CN112236131A

CN112236131A - 包含pten抑制剂的囊泡及其用途

Info

Publication number: CN112236131A
Application number: CN201980035234.0A
Authority: CN
Inventors: 舒拉米特·利文贝格; 郭绍伟; 丹尼尔·奥芬; 尼西姆·佩列茨
Original assignee: Ramot at Tel Aviv University Ltd; Technion Research and Development Foundation Ltd
Current assignee: Ramot at Tel Aviv University Ltd; Technion Research and Development Foundation Ltd
Priority date: 2018-03-29
Filing date: 2019-03-27
Publication date: 2021-01-15
Also published as: JP2021519283A; EP3773506A1; IL277605A; RU2020132733A; US20230330130A1; WO2019186558A1; EP3773506A4; US11648260B2; KR20210005031A; US20210077520A1

Abstract

本发明提供了包含膜囊泡的药物组合物，膜囊泡包括细胞外囊泡，细胞外囊泡包括被称为外泌体的囊泡，细胞外囊泡装载有外源磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)抑制剂。提供了使用细胞外囊泡治疗神经系统疾病、病症或病状的方法。还提供了装载有外源磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)抑制剂的分离的细胞外囊泡。

Description

包含PTEN抑制剂的囊泡及其用途

技术领域

本发明涉及装载有PTEN抑制剂的膜状囊泡，包含该囊泡的药物组合物，以及它们在治疗神经系统疾病中的用途，更特别地，涉及装载有外源PTEN抑制剂的细胞衍生的细胞外囊泡，包含该囊泡的药物组合物，以及它们治疗脊髓损伤的用途。

背景技术

脊髓损伤可能导致植物神经功能障碍，感觉丧失或活动能力丧失。这种脊髓损伤(SCI)是由外伤、肿瘤、局部缺血、发育紊乱、神经退行性疾病、脱髓鞘疾病、横突性脊髓炎、血管畸形或其他原因引起的。SCI的后果取决于损伤的具体性质及其在脊髓中的位置。此外，由于SCI是一个动态过程，因此在所有急性脊髓综合症中，损伤程度最初可能并不明显。脊髓不完整病变可能演变成更完整病变。更常见的是，在最初事件发生后的数小时至数天内，损伤水平会升高一个或两个脊髓水平。复杂的病理生理事件级联导致了这种临床恶化。

SCI的心理和社会影响通常是毁灭性的。与SCI相关的一些一般性致残状况是四肢永久性瘫痪、慢性疼痛、肌肉萎缩、对膀胱和肠的自愿控制丧失、性功能障碍和不育。

神经科学的最新进展引起了对SCI研究的极大关注，并提供了明显更好的治疗和康复选择。例如，功能性电刺激(FES)已显示出增强神经再生和SCI后在恢复和改善功能能力方面显著改善的潜力。但是，并非所有脊髓损伤患者都符合FES的资格(必须存在脊髓完整病变)。患者必须处于神经学稳定状态；并且外围神经必须完整，以应对外源电刺激。

SCI后的轴突再生受到限制，这是由于成熟神经元的内在极其有限的生长能力，以及外在因素，例如随着时间的推移神经胶质瘢痕成熟和抑制性分子。已经尝试改变外在因素，但是成功是有限的。例如，去除细胞外抑制分子，递送神经营养因子或允许的基质移植未能引起受损的皮质脊髓束强烈再生。

磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)是高度保守的双特异性蛋白酪氨酸磷酸酶。该蛋白使脂质第二信使磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸[PI(3,4,5)P3]和磷脂酰肌醇3,4-双磷酸酯[PI(3,4)P2]去磷酸化，生成磷脂酰肌醇4,5-双磷酸酯[PI(4,5)P2]和磷脂酰肌醇4-磷酸盐[PI(4)P]。这种独特的活性使PTEN成为主要的稳态调节剂和肿瘤抑制蛋白，由于体细胞变化，其功能在多种肿瘤中不存在或有缺陷。PI3K/AKT/mTOR信号通路在细胞生长、再生和存活中的重要作用支持了PTEN靶向治疗的基本原理。建议的基于PTEN抑制的治疗靶点包括损伤或损害后的神经生长和再生，心脏缺血/再灌注和相关疾病的治疗，伤口修复和不育(参见Pulido的综述，2018，Molecules，23，285)。有趣的是，PTEN参与癌症的主要范例是作为一种癌症抑制剂，并且已证明PTEN抑制可能发生在脑转移中(Zhang等，Nature，2015，527，100-104)。

PTEN在成年大脑的神经元中优先表达，通过下调雷帕霉素(mTOR)哺乳动物靶标的活性在控制皮质脊髓神经元的再生中起关键作用。在轴突切除的成年神经元中，mTOR活性被显著抑制，限制了持续轴突再生所需的新蛋白合成。一些出版物提及PTEN参与抑制神经再生，另一些出版物则表明PTEN耗竭对与轴突损害或受损有关的疾病具有积极作用。有效抑制PTEN将是增加mTOR从而促进神经再生的候选者。

WO 2009/117389描述了PTEN抑制剂在治疗神经退行性疾病中的治疗用途。WO2015/066701描述了通过在受伤的神经处或附近施用PTEN抑制肽来再生神经或减轻神经变性的方法。WO 2011/044701描述了特定的PTEN抑制肽及其在治疗与细胞毒性应激有关的疾病中的用途，所述疾病包括中枢神经系统的疾病和损伤。

有大量载体被认为可用于传递siRNA分子，包括脂质体、蛋白粒子、胶束和脂质粒子等。Rungta等(Molecular Therapy-Nucleic Acids，2013，2，e136)表明脂质纳米粒子(LNP)中的siRNA可能有效沉默神经元基因的表达。

细胞外膜囊泡(EV)是由不同类型细胞分泌的膜囊泡。EV在正常生理条件下存在于血液循环中，在各种疾病中，EV的水平会升高，例如糖尿病和相关的血管并发症、心血管疾病、血液系统恶性肿瘤以及实体瘤。

EV可分为三个亚群：(I)外泌体：直径为30-100nm，并来自内体区室；(II)微囊泡：直径为100nm-1μm，通过“囊泡化”从细胞表面释放出来；(III)凋亡体：直径为1-5μm，并从凋亡细胞中释放出来。EV包含亲代细胞的几种元素，包括蛋白，DNA片段，微小RNA和mRNA。

EP 2254586涉及从间充质干细胞分离的外泌体，所述外泌体包括间充质干细胞的至少一种生物学特性。此外，提出了外泌体作为不同药物(包括小分子和非编码RNA)的载体(例如，US 2017/0247708和Ha等，Acta Pharmaceutica Sinica B 2016；6(4)：287-296)。通常，通过电穿孔将siRNA引入外泌体。

本申请的一些发明人的WO2018/033911教导了用于治疗神经系统疾病的源自间充质干细胞的外泌体。

一般的神经损伤，尤其是脊髓损伤(SCI)包括继发于损伤本身的漫长而复杂的继发事件级联。级联的复杂性可能会影响所建议治疗的效率，并且仍然存在未满足的需求，需要开发其他安全、有效和方便的方法来治疗SCI。

发明内容

根据一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含装载有外源磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)抑制剂的细胞外囊泡。

根据另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含载有外源磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)抑制剂的细胞外囊泡，用于治疗神经系统疾病、病症或病状。

根据本发明的另一方面，提供了一种在有需要的受试者中治疗神经系统疾病、病症或病状的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的装载有外源磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)抑制剂的膜粒子，从而治疗神经系统疾病或病状。根据一些实施方案，膜粒子是源自细胞的细胞外囊泡。

根据另一方面，本发明提供了装载有外源磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)抑制剂的分离的细胞外囊泡。

根据上述任何一个方面，所述细胞外囊泡选自由外泌体、微囊泡、膜粒子、膜囊泡、胞体和囊泡。根据所描述的实施方案中的进一步特征，所述粒子包含外泌体。根据一些实施方案，细胞外囊泡是外泌体和微囊泡的组合。根据一些实施方案，细胞外囊泡例如外泌体源自表达间充质标志物的贴壁细胞。根据一些实施方案，表达间充质标志物的贴壁细胞选自间充质干细胞、口腔粘膜干细胞或嗅鞘细胞。根据其他实施方案，细胞外囊泡，例如外泌体，源自表达来自神经嵴细胞标记的贴壁细胞。根据一个实施方案，神经嵴细胞包括颅神经嵴细胞。根据所描述的实施方案中的进一步特征，颅神经嵴细胞选自牙髓干细胞(DPSC)、脱落的乳牙干细胞(SHED)、牙周膜干细胞(PDLSC)、牙根尖乳头干细胞(SCAP)和牙囊祖细胞(DFPC)。根据以上任一个方面和实施方案，所述细胞外囊泡是分离的细胞外囊泡。根据一些方面和实施方案，本发明的药物组合物是无细胞组合物。

