Aufbereitung hergestellt (beginnend bei 2,5 ug RNA), und gleiche Beträge wurden auf doppelte Nylon-Membranen angewendet unter Verwendung einer Schlitz-Fleck-Apparatur (Biorad). Ein Fleck wurde mit dem radioaktiv markierten EcoR1-Hhal env Fragment aus den HIV-1, das Plasmid pARV-7/2 enthält, untersucht, während das andere mir radioaktiv markierten cDNA für ß-Actin untersucht wurde. Die resultierenden Autoradiogramme wurden dann durch Densitometrie analysiert. Die auf der Ordinate dargestellten Dichtigkeitseinheiten drücken das Verhältnis von (env- Probendichtigkeit)/(Actin-Probendichtigkeit) aus. W stellt dar HIV29 par, F stellt dar HIV31 anti, und F stellt dar das zufallsorientierte HIV29 Isomer.
  • Fig.7 zeigt die Beständigkeit der Wirkung von Oligonukleotiden auf HIV infizierte H9 T Zeilen. HIV-1 infizierte U937 Zellen wurden über 12 bis 72 Stunden nach der letzten Hinzufügung von HIV31anti kultiviert. Das Oiigonukleotid wurde bei Beginn der Kultivierung und zwei Stunden danach hinzugefügt, um eine endgültige Konzentration von 10 uM aufrechtzuerhalten. Zellen wurden danach bei den angedeuteten Zeitpunkten geerntet. Das vollständige zellulare RNA wurde geerntet und an doppelten Nylonmembranen in Reihenverdünnung mit einer Schlitz-Fleck-Apparatur angewendet. Eine Wiederholung wurde mit dem HIV-1 env cDNA und die andere mit dem cDNA für ß-Actin untersucht. Die Dichteeinheiten (Ordinate) werden ausgedrückt als das Verhältnis von env zu den ß-Actin Densitometrieablesungen. F stellt das HIV31 anti und O die Steuerungen dar.
  • Fig.8 zeigt die Hemmung des lebensfähigen mRNA durch HIV29 par in infizierten H9 Zellen. Die densitometrische Analyse zeigt einen Abfall der spezifischen Aussage über die Lebensfähigkeit. H9 Zellen, infiziert mit HTLV IIIB, wurden alle zwei Stunden mit Oligomer (5uM 9) behandelt. Bei vier und zwölf Stunden wurden die Zellen geerntet, mit PBS gewaschen, und das gesamte zellulare RNA wurde extrahiert. Die schraffierten Balken zeigen die Oligomer-Behandlung, und die nicht schraffierten Balken zeigen die Steuerung.
  • Die Zeichnungen sind nich notwendigerweise maßstabsgerecht. Bestimmte Merkmale der Erfindung können im Interesse einer Klarheit und Kürze im Maßstab vergrößert oder in schematischer Form gezeigt sein.
  • Es ist für den Fachmann auf diesem Gebiet offensichtlich, daß verschiedene Substitutionen und Abänderungen an der hier offenbarten Erfindung durchgeführt werden können, ohne von dem Schutzumfang der Erfindung abzuweichen.
  • Der Ausdruck "synthetische Oligonukleotide", wie er hier verwendet wird, ist als ein Molekül definiert, das aus zwei oder mehr Deoxyribonukleotiden oder Ribonukleotiden besteht, vorzugsweise vorzugsweise mehr als zehn. Deren exakte Größe ist von vielen Faktoren abhängig, einschließlich ihrer Artspezifität und der Bindungs-Affinität.
  • Was die hier verwendeten Grundstoffe betrifft, enthält der Ausdruck sowohl deoxyribonucleische Säuren und ribonucleische Säuren. Es werden die folgenden Abkürzungen verwendet: "A" bezeichnet Adenine und ebenso seine deoxyribose Ableitung, "T" bezeichnet Thymine und ebenso seine deoxyribose Ableitung, "G" bezeichnet Quanine ebenso wie seine deoxyribose Ableitung, "C" bezeichnet Cytosine, ebenso seine deoxyribose Ableitung, "X" bezeichnet Xanthine und ebenso seine deoxyribose Ableitung, und "I" bezeichnet Inosine.
  • Die "Haupt-Vertiefung" bezeichnet eine der Vertiefungen entlang der äußeren Oberfläche der DNA Helix, die deshalb gebildet wird, weil die Zucker-Phosphat Hauptkette sich weiter von der Achse erstreckt, als es die Grundstoffe tun. Die Haupt-Vertiefung ist wichtig für die Bindung von Regulator-Molekülen an die spezifischen DNA Folgen.
  • Es wurde eine Reihe von Arbeitsweisen eingesetzt, um DNA oder RNA Oligonukleotide zu erzeugen, die spezifisch durch eine kolineare Triplexbildung an einer DNA Bestimmungsstelle binden. Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines synthetischen Oligonukleotid, das an Bestimmungsstellen in Duplex DNA bindet, das durch Bindung mit der Haupt-Vertiefung ein kolineares Triplex bildet, wobei das Verfahren die folgenden Schritte enthält: es wird ein genomisches Duplex DNA abgetastet, und es werden nukleotide Bestimmunsstellen mit mehr als 20 Nukleotiden identifiziert, wobei die Bestimmungsstellen entweder ungefähr wenigstens 65% Purin-Grundanteile oder etwa wenigstens 65% Pyrimidin-Grundanteile enthalten; es werden diese synthetischen Oligonukleotide an der genannten identifizierten Bestimmungsstelle vollständig synthetisch hergestellt> wobei das synthetische Oligonukleotid ein G aufweist, wenn die komplementäre Lage in dem DNA Duplex ein GC Basenpaar hat, und ein T aufweist, wenn die komplementäre Lage in dem DNA Duplex ein AT Basenpaar hat. In spezifischen Ausführungsformen wird das synthetische Oligonukleotid aus der Gruppe ausgewählt, die aus einem Oligonukleotid besteht, das 3' bis 5' ausgerichtet ist und antiparallel mit ungefähr wenigstens 65% Purin-Anteilen bindet, und ein 5' bis 3' ausgerichtetes Oligonukleotid, das parallel mit ungefähr wenigstens 65% Purin-Anteilen bindet. Das resultierende Oligonukleotid kann in Gramm-Mengen durch Standardverfahren einer festen Phasen-Oligonukleotid-Synthese synthetisch hergestellt werden.
  • Die Stellen-spezifische O!igonukleotid-Arbeitsweise wird in drei Teile unterteilt:
  • I. Gestaltung der Oligonukleotid-Grundstoffolge.
  • II. Analyse der Duplex Bestimmungsstelle.
  • III. Sekundäre chemische Abwandlung des Oligonukleotid.
    • I. Gestaltung der Oligonukleotid-Grundstoffolge.
  • Nach der Identifizierung einer DNA Bestimmungsstelle mit einer interessierenden biologischen Funktion muß eine Oligonukleotid- Länge gewählt werden. Es gibt einen 1:1 Zusammenhang zwischen der Oligonukleotid-Länge und der Länge der Bestimmungsstelle. Zum Beispiel ist ein 27 Grundanteile langes Oligonukleotid erforderlich, um mit einem 27 Basenpaar langen Duplex die DNA Bestimmungsstelle zu binden. Unter optimalen Bedingungen steigt die Stabilität der Oligonukleotid-Duplex DNA Wechselwirkung im allgemeinen kontinuierlich mit der Oligonukleotid-Länge an. In der bevorzugten Ausführungsform wird ein DNA Oligonukleotid im Bereich von ungefähr 20 - 40 Grundanteilen verwendet. Oligonukleotide in diesem Bereich haben gewöhnlich nützliche Abscheidungs-Konstanten für ihre spezifische DNA Bestimmungsstelle. Die Abscheidungs-Konstanten liegen vorzugsweise in dem Bereich von ungefähr 10&supmin;&sup9; - 10&supmin;&sup8; Mol. Oligonukleotide kürzer als 20 Grundanteile zeigen eine schwächere und weniger spezifische Bindung zu den Bestimmungsstellen und sind daher weniger nützlich.
  • Ein an Duplex DNA bindendes Oligonukleotid wird durch Bindung an den Purinen in dem zugrundeliegenden Duplex stabilisiert. Wenn eine DNA Bestimmungsstelle einmal identifiziert ist, wird ein umso reicherer Purin-Anteil des Bestimmunsstellen-Bereiches als der "ausrichtende" Anteil der Bindungsstelle gebildet. Es wurde ein Oligonukleotid-Ligand gebildet, das entweder parallel oder antiparallel an dem ausrichtenden Anteil bindet. Die Stabilität der Bindung ist abhängig von der Größe des Oligonukleotid und der Lage in dem Genom. Manchmal ist das parallele stabiler als das antiparallele, während zu anderen Zeiten das Gegenteil der Fall ist oder sie gleich stabil sind. In der bevorzugten Ausführungsform enthält das Verfahren zum Gestalten einer detaillierten Folge eines Oligonukleotid-Ligand, das ein T in dem Oligonukleotid angeordnet wird, immer wenn ein AT Basenpaar in der Duplex-Bestimmungsstelle auftritt, und ein G in dem Oligonukleotid plaziert wird, immer wenn ein GC Basenpaar in der Duplex-Bestimmungsstelle auftritt.
  • Beispiele der Ausrichtung von Bindung-Spendern und Akzeptoren, die auf dieser Oligonukleotid-Struktur basieren, sind in den Fig.2 und 3 dargestellt.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält ein synthetisches Oligonukleotid zur Bildung eines kolinearen Triplex mit Bestimmungsstellen in einem Duplex DNA, wenn diese Bestimmungsstellen entweder ungefähr bei wenigstens 65% Purin- Grundanteilen oder ungefähr bei wenigstens 65% Pyrimidin-Anteilen liegen, die eine nukleotide Folge von wenigstens ungefähr 20 Nukleotiden enthalten. Diese Nukleotidfolge> enthaltend G und T, worin G dann benutzt wird, wenn die komplementäre Lage in dem Duplex DNA ein GC Basenpaar ist, und T dann benutzt wird, wenn die komplementäre Lage in dem Duplex DNA ein AT Basenpaar ist. Die aus der Gruppe ausgewählte Folge besteht aus einem Oligonukleotid, das bei 3' bis 5' ausgerichtet und antiparallel mit ungefähr wenigstens 65% Purin-Anteilen in der Duplex DNA Bestimmungsstellen sowie ein Oligonukleotid, das bei 5' bis 3' orientiert ist und parallel mit ungefähr wenigstens 65% Purin-Anteilen in den Duplex DNA Bestimmungsstellen bindet. Wenngleich Moleküle, die ein oder mehrere Grundanteile enthalten, die nicht mit diesem Verhältnis übereinstimmen, hergestellt werden können, wird die Bindungs- Affinität und die Stelien-Artspezifität dieser geänderten Oligonukleotide reduziert werden.
  • Demzufolge wird die biologische Wirksamkeit dieser Moleküle kleiner sein als bei den Oligonukleotiden, die G/GC und T/AT Verhältnisse haben.
  • Untenstehend ist ein Schema dargestellt, das Bestimmungsstellen und Oligonukleotid-Liganden zeigt, die durch das obige Gestaltungsverfahren bestimmt sind.
  • Bestimmungsstellen-Folge (35bp)
  • Paralleles synthetisches Oligonukleotid
  • Antiparalleles synthetisches Oligonukleotid
  • Wenn das synthetische Oligonukleotid mit einer Standard Phosphodiesterverbindung aufgebaut wird, wäre seine Bindungs- Affinität für die Bestimmungsstelle in der Nähe von 10&supmin;&sup8; M unter physiologischen Bedingungen einer saizhaltigen, zweiwertigen Ionen- Konzentration und Temperatur. Da die Abscheidungs-Konstante für Oligonukleotid, das an einer zufallsorientierten DNA Folge bindet, in der Nähe von 10&supmin;³ M für ein 35 Grundanteile Oligonukleotid ist, wäre die synthetische Oligonukleotid-Affinität für die Bestimmungsstelle etwa 10&supmin;&sup5; mal größer als für eine zufallsorientierte Folge DNA unter denselben Bedingungen.
    • II. Analyse der Duplex Bestimmungsstelle.
  • Wenn diese Arbeitsweisen befolgt werden, um ein synthetisches Oligonukleotid herzustellen, kann jede Duplex DNA Folge von ungefähr wenigstens 65% Purinen ein stabiles Triplex bilden. Innerhalb eines DNA Bereiches bilden, obwohl der A+T Inhalt keine besondere Beachtung erfährt, Duplex DNA Folgen, die nur Purine auf dem Matrizenanteil aufweisen, Komplexe, die im allgemeinen durch eine erhöhte Stabilität gekennzeichnet sind. Wenn wir als n die Zahl von Grundstoffen in dem Matrizenanteil definieren, die Purine sind, und (1-n) als die Zahl von Pyrimidin-Grundanteilen in der Matrize definieren, kann die ungefähre Abscheidungs-Konstante aus der folgenden halb-empirischen Gleichung vorausgesagt werden:
  • K = exp-[0.4n + (0.2(l-n)/RT)]
  • Diese Formel setzt nahezu physiologische Bedingungen in vitro voraus, das ist 0,05M TRIS/HCl, 5mM MgCl&sub2;, 3mMol Spermine pH 9,2, 37ºC. Diese Bedingungen bilden den Arbeitsstandard, der in dem Gestaltungsprozeß verwendet wird.
  • Dieser Zusammenhang sagt voraus, daß ein Oligonukleotid, ausgebildet, um an einer 35 Grundanteil langen Bestimmungsstelle mit nur Purin- Grundanteilen in seinem Matrizenanteil, ein Triplex bilden wird, in dem das Oligonukleotid mit einer Standard-Abscheidungs-Konstante von ungefähr 1 x 10-¹&sup0;M bindet. Diese Abscheidungs-Konstante wird jedoch geändert, wenn Pyrimidin in dem Matrizenanteil enthalten ist. In der obigen schematischen Darstellung, in der die Matrtize Pyrimidin enthält, ist die Abscheidungs-Konstante 3 x ¹&sup0;&supmin;&sup7;M.
  • Dieser Zusammenhang stimmt überein mit der Beobachtung, daß die freie Energie der Triplex Bildung im Verhältnis zu der Spanne der Wechselwirkung Bestimmungsstelle-Oligonukleotid anzusteigen scheint, sowie der Beobachtung, daß die Bindungsenergie eines G zu einem GC Basenpaar oder eines T zu einem AT Basenpaar von der Basenpaar-Ausrichtung relativ zu den Matrizenanteil abhängig ist.
  • Der molekulare Ursprung dieses Effektes ist in Fig.2 zu sehen. Es ist offensichtlich, daß dann, wenn der zugrunde liegende Matrizenanteil eine Reihe von Purinen enthält, die Grundanteile in dem komplementären dritten Anteil eine angrenzende gestapelte Anordnung bilden. Andererseits invertiert die Anordnung eines Pyrimidins in dem Matrizenanteil das Basenpaar. Auf diese Weise wird es, obwohl die Bindung des dritten Anteils von Wasserstoff mit der parallelen Anteils-Ausrichtung noch erfolgt, assoziiert mit einer Versetzung des Weges, der durch den dritten Anteil in der Haupt- Vertiefung durchschritten wird. Auf diese Weise resultiert entweder für ein AT oder GC Basenpaar etwa 0,4 kcal nützlicher freier Bindungsenergie aus der Assoziation des dritten Anteils an einer Purin-Stelle in der Matrize, aber nur ungefähr 0,2 kcal, wenn der dritte Anteil mit einer Stelle bindet, an der eine Umsetzung von Purin in Pyrimidin stattgefunden hat.
    • III. Sekundäre chemische Modifikation des Oligonukleotid.
  • A. Ein Fachmann auf diesem Gebiet wird erkennen, daß eine Vielzahl von synthetischen Vorgängen verfügbar ist. In der bevorzugten Ausführungsform werden die Oligonukleotide durch das Phosphoramidit-Verfahren synthetisch hergestellt und erzeugen dadurch Standard-deoxyribonukleische Säure-Oligomere.
  • Eine molekulare Modellierung schlägt vor, daß eine Substitution der nicht-hydrolysierbaren Phosphodiester-Hauptkette in dem Oligonukleotid oder ausgewählten Stellen tatsächlich die Stabilität des resultierenden Triplex erhöhen wird. Die Phosphodiester-Analogien sind widerstandsfähiger gegen Angriff durch zellulare Nukleasen. Beispiele einer nicht-hydrolysierbaren Phosphodiester-Hauptkette sind Phosphorothiotat, Phosphoroselenoat, Methylphosphat, Phosphotriester und die Alpha-Enantiomere von natürlich auftretendem Phosphodiester. Das Thiophosphat und die Methylphosphonat-Verbindungen sind in Fig.4 gezeigt. Diese nichthydrolysierbaren Ableitungen der vorgeschlagenen Oligonukleotid- Folgen könne mit einer geringen Änderung der DNA Bestimmungsstellen Artspezialität erzeugt werden.
  • Eine Änderung der Hauptkette ergibt ein praktisches Werkzeug, um die Stabilität der Oligonukleotid-Liganden innerhalb einer lebenden Zelle "fein abzustimmen". Z.B. werden Oligonukleotide, die die natürliche Phosphodiester-Verbindung enthalten, über den Verlauf von ein bis zwei Stunden in eukaryotischen Zellen abgebaut, während die nicht-hydrolysierbaren Ableitungen endgültig stabil zu sein scheinen.
  • B. Oligonukleotid-Hybride bieten ein anderes Verfahren, die Merkmale der synthetischen Oligonukleotide zu ändern. Es können Verbinder den 5' und/oder 3' Termini der synthetischen Oligonukleotide zugordnet werden. Die Verbinder, die dem 5' Terminus zugeordnet werden, werden im allgemeinen aus einer Gruppe ausgewählt, die aus einem analogen Grundstoff mit einem primären Amin besteht, das über eine Alkyl-Verbindung mit der Orundstoffebene fixiert ist, oder aus einem analogen Grundstoff mit einem Sulfhydryl, das über eine Alkyl-Verbindung an der Grundstoffebene fixiert ist, oder einer langen Amin-Kette, die direkt mit der 5' Hydroxyl-Gruppe der Oligonukleotide gekoppelt ist, und einer langen Thiolkette, die direkt mit der 5' Hydroxlgruppe des Oligonukleotid gekoppelt ist. Der Verbinder auf dem 3'Terminus ist üblicherweise ein Grundstoff analog mit einem primären Amin, das mit der Grundstoffebene über eine Alkyl-Verbindung oder einen analogen Grundstoff mit einem Sulfhydryl fixiert ist, das an der Grundstoffebene über eine Alkyl-Verbindung fixiert ist. Die Fixierung einer primären Amin-Verbindung an dem Terminus ändert nicht die Oligonukleotid-Bindung an der Duplex DNA Bestimmungsstelle.
  • Wenn einmal eine Verbindung dem synthetischen Oligonukleotid zugeordnet ist, kann eine Vielzahl von modifizierenden Gruppen dem synthetischen Oligonukleotid zugeordnet werden. Die Moleküle, die sich zuordnen können, enthalten Interkalatoren, vertiefungsbindende Moleküle, kationische Amine oder kationische Polypeptide. Die modifizierende Gruppe kann nach ihrer Fähigkeit ausgewählt werden, DNA zu zerstören. Z.B. kann die modifizierende Gruppe katalytische Oxydanten wie das Eisen-EDTA Chelat, Stickstoff-Gas, Alkylatoren, photochemische Vernetzer wie Psoralin, photochemische Sensibilisatoren aus einem einfachen Sauerstoff wie Eosin, blaues Methylen, oranges Acridin und 9-Aminoacridin und Reagenzien einer direkten photochemischen Zerstörung enthalten wie Ethidium und verschiedene Pyren-Ableitungen.
  • Z.B. arbeitet ein "Aminolink", wie es von Milligen angeboten wird (s. Fig.5) recht gut. Jedoch ist eine End-Kopplung jeglicher Art offenbar äquivalent. Wenn sie einmal mit einem Aminolink synthetisch hergestellt sind, können die modifizierten Oligonukleotide mit jeglichem Reagenz gekoppelt werden, das für ein primäres Amin spezifisch ist, z.B. ein Succimidat oder ein Isothiocyanat-Anteil(Fig.5).
  • In einer Ausführungsform wird eine "Aminolink"-Kopplung benutzt, um das eingelagerte Farbstoff-9-Acridin-Isothiocyanat an den Triplex-formenden Oligonukleotiden zu fixieren. Die Duplex-Bindungs- Affinität des Oiigonukleotid-Farbstoff-Hybrids ist ungefähr 100 mal größer als die Oligonukleotid-Bindungs-Affinität. Andere Ausführungsformen enthalten die Fixierung von Eosin-Isothiocyanat an Oligonukleotiden. Da Eosin-lsothiocyanat die DNA Helix bei Bestrahlung aufspaltet, schneidet dieses hybride Oligonukleotid die Helix an ihren Bindungsstellen, wenn es bestrahlt wird. Dieses Hybrid- Oligonukleotid ist nützlich für die Identifizierung der Oligonukleotid- Bindungsstelle sowohl in vitro wie auch in vivo und kann möglicherweise als ein therapeutisches Werkzeug für eine selektive Zerstörung der Gen-Bestimmungsstelle benutzt werden.
  • Eine photochemische Reaktivität wird auch erreicht durch Fixierung von Psoralin-Ableitungen an Oligonukleotiden über eine 5'Verbindung. Psoralin bindet kovalent nach Bestrahlung an DNA und ist als Folge davon eine wirksame cytotoxisches Agenz. Auf diese Weise erzeugt eine photochemische Reaktivität mit der Oligonukleotid-Empfindlichkeit ein Werkzeug, um die toxische Psoralin-Verletzung auf die Oligonukleotid-Bestimmungsstelle zu richten.
  • Eine ähnliche Oligonukleotid-Kopplung wird benutzt, um eine toxische chemische Reaktivität auf die spezifischen DNA Folgen zu richten. Beispiele enthalten katalytische Oxydanten wie Übergangs-Metall- Chelatverbindungen und Nukleasen.
  • Eine photochemische Reaktivität und/oder toxische chemische Agenzen könne benutzt werden, um eine Gen-Expression ständig zu verhindern.
  • Zusätzlich zu der chemischen Reaktivität ändern Modifiktionen der Oligonukleotide die Rate der zellularen Aufnahme der hybriden Oligonukleotid-Moleküle. Der Aufnahme-Vorgang erfolgt schnell, ist aber kaum verständlich. Eine End-Modifikation schafft ein nützliches Vorgehen, um die Zellen-typische Artspezialität, die Pharmakokinetik, die nukleare Permeabilität und die absolute Zellen-Aufnahme-Rate für Oligonukleotid-Liganden zu modifizieren.