根据以上任一个方面和实施方案，所述PTEN抑制剂包括PTEN表达的多核苷酸或寡核苷酸抑制剂。根据一些实施方案，所述PTEN抑制剂是RNA干扰寡核苷酸。根据一些实施方案，RNA干扰寡核苷酸是针对PTEN的siRNA。根据一些实施方案，所述siRNA包含与编码人PTEN蛋白的核酸互补的序列。根据一些实施方案，所述寡核苷酸抑制剂包含疏水部分。根据某些实施方案，疏水部分是固醇、神经节苷脂、脂质、维生素、脂肪酸、肽或其组合。根据一些实施方案，疏水部分是固醇。根据一些实施方案，所述固醇包含胆固醇。

根据所述任一个方面或实施方案的进一步特征，所述PTEN抑制剂包括肽抑制剂。

根据上述一些方面和实施方案，所述神经系统疾病是神经变性疾病。根据其他方面和实施方案，神经系统疾病是脊髓损伤。根据以上一些方面和实施方案，治疗脊髓损伤包括给有需要的受试者施用所述药物组合物或分离的细胞外囊泡。根据一些实施方案，施用包括鼻内施用。根据一些实施方案，治疗还包括向受试者施用治疗有效量的软骨素酶ABC或编码其的多核苷酸。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于本发明的实施方案的实践或测试中，但是下面描述了示例性的方法和/或材料。在有冲突的情况下，以专利说明书，包括定义为准。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的，并非有意必须限制于此。

附图说明

本文仅通过示例的方式，参考附图描述了本发明的一些实施方案。要强调的是，现在具体地详细参考附图所示出的细节是作为示例并且出于对本发明的实施方案的说明性讨论的目的。在这方面，对本领域技术人员来说，结合附图进行的描述使如何实施本发明的实施方案变得显而易见。

图1显示了Cryo-TEM对MSC-Exo的可视化。

图2显示了受伤的(上图)和健康的(下图)大鼠中所有CNS组织的微CT扫描。该图显示外泌体穿过血脑屏障，到达脊髓病变处。

图3显示了在健康和受伤老鼠的中枢神经系统(左图)和主要器官(右图)中，使用FAAS，采用电感耦合等离子体(ICP)评估通过鼻内施用GNP-外泌体后金纳米粒子(GNP)的定量分析。*p＜0.05，***p＜0.001。

图4显示了使用PKH26标记的外泌体(PKH26-Exo)后，完整和受伤的大鼠中T10脊柱节段中PKH26平均信号强度的定量。**p＜0.01。

图5显示了与神经元、星形胶质细胞和活化的小胶质细胞共定位的PKH26-Exo信号的定量(p<0.01)。

图6显示了与外泌体一起温育的Cy3标记的自传递MAPK-siRNA的NanoSight分析。该图显示了非荧光外泌体(灰色)和Cy3外泌体(黑色)的大小分布。

图7显示了用以下方法处理的背根神经节(DRG)神经元的代表性免疫荧光染色图像：对照(培养基)(图7A)、非靶向对照siRNA(图7B)、MSC-Exo(图7C)、PTEN-siRNA(图7D)或ExoPTEN(图7E)。比例尺，100μm。

图8显示了所有组中分支水平上的分支点数。在各组之间比较了通过IMARIS软件量化的中位分支水平的分支点的数量。在中位分支水平上，PTEN-siRNA-外泌体的神经突分支点的数量明显高于所有其他组。

图9显示了在所有组中测量和比较的神经突总长度(图9A)、神经突数量(图9B)，分支点(图9C)和最大分支水平(图9D)。

图10显示了鼻内施用ExoPTEN后在SCI部位和肝脏中的蛋白和mRNA表达。图10A和B分别显示了与未治疗的SCI大鼠相比，外泌体(IN)治疗的和ExoPTEN(IN)治疗的脊髓和肝脏中的PTEN蛋白表达。图10C和D显示了未治疗的、外泌体(IN)治疗和ExoPTEN(IN)治疗的SCI大鼠的脊髓和肝脏中PTEN mRNA表达的RT-qPCR分析，以GAPDH作为内部对照。数据以平均值±SEM表示，采用Kruskal-Wallis多重比较；IL：病变内；IN：鼻内。

图11显示了鼻内ExoPTEN治疗诱导运动、感觉和膀胱恢复。图11A显示了SCI大鼠的每周Basso、Beattie和Bresnahan(BBB)运动评分：未治疗(n＝15，黑色)，或用PTEN-siRNA(IL)(n＝3)、ExoPTEN(IL)(n＝4)、外泌体(IN)(n＝10)或ExoPTEN(IN)(n＝7)治疗；IL：病变内；IN：鼻内。双因素ANOVA，随后Tukey多重比较检验(横断对照和ExoPTEN(IN)之间的***p<0.001，****p<0.0001。外泌体(IN)和ExoPTEN(IN)之间的#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001。图11B显示了在整个8周期间每组的BBB运动评分的分布。呈现了每组中每只大鼠获得的最高分数。示出了给定分数的大鼠数与每组中大鼠总数的比值。图11C显示了横断对照或用PTEN-siRNA(IL)、ExoPTEN(IL)、外泌体(IN)或ExoPTEN(IN)治疗的大鼠的平均每周体重(±SEM)。双因素ANOVA，随后Tukey多重比较检验。横断对照与ExoPTEN(IN)之间的*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001。外泌体(IN)和ExoPTEN(IN)之间的#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001。图11D显示了第8周每组体重与BBB评分的关系。计算了皮尔逊相关系数，表示为R2，显示了所有组BBB评分与体重之间的高度相关性。图11E显示了在治疗后第0、4、8周的感觉恢复的百分比。图11F显示了膀胱功能，其反映为从开始治疗起达到自发性尿反射的时间(天)。图11G显示了在手术后第3天至第8周，横断后的大鼠的图像：未治疗(上图)、外泌体治疗(中图)和PTEN-siRNA-外泌体治疗(下图)。

图12显示了治疗和未治疗的大鼠的病变区域中的MRI和电生理参数的测量：图12A和图12B分别显示了距受伤正中心4mm的吻侧和尾侧的横截面积；图12C显示了病变内的平均分数各向异性(FA)值；图12D和图12E显示了外泌体(IN)、ExoPTEN(IN)或健康大鼠中运动诱发电位的振幅(图12D)和延迟(图12E)。

图13显示了三组大鼠中免疫荧光标志物的定量和比较：未治疗、用外泌体治疗和用ExoPTEN治疗。标志物是β-III-微管蛋白(图13A)、CD11b(图13B)、GFAP(图13C)和CD31(图13D)。数据以平均值±SEM，以及单因素ANOVA，随后Tukey多重比较检验(*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001)。

图14显示了未治疗(上图，n＝3)，外泌体治疗(中图，n＝3)和ExoPTEN治疗(下图，n＝2)的SCI大鼠中BDA追踪的皮质脊髓束突轴突的代表性图像。比例尺，500μm。方框显示所选区域的放大率更高。白色箭头表示正中心尾侧的BDA阳性纤维。比例尺，100μm。与横断对照或外泌体治疗相比，鼻内ExoPTEN治疗后观察到轴突生长量高得多(上图)。

具体实施方式

在本发明的一些实施方案中，本发明涉及装载有用于治疗神经系统疾病的外源PTEN抑制剂的囊泡，并且更具体但非排他地涉及装载有用于治疗脊髓损伤的PTEN抑制剂的源自细胞的囊泡。在详细解释本发明的至少一个实施例之前，应当理解，本发明的应用并不一定限于以下描述中阐述的或由实施例举例说明的细节。本发明能够具有其他实施方式，或者能够以各种方式被实践或执行。

特别地，本发明人已经证明外泌体可以有效装载缀合胆固醇的siRNA(图6)。如实施例中所示，在超过三分之一的外泌体中观察到可检测量的siRNA。此外，装载PTEN-siRNA的外泌体在体外促进了背根神经节神经元的强力轴突再生(图7)。当移至体内研究时，整个中枢神经系统的组织学和microCT成像证实，鼻内施用的外泌体已越过血脑屏障，归巢于脊髓病变，并被病变中的神经元内化(图2)。更惊人的是，鼻内施用装载PTEN-siRNA的外泌体促进了强大的轴突再生和血管生成，并伴有星形胶质细胞和小胶质细胞减少(图13)。此外，鼻内ExoPTEN治疗可部分恢复电生理和结构完整性，最重要的是，可实现显著的功能运动恢复(图11)。

根据本发明的教导，装载有能够下调PTEN表达和/或活性的试剂的外泌体可用于治疗一般的其他神经系统疾病或病状，更具体地，用于治疗退化性神经系统疾病。特别地，由本发明可以清楚的是，抑制活性，特别是抑制病变部位中PTEN的表达有效地治疗了脊髓损伤。

根据本发明的一个方面，提供了一种药物组合物，其包含装载有外源磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)抑制剂的粒子。

术语“磷酸酶和张力蛋白同源物”“PTEN”在本文中可互换使用，是指人磷酸酶和张力蛋白同源酶，EntrezGene ID：5728的产物，并且其氨基酸序列组成可对应于UniProt登录号：P60484。使用已知的方法，例如BLAST搜索，可以容易地鉴定其他非人类同源物，并且被认为在本发明的范围内。PTEN蛋白充当磷酸酶，使磷脂酰肌醇(3,4,5)-三磷酸(PtdIns(3,4,5)P3或PIP3)去磷酸化。PTEN特异性催化PIP3中肌醇环的3'磷酸的去磷酸化，生成双磷酸酯产物PIP2(PtdIns(4,5)P2)。该去磷酸化是重要的，因为它导致AKT信号通路抑制。代表性的PTEN氨基酸序列示于SEQ ID NO：1。

术语“粒子”和“囊泡”在本文中可互换使用，是指用于递送活性剂的离散实体。术语“活性剂”和“活性部分”在本文中可互换使用，是指具有生物学活性、药理作用和/或治疗用途的试剂。所述活性剂的非限制性实例是小分子、RNA、DNA、肽和蛋白。根据一些实施方案，所述活性剂是非内源性的活性剂，即不是天然存在于活细胞中。在一个实施方案中，非内源性的是指活性剂在人体和/或人体细胞中不存在。

所述粒子可以包含由脂质双层限制的囊泡或扁平球。所述粒子的直径可以为40-100nm。该粒子可以通过内体膜的向内出芽形成。所述粒子可以具有约1.13-1.19g/ml的密度并且可以漂浮在蔗糖梯度上。所述粒子中可以富含胆固醇和鞘磷脂，以及脂质筏标志物，例如GM1、GM3、flotilin和src蛋白激酶Lyn。所述粒子可包含间充质干细胞或间充质干细胞条件培养基(MSC-CM)中存在的一种或多种蛋白，例如对MSC或MSC-CM具有特征性或特异性的蛋白。它们可以包含RNA，例如miRNA。

根据一些实施方案，所述粒子是膜囊泡。如本文所用，术语“膜囊泡”是指包含被脂质双层包围的液体的任何囊泡结构。因此，根据一些实施方案，所述粒子是脂质双层磷脂膜囊泡。根据一些实施方案，膜囊泡选自细胞外囊泡、脂质体、核外粒体和转移体(transferosome)。根据一些实施方案，所述膜囊泡是合成膜囊泡。根据其他实施方案，所述膜囊泡是源自细胞的粒子。根据一些实施方案，所述细胞是真核细胞。根据一个实施方案，所述膜囊泡是脂质体。

根据一个实施方案，所述膜囊泡是细胞外囊泡。根据一些实施方案，本发明的药物组合物包含装载有外源磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)抑制剂的细胞外囊泡，其中所述细胞外囊泡源自细胞。

术语“细胞外囊泡”和“EV”在本文中可互换使用，是指源自细胞的囊泡，其包含包围内部空间的膜。通常，细胞外囊泡的直径范围为30nm至1000nm，并且可以在内部空间内包括各种大分子货物，展示在细胞外囊泡的外表面，和/或跨膜包括各种大分子货物。所述货物可以包括核酸、蛋白、碳水化合物、脂质、小分子和/或其组合。术语细胞外囊泡包括术语“外泌体”和“微囊泡”。术语“外泌体”和“纳米囊泡”在本文中可互换使用，是指直径在30至100nm之间的大小的EV。通常，在不限于任何特定理论的情况下，外泌体在细胞内形成并在多囊泡体(MVB)与质膜融合后从细胞释放。或者，外泌体直接从质膜释放。如本文所用，术语“微囊泡”是指具有直径在100至1000nm之间的大小的EV。术语“核外粒体”是指直接从质膜出芽的各种大小的囊泡(例如直径为0.1-1mm)。

根据一些实施方案，细胞外囊泡选自外泌体、微囊泡、核外粒体、外囊泡及其组合。

根据一个实施方案，所述EV是外泌体。所述外泌体可具有以下特性中的至少一种：(a)电子显微镜确定大小在50nm至100nm之间；(b)包含分子量>100kDa的复合物，包含<100kDa的蛋白；(c)包含分子量>300kDa的复合物，包含<300kDa的蛋白；(d)包含分子量>1000kDa的复合物；(e)通过激光衍射或动态光散射测定的低于100nm的流体力学半径。根据一个实施方案，外泌体的直径为50至100nm。

根据另一个实施方案，细胞外囊泡是微囊泡。根据一个实施方案，所述EV是微囊泡。根据一个实施方案，微囊泡的直径为100至1000nm、120至800nm、150至600nm或200至400nm。根据另一个实施方案，微囊泡的尺寸为100至300nm或150至250nm。根据一些实施例，EV的直径为30至250nm或50至200nm。根据一些实施例，EV的直径为70至170nm或80至150nm。

EV的大小可以大于2nm。EV的大小可以大于5nm、10nm、20nm、30nm、40nm或50nm。EV的大小可以大于100nm，例如大于150nm。EV的大小可以为大致200nm或更大。

EV的大小可以在一定范围内，例如在2nm至20nm、2nm至50nm、2nm至100nm、2nm至150nm或2nm至200nm之间。EV的大小可以在20nm至50nm，20nm至100nm，20nm至150nm或20nm至200nm之间。EV的大小可以在50nm至100nm、50nm至150nm或50nm至200nm之间。EV的大小可以在100nm至150nm或100nm至200nm之间。EV的大小可以在150nm至200nm之间。EV的大小可以在100至600nm、150至500nm或200至400nm之间。

可以通过各种方式确定大小。原则上，可以通过尺寸分级和通过具有相关尺寸截止值的膜过滤来确定大小。然后可以通过使用SDS-PAGE追踪组分蛋白的分离或通过生物学试验来确定粒径。

大小可以包括流体动力学半径。EV的流体动力学半径可以低于100nm。它可以在约30nm至约70nm之间。流体力学半径可以在约40nm至约60nm之间，例如在约45nm至约55nm之间。流体力学半径可以为约50nm。EV的流体力学半径可以通过任何合适的方式来确定，例如，激光衍射或动态光散射。

根据另一个实施方案，细胞外囊泡是外泌体和微囊泡的组合。根据一些实施方案，细胞外囊泡是分离的细胞外囊泡。根据又一个实施方案，所述EV是外囊泡或核外粒体。

如上所述，细胞外囊泡源自细胞。术语“源自”和“起源自”在本文中可互换使用，是指在特定细胞、细胞类型或细胞群内产生、由其产生或从其中产生的囊泡。如本文所用，术语“亲代细胞”、“生产细胞”和“原始细胞”包括从其衍生和分离细胞外囊泡的任何细胞。该术语还涵盖共享细胞外囊泡的蛋白、脂质、糖或核酸组分的细胞。例如，“亲代细胞”或“生产细胞”包括用作细胞外囊泡的来源的细胞。根据一些实施方案，所述细胞是真核细胞。

细胞外囊泡(EV)可以通过几种方式中的任何一种从生物细胞中衍生出来，例如通过从生物细胞分泌、出芽或分散。EV可以是从间充质干细胞(MSC)、神经嵴细胞(NCC)、间充质干细胞条件培养基(MSC-CM)或神经嵴细胞条件培养基中可分离的物质。EV可负责或至少具有亲本细胞的活性，例如MSC、NCC、NCC-CM或MSC-CM。EV可负责并执行亲代细胞的活性的基本上大部分或全部功能，例如MSC、NCC、NCC-CM或MSC-CM。例如，EV可以是MSC、NCC、NCC-CM或MSC-CM的替代物(或生物替代物)。例如，细胞外囊泡可以从生物细胞产生、渗出、发射或脱落。在生物细胞处于细胞培养中的情况下，粒子可以被分泌到细胞培养基中。