  • C. Modifizierte Grundstoff-Analogien bilden ein anderes Mittel, die Merkmale des synthetischen Oligonukleotids zu ändern. Wenngleich eher ein Purin als ein Pyrimidin, ist X bezüglich seiner Kapazität, Wasserstoffverbindungen zu bilden, identisch mit T. Eine molekulare Modellierung hat gezeigt, daß die Substitution von X für T in den obigen Vorgängen für eine Oligonukleotid-Gestaltung in einem modifizierten Triplex resultiert, das wesentlich stabiler ist. Die erhöhte Stabilität ist bedingt prinzipiell durch eine erhöhte Stapelung und eine Erhöhung der Symmetrie der Phosphodiester-Hauptkette innerhalb des Ligand. Beispiele für die Grundstoff-Substitutionen für T sind X, I und halogeniertes X und I. G kann durch halogeniertes G ersetzt werden. Außerdem kann eine 2'-Furanose-Lage auf dem Grundstoff eine Substitution einer nicht-geladenen umfangreichen Gruppe haben. Beispiele von nicht-geladenen umfangreichen Gruppen enthalten verzweigte Alkyle, Zucker und verzweigte Zucker. In der bevorzugten Ausführungsform wird wenigstens ein Grundstoff substituiert.
  • Eine molekulare Modellierung läßt vermuten, daß die Oligonukleotid- Ausbildung Liganden mit einer Bestimmungsstellen-Affinität und Artspezifität erzeugen, die diejenige selbst der am meisten spezifischen Antigen-monoklonalen Gegenkörper Wechselwirkung überschreitet.
  • Synthetische Oligonukleotide wurden gestaltet für den Transkriptions- Steuer-Bereich des menschlichen c-myc Protoonzogen, für die Regulationssequenz von Kollagen Ia, um das TATA Box-Segment des Küken-Alpha-Aktin-Gen zu binden und eine Steigerungsfolge in dem frühen Gen-Bereich des menschlichen HIV-I zu binden.
  • In der vorliegenden Anmeldung wird ein Verfahren zur Verhinderung des Anwachsens von Zellen beschrieben, das folgende Schritte enthält: Applizierung eines synthetischen Oligonukleotid in einem ausreichenden Betrag für eine zellulare Aufnahme und Bindung mit den Bestimmungsstellen, wobei diese Bestimmungsstellen innerhalb des DNA Bereiches liegen, der an den RNA Transkriptions-Ursprung angrenzt. Das synthetische Oligonukleotid ist so, wie es in der Beschreibung des Gestaltungsvorgangs beschrieben wurde. Die Aufnahme in den Zellen ist schnell für diese synthetischen Oligonukleotide und kann durch geeignete Substitutionen und Modifikationen geändert werden. Auf ähnliche Weise kann die Bindung durch geeignete Änderungen an dem synthetischen Oligonukleotid geändert werden. Die Hemmung des Zellenwachstums kann in der Behandlung von Krebszellen angewendet werden. Zusätze eines spezifischen Oligonukleotids verhindern im einzelnen das Zellenwachstum. Z.B. können synthetische Oligonukleotide an dem c- myc Gen genutzt werden, um ein Anwachsen einiger Krebszellen zu verhindern. Beispiele von synthetischem Oligonukleotid, die eine c- myc Expression verhindern, enthalten: und/oder
  • und Fragmente sowie Analogien davon.
  • Eine andere Ausführungsform enthält ein Verfahren zur Hemmung des Anwachsens von Krankheitserregern mit den folgenden Schritten: Applizierung eines synthetischen Oligonukleotids in einem ausreichenden Betrag für eine zellulare Aufnahme und Bindung mit den Bestimmungsstellen, wobei diese Folge mit der nukleischen Säure bindet, das an den RNA Transkriptions-Ursprung angrenzt. Z.B. kann ein HIV-1 Virus gehemmt werden mit einem synthetischen Oligonukleotid, das selektiv mit dem Virus LTR-Bereich bindet. Spezifische Beispiele dieses synthetischen Oligonukleotids können enthalten und/oder
  • sowie Fragmente und Analogien davon.
  • Eine zusätzliche Ausführungsform enthält ein Verfahren zur Manipulation des strukturellen Protein-Inhalts von Hautgewebe mit den folgenden Schritten: Applizierung eines synthetischen Oligonukleotids in einem ausreichenden Betrag für eine zellulare Aufnahme und Bindung mit den Bestimmungsstellen. Dies enthält eine Hemmung der verschiedenen Enzyme und eine Regulierung des Proteins in der Haut. Z.B. kann die Rate der Kollagen Ia-Gen-Synthese geändert werden durch Verwendung von und/oder
  • sowie Fragmente und Analogien davon als das synthetische Oligonukleotid. Auf ähnliche Weise kann das Kollagenase-Gen gehemmt werden durch Anwendung von und/oder
  • sowie Fragmenten und Analogien davon.
  • Die folgenden Beispiele werden zum Zwecke der Erläuterung dargeboten und dienen nicht dazu, die Erfindung in irgend einer Weise einzuschränken. Die in den Beispielen beschriebenen synthetischen Oligonukleotide können eine der vorher beschriebenen Substitutionen enthalten. Die Hauptkette, der Grundstoff, die Verbinder und modifizierende Gruppen können hinzugefügt werden. Diese Substitutionen erhöhen die Affinität, die chemische Stabilität und die zellularen Aufnahme-Eigenschaften der spezifischen Oligonukleotid-Behandlungen.
    • Beispiel 1. A. Verfahren zum Anhalten des Anwachsens von Krebsgewebe beim Mann durch Intervention in das Programm einer c-myc Gen- Expression.
  • Die verfügbare Erkenntnis läßt vermuten, daß eine Familie von Tumoren, enthaltend Burkitt's Lymphoma und andere, Anteil haben an einer gemeinsamen genetischen Verletzung, die evident ist als eine konstitutive Überproduktion des c-myc mRNA und seines entsprechenden c-myc Protein. Da das c-myc Protein sich als kritisches Element in der Steuerung des Zell-Wachstums erwiesen hat, wird angenommen, daß ein direkter kausaler Zusammenhang zwischen der Überproduktion des c-myc-Proteins und dem unkontrollierten Krebs-Anwachsen für derartige Zellen bestehen könnte.
  • Sowohl in Krebs- als auch in normalen Zellen besitzt das c-myc Gen mehrere Bestimmungsstellen innerhalb seiner 5'flankierenden Folge, die die Gestaltungskriterien des synthetischen Oligonukleotid erfüllen. In einem Programm einer Arzneimittel-Entwicklung werden diese Bestimmungsstellen sowie andere als Matrizen verwendet, eine Oligonukleotid-Gestaltung zu richten. Der Zweck dieser Oligonukleotide besteht darin, selektiv eine c-myc Transkription zu hemmen und dadurch das unkontrollierte Anwachsen von Tumoren mit der c-myc Verletzung zu unterdrücken.
  • Drei repräsentative Bestimmungsstelien in dem Transkriptions- Kontrollbereich des menschlichen c-myc Gens sind unten gezeigt:
  • A. Bestimmungsstelle: Die TATA Box für das C-MYC Gen
  • DNA Bestimmungsstellen-Duplex
  • Parallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Antiparallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • B. Bestimmungsstelle: Transkriptionsaktivator-Bindungsstelle - Die prinzipielle aktivierende Protein-Bindungsstelle des C-MYC Gen- Promotors.
  • Ungeeignet hohe Werte der c-myc Gen-Expression sind im starken Maße verknüpft mit dem Vorkommen einer Vielzahl von menschlichen Tumoren. Die hier beschriebenen Triplex- Oligonukleotide wurden so gestaltet, daß sie selektiv die Expression des c-myc Gens in derartigen Tumoren unterdrücken und dadurch das Anwachsen von Krebs verlangsamen.
  • (1) DNA Bestimmungsstellen-Duplex
  • Antiparalleles synthetisches Oligonukleotid
  • (2) DNA Bestimmungsstellen-Duplex
  • Parallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • (3) DNA Bestimmungsstellen-Duplex (27bp)
  • Parallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Antiparalleles synthetisches Oligonukleotid
  • Das 27 bp Bestimmungsstellen-Duplex hat 74% GC Basenpaare und 89% Purine in dem ausrichtenden Anteil. Das Kdiss (6 x 10-¹&sup0;M) ist dasselbe sowohl für die parallele als auch für die antiparallele Bindung.
  • C. Bestimmungsstelle: Folge zwischen TATA Box und Aktivatorstelle in einer im hohen Maße konservierten Folge zwischen der Wirbeltiere c-myc Gen-Familie.
  • DNA Bestimmungsstellen-Duplex
  • Parallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Antiparallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Die wahrscheinliche Funktion dieser Stellen, die Position relativ zu dem RNA Transkriptionsursprung und die Oligonukleotid-Folge, die als eine c-myc spezifische Behandlung verwendet werden kann, sind dargestellt. Ein Fachmann auf diesem Gebiet wird mühelos erkennen, daß, da die Molekurlarentwicklungen des c-myc Gens mehr in Detail erklärt werden, die Liste der Bestimmungsstellen in den 5'- flankierenden Bereich durch die Anwendung der obigen Gestaltungskriterien ausgedehnt wird.
  • Sowohl die synthetischen Oligonukleotide A und B wirken spezifisch wechselwirkend zusammen mit den Bestimmungstellen-Duplex für die Hemmung des Krebs-Anwachsens mittels einer spezifischen Unterdrückung der c-myc Transkription. Das besondere Verfahren für die Hemmung des Oligonukleotid C ist unbekannt.
  • Ein Fachmann auf dem Gebiet wird leicht erkennen, daß Oligonukleotide für andere in menschlichen Tumoren enthaltene Gene auf ähnlich Weise gestaltet werden können. Das Verfahren ist nur durch die verfügbaren Daten über die Molekularfolge begrenzt.
    • Beispiel 2. Ein Verfahren für die Manipulation des strukturellen Protein-Inhalts von Hautgeweben zum Zwecke der Änderung der Gewebeerscheinung und der Wundheilung.
  • Die strukturellen Proteine, die die mechanischen Eigenschaften der Haut bestimmen, sind wohlbekannt. Die molekulare Struktur des Kollagens und der Elastin-Proteine und ihrer entsprechenden Proteasen wurden intensiv studiert. Diese Proteine stehen unter der Kontrolle eines Versuchsprogramms der Regulierung, das während des Wundheilungsvorganges und als ein Ergebnis des Alterungsprozesses sich zu ändern scheint. Die Molekularstruktur ist ausreichend bestimmt, um Behandlungen zu erwägen, die auf einer Genspezifischen Intervention in das Muster von strukturellen Proteinsynthesen und/oder einer enzymatischen Degradierung basieren.
  • Daten lassen vermuten, daß die Änderung in den mechanischen Eigenschaften der Haut, die die Alterung (Faltenbildung, etc.) begleitet, teilweise zurückzuführen ist auf eine altersspezifische Änderung in dem relativen Überfluß von Kollagenen und anderen strukturellen Proteinen. Der Eingriff dieser Proteine in die Synthese und/oder selektive Degradation durch eine Arzneimittel-Behandlung kann eine Verteilung wieder herstellen, die sich an das jüngere Gewebe annähert, und auf diese Weise können die Alterungswirkungen teilweise ins Gegenteil verkehrt werden.
  • Ein Programm für eine Gestaltung von synthetischem Oligonukleotid, basierend auf der Manipulation einer Kollagen I-Synthese in menschlicher Haut wird im folgenden beschrieben. Durch Änderung der relativen Proteinkonzentrationen können die Struktur und die mechanischen Eigenschaften der Haut geändert werden. Auf diese Weise kann das synthetische Oligonukleotid als ein therapeutisches Heilmittel verwendet werden, um den Hautalterungsvorgang oder den Wundheilungsvorgang zu beeinflussen. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird leicht erkennen, daß das Konzept auf andere Kollagene, auf andere Hautproteine und ihre komplementären Proteasen, die auf der Verfügbarkeit der notwendigen Entwicklungsdaten basieren, ausgedehnt werden kann.
  • Repräsentative Bestimmungsstellen in dem Transkriptions- Steuerbereich des menschlichen alphal (I) Kollagen -Gens, die wahrscheinliche Funktion dieser Stellen, ihre relative Lage zu dem RNA Transkriptionsursprung und die für die kollagenspezifische Behandlung vorgesehene synthetische Oligonukleotid-Folge sind unten dargestellt. Wenn sich die molekularen Entwicklungen der Kollagen- Gene entwickeln, wird die Liste der Bestimmungsstellen in dem 5'- flankierenden Bereich ausgedehnt.
  • A. Bestimmungsstelle: Die CAT Box für das Kollagen-Gen
  • DNA Bestimmungsstellen-Duplex
  • Synthetische Oligonukleotid-Folge
  • B. Bestimmungsstelle: Steigerungsmittel für das Kollagen-Gen
  • DNA Bestimmungsstellen-Duplex
  • Synthetische Oligonukleotid-Folge
  • C. Bestimmungsstelle: hochkonserviertes Polypurin-Segment, das in der Nähe von - 200 in allen Kollagenen erscheint
  • DNA Bestimmungsstellen-Duplex
  • Synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Synthetische Oligonukleotide A und B hemmen eine Typ-I-Kollagen- Proteinsynthese. Der Vorgang enthält die spezifische Unterdrückung einer Kollagen-RNA Transkription. Das Verfahren für die Hemmung des C synthetischen Oligonukleotids ist nicht bekannt. Die Einwirkung von Hautproteinen auf eine Proteinsynthese kann beobachtet werden, wenn ausreichende Beträge des synthetischen Oligonukleotids für eine Aufnahme in kultivierten menschlichen Bindegewebszellen hinzugefügt werden.
  • Im folgenden werden zwei repräsentative Bestimmungsstelle in dem Tanskriptions-Kontrollbereich der menschlichen Kollagcn-Gene, die Funktion dieser Stellen, ihre relative Lage zu dem RNA- Transkriptionsursprung und die Oligonukleotid-Folge beschrieben, die für eine Kollagen-spezifische Behandlung bestimmt ist. Wenn die molekularen Entwicklungen der Kollagen-Gene sich entwickeln, wird die Liste der Bestimmungsstellen in dem 5'-flankierenden Bereich ausgedehnt.
  • D. Bestimmungsstelle: Die TATA Box für die Kollagenase-Gene
  • DNA Bestimmungsstellen-Duplex
  • Synthetische Oligonukleotid-Folge
  • E. Bestimmungsstelle: Der einleitbare Verstärker für die Kollagen- Gene. Verleiht eine TPA Tumor-Promotor-Verantwortlichkeit
  • DNA Bestimmungsstellen-Duplex
  • Synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Das D synthetische Oligonukleotid hemmt eine Kollagenase- Proteinsynthese. Der Vorgang enthält eine spezifische Unterdrückung einer Kollagenasen-RNA Transkription. Das E synthetische Oligonukleotid verursacht einen Verlust an TPA-Empfindlichkeit und eine darauffolgende Unterdrückung von Kollagenasen-Synthesen in der Anwesenheit von Promotoren wie TPA. Dieser Vorgang enthält eine besondere Unterdrückung der Kollagenasen-RNA Transkription.
  • Eine Wechselwirkung des synthetischen Oligonukleotids bewirkt, daß die Kollagen-Proteinbeträge in der Zelle anwachsen, wenn die Kollagenase-Beträge abfallen. Die klinische Wirkung dieses Anwachsens könnte eine nützliche Änderung der mechanischen Eigenschaften der Haut verursachen. Diese Wirkungen können beobachtet werden durch Hinzufügung von für eine zellulare Aufnahme ausreichenden Beträgen von Oligonukleotid zu den kultivierten menschlichen Bindegewebszellen.
  • Der Fachmann auf diesem Gebiet wird leicht zugestehen, daß diese Konzepte auf andere Gene ausgedehnt werden können, die bekanntlich in der Hautentwicklung, in der Wiederherstellung und in der Alterung eingesetzt werden, und ist nur durch die verfügbaren molekularen genetischen Daten begrenzt.
    • Beispiel 3 Verfahren zur Unterdrückung des Anwachsens des menschlichen HIV-1 Virus, durch Bindung von Oligonukleotid an Bestimmungsstellen innerhalb des HIV-1 LTR.
  • Der HIV-I Virus ist bekanntlich das ursächliche Heilmittel in dem menschlichen angeeigneten Immunmangelsyndrom (AIDS). Die lange End-Wiederholung des HIV-I Virus enthält bekanntlich mehrere DNA-Segmente innerhalb des LTR-Bereiches, die für die Auslösung einer Transkription in menschlichen T-Gastzellen sind. Die synthetischen Oligonukleotide unterdrücken selektiv eine HIV-1 mRNA-Synthese in menschlichen Gast-Zellen durch eine Triplex- Bildung auf Bestimmungsstellen innerhalb des Virus-LTR. Die Unterdrückung einer RNA-Synthese resultiert in einer Verringerung der Wachstumsrate des Virus. Dies könnte resultieren in einer Verlangsamung des Infektionsvorgangs oder in der Unterdrückung des Überganges von einem latenten zu einem virulenten Anwachsen. Die meisten der Stellen innerhalb des LTR werden Bestimmungsstellen für eine Arzneimittel-(Oligonukleotid) Intervention enthalten. Es besteht kein vergeudetes DNA in dem schmalen hochkonservierten LTR-Gebiet.
  • Repräsentative Bestimmungsstellen in dem Transkriptions- Kontrollbereich des menschlichen HIV-1 LTR, die wahrscheinliche Funktion dieser Stellen, ihre Lage relativ zu dem RNA Transknptionsursprung und die Oligonukleotid-Folge, die für eine HIV-I spezifische Behandlung bestimmt ist, werden unten gezeigt. Wenn die molekularen Entwicklungen des HIV-I sich entwickeln, wird die Liste von Bestimmungsstellen innerhalb des LTR und auch anderswo ausgedehnt.
  • In allen Fällen werden sowohl die parallelen als auch die antiparallelen Isomere beschrieben. Der Grund dafür ist, daß, obwohl die eine oder die andere immer eine bessere Bindungsaffinität in vitro zeigen wird, die Wirksamkeit einer jeden in vivo untersucht werden muß, um eine endgültige Entscheidung zu treffen.
  • A. Bestimmungsstelle: Das 5'-Ende des HIV-1 LTR-Gebietes
  • DNA Bestimmungsstellen-Duplex (25bp, 92% Purine)
  • Parallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Antiparallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • B. Bestimmungsstelle: Ein Segment des negativen HIV-1 Regulierungsgebietes, mit Ähnlichkeit zu einem homologen Gebiet im Interleukin-2 Gen.
  • DNA Bestimmungsstellen-Duplex (33 bp, 88% Purin)
  • Parallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Antiparallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • C. Bestimmungsstelle: eine Stelle in der Nähe des Zentrums des LTR.
  • DNA Bestimmungsstellen-Duplex (25 bp, 88% Purin)
  • Parallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Antiparallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • D. Bestimmungsstelle:
  • Bindungsstelle für den Spl-line Transkriptionsaktivator.
  • (1) DNA Bestimmungsstellen-Duplex (36 bp, 78% Purin)
  • Parallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Antiparallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Das HIV4 par wirkt auch, wenn TG dem 3'-Ende hinzugefügt wird, um HIV38 par zu erzeugen.
  • E. Bestimmungsstelle: Bindungsstelle für den Transkriptions- Aktivatorberich (tar); die Hußabwärt-Hälfte der tar DNA Bestimmungsstellen-Duplex (29-31 bp, 72 % Purin)
  • Parallele synthetische Oligonukleotidfolge
  • Antiparallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Die Oligonukleotide HIV29 par und HIV3 lanti wurden so gestaltet, wie es hier im vorangehenden beschrieben wurde. HIV3lanti funktioniert ebenso, wenn Grundanteile zwei TG von den 3'- Ende entfernt werden. Die relative Mobilität und die Analysen des DNA Ichnogramms beider Oligonukleotide zeigen eine Bindung mit hoher Affinität an den proviraien Bestimmungsstellen, in vitro.
  • HIV-1 infizierte U937-Zellen, eine monocytotische Linie, wurde mit bis zu 20uM entweder mit HIV29 par, HIV31 anti oder einem zufallsorientierten Isomer von HIV29 ohne feststellbare in vitro Affinität für die Bestimmungsstellen behandelt. Eine nennenswerte Hemmung der Virus mRNA-Produktion, wie sie gezeigt ist durch den Abfall in den relativen Konzentrationen von env verglichen mit ß- Actin mRNA, wurde erreicht bei einer Dosis von 10uM von entweder Oligonukleotid (pg0.1, gepaarter t-Test, Fig.6) erreicht. Keine zusätzliche Unterdrückung wurde beobachtet bei 20uM. Das zufallsorientierte Isomer von HIV29 behinderte nicht die Virus mRNA-Synthese, selbst bei 20uM und bestätigte dadurch die Artspezifität der mit HIV29 erzielten Unterdrückung.
  • Wir haben herausgefunden, daß dann, wenn U937/HIV-1 Zellen in einem Medium enthaltend 0,6 uM³² p bezeichnetes HIV29 par, inkubiert wurden, die Zellen in der Lage waren, das Oligomer in Konzentrationen, die die des Mediums übersteigen, schnell zu maskieren. Unter der Annahme eines mittleren Zellvolumens von 350 fL wurde festgestellt, daß die intrazellulare Konzentration von 2,4 uM nach 10 Minuten auf einen Wert von ungefähr 6 uM nach 2 Stunden anstieg. Die Oligonukleotide hatten eine verlängerte Wirkung auf die HIV-1 Transkription in dem Sinne, daß zwei voneinander um zwei Stunden beabstandete Behandlungen die Virus mRNA-Synthese für bis zu 72 Stunden (Fig.7) hemmten. Weitere Untersuchungen zeigten die Wirkungen einer Folge von tar Folge spezifische Oligonukleotide auf infizierte T-Zellen. Es wurde HIV29 tar benutzt, die HIV- infizierten H9 T-Zellen zu behandeln. Eine Behandlung alle zwei Stunden mit einer 5 uM effektiv unterdrückten mRNA Synthese in HIV-1 infizierte H9 T-Zellen bei 2 und 12 Stunden.
  • Es ist somit ersichtlich, daß die Oligonukleotide, die ausgebildet waren, mit der Haupt-Vertiefung der DNA-Helix und Triplexe mit den spezifischen Genfolgen in den tar Gebiet des HIV-1 Provirus zu binden, leicht aufgenommen wurden durch die HIV-1 infizierten Zellen und selektiv die Synthese von HIV-1 mRNA unterdrückten, ohne eine begleitende Unterdrückung von mRNA für P-Actin, das konstitutiv in diesen Zellen ausgedrückt wurde. Mit der Hemmung des Virus MRNA-Synthese wurde eine Übertragung der Virus-encodierten Proteine ebenso unterdrückt. Die Hemmung des Virus mRNA war abhängig von der Dosis des hinzugefügten Oligonukleotid. Eine maximale Hemmung ergab sich bei Konzentrationen von 10uM. Die Oligonukleotide, die bestimmt waren, mit spezifischen Folgen in dem DNA Duplex zu binden und kolineare Triplexe mit den Bestimmungsstellen bilden, erzeugen eine effiziente und hochspezifische Agenz für die Regulierung der Gen-Expression. Derartige Agenzen erzeugen eine neue Klasse von rational ausgebildeten chemotherapeutischen Agenzen zur Steuerung der Virus-Replikation und anderen Vorgängen, die von der neuen mRNA -Produktion abhängen.
  • Die synthetischen Oligonukleotide in A durch E hemmen die HIV-I mRNA -Synthese und dadurch das Virus-Anwachsen. Der Vorgang enthält eine besondere Unterdrückung der RNA Transkription von dem Virus LTR.