可衍生出EV的生物细胞的实例包括表达间充质标志物例如间充质干细胞、口腔粘膜干细胞或嗅鞘细胞的贴壁细胞、星形胶质细胞和神经嵴细胞。因此，根据一些实施方案，本发明提供了一种药物组合物，其包含装载有外源PTEN抑制剂的细胞外囊泡，其中所述细胞外囊泡源自表达间充质标志物的贴壁细胞。根据一个实施方案，表达间充质标志物的贴壁细胞选自间充质干细胞(MSC)、口腔粘膜干细胞和嗅鞘细胞。根据一个实施方案，细胞是间充质干细胞(MSC)。

术语“间充质干细胞”是指能分化为多种细胞类型的多能基质细胞，如本领域众所周知，包括：成骨细胞(骨细胞)、软骨细胞、肌细胞(肌肉细胞)和脂肪细胞。

在多能状态下，间充质干细胞通常表达以下标志物：CD105、CD166、CD29、CD90和CD73，而不表达CD34、CD45和CD133。

间充质干细胞可以分离自多种组织，包括但不限于骨髓、脂肪组织、牙髓、口腔粘膜、外周血和羊水。根据一个实施方案，间充质干细胞是从骨髓分离的。根据一个实施方案，间充质干细胞起源于选自以下的部位：骨髓、脂肪组织、脐带、牙髓、口腔粘膜、外周血和羊水。根据一些实施方案，所述EV源自起源于骨髓的MSC。根据其他实施方案，所述EV源自起源于脂肪组织的MSC。根据一些这样的实施方案，所述EV选自外泌体、微囊泡及其组合。根据一些实施方案，细胞表达CD105、CD166、CD29、CD90和CD73标志物。根据另一个实施方案，细胞表达CD105、CD166、CD29、CD90和CD73，并且不表达CD34、CD45和CD133。根据一些实施方案，所述细胞选自牙髓干细胞(DPSC)、脱落的乳牙干细胞(SHED)、牙周膜干细胞(PDLSC)、牙根尖乳头干细胞(SCAP)和牙囊祖细胞(DFPC)。

EV可包含由特定细胞类型例如间充质干细胞或神经嵴细胞分泌的一种或多种蛋白、寡核苷酸或多核苷酸。EV可包含存在于间充质干细胞条件培养基(MSC-CM)中的一种或多种蛋白或多核苷酸。在一个特定的实施方案中，EV可包含源自MSC或神经嵴细胞的miRNA。

例如，EV可包含10％或更多，20％或更多，30％或更多，40％或更多，50％或更多，60％或更多或70％或更多这些蛋白或多核苷酸。EV可包含基本上约75％的这些蛋白和/或多核苷酸的。可以参考蛋白列表或基因列表中的基因产物来定义蛋白。

EV可能具有间充质干细胞的至少一种特性。该粒子可以具有生物学性质，例如生物学活性。该粒子可以具有MSC的任何生物活性。该粒子可以例如具有MSC的治疗或恢复活性。

分离、纯化和扩增间充质干细胞(MSC)的方法在本领域中是已知的，包括例如Caplan和Haynesworth在美国专利No.5,486,359和Jones E.A.等，2002，Isolation andcharacterization of bone marrow multipotential mesenchymal progenitor cells,Arthritis Rheum.46(12)：3349-60中公开的那些方法。

间充质干细胞培养物可通过用等体积的汉克平衡盐溶液(HBSS；GIBCO实验室，美国纽约州格兰德岛)稀释BM抽吸物(通常为20ml)，然后将稀释的细胞铺在约10ml Ficoll色谱柱(Ficoll-Paque；Pharmacia，Piscataway，美国新泽西州)来产生。以2500x g离心30分钟后，将单核细胞层从界面上移出并悬浮在HBSS中。然后将细胞以1500x g离心15分钟，然后重悬于完全培养基(MEM，不含脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的αMEM；GIBCO)，20％的胎牛血清(FCS)，源自大量选择用于MSC快速生长的胎牛血清(亚特兰大生物公司，诺克罗斯，佐治亚州)；100单位/ml青霉素(GIBCO)，100μg/ml链霉素(GIBCO)；和2mM L-谷氨酰胺(GIBCO)。将重悬的细胞接种在10cm培养皿(Corning Glass Works，康宁，纽约州)中的约25ml培养基中，并在37℃下与5％湿润的CO2温育。培养24小时后，丢弃非贴壁细胞，并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)彻底清洗贴壁细胞两次。每3或4天用新鲜的完全培养基替换一次，持续约14天。然后用0.25％的胰蛋白酶和1mM EDTA(Trypsin/EDTA，GIBCO)在37℃下收获贴壁细胞5分钟，再铺在6厘米的平板中，再培养14天。然后用胰蛋白酶消化细胞，并使用细胞计数装置例如血细胞计数器(Hausser Scientific，Horsham，PA)对细胞进行计数。离心回收培养的细胞，并以每毫升1-2X 106个细胞的浓度重悬于5％DMSO和30％FCS。将每份约1毫升的等分试样缓慢冷冻并储存在液氮中。

为扩大间充质干细胞级分，将冷冻的细胞在37℃融化，用完全培养基稀释，并通过离心去除DMSO进行回收。将细胞重悬于完全培养基中，并以约5,000个细胞/cm2的浓度铺板。培养24小时后，除去非贴壁细胞，并使用Trypsin/EDTA收集贴壁细胞，用狭窄的巴斯德吸管分离，并优选以约1.5至约3.0细胞/cm2的密度重新铺片。在这些条件下，MSC培养物可以增长约50倍，并可以扩增约2000倍[Colter DC.等，Rapid expansion of recyclingstem cells in cultures of plastic-adherent cells from human bone marrow.ProcNatl Acad Sci USA.97:3213-3218,2000]。

本发明的一些实施方案利用的MSC培养物包括由其形态特征定义的三组细胞：小粒状细胞(下文称为RS-1)、小颗粒状细胞(下文称为RS-2)以及大和中等颗粒状细胞(下文称为成熟的MSC)。可以通过使用例如免疫荧光、原位杂交和活性测定法来鉴定各种细胞表面标志物的存在或不存在来测定培养物中此类细胞的存在和浓度。

根据一些实施方案，EV不源自星形胶质细胞。因此，本发明涉及包含装载有PTEN抑制剂的粒子的组合物，条件是该粒子不是源自星形胶质细胞的外泌体。

根据一个具体的实施方案，细胞外囊泡源自表达来自神经嵴细胞的标志物的细胞。根据一个具体的实施方案，所述EV源自神经嵴细胞。根据另一个实施方案，神经嵴细胞是颅神经嵴细胞。根据一些实施方案，颅神经嵴细胞包括但不限于牙髓干细胞(DPSC)、脱落的乳牙干细胞(SHED)、牙周膜干细胞(PDLSC)、牙根尖乳头干细胞(SCAP)和牙囊祖细胞(DFPC)。根据一些实施方案，这样的细胞表达如上文定义的间充质标志物。

EV可以通过多种方式生产或分离。这样的方法可以包括从间充质干细胞(MSC)或神经嵴细胞(NCC)分离EV。

因此，本发明的EV是分离的EV。因此，本发明提供了一种药物组合物，其包含装载有外源磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)抑制剂的分离的细胞外囊泡，其中所述细胞外囊泡是从细胞分离的。根据一些实施方案，细胞是人细胞。

根据以上任一个实施方案，所述细胞外囊泡是分离的细胞外囊泡。如本文所用，术语“纯化”、“纯化的”、“使纯化”、“分离”和“分离的”可互换使用，是指细胞外囊泡的群体(例如，大量已知或未知的量和/或浓度)状态，其已经历一种或多种纯化过程的，例如选择所需的细胞外囊泡，或者去除或减少残留的生物产物。根据一个实施方案，EV与残余亲代细胞的比率比在起源材料中至少高2、3、4、5、6、8或10倍，或在某些有利的实施方案中至少高50、100或1000倍。在一些有利的实施方案中，术语“分离的”具有基本上无细胞或无细胞的含义，并且可以被其取代。因此，根据一些实施方案，根据本发明的药物组合物包含装载有PTEN抑制剂的分离的细胞外囊泡。根据一些实施方案，所述药物组合物是无细胞组合物，即不包含可检测量的细胞。