  • Ein Fachmann auf diesem Gebiet wird leicht erkenne, daß diese Konzepte ausgedehnt werden können auf andere Gene, die bekanntlich in den Infektionsprozess eingesetzt werden, durch den HIV-I und andere Viren wirken.
    • Beispiel 4
  • Ein Verfahren zur Änderung der Küken-Skelett-Actin-Transkription. Eine repräsentativ Bestimmungsstellen-Folge in dem Transkriptions- Steuergebiet der Küken-Skelett-alpha-Actin-Gene, die Funktion dieser Stelle, ihre Lage relativ zu dem RNA Transkriptionsursprung und die Oligonukleotid-Folge, die als eine Actin-spezifische Behandlung geformt würde, sind unten gezeigt. Wenn sich die molekularen Entstehungen der Actin-Gene entwickeln, wird die Liste der Bestimmungsstellen innerhalb des Actin-Steuergebietes ausgedehnt.
  • A. Bestimmungsstelle: Die TATA Box für die Küken-Skelett-alpha- Actin-Gene
  • DNA Bestimmungsstellen-Duplex
  • Synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Dieses synthetische Oligonukleotid-Molekül hemmt die Actin- Proteinsynthese, und zwar durch besondere Unterdrückung der RNA Transkription. Diese Hemmung kann in kultivierten Küken- Myoblasten abgeschätzt werden. Das unbeschädigte Küken zeigt eine Änderung in der Qualität des Actin oder anderer Muskelproteine, deren Synthese stark gekoppelt ist mit der Actin-Expression. Das praktische Ergebnis dieser Änderung ist eine Umwandlung der Eigenschaften des Kükenfleisches.
  • Ein Fachmann auf diesem Gebiet wird leicht anerkennen, daß diese Konzepte auf andere Gene ausgedehnt werden können, die bekanntlich in dem Anwachsen und der Entwicklung von Muskeln enthalten sind, und durch die verfügbaren molekuiaren genetischen Daten begrenzt ist.
    • Beispiel 5 Interleukin 2 Alpha Ketten Rezeptor
  • Bestimmungsstelle: Trans-Promotor-Gebiet
  • DNA Bestimmungsstellen-Duplex (28 bp)
  • Paralleles synthetisches Oligonukleotid
  • Antiparalleles synthetisches Oligonukleotid
  • Die 28 bp Bestimmungsstelle ist zusammensetzt aus 54% G + C Basenpaaren und ist 61% Purin auf dem ausrichtenden Anteil. Das Kdiss für den parallelen Anteil ist 1,5 x 10&supmin;&sup7;, und das Kdiss für das antiparallele ist 8 x 10&supmin;&sup7;.
    • Beispiel 6
  • Eine Sequenz für die dispersierende Plaque-Formation in der Alzheimer-Krankheit.
  • Der APP770 Gen-Promotor ist das Präcursor-Protein, das für die Produktion von Plaque in der Alzheimer-Krankheit verantwortlich ist.
  • A. Bestimmungsstelle: Flußabwärts TATA Box Stelle
  • DNA Duplex-Bestimmungsstelle
  • Parallele synthetische Oligonukleotidfolge
  • Antiparallele synthetische Oligonukleotidfolge
  • B. Bestimmungsstelle: unbekannt
  • DNA Duplex-Bestimmungsstelle
  • Parallele synthetische Oligonukieotid-Folge
  • Antiparallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • C. Bestimmungsstelle: unbekannt
  • DNA Duplex-Bestimmungsstelle
  • Parallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Antiparallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • D. Bestimmungsstelle: unbekannt
  • DNA Duplex-Bestimmungsstelle
  • Parallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Antiparaliele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • E. Bestimmungsstelle: unbekannt
  • DNA Duplex-Bestimmungsstelle
  • Parallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Antiparallele synthetische Olingonukleotid-Folge
  • F. Bestimmungsstelle: unbekannt
  • DNA Duplex-Bestimmungsstelle
  • Parallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Antiparallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • G. Bestimmungsstelle: unbekannt
  • DNA Duplex-Bestimmungsstelle
  • Parallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Antiparallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • H. Bestimmungsstelle: unbekannt
  • DNA Duplex-Bestimmungsstelle
  • Parallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Antiparallele synthetische Oligonukleotid-Folge
    • Beispiel 7 Das EGFR Promotor-Gebiet
  • Eine ungeeignet hohe Expression der Haut-Anwachs-Faktor-Gene (EGFR) war entscheidend für die Entwicklung von Krebs-Arten und verschiedenen Hautkrankheiten (Psoriasis) beteiligt. Die unten beschriebenen synthetischen Oligonukleotide wurden so ausgebildet, daß sie selektiv die Expression der EFGR-Gene in derartigen Krankheiten unterdrücken.
  • A. Bestimmungsstelle: SP1 Bindungsstelle
  • DNA Duplex-Bestimmungsstelle
  • Parallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Antiparallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • B. Bestimmungsstelle SP1 Bindungsstelle
  • DNA Duplex-Bestimmungsstelle
  • Parallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Antiparallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • C. Bestimmungsstelle: SP1 Bindungsstelle
  • DNA Duplex-Bestimmungsstelle
  • Parallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Anti parallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • D. Bestimmungsstelle: Nuklease-empfindliches Gebiet, das für eine EGFR-Expression erforderlich ist.
  • DNA Duplex-Bestimmungsstelle
  • Parallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Antiparallele synthetische Oligonukleotid-Folge
    • Beispiel 8 Die GSTpi-Gene
  • Eine Überexpression des Enzyms Glutathion-s-Transferase pi wurde beteiligt, weil sie verantwortlich ist für die Resistenz in dem Arzneimittel mit breitem Anwendungsbereich, die sich in einer Vielzahl von Krebsarten entwickelt. Die unten beschriebenen synthetischen Oligonukleotide sind so gestaltet, daß sie eine GST-pi Expression unterdrücken und dadurch Krebsgewebe gegenüber einer traditionellen Arzneimittel-Chemotherapie empfindlich machen.
  • A. Bestimmungsstelle: Das Bestimmungsstellengebiet enthält die Übereinstimmung der Bindungsfolgen für die Transkriptionsaktivierenden Faktoren AP1 & Sp1. Dagegen gerichtete synthetische Oligonukleotide unterdrücken eine GSTpi Transkription mittels eines Wettbewerbs mit AP1 und Sp1.
  • DNA Duplex-Bestimmungsstelle
  • Parallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Antiparallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • B. Bestimmungsstelle: Eine Beschleuniger-ähnliche Polypurinfolge. Ein gegen diese Stelle gerichtetes synthetisches Oligonukleotid unterdrückt die GSTpi Transkription durch Wettbewerb mit dem Beschleuniger.
  • Parallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Antiparallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Ein ungewöhnliches wiederholtes DNA-Segment. Keine Funktion wurde bisher auf dieses Segment zurückgeführt. Es ist jedoch innerhalb des Steuergebietes und kann eine Rolle spielen in der Auslösung der Transkription.
  • DNA Duplex-Bestimmungsstelle
  • Parallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Antiparallele synthetische Oligonukleotid-Folge
    • Beispiel 9 Die HMGCoA Reduktase-Gene
  • Die HMGCcA Reduktase ist das Enzym, das den die Rate begrenzenden Schritt in der Cholesterol-Biosynthese bestimmt. Ihre molekularen Entstehungen wurden studiert, um die Steuerung der Cholesterol- Synthese zu verstehen. Die beschriebenen synthetischen Oligonukleotide intervenieren in dem Programm der Cholesterol- Synthese durch eine Modulation der Transkription von HMGCoA.
  • A. Bestimmungsstelle: Die Bestimmungsstelle ist die Bindungsstelle für eine Repressor-Protein, das bei einer indirekten Endprodukt- Hemmung der Transkription durch Cholesterol erscheint. Das synthetische Oligonukleotid ist ein synthetischer Repressor einer HMGCoA-Expression, als ein Agonist des zellularen Repressors.
  • DNA Duplex-Bestimmungsstelle
  • Parallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Antiparallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • B. Bestimmungsstelle: Die Bestimmungsstelle ist eine Bindungsstelle für Protein, das bei der aktivierten Transkription von HMGCoA erscheint. Das synthetische Oligonukleotid gegen diese Stelle ist ein synthetischer Repressor einer HMGCoA-Expression, als ein Antagonist des zellularen Proteins, das an der Bestimmungsstelle bindet.
  • DNA Duplex-Bestimmungsstelle
  • Parallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Antiparallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • C. Bestimmungsstelle: Die Bestimmungsstelle ist eine Bindungsstelle für ein Protein, das erscheint, um die Transkription von HMGCoA durch Bindung mit dem "TATA Box"-Gebiet zu aktivieren. Ein TFO gegen diese Stelle ist so ausgebildet, daß es ein synthetischer Repressor einer HMGCoA-Expression ist, als ein Antagonist des zellularen Proteins, das mit der TATA Box- Bestimmungsstelle bindet.
  • DNA Duplex-Bestimmungsstelle
  • Parallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Antiparallele synthetische Oligonukleotid-Folge
    • Beispiel 10 Nerven-Anwachs-Rezeptor (NGFR)
  • Das NGFR-Gen encodiert einen Zellen-Oberflächen-Rezeptor, der für eine Nervenzellenwucherung erforderlich ist. Er ist überexprimiert in dem Neuroblastom und Melanomen. Triplex-Oligonukleotide sind so ausgebildet, daß sie das Anwachsen dieser Krebsgewebe unterdrücken. Die Aktivierung der Gene wäre eine Voraussetzung der Aktivierung einer Nervenzellen-Regeneration. Die mRNA-Startstelle liegt bei -122 in diesem Zahlenschema.
  • A. Bestimmungsstelle: Konsensus Sp1 Bindungsstelle
  • DNA Duplex-Bestimmungsstelle
  • Parallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Antiparallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • B. Bestimmungsstelle: Konsensus SPI Bindungsstelle.
  • DNA Duplex-Bestimmungsstelle
  • Parallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Antiparallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • C. Bestimmungsstelle: Gebiet-flankierende Konsensus Sp1 Bindungsstellen
  • DNA Duplex-Bestimmungsstelle
  • Parallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Antiparallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • D. Bestimmungsstelle: Gebiet-flankierende Konsensus Sp I Bindungsstellen.
  • DNA Duplex-Bestimmungsstelle
  • Parallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Antiparallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Bestimmungsstelle: Konsensus Sp1 Bindungsstelle. DNA Duplex-Bestimmungsstelle
  • Parallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Antiparallele synthetische Oligonukleotid-Folge
    • Beispiel 11 HERPES SIMPLEX VIRUS 1: DNA-Polymerase und DNA Bindungs- Proteine
  • HSV-1 ist verantwortlich für eine Vielzahl von Hautverletzungen und andere Infektionen. Das Triplex-Oligonukleotid ist so ausgebildet, daß es direkt an das Promotor-Gebiet der Gene bindet, die die Virus-DNA- Polymerase und das DNA-Bindungs-Protein encodieren und dadurch eine Virus-Replikation hemmen. Beide Gene erscheinen in 0,4 map Einheiten und flankieren den Replikations-Ursprung oriL. Die unten stehende Numerierung erfolgt in Ausdrücken der Polypeptid- Startstelle für jedes Gen.
  • A. Bestimmungsstelle. Diese Stelle liegt in der 5'- flankierenden Folge der DNA-Polymerase-Gene. Der Angelotti-Strang hat drei Grundstoff-Änderungen relativ zu dem Strang 17.
  • (1) Strang 17
  • DNA Duplex-Bestimmungsstelle
  • Parallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Antiparallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • (2) Strang Angelotti
  • Parallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Antiparallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • A: Bestimmungsstelle: Diese Stelle liegt in der 5'-flankierenden Folge der DNA-Bindungs-Protein-Gene für Strang 17.
  • Parallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Antiparallele synthetische Oligonukleotid-Folge
    • Beispiel 12 HERPES SIMPLEX VIRUS 1: Ursprung der Replikation
  • HSV-1 ist verantwortlich für eine Vielzahl von Hautverletzungen und anderen Infektionen. Die Triplex-Oligonukleotide sind so ausgebildet, daß sie direkt an den zwei Klassen des HSV-1 DNA Replikations- Ursprungs binden und dadurch die Virus-Replikation hemmen. Der erste Ursprung (oriL) erscheint bei 0,4 map Einheiten und liegt zwischen und unmittelbar anliegend an die HSV-1 DNA-Polymerase und die DNA bindenden Protein-Gene. Die zwei identischen Ursprünge des zweiten Typs (oriS) erscheinen bei 0,82 und 0,97 map Einheiten. Die unten stehende Numerierung sind die Ausdrücke der Lagen relativ zu den zwei gefalteten symmetrischen Achsen jedes Ursprungs.
  • A. Bestimmungsstelle oriL-Ursprung
  • 1. DNA Duplex-Bestimmungsstelle
  • Parallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Antiparallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • 2. DNA Duplex-Bestimmungsstelle
  • Parallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Antiparallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Diese zwei Bestimmungsstellen liegen innerhalb des oriL-Ursprungs. Da das oriL auch das 5'-flankierende Gebiet der HSV-1 DNA- Polymerase und das HSV-1 Haupt-DNA-Bindungsprotein enthält, können diese Triplex-Oligonukleotide auch in Eingriff gelangen mit der Transkription dieser zwei Gene.
  • B. Bestimmungsstelle: oriS-Organ
  • DNA Duplex-Bestimmungsstelle
  • Parallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Antiparallele synthetische Oligonukleotid-Folge
    • Beispiel 13 Menschliches Beta-Globin
  • Das Beta-Globin-Gen encodiert eines der Proteine, die ausgewachsenes Hämoglobin enthalten. Eine Mutation in diesem Gen ist verantwortlich für Beta-Thalassemie und Sichelzellenänemie.
  • Auf dieses Gen gerichtete Triplex-Oligonukleotide sind so ausgebildet, daß sie die Beta-Globin-Gene in thalassämischen und in Patienten mit einer Sichelzellen-Anämie hemmen, damit diese durch natürlich auftretende Delta-Proteine ersetzt werden. Es werden zwei Klassen von Triplex-Oligonukleotiden TFO beschrieben, die gegen den 5'- Beschleuniger des Promotor/codierenden Gebietes gerichtet sind. Die Numerierung erfolgt relativ zu der Haupt-mRNA-Startstelle.
  • A. DNA Duplex-Bestimmungsstelle
  • Parallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Antiparallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • B. DNA Duplex-Bestimmungsstelle
  • Parallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Antiparallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • C. DNA Duplex-Bestimmungsstelle
  • Parallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Antiparallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • D. DNA Duplex-Bestimmungsstelle
  • Parallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Antiparallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • E. DNA Duplex-Bestimmungsstelle
  • Parallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Antiparallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • F. DNA Duplex-Bestimmungsstelle
  • Parallele synthetische Oligonukleotid-Folge
  • Antiparallele synthetische Oligonukleotid-Folge
    • Beispiel 14
  • Untersuchung für die Wirkung der Oligonukleotid-Bindung in Zellen. Die Wirkungen der Triplex-formenden Oligonukleotide werden in einer Zellstruktur untersucht. Oligonukleotide werden auf kultivierte menschlich Zellinien appliziert, die dann für eine Oligonukleotid- Aufnahme und für eine Änderung des Ruhezustand-Wertes der Boten-RNA analysiert werden, der mit der DNA-Bestimmungsstelle assoziiert ist. Als ein Beispiel sind die Verfahren für die c-myc Gene dargstellt. Ein Fachmann auf diesem Gebiet wird dieses leicht auf jede Gene in der kultivierten Zelle verallgemeinern können.
  • Auf einem festen Träger (100 ul Geamtvolumen) gewachsene HeLa- Zellen werden mit einem ³²P-bezeichneten Oligonukleotid behandelt, dann als Funktion der Zeit und Konzentration inkubiert. Die Zellen werden von dem Serum durch Zentrifugation und erschöpfendes Waschen getrennt, durch Entproteinisierung aufgespalten und dann auf einem 8% Gel-Sequenator quantitativ geprüft. Dieser Analyse- Vorgang ergibt die folgenden Merkmale:
  • a. Der offensichtliche Teilungs-Koeffizient für die Olinonukleotid- Aufnahme in HeLa-Zellen.
  • b. Die Aufnahmerate, d.h. die Zeitkonstante, um einen Ruhezustand bezüglich der Oligonukleotid-Aufnahme zu erreichen.
  • c. Die Halbwertszeit für den Oligonukleotid-Verfall in Serum und in der HeLa-Zelle.
  • Aus diesen Daten werden der optimierte Zeitverlauf und Titratinsbereich für die Oligonukleotid-Behandlung von Zellen bestimmt.
  • Die Transkriptions-Hemmung wird durch eine Abwandlung des RNase-Schutzversuches untersucht, was die Standardprüfung für die quantifizierenden Ruhezustand mRNA-Werte in Säugetier-Zellen darstellt. Das gesamte zellulare RNA wird aus den Oligonukleotidbehandelten HeLa-Zellen extrahiert, dann zu einem gleichmäßig bezeichneten antisensitiven RNA-Transkript hybridisiert, das durch die Wirkung einer T7-Poymerase auf das Smal-PvuII menschlich c- myc Fragment in pSPT19 erzeugt ist.
  • Diese SmaI-PvuII-Probe ist komplementär zu dem ersten myc Exon und den Folgen, die die P1 und P2 Applikations-Startstellen von myc enthalten. Wenn die Probe über die MYC-Transkript hinaus hybridisiert ist, erzeugt ein Begrenzungs-RNaseI-Abbau entweder ein 0,6 kb Duplex (Transkription von P1, das der bevorzugte Ursprung in HeLa-Zellen ist), oder ein 0,4 kb Duplex (Transkription erfolgt an Stelle von P2, das in HeLa-Zellen unter Bedingungen einer Serum- Verhungerung benutzt wird).
  • Die Größe und Menge der resultierenden RNase-resistenten Duplexe wird dann durch eine quantitative Autoradiographie auf einer 5% Acrylamid-Gel-Matrix bestimmt. Dieses Prüfungssystem kann die Ruhezustands-RNA-Werte bis zu einer Genauigkeit von 20% quantifizieren, was für die Zwecke dieser Analyse ausreichend ist.
  • Das Ergebnis dieser zellularen Titrationen wird im Zusammenhang mit zwei Kontrollexperimenten analysiert. Das erste ist ein Vergleich der Dosen-Reaktion der Oligonukleotide, die einzeln an den Verbindungsstellen-Gen binden, und der Dosen-Reaktion der Oligonukleotide, die nicht verwandt sind. Wenn eine Oligonukleotidvermittelte Unterdrückung der c-myc Transkription auf eine Stellenspezifische Triplex-Bildung in der Zelle zurückzuführen ist, wird ein nicht verwandtes Oligonukleotid über einen äquivalenten Konzentrationsbereich keine Wirkung hervorbringen.
  • Die zweite Kontrolle bezeichnet die Gen-Artspezifität der Wirkung. In dem RNase-Schutz-Versuch werden die Daten immer auf eine RNA- Konzentration über alles in der Zelle normalisiert. Als solches sind die Änderungen in dem Ruhezustands-Wert des myc-Transkriptes in ihrem eigenen Recht bedeutungsvoll. Um jedoch zu bestätigen, daß die Wirkungen der Oligonukleotid-Bindung für das c-myc-Gen spezifisch sind, untersuchen wir auch die Wirkung der myc-spezifischen Oligonukleotid-Behandlung auf die Ruheszustandswerte der Histon 2A (H2A)-Information in HeLa-Zellen, wobei das RNA-Komplement mit einem H2A-antisensitiven RNA untersucht wird, das aus einem Aufbau erzeugt ist, welcher, wie für myc-Folgen, in einen RNA- Expressions-Vektor geklont ist. Wenn eine Oligonukleotid-vermittelte Unterdrückung für das myc-Gen spezifisch ist, wird die H2A- Transkription in HeLa-Zellen über eine äquivalenten Konzentrationsbereich nicht beeinflußt.
  • Über den Bereich von 1-50 micro-Mol unterdrücke Oligonukleotide, die mit dem Steuergebiet des menschlichen c-myc-Gen binden, selektiv eine c-myc eine Transkription in einer unversehrten HeLa- Zelle. Vorarbeiten mit anderen in den Beispielen beschriebenen Oligonukleotiden haben begonnen, ähnliche selektive Wirkungen zu zeigen.
  • Ein Fachmann auf diesem Gebiet wird erkennen, daß die Anwendung dieser Verfahren leicht verallgemeinert werden kann auf jedes Gen in jeden Zellinien und nur begrenzt ist durch die Verfügbarkeit von geklonten Gen-Aufbauten, DNA-Folgedaten und dem rudimentären Verständnis der molekularen Entstehungen der zu untersuchenden Gene. Augenblicklich ist diese Reihe von Informationen für einige hundert menschliche Gene und einige tausend Gene anderer Arten verfügbar.
  • Die Verfahren können auch ohne nennenswerte Änderung angewendet werden auf die Benutzung chemisch geänderter Oligonukleotid-Varianten, wie jene mit chemischen dem 3'-und 5'- hinzugefügten Anteilen, Oligonukleotiden mit einer geänderten Phosphodiester-Hauptkette oder jene mit anderen Grundanteilen als G und T (d.h. iodo-G oder X).
  • Schließlich liegt die Bedeutung dieser Beispiele darin, zu zeigen, daß eine ganze Klasse von Einzel-Anteil-Oligonukleotid-Molekülen durch eukaryotische Zellen aufgenommen wird, ohne eine exogene Manipulation irgeneiner Art. Der Aufnahme-Mechanismus ist derzeit nicht bekannt, aber in den meisten Zellen ist er wirksam und, offensichtlich, unabhängig von der Oligonukleotid-Folge (Eppstein D.A., Schryver B.B. & Marsh Y.V. (1986) J. Biol. Chem. 261, 5999). Daher sind im allgemeinsten Sinne die Gesamt-Aufnahme-Eigenschaften derartiger Oligonukleotide nicht nennenswert unterschiedlich von anderen wirksamen Arzneimitteln. Durch dieses Kriterium ist es sicher, daß ein Oligonukleotid-Ligand, der dazu bestimmt ist, selektiv in den Vorgang der Gen-Expression zu intervenieren, in einer unversehrten Zelle pharmakologische Effekte zeigen wird.
  • In der Vergangenheit wurden diese Zellen-Aufnahme-Konzepte dazu benutzt die Wirksamkeit von RNA-Oligonukleotiden als Arzneimittel zu erklären, die die Wirkung einer Interferon-Behandlung erhöhen (Eppstein D.A., Schryver B.B. & Marsh Y.V. (1986) J. Biol. Chem. 261, 5999) und der Fähigkeit von "antisensitiven" oder "anti-splice Verbindungen"-Oligonukleotiden zu erhöhen, um einen mRNA- Vorgang in der Zelle zu hemmen (Heikkile R. et. al. (1987) Nature 328, 445 und Eppstein D.A., Schryver B.B. & Marsh Y.V. (1986) J. Biol. Chem. 261, 5999). Es ist wahrscheinlich, daß derselbe Aufnahme- Vorgang die Basis ist für die Anwendung von Triplex-bildenden Oligonukleotiden als Arzneimittel, um selektiv die Transkriptions- Auslösung zu regulieren oder selektiv eine Gen-Bestimmungsstelle zu zerstören.