如所提及的，脂质双层磷脂膜囊泡，例如细胞外囊泡，装载有外源PTEN抑制剂。

如本文所用，术语“外源的”是指分子或物质(例如化合物，核酸或蛋白)，其起源自给定的膜囊泡(例如细胞外囊泡)的外部，并且不是天然存在于囊泡中的。关于细胞外囊泡，该术语是指天然不存在于囊泡中和细胞外囊泡所源自的细胞中的分子或物质。根据一些实施方案，术语“外源的”是指合成的非天然分子。根据一些实施方案，将所述物质人工加载至细胞外囊泡或细胞外囊泡所源自的细胞。对于肽、蛋白和核酸，该术语是指将该化合物人工加载至细胞外囊泡或该囊泡所源自的细胞，或在该囊泡所源自的细胞内人工表达，而该化合物不在亲代细胞中天然表达。

术语“装载的”的含义是粒子，即膜囊泡，被人工添加或填充抑制剂。关于抑制剂相对于膜囊泡的位置，该术语具有以下含义：包埋在囊泡内部，暴露或存在于包埋在囊泡膜中(外部或内部或之间)的囊泡表面(内表面和/或外表面)。根据一个实施方案，所述抑制剂被包埋在囊泡的外膜内。根据另一个实施方案，所述抑制剂被包埋在囊泡的内膜内。根据另一个实施方案，所述抑制剂被包埋在囊泡的液相内。

根据一个实施方案，PTEN抑制剂抑制或下调PTEN活性。根据另一个实施方案，PTEN抑制剂抑制或下调PTEN表达。

根据一个实施方案，PTEN抑制剂是蛋白或肽。根据另一个实施方案，PTEN抑制剂是小分子。基于蛋白的PTEN抑制剂的实例包括但不限于美国专利申请号20160074472和20160311857中公开的那些，二者的内容通过引用并入本文。根据一些实施方案，基于蛋白的PTEN抑制剂包括具有选自WO 2011/044701中描述的序列1、2、5、6和具有WO 2015/105957中描述的序列1-5的序列的肽。

本发明的基于蛋白的抑制剂可以例如通过使用标准固相技术进行生物化学合成。这些方法包括专有固相合成、部分固相合成方法、片段缩合、经典溶液合成。固相多肽合成方法是本领域众所周知的。合成肽可通过制备型高效液相色谱法纯化，其组成可通过氨基酸测序确认。

重组技术也可以用于产生本发明的基于蛋白的抑制剂。为了使用重组技术生产本发明的多肽抑制剂，将编码本发明的肽的多核苷酸连接到核酸表达载体中，该载体包含在顺式调控序列(例如启动子)的转录控制下的多核苷酸序列，所述调控序列适合指导本发明多肽在宿主细胞中的组成型、组织特异型或诱导型转录。下文进一步描述了表达载体在。

除了在宿主细胞中可合成外，本发明的肽还可以使用体外表达系统合成。这些方法在本领域中是公知的，并且系统的组分是可商购的。

根据一个具体的实施方案，基于蛋白的抑制剂在EV所源自的细胞中表达。因此，例如，本发明预期在MSC群体中表达蛋白抑制剂，然后从遗传修饰的MSC获得EV。

根据一些实施方案，外源PTEN抑制剂是PTEN表达抑制剂。根据一个实施方案，PTEN表达抑制剂是多核苷酸或寡核苷酸。根据另一个实施方案，所述抑制剂是RNA干扰(RNAi)寡核苷酸。根据一个实施方案，RNA干扰寡核苷酸是siRNA。根据另一个实施方案，RNA干扰寡核苷酸是shRNA。

如本文所用，术语“多核苷酸”是指包含超过150个核苷酸的长核酸。如本文所用，术语“寡核苷酸”是指核酸的短单链或双链序列，例如核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)或其模拟物，所述核酸通常具有小于或等于150个核苷酸。根据一些实施方案，所述寡核苷酸包含2至150、10至100或15至50个核苷酸。根据其他实施方案，所述寡核苷酸包含15至40、17至35或18至30个核酸。

在一个实施方案中，所述多核苷酸或寡核苷酸试剂是RNA沉默剂。如本文所用，术语“RNA沉默”是指由RNA分子介导的一组调节机制(例如RNA干扰(RNAi)、转录基因沉默(TGS)、转录后基因沉默(PTGS)、抑制、共抑制和翻译抑制)，导致相应编码蛋白的基因的表达抑制或“沉默”。在许多类型的生物体中都已观察到RNA沉默，包括植物、动物和真菌。

如本文所用，术语“RNA沉默剂”、“RNA沉默分子”和“RNA沉默寡核苷酸”在本文中可互换使用，是指能够抑制或“沉默”靶基因表达的RNA。在某些实施方案中，所述RNA沉默剂能够通过转录后沉默机制防止mRNA分子的完全加工(例如，完全翻译和/或表达)。RNA沉默剂包括非编码RNA分子，例如包含成对链的RNA双链体，以及可从其产生此类小的非编码RNA的前体RNA。示例性的RNA沉默剂包括dsRNA，例如siRNA，miRNA和shRNA。在一实施方案中，所述RNA沉默剂能够诱导RNA干扰。在另一个实施方案中，所述RNA沉默剂能够介导翻译抑制。

RNA干扰是指动物中由短干扰RNA(siRNA)介导的序列特异性转录后基因沉默的过程。植物中的相应过程通常称为转录后基因沉默或RNA沉默，在真菌中也被称为抑制。转录后基因沉默的过程被认为是一种进化保守的细胞防御机制，可用于阻止外源基因的表达，并且通常被多样的植物区系和门共有。这种对外源基因表达的保护可能已进化为响应于双链RNA(dsRNA)的产生，所述双链RNA的产生来源于病毒感染或来源于转座子元件通过特异性破坏同源单链RNA或病毒基因组RNA的细胞应答而随机整合到宿主基因组中。

细胞中长dsRNA的存在刺激了称为dicer的核糖核酸酶III酶的活性。Dicer参与将dsRNA加工成被称为短干扰RNA(siRNA)的短片段dsRNA的过程。由dicer活性得到的短干扰RNA的长度通常为约21至约23个核苷酸，并且包含约19个碱基对双链体。RNAi反应还具有核酸内切酶复合物的特征，通常称为RNA诱导的沉默复合物(RISC)，其介导具有与siRNA双链体反义链互补的序列的单链RNA的切割。靶RNA的切割发生在与siRNA双链体的反义链互补的区域的中间。

因此，本发明考虑使用dsRNA来下调由mRNA表达蛋白。根据一个实施方案，dsRNA大于30bp。由于人们相信这些较长区域的双链RNA会导致诱导干扰素和PKR反应，因此长dsRNA(即大于30bp的dsRNA)的使用受到了很大的限制。然而，长dsRNA的使用可以提供许多优势，因为细胞可以选择最佳的沉默序列，从而无需测试许多siRNA；较长的dsRNA将允许沉默文库具有低于siRNA所需的复杂性。而且，也许最重要的是，长dsRNA在用作治疗剂时可以防止病毒逃逸突变。

各种研究表明，长dsRNA可用于沉默基因表达而不会诱导应激反应或引起明显的脱靶效应。

特别地，本发明还考虑了在干扰素途径未被激活的细胞(例如，胚胎细胞和卵母细胞)中引入长dsRNA(超过30个碱基的转录物)用于基因沉默。

本发明还考虑了引入长的dsRNA，其被特别设计为不诱导下调基因表达的干扰素和PKR途径。例如Shinagwa和Ishii[Genes&Dev.17(11):1340-1345,2003]已经开发了一种名为pDECAP的载体，其可以从RNA聚合酶II(Pol II)启动子表达长双链RNA。由于来自pDECAP的转录本缺乏有助于ds-RNA输出到细胞质的5'-帽结构和3'-聚(A)尾巴，因此来自pDECAP的长ds-RNA不会诱导干扰素应答。

在哺乳动物系统中规避干扰素和PKR途径的另一种方法是通过转染或内源性表达引入小的抑制性RNA(siRNA)。

术语“siRNA”是指诱导RNA干扰(RNAi)途径的小的抑制性RNA双链体(通常在18-30个碱基对之间)。通常，siRNA化学合成为21聚体，具有中心的19bp双链体区域和末端具有对称的2个碱基的3'突出端，尽管最近已描述了化学合成的25-30个碱基长的RNA双链体与相同位置21mers的双链体相比效能增加可达100倍。使用更长的RNA触发RNAi获得的观察到的效力增加理论上被认为是由于为Dicer提供了底物(27mer)而不是产物(21mer)而产生的，并且这提高了siRNA双链体进入RISC的速度或效率。

已发现3'突出端的位置影响siRNA的效力，反义链上具有3'突出端的不对称双链体通常比有义链上具有3'突出端的不对称双链体更有效。这可以归因于不对称链加载到RISC中，因为靶向反义转录物时观察到相反的功效模式。

预期用于抑制PTEN的示例性siRNA序列包括5'-GUUAGCAGAAACAAAAGGAGAUAUCAA-3'(SEQ ID NO：2；有义)；和5'-UUGAUAUCUCCUUUUGUUUCUGCUAAC-3'(SEQ ID NO：3；反义)；或5'-CAGCCGUUCGGAGGAUUAUUCGUCUTT-3'(SEQ ID NO：4；有义)；5'-AGACGAAUAAUCCUCCGAACGGCUGTT-3'(SEQ ID NO：5反义)。根据一个实施方案，抑制PTEN表达的siRNA包含核酸序列5'-GAGUUCUUCCACAAACAGAA-3'(SEQ ID NO：10；有义)。根据一个实施方案，抑制PTEN表达的siRNA包含核酸序列5'-UUCUGUUUGUGGAGAAGAACUC-3'(SEQ ID NO：11；反义)。根据一个实施方案，所述siRNA是包含SEQ ID NO：10和11的双链siRNA。

PTEN siRNA可靶向的一种示例性序列在SEQ ID NO：6(5'-GAGTTCTTCCACAAACAGAA-3')中列出。PTEN siRNA可以靶向的另一个示例性序列在SEQ IDNO：7(5'-GTATAGAGCGTGCAGATAA-3')中列出。

因此，根据一个实施方案，所述PTEN抑制剂是siRNA。根据一些实施方案，所述siRNA可具有改善进入囊泡或细胞的膜的多种修饰。

根据一个实施方案，所述siRNA包含选自SEQ ID NO：10、11、2、3、4和5的核酸序列。根据一个实施方案，所述PTEN抑制剂是具有序列SEQ ID NO：2和/或3的siRNA。根据另一个实施方案，所述PTEN抑制剂是具有序列SEQ ID NO：4和/或5的siRNA。根据一些实施方案，所述siRNA包含靶向SEQ ID NO：6的核酸序列。根据其他实施方案，所述siRNA包含靶向SEQ IDNO：7的核酸序列。根据一个实施方案，所述PTEN抑制剂是具有序列SEQ ID NO：10的siRNA。根据另一个实施方案，所述PTEN抑制剂是具有序列SEQ ID NO：11的siRNA。根据另一个实施方案，所述PTEN抑制剂是包含序列SEQ ID NO：10和11的双链siRNA。

根据另一个实施方案，PTEN抑制剂是siRNA，其是选自SEQ ID NO：10、11、2、3、4和5的核酸序列的变体。根据一个实施方案，所述变体与原始序列具有至少70％的序列同一性。根据另一个实施方案，所述变体与原始序列具有至少80％、85％或90％的序列同一性。根据一个实施方案，所述变体具有原始序列的活性。

术语“同源物”、“变体”、“DNA变体”、“序列变体”和“多核苷酸变体”在本文中可互换使用，是指与原始序列具有至少70％序列同一性的DNA多核苷酸或寡核苷酸。所述变体可以包括突变，例如缺失，添加或取代，从而使得突变不改变开放阅读框并且所述多核苷酸编码具有与亲本多核苷酸编码的肽或蛋白基本相似的结构和功能的肽或蛋白。根据一些实施方案，所述变体是保守变体。如本文所用，术语“保守变体”是指这样的变体，其中给定密码子位置的一个或多个核苷酸的改变并未导致该位置编码的氨基酸改变。因此，由保守变体编码的肽或蛋白与由亲本多核苷酸编码的肽或蛋白具有100％的序列同一性。根据一些实施方案，所述变体是编码作为亲本多核苷酸编码的蛋白的肽保守类似物的肽或蛋白的非保守变体。根据一些实施方案，所述变体与原始序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性。

根据另一个实施方案，所述siRNA是与编码PTEN的序列互补并抑制其表达和/或翻译的siRNA。根据一个实施方案，所述siRNA与选自SEQ ID NO：6和7的序列互补。根据一个实施方案，所述siRNA包含与编码PTEN蛋白的核酸的片段互补的序列并抑制其表达。根据一个实施方案，所述siRNA包含与编码SEQ ID NO：1的核酸的片段互补的序列。根据一个实施方案，这种siRNA与所述序列具有85％、88％、90％、92％、95％、98％、99％或100％的互补性。

应当理解，可以使用一种以上的siRNA试剂来下调靶基因。因此，例如，本发明考虑使用至少两种靶向PTEN的siRNA。

术语“具有”和“包含”也可以包含“由...组成”和“基本上由...组成”的含义，并且可以用这些术语代替。

可将双链干扰RNA(例如，siRNA)的链连接以形成发夹或茎环结构(例如，shRNA)。因此，如所提及的本发明的RNA沉默剂也可以是短发夹RNA(shRNA)。

如本文所用，术语“shRNA”是指具有茎环结构的RNA剂，其包含互补序列的第一和第二区域，所述区域的互补程度和方向足以使该区域之间发生碱基配对，第一和第二区域通过环区域连接，该环是由于环区域内核苷酸(或核苷酸类似物)之间缺乏碱基配对而导致的。所述环中核苷酸的数目是3至23、或5至15、或7至13、或4至9、或9至11之间的数字并包括它们。所述环中的一些合适可参与与环中其他核苷酸的碱基配对。可用于形成环的寡核苷酸序列的实例包括5'-UUCAAGAGA-3'(SEQ ID NO：8；)和5'-UUUGUGUAG-3'(SEQ ID NO：9)。本领域技术人员将认识到，所得的单链寡核苷酸形成茎环或发夹结构，其包含能够与RNAi机制相互作用的双链区。根据一些实施方案，所述shRNA包含核酸SEQ ID NO：2。根据其他实施方案，所述shRNA包含核酸SEQ ID NO：4。根据一个实施方案，shRNA包含核酸SEQ ID NO：2和3。根据另一个实施方案，所述shRNA包含核酸SEQ ID NO：4和5。根据一些实施方案，所述shRNA包含核酸SEQ ID NO：10或11。根据其他实施方案，所述shRNA包含核酸SEQ ID NO：10和11。

根据另一个实施方案，所述RNA沉默剂可以是miRNA。MiRNA是由编码各种大小的初级转录本的基因组成的小RNA。在动物和植物中都已发现它们。初级转录本(称为“pri-miRNA”)通过各种核酸水解步骤加工成较短的前体miRNA或“pre-miRNA”。pre-miRNA以折叠形式存在，因此最终的(成熟)miRNA以双链体形式存在，两条链被称为miRNA(最终将与靶碱基配对的链)。所述pre-miRNA是dicer底物的形式，dicer可从前体中除去miRNA双链体，此后，类似于siRNA，可将双链体放入RISC复合物中。已经证明miRNA可以被转基因表达并且通过前体形式而不是整个初级形式的表达是有效的。

与siRNA不同，miRNA仅部分互补地与转录物序列结合，并抑制翻译而不会影响稳态RNA水平。miRNA和siRNA均由Dicer加工，并与RNA诱导的沉默复合物的组分结合。假设通过miRNA途径相对于siRNA途径的基因调控仅取决于与目标转录本的互补程度。推测仅与mRNA靶标具有部分同一性的siRNA将在翻译抑制中起作用，类似于miRNA，而不是触发RNA降解。

应当理解，本发明的RNA沉默剂不必限于仅包含RNA的分子，而是还包括化学修饰的核苷酸和非核苷酸。

能够下调PTEN的另外的试剂包括核酶、DNA酶和CRISPR系统试剂(例如CRISPR/Cas)。

核酶正通过切割编码感兴趣蛋白的mRNA而越来越多地用于序列特异性的基因表达抑制。设计核酶以切割任何特定靶RNA的可能性使它们成为基础研究和治疗应用中的宝贵工具。在治疗领域，核酶已被用于靶向传染病中的病毒RNA、癌症中的主要致癌基因以及遗传疾病中的特定体细胞突变。最值得注意的是，针对HIV患者的几种核酶基因治疗方案已经在1期试验中。最近，核酶已用于转基因动物研究，基因靶标验证和途径阐明。几种核酶处于临床试验的不同阶段。