  • Der hier beschrieben Gestaltungsvorgang kann verwendet werden, ein synthetisches DNA-Oligonukleotid zu schaffen, das spezifisch an einer doppelt-anteiligen DNA-Bestimmungsstelle von Interesse bindet. Der resultierende Oligonukleotid-Duplex DNA-Komplex wird am besten als ein kolineares Triplex beschrieben. In dem Triplex nehmen die Oligonukleotid-Moleküle die Haupt-Vertiefung des Duplex ein. Der Komplex wird durch eine Grundanteil-Grundanteil Wasserstoffbindung an der Oberfläche der Haupt-Vertiefung stabilisiert, wobei er die Watson-Crick-Paarung unversehrt läßt. Als ein Ergebnis werden die Stabilität und die Stellen-Artspezifität des synthetischen Oligonukleotids durch die Modifikation der Phosphodiesterverbindung oder durch die chemische Modifikation des Oligonukleotid-Terminus nicht nennenswert beeinträchtigt. Demzufolge können diese Oligonukleotide chemisch modifiziert werden, und zwar durch Erhöhung der Gesamt-Bindungsstabilität relativ zu dem chemischen Abbau, Erhöhung der Rate, mit der die Oligonukleotide in die Zellen hineintransportiert werden, und durch Übertragung der chemische Reaktivität auf die Moleküle.
  • Basierend auf den hier beschriebenen Gestaltungsverfahren ist es möglich, Oligonukleotide zu schaffen, die durch eukaryotische Zellen leicht aufgenommen werden und, wenn sie einmal in der Zelle sind, auf spezifische Stellen innerhalb eines Genoms gerichtet werden können. Augenblicklich sind die Stellen-Artspezifität und die Stabilität der Wechselwirkungen der synthetischen Oligonukleotid- Bestimmungsstelle so gut wie augenblickliche Wechselwirkungen monoklonaler Antikörper-Antigen-Bindungen.
  • Diese neue Klasse von Stellen-spezifischen Molekülen kann als Genspezifische Reagentien mit der Fähigkeit, den Transkriptionsvorgang in einer Gen-spezifischen Weise zu steuern, verwendet werden. Diese Steuerung ist wirksam sowohl bei körperlichen Genen und Virus- Genen, die eine Gast-Zelle infiziert haben. Wenn synthetische Oligonukleotide in geeigneter Weise mit einem reaktiven chemischen Komplement gekoppelt werden, ist es möglich, ein hybrides Molekül mit der Fähigkeit zu schaffen, selektiv eine Gen-Bestimmungsstelle von Interesse zu zu zerstören.
  • Ein Fachmann auf diesem Gebiet wird mühelos erkennen, daß die vorliegende Erfindung gut geeignet ist, die Aufgaben zu lösen und die Endergebnisse und Vorteile zu erzielen, die hier erwähnt sind, sowie auch solche, die in diesen inhärent sind. Die hier beschriebenen Oligonukleotide, Zusammensetzungen, Verfahren, Arbeitsvorgänge und Techniken sind derzeit repräsentative und bevorzugte Ausführungsformen. Sie sollen nur als Beispiele dienen und nicht als Beschränkungen des Schutzumfangs.

Claims (76)

1. Verfahren zur Herstellung synthetischer Oligonukleotide, die an Bestimmungstellen auf Duplex-DNA-Molekülen binden, durch Formen eines kollinearen Triplex durch Pindung mit der Haupt- Vertiefung, gekennzeichnet durch folgende Schritte:
Aus einem genomischen Duplex-DNA-Molekül werden nukleotide Bestimmungsstellen mit mehr als etwa 20 Nukleotiden identifiziert, die entweder etwa wenigstens 65% Grundanteile von Purin oder etwa wenigstens 65% Grundanteile von Pyrimidin enthalten; und
die synthetischen, zu den identifizierten Bestimmungsstellen komplementären Oligonukleotide werden künstlich hergestellt, wobei die synthetischen Oligonukleotide ein G aufweisen, wenn die komplementäre Lage in dem Duplex-DNA-Molekül ein GC- asenpaar hat, und ein T aufweisen, wenn die komplementäre Lage in dem Duplex-DNA-Molekül ein AT-Basenpaar hat.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß wenigsten ein T der Oligonukleotide durch eine Zusammensetzung ersetzt wird, die aus X, halogenierten Ableitungen von X, I und halogenierten Ableitungen von I ausgewählt ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß wenigsten ein G der Oligonukleotide durch eine halogenierte. Ableitung von G ersetzt wird.
4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens ein Grundanteil der Oligonukleotide bei der 2'-furanosen Lage durch eine nicht geladene umfangreiche Gruppe ersetzt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichznet, daß die nicht geladene umfangreiche Gruppe aus einem verzweigten Alkyl, einem Zucker und einem verzweigten Zucker ausgewahlt wird.
6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Hauptkette der Oligonukleotide ein analoges Phosphodiester ist, das durch Zellular-Zellbildung nicht vollständig hydrolisiert ist.
. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das analoge Phosphodiester aus einem Phosphorothiotat, einem Phosphoroselenoat, einem Methylphosphat, einem Phosphoramidit, einem Phosphotriester und dem Alpha-Enantiomer von natürlich auftretendem Phosphodiester ausgewählt wird.
8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich einen Verbinder bei einem Terminus der Oligonukleotide enthält.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligonukleotid außerdem eine modifizierende, dem Verbinder zugeordnete Gruppe enthält, wobei die modifizierende Gruppe das Duplex-DNA-Molekül bindet und aus einem Interkalator, einem eine Vertiefung bindenden Molekül, einem kationischen Amin und einem kationischen Polypeptid ausgewählt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligonukleotid außerdem eine modifizierende, dem Verbinder zugeordnete Gruppe enthält, wobei die modifizierende Gruppe das DNA zerstört und aus einem katalytischen Oxydans, einem Stickstoff-Gas, einem Alkylator, einem photocheinischen Vernetzer, einem photochemischen Sensibilisator eines Singulett-Sauerstoffs und einer Reagenz ausgewählt wird, die eine direkte photochemische Zerstörung ermöglicht.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der photochemische Sensibilisator des Singulett-Sauerstoffs Eosin, blaues Methylen, orangenes Acridin oder ein 9-Amino- Acridin ist.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß-die Reagenz ein Ithidium oder eine Pyren-Ableitung ist.
13. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die modifizierende Gruppe aus einem Eosin-Isothiocyanat, einer Psoralin-Ableitung und einer Metall-Chelatverbindung ausgewählt wird.
14. Synthetisches Oligonukleotid für die Verbindung mit identifizierten Bestimmungsstellen auf Duplex-DNA-Molekülen durch Formen eines kollinearen Triplex, wenn die Bestimmungsstellen entweder ungefähr wenigstens 65% Purin-Grundanteile oder etwa wenigstens 65% Pyrimidin-Grundanteile enthält, gekennzeichnet durch folgende Merkmale:
Eine Nukleotidfolge mit etwa 20 bis 40 Nukleotiden; die Nukleotidfolge enthält G und T, wobei G anwesend ist, wenn die komplementäre Lage in dem Duplex-DNA ein GC- Basenpaar ist, und T anwesend ist, wenn die komplementäre Lage in dem Duplex-DNA ein AT-Basenpaar ist;
und die Folge aus einem Oligonukleotid ausgewählt wird, das bei 3' bis 5' orientiert ist und sich antiparallel mit dem ungefähr wenigstens 65% Purinanteil in den Duplex-DNA- Bestimmungsstellen und ein Oligonukleotide enthält, das bei 5' bis 3' orientiert ist und sich parallel mit dem ungefähr wenigstens 65% Purin-Fluß in den Duplex-DNA- Bestimmungsstellen verbindet.
15. Synthetisches Oligonukleotid nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleotid-Folge von gleicher Oligonukleotid-Länge zu den Bestimmungsstellen ist.
16. Synthetisches Oligonukleotid nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Dissoziations-Konstante von 6 x 10&supmin;¹&sup0; bis 1,5 x 10&supmin;&sup7; Mol hat.
17. Synthetisches Oligonukleotid nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Dissoziations-Konstante von etwa 10&supmin;&sup9; bis 10&supmin;&sup8; Mol hat.
18. Synthetisches Oligonukleotid nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß wenigsten ein T durch eine Verbindung ersetzt wird, die aus X, halogenierten Ableitungen von X, I und halogenierten Ableitungen von I ausgewählt ist.
19. Synthetisches Oligonukleotid nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens ein G durch eine halogenierte Ableitung von G ersetzt ist.
20. Synthetisches Oligonukleotid nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens ein Grundanteil bei der 2'- Furanose-Lage durch eine nicht geladene umfangreiche Gruppe ersetzt ist.
21. Synthethisches Oligonukleotid nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die nicht geladene umfangreiche Gruppe aus einem verzweigten Alkyl, einem Zucker und einem verzweigten Zucker ausgewählt ist.
22. Synthetisches Oligonukleotid nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Hauptkette ein anologes Phosphodiester ist, der nicht vollständig durch eine Zellular-Nuklease hydrolisiert ist.
23. Synthetisches Oligonukleotid nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß das analoge Phosphodiester aus Phosphorothioat, Phosphoroselenoat, Methyl-Phosphat, Phosphoramidit, Phosphotriester und dem Alpha-Enantiomer eines natürlich auftretenden Phosphodiester ausgewählt ist.
24. Synthetisches Oligonukleotid nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich eine Verbindung bei einem Terminus enthält.
25. Synthetisches Oligonukleotid nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß der Verbinder dem 3'-Terminus zugeordnet und aus einem analogen Grundstoff mit einem Primär-Ainin ausgewählt ist, das über eine Alkylverbindung und einen analogen Grundstoff mit einen Sulfhydryl, der mit der Basisebene über eine Alkylverbindung verbunden ist, verbunden ist.
26. Synthetisches Oligonukleotid nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung dem 5'-Terminus zugeordnet und ausgewählt ist aus einem analogen Grundstoff mit einem primären Amin, das über eine Alkylverbindung der Basisebene zugeordnet ist, sowie einem analogen Grundstoff mit einem Sulfhydryl, das über eine Alkylverbindung der Grundstoffebene zugeordnet ist, wobei eine lange Aminkette direkt mit der 5'- Hydroxyl-Gruppe des Oligonukleotid gekuppelt ist und eine lange Thiolkette direkt mit der 5'-Hydroxyl-Gruppe des Oligonukleotid gekuppelt ist.
27. Synthetisches Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 24, 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich eine der Verbindung zugeordnete modifizierende Gruppe enthält, wobei die modifizierende Gruppe das Duplex-DNA-Molekül bindet und aus einem Interkalator, einem Vertiefungs-bindenden Molekül, einem kationischen Amin und einem kationischen Polypeptid ausgewählt ist.
28. Synthetisches Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 24, 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich eine dem Verbinder zugeordnete modifizierende Gruppe enthält, wobei die modifiziernde Gruppe das DNA stört und aus einem kathalytischen Oxydans, einem Stickstoff-Gas, einem Alkylator, einem photochemischen Querverbinder, einem photochemischen Sensibilisator eines Singulett-Sauerstoffs und einer Reagenz ausgewählt ist, die eine direkte photochemische Störung ermöglicht.
29. Synthetisches Oligonukleotid nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß der photochemische Sensibilisator des Singulett-Sauerstoffs Eosin, blaues Methylen, orangenes Acridin oder ein 9-Amino-Acridin ist.
30. Synthetisches Oligonukleotid nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenz Ethidium oder eine Pyren- Ableitung ist.
31. Synthetisches Oligonukleotid nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß die modif izierende Gruppe von einem Eosin- Isothiokyanat, einer Psoralin-Ableitung und einer Metall- Chelatverbindung ausgewählt ist.