是人类临床试验中待研究的第一个化学合成的核酶。

特异性抑制血管生成途径中的一个关键组分VEGF-r(血管内皮生长因子受体)的形成。Ribozyme Pharmaceuticals，Inc.和其他公司已经证明了抗血管生成治疗剂在动物模型中的重要性。发现

—一种被设计选择性破坏丙型肝炎病毒(HCV)RNA的核酶，在细胞培养试验中可有效减少丙型肝炎病毒RNA(RibozymePharmaceuticals，Incorporated-WEB主页)。

能够下调PTEN的另一种试剂是RNA引导的核酸内切酶技术，例如CRISPR系统。

调节细胞中PTEN基因表达的另一种方法是通过三链体形成寡核苷酸(TFO)。研究表明，可以设计TFO使其能够以序列特异性方式识别并结合双链螺旋DNA中的聚嘌呤/聚嘧啶区域。寡核苷酸的修饰，例如插入剂的引入和主链的取代，以及结合条件(pH和阳离子浓度)的优化，有助于克服TFO活性的固有障碍，例如电荷排斥和不稳定性，并且最近发现合成寡核苷酸可以针对特定序列。

因此，对于PTEN中的任何给定序列，可以设计三链体形成序列。形成三链体的寡核苷酸的长度优选为至少15个，更优选为25个，再更优选为30个或更多个核苷酸，最高达50或100bp。

如上所述，本发明的细胞外囊泡可以直接装载抑制PTEN表达的多核苷酸或寡核苷酸试剂。

为了促进膜囊泡(例如外泌体)的装载，多核苷酸或寡核苷酸货物可包含一种或多种疏水修饰。与天然(未修饰的)RNA或DNA相比，疏水修饰增加了多核苷酸或寡核苷酸货物的疏水性。在某些实施方案中，相对于天然(未修饰的)RNA或DNA，所述疏水修饰使多核苷酸或寡核苷酸的疏水性增加至少两个数量级(例如，至少3、4、5、6、7、8、9、10或更多个数量级)。在其他实施方案中，相对于天然(未修饰的)RNA或DNA，所述疏水修饰使多核苷酸或寡核苷酸的疏水性增加至少10个数量级。在其他实施方案中，相对于未修饰的多核苷酸或寡核苷酸，所述疏水修饰使多核苷酸或寡核苷酸的疏水性增加至少两个数量级(例如，至少3、4、5、6、7、8、9、10或更多个数量级)。在其他实施方案中，相对于未修饰的多核苷酸或寡核苷酸，所述疏水修饰使多核苷酸或寡核苷酸的疏水性增加至少十个数量级。疏水性的增加可以使用任何合适的方法来评估。例如，疏水性可以通过测量在有机溶剂(例如辛醇)中的溶解度百分比与在水性溶剂(例如水)中的溶解度相比较来确定。

在一些实施方案中，可通过增加多核苷酸或寡核苷酸分子中被疏水修饰的核苷酸的比例来增加多核苷酸或寡核苷酸货物的疏水特性。例如，在一个实施方案中，寡核苷酸或多核苷酸分子中20％或更多的核苷酸被疏水修饰，例如寡核苷酸或多核苷酸分子中25％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多、95％或更多、99％或更多等等的核苷酸被疏水修饰。在一个实施方案中，寡核苷酸或多核苷酸分子中100％的核苷酸被疏水修饰。在一个示例性的实施方案中，寡核苷酸或多核苷酸分子中30％或更多的核苷酸含有疏水修饰。当例如疏水修饰是弱疏水性(例如2'O-甲基修饰)时，增加寡核苷酸或多核苷酸分子中的疏水修饰核苷酸的比例可能是有用的。在采用强疏水修饰的实施方案中，例如固醇，脂质等，单个疏水修饰足以促进外泌体装载。

在一些实施方案中，所述疏水修饰是共价修饰。核酸分子的疏水修饰可包括例如主链修饰，糖修饰，碱基修饰和/或缀合物修饰及其组合。

主链修饰涉及核酸分子中磷酸酯键的改变。合适的主链修饰的实例包括但不限于硫代磷酸酯修饰、二硫代磷酸酯修饰、对乙氧基修饰、甲基磷酸酯修饰、甲基硫代磷酸硫醚修饰、烷基和芳基磷酸酯(其中带电荷的磷酸酯氧被烷基或芳基取代)、烷基磷酸三酯(其中带电荷的氧部分被烷基化)、肽核酸(PNA)主链修饰、锁核酸(LNA)主链修饰等。这些修饰可以彼此结合和/或与磷酸二酯主链键结合使用。

在一个实施方案中，所述疏水修饰是硫代磷酸酯(PS)修饰，其中非桥连的磷酸氧原子之一被硫取代得到PS基团。这种修饰提供了对核酸酶降解的显著抗性并具有有利的药代动力学性质。使用标准技术，例如固相寡核苷酸合成，可以很容易地将PS键连接到寡核苷酸分子中。

在另一个实施方案中，所述疏水改性是磷酸酯修饰，其中一个非桥连氧被烷基取代。在其他实施方案中，所述疏水修饰是肽核酸(PNA)修饰。与天然RNA和DNA的高电荷糖磷酸主链相比，PNA是具有带中性电荷的肽主链的寡核苷酸模拟物(参见例如，在其他实施方案中，疏水修饰的核酸分子是二氨基磷酸吗啉代寡核苷酸(PMO))。

在其他实施方案中，寡核苷酸货物分子可以在糖部分(例如核糖，脱氧核糖等)上被疏水修饰。糖修饰经常发生在糖环的2'位置，其中例如2'部分可以被疏水部分例如卤素、烷氧基、氨基烷氧基、烷基、叠氮基或氨基修饰或取代。在非限制性实例中，糖修饰可以包括O-甲基、F、甲氧基-乙基和2'-氟-β-D-阿拉伯糖核苷酸(FANA)。其他2'修饰包括例如2'O-烯丙基、2'O-乙胺和2'O-氰基乙基修饰。另外，可以在其他位点进行修饰，包括糖的4'位。

在其他实施方案中，寡核苷酸货物分子可包含疏水性碱基修饰。在示例性的实施方案中，这些修饰包括苯基、萘基和异丁基。其他实施方案包括C-5丙炔基修饰的碱基、5-甲基胞嘧啶、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2，6-二氨基嘌呤和次黄嘌呤。

除了增加寡核苷酸货物的疏水性之外，前述的主链、糖和碱基修饰还增加粒子(例如外泌体)存在的情况下寡核苷酸的稳定性和使装载期间可能发生的任何降解最小化。

根据一些实施方案，RNA干扰寡核苷酸例如siRNA或shRNA包含疏水部分。疏水部分也可以化学缀合至寡核苷酸以增强其疏水特性。因此，在一个实施方案中，将RNA干扰寡核苷酸与疏水部分缀合。根据一个实施方案，所述疏水部分选自固醇、神经节苷脂、脂质、维生素、脂肪酸、肽及其组合。根据一个实施方案，所述RNA干扰寡核苷酸与固醇缀合。在示例性的实施方案中，该部分是固醇胆固醇分子，因此根据这样的实施方案，所述RNA干扰寡核苷酸与胆固醇缀合。根据一些实施方案，双链RNAi的一条链与疏水性分子例如胆固醇缀合。根据其他实施方案，双链RNAi的两条链与疏水性分子例如胆固醇缀合。根据其他实施方案，RNA干扰寡核苷酸与选自单唾液酸四己糖基神经节苷脂(GM1)、脂质、维生素、小分子、肽或其组合的分子缀合。在一些实施方案中，该部分是脂质。例如，在某些实施方案中，该部分是棕榈酰基。在一些实施方案中，该部分是固醇，例如胆固醇。另外的疏性部分包括例如磷脂、维生素D、维生素E、角鲨烯和脂肪酸。在另一个示例性的实施方案中，所述寡核苷酸货物与肉豆蔻酸或其衍生物(例如肉豆蔻酰化的寡核苷酸货物)缀合。在一些实施方案中，所述疏水部分在寡核苷酸载体的末端缀合(即，“末端修饰”)。在其他实施方案中，所述疏水部分与寡核苷酸分子的其他部分缀合。