32. Synthetisches Oligonukleotid nach Anspruch 14 für eine Applikation mit einem ausreichendem Betrag für eine zellulare Aufnahme und eine Bindung mit den Bestimmungsstellen für eine Verhinderung eines Anwachsens von Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmungsstellen in dem DNA-Gebiet benachbart zu dem RNA-Übertragungs-Ursprung liegen.
33. Synthetisches Oligonukleotid nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen Krebszellen sind und das synthetische Oligonukleotid spezifisch zu dem C-myc-Gen ist.
34. Synthetisches Oligonukleotid nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß das synthetische Oligonukleotid ausgewählt ist aus:
35. Synthetisches Oligonukleotid nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligonukleotid einen Verbinder und eine modifiziernde Gruppe enthält.
36. Synthetisches Oligonukleotid nach Anspruch 14 für eine Applikation in einem ausreichenden Betrag für eine zellulare Aufnahme und eine Verbindung mit den Bestimmungsstellen zur Verhinderung des Anwachsens von Krankheitserregern, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmungsstellen innerhalb des nukleischen Säurebereiches, der an die ursprüngliche RNA- Transkription angrenzt, abbinden.
37. Synthetisches Oligonukleotid nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß der Krankheitserreger ein HIV-1-Virus und das synthetische Oligonukleotid innerhalb des Virus-LTR- Bereiches ist.
38. Synthetisches Oligonukleotid nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß das synthetische Oligonukleotid ausgewählt ist aus:
39. Synthetisches Oligonukleotid nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligonukleotid einen Verbinder und eine modifizierende Gruppe enthält.
40. Synthetisches Oligonukleotid nach Anspruch 14 für die Applikation in einem ausreichendem Betrag für eine zellulare Aufnahme und Bindung mit den Bestimmungsstellen, um den strukturellen Protein-Inhalt des Haut-Gewebes zu manipulieren.
41. Synthetisches Oligonukleotid nach Anspruch 40 für eine Verhinderung eines Kollagen-Gen, dadurch gekennzeichnet, daß das synthetische Oligonukleotid ausgewählt ist aus:
42. Synthetisches Oligonukleotid nach Anspruch 40 für die Verhinderung einer Kollagenasen-Gen, dadurch gekennzeichnet, daß das synthetische Oligonukleotid ausgewählt ist aus:
43. Synthetisches Oligonukleotid nach Anspruch 14 für die Applikation in einem ausreichenden Betrag für eine zellulare Aufnahme und Bindung mit den Bestimmungsstellen, um permanent eine Gen-Expression zu verhindern.
44. Synthetisches Oligonukleotid nach Anspruch 14 für eine Applikation in einem ausreichenden Betrag für eine zellulare Aufnahme und eine Bindung mit den Bestimmungsstellen, um die Merkmale der Muskelproteine in tierischen Nahrungsmitteln zu verändern.
45. Synthetisches Oligonukleotid nach Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, daß das synthetische Oligonukleotid ausgewählt ist aus:
46. Synthetisches Oligonukleotid nach Anspruch 14 für eine Applikation mit einem ausreichenden Betrag für eine zellulare Auf nahme und Bindung mit den Bestimmungsstellen, um den Interleukin-2-alpha-Kettenreceptor zu verhindern.
47. Synthetisches Oligonukleotid nach Anspruch 46 für die Verbinderung eines Interleukin-2-alpha-Kettenreceptors, dadurch gekennzeichnet, daß das synthetische Oligonukleotid ausgewählt ist aus:
48. Synthetisches Oligonukleotid nach Anspruch 14 für eine Applikation in einem ausreichenden Betrag für eine zellulare Aufnahme und Bindung mit den Bestimmungsstellen, um eine Plaque-Formation in der Alzheimer-Krankheit zu dispergieren.
49. Synthetisches Oligonukleotid nach Anspruch 48 zum Dispergieren der Plaque-Formation in der Alzheimer-Krankheit, dadurch gekennzeichnet, daß das synthetische Oligonukleotid ausgewählt ist aus:
50. Synthetisches Oligonukleotid nach Anspruch 14 für eine Applikation mit einem ausreichenden Betrag für eine zellulare Aufnahme und Bindung mit den Bestimmungsstellen, um die Expression des krankhaften Wachstums der Genfaktoren zu unterdrücken.
51. Synthetisches Oligonukleotid nach Anspruch 50 für eine Unterdrückung der Expression des krankhaften Anstiegs der Genfaktoren, dadurch gekennzeichnet, daß das synthetische Oligonukleotid ausgewählt ist aus:
52. Synthetisches Oligonukleotid nach Anspruch 14 für die Applikation mit einem ausreichenden Betrag für eine zellulare Aufnahme und Bindung mit den Bestimmungsstellen, um die Glutathion-s-Transferase pi Gen zu unterdrücken.
53. Synthetisches Oligonukleotid nach Anspruch 52 für eine Unterdrückung der Glutathion-s-Transferase pi Gen, dadurch gekennzeichnet, daß das synthetische Oligonukleotid ausgewählt ist aus:
54. Synthetisches Oligonukleotid nach Anspruch 14 für eine Applikation mit einem ausreichenden Betrag für eine zellulare Aufnahme und Bindung mit den Bestimmungsstellen, um in dem Programm der Cholesterol-Synthese zu intervenieren durch eine Modulation der Transkription des Enzyms, das die Rate bestimmt, die den Schritt in der Cholesterol-Biosynthese, bekannt als HMGCoA-Reduktase, begrenzt.
55. Synthetisches Oligonukleotid nach Anspruch 54 für eine Modulation der Transkription des Enzyms, das den die Rate begrenzenden Schritt in der Cholesterol-Biosynthese bestimmt, die als HMGCoA-Reduktase bekannt ist, dadurch gekennzeichnet, daß das synthetische Oligonukleotid ausgewählt ist aus:
56. Synthetisches Oligonukleotid nach Anspruch 14 für die Applikation mit einem ausreichenden Betrag für eine zellulare Aufnahme und eine Bindung mit den Bestimmungsstellen, um die Expression des Nerven-Wachstumsfaktor-Receptors zu unterdrücken.
57. Synthetisches Oligonukleotid nach Anspruch 56 für die Unterdrückung des Gen-kodierenden Nervenwachstums-Faktor- Receptors, dadurch gekennzeichnet, daß das synthetische Oligonukleotid ausgewählt ist aus:
58. Synthetisches Oligonukleotid nach Anspruch 14 für eine Applikation mit einem ausreichenden Betrag für eine zellulare Aufnahme und eine Bindung mit den Bestimmungsstellen, um die Virus-Replikation des Herpes-Simplex-Virus 1 anzuhalten.
59. Synthetisches Oligonukleotid nach Anspruch 58 für ein Anhalten der Virus-Replikation, dadurch gekennzeichnete, daß das synthetische Oligonukleotid ausgewählt ist aus:
60. Synthetisches Oligonukleotid nach Anspruch 14 für die Applikation mit einem ausreichenden Betrag für eine zellulare Aufnahme und Bindung mit den Bestimmungsstellen, um die Beta- Globin-Gen-Synthese in thallassemischen und in Sichel-Zellen- Anämien zu unterdrücken.
61. Synthetisches Oligonukleotid nach Anspruch 60 für die Unterdrückung der Synthese von Beta-Globin-Genen, dadurch gekennzeichnet, daß das synthetische Oligonukleotid ausgewählt ist aus:
62. Kolineares Triplex mit einem synthetischen Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 14 - 61, das mit identifizierten Bestimmungsstellen auf Duplex-DNA-Molekülen gebunden ist.
63. Kolineares Triplex gemäß Anspruch 62, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonukleotid-Länge der Bestimmungsstellen gleich derjenigen des synthetischen Oligonukleotid ist.
64. Synthetisches Oligonukleotid, das nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 - 13 gewinnbar ist, für die Applikation mit einem ausreichenden Betrag für eine zellulare Aufnahme und Bindung mit den Bestimmungsstellen für eine Verhinderung des Anwachsens der Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmungsstellen in dem DNA-Gebiet positioniert werden, das benachbart zu dem RNA-Transkriptions-Ursprung liegt.
65. Synthetisches Oligonukleotid, das durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 13 gewinnbar ist, für die Applikation mit einem ausreichenden Betrag für eine zellulare Aufnahme und Bindung mit den Bestimmungsstellen zur Verhinderung des Anwachsens von Krankheitserregern, dadurch gekennzeichnet, daß die Folge in einem nukleischen Säuregebiet bindet, das benachbart zu dem RNA-Transkriptions-Ursprung liegt.
66. Synthetisches Oligonukleotid, das durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 - 13 gewinnbar ist, für die Applikation in einem ausreichenden Betrag für eine zellulare Aufnahme und Bindung mit den Pestimmungsstellen, um so den strukturellen Proteininhalt des Hautgewebes zu berechnen.
67. Synthetisches Oligonukleotid, das durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 - 13 gewinnbar ist, für die Applikation mit einem ausreichenden Betrag für eine zellulare Aufnahme und Bindung mit den Bestimmungsstellen, um so permanent eine Gen-Expression zu verhindern.
68. Synthetisches Oligonukleotid, das durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 13 gewinnbar ist, zur Applikation mit einem ausreichenden Betrag für eine zellulare Aufnahme und Bindung mit den Bestimmungsstellen, um so die Eigenschaften der Muskelproteine in tierischen Lebensmitteln zn ändern.
69. Synthetisches Oligonukleotid, hergestellt durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 13 für eine Applikation in einem ausreichenden Betrag für eine zellulare Aufnahme und Bindung mit den Bestimmungsstellen, um so den Interleukin-2-alpha- Kettenreceptor zu verhindern.
70. Synthetisches Oligonukleotid, hergestellt durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 13 für eine Applikation mit einem ausreichenden Betrag für eine zellulare Aufnahme und Bindung mit den Bestimmungsstellen, um so eine Plaque-Formation in der Alzheimer-Krankheit zu dispergieren.
71. Synthetisches Oligonukleotid, hergestellt durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 13 für eine Applikation in einem ausreichenden Betrag für eine zellulare Aufnahme und Bindung mit den Bestimmungsstellen, um so die Expression der Haut- Wachstumsfaktor-Gene zu unterdrücken.
72. Synthetisches Oligonukleotid, hergestellt durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 13 für eine Applikation in einem ausreichenden Betrag für eine zellulare Aufnahme und Bindung mit den Bestimmungsstellen, um so die Glutathion-s- Transferase pi Gen zu unterdrücken.
73. Synthetisches Oligonukleotid, hergestellt durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 13 für eine Applikation in einem ausreichenden Betrag für eine zellulare Aufnahme und Bindung mit den Bestimmungsstellen, um so in dem Programm der Cholesterol-Synthese zu intervenieren, und zwar durch Modulation der Transkription des Enzyms, das den Schritt in der Begrenzung der Rate in der Cholesterol-Biosynthese bestimmt, die als HMGCoA-Reduktase bekannt ist.
74. Synthetisches Oligonukleotid, hergestellt durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 13, für eine Applikation in einem ausreichenden Betrag für eine zellulare Aufnahme und Bindung mit den Bestimmungsstellen, um so die Expression des Nerven-Wachstumsfaktor-Receptors zu unterdrücken.
75. Synthetisches Oligonukleotid, hergestellt durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 13, für die Applikation in einem augreichenden Betrag für eine zellulare Aufnahme und Bindung mit den Bestimmungsstellen, um so die Virus-Replikation des Herpes-Simplex-Virus 1 anzuhalten.
76. Synthetiscbes Oligonukleotid, hergestellt durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 13, für eine Applikation in einem augreichenden Betrag für eine zellulare Aufnahme und Pindung mit den Bestimmungsstellen, um so die Beta-Globin- Gen-Synthese in thallassemischen und Sichel-Zellen-Anämien zu unterdrücken.
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