根据一些特定的实施方案，所述PTEN抑制剂是siRNA分子，其包含选自SEQ ID NO：10、11、2、3、4和5的核酸序列，并与疏水性分子例如胆固醇缀合。根据一些实施方案，所述siRNA包含靶向于选自SEQ ID NO：6和7的核酸序列的核酸序列，并与疏水性分子例如胆固醇缀合。根据一些实施方案，所述siRNA包含靶向于选自SEQ ID NO：6和7的核酸序列的核酸序列，并与疏水性分子例如胆固醇缀合。根据一个实施方案，所述PTEN抑制剂是与胆固醇缀合的具有序列SEQ ID NO：10的siRNA。根据另一个实施方案，所述PTEN抑制剂是双链siRNA，其包含与胆固醇以及SEQ ID NO：11缀合的序列SEQ ID NO：10。根据特定的实施方案，所述siRNA包含与编码PTEN蛋白的核酸的片段互补的序列，并抑制其表达，并且其中siRNA的至少一个序列与疏水性分子例如胆固醇缀合。根据一个实施方案，PTEN蛋白包含SEQ ID NO：1。

在特定的实施方案中，所述寡核苷酸通过掺入本文所述的一种或多种主链修饰、糖修饰和/或碱基修饰并另外与疏水部分缀合而稳定。例如，在某些实施方案中，所述寡核苷酸至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％或更多的核苷酸可包含一种或多种主链修饰、糖修饰和/或碱基修饰，并且进一步与本文所述的疏水部分缀合，例如与固醇、GM1、脂质、维生素、小分子缀合物、或肽，或其组合缀合。在一个示例性的实施方案中，所述寡核苷酸货物与固醇例如胆固醇缀合。在另一个示例性的实施方案中，所述寡核苷酸货物与GM1缀合。在另一个示例性的实施方案中，所述寡核苷酸货物与肉豆蔻酸或其衍生物缀合。

在一些实施方案中，疏水修饰的寡核苷酸可包括可检测标记。示例性的标记包括荧光标记和/或放射性标记。在疏水修饰的寡核苷酸被荧光标记的实施方案中，可检测标记可以是例如Cy3。向疏水修饰的寡核苷酸添加可检测标记可用作标记外泌体并追踪其生物分布的方式。在其他实施方案中，可检测标记可以例如通过标记外泌体脂质和/或外泌体肽而直接与外泌体连接。

可以使用本领域已知的许多方法来合成核酸。为此目的，许多自动核酸合成仪是可商购的。在一些实施方案中，核酸货物是合成的寡核苷酸。在其他实施方案中，可以使用例如限制酶、核酸外切酶或核酸内切酶来制备核酸。

根据上述任一个实施方案，根据本发明的药物组合物还包含软骨素酶ABC裂解酶。

软骨素ABC裂解酶(EC 4.2.2.4，软骨素酶，软骨素ABC消除酶，软骨素酶ABC)是一种系统命名为软骨素ABC裂解酶的酶。该酶催化以下化学反应：

含1,4-β-D-己糖基和1,3-β-D-葡萄糖醛糖基或1,3-α-L-异壬糖基键的多糖的消除性降解为含4-脱氧-β-D-葡萄糖-4-神经糖基的二糖。在一个实施方案中，软骨素酶ABC裂解酶源自寻常变形杆菌(Proteus vulgaris)。

软骨素酶ABC可以本身作为蛋白提供，也可以以载体例如粒子的形式提供(如上所述)。根据一个实施方案，所述药物组合物包含装载有外源PTEN抑制剂和软骨素酶ABC作为蛋白的细胞外囊泡。根据另一个实施方案，所述药物组合物包含在相同类型的细胞外囊泡(例如，间充质干细胞来源的外泌体)中，装载有外源PTEN抑制剂和装载有软骨素酶ABC的细胞外囊泡。根据另外的实施方案，所述药物组合物包含装载有外源PTEN抑制剂的细胞外囊泡和装载有软骨素酶ABC的其他的不同的细胞外囊泡。根据一些实施方案，不同的细胞外囊泡可以是相同类型(例如，间充质干细胞来源的外泌体)或不同类型的(源自不同细胞来源的细胞外囊泡，例如PTEN抑制剂包含在间充质干细胞来源的外泌体中，或软骨素酶ABC为包含在源自牙髓的外泌体中，反之亦然)。

根据一些实施方案，所述药物组合物还包含可用于治疗神经系统疾病的另外的治疗剂。此类活性剂的非限制性实例是神经节苷脂；抗生素、神经递质、神经激素、毒素、神经突促进分子；以及抗代谢物的小分子药物和神经递质分子的前体，例如L-DOPA。另外或替代地，另外的治疗剂是能够减轻神经系统疾病的至少一种症状的细胞。

如本文所用，术语“药物组合物”是指包含与一种或多种药学上可接受的载体一起配制的装载有外源PTEN抑制剂的膜囊泡(特别是诸如胞外泌体的细胞外囊泡)的组合物。

可以根据应用调整药物组合物的制剂。特别地，可以使用本领域已知的方法配制药物组合物，以便在施用给哺乳动物后提供活性成分的快速、连续或延迟释放。例如，所述制剂可以是选自下列任何一种：膏药、颗粒剂、洗剂、搽剂、柠檬水、芳香水、粉末、糖浆、眼药膏、液体和溶液、气雾剂、喷雾剂、提取物、酏剂、软膏剂、流体提取物、乳剂、混悬剂、汤剂、输液剂、眼药水、片剂、栓剂、注射剂、酒精剂、胶囊剂、乳膏剂、锭剂、酊剂、糊剂、丸剂和软或硬明胶胶囊。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”是指与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、防腐剂、抗氧化剂、包衣、等渗和吸收延迟剂、表面活性剂、填充剂、崩解剂、粘合剂、稀释剂、润滑剂、助流剂、pH调节剂、缓冲剂、增强剂、湿润剂、增溶剂、表面活性剂、抗氧化剂等。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域公知的。所述组合物可以包含提供补充、附加或增强的治疗功能的其他活性化合物。固体载体或赋形剂，例如乳糖、淀粉或滑石，或液体载体，例如水、脂肪油或液体石蜡。所述载体的其他实例包括培养基，例如DMEM或RPMI；和低温存储介质，包含清除自由基、提供pH缓冲、渗透/渗透支持、能量底物和离子浓度的组分，这些组分可平衡低温下的细胞内状态；以及有机溶剂与水的混合物。

赋形剂的实例包括但不限于白蛋白、血浆、血清和脑脊髓液(CSF)、抗氧化剂例如N-乙酰半胱氨酸(NAC)或白藜芦醇。通常，所述药物载体使粒子数目和PTEN抑制剂的活性在组合物中保持至少24小时、至少48小时或甚至至少96小时(例如，该量减少不超过90％)。

根据上述任一个实施方案，所述药物组合物被配制成用于通过选自鼻内、病变内、鞘内、静脉内、肌内、皮下、舌下、口服和脑内施用途径的施用途径用于施用。根据一个实施方案，所述药物组合物被配制用于鼻内施用。根据一些实施方案，这种药物组合物为液体溶液，滴鼻剂，喷雾剂，定量喷雾(measured stray)形式。根据其他实施方案，所述药物组合物配制成用于注射的制剂，例如病变内、鞘内或静脉内注射。根据这种实施方案，所述药物组合物为无菌注射溶液的形式。

根据一些实施方案，本发明提供了一种药物组合物，其包含装载有外源磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)抑制剂的细胞外囊泡，其中所述细胞外囊泡源自细胞。根据一个实施方案，所述EV选自外泌体、微囊泡及其组合。根据另一个实施方案，所述细胞外囊泡是外泌体。根据一些实施方案，所述细胞外囊泡源自MSC。根据一个实施方案，所述PTEN抑制剂是PTEN表达的抑制剂。根据另一个实施方案，所述PTEN表达的抑制剂是siRNA。根据另一个实施方案，所述PTEN表达的抑制剂是shRNA。根据一些实施方案，所述siRNA包含选自SEQ IDNO：10、11、2、3、4和5的核酸序列。根据一个实施方案，所述PTEN抑制剂是包含核酸SEQ IDNO：10的siRNA。根据另一个实施方案，所述PTEN抑制剂是包含序列SEQ ID NO：10和SEQ IDNO：11的双链siRNA。根据一些实施方案，所述siRNA包含靶向SEQ ID NO：6的核酸序列。根据其他实施方案，所述siRNA包含靶向SEQ ID NO：7的核酸序列。根据一个实施方案，所述siRNA包含与编码PTEN蛋白的核酸的片段互补的序列，并抑制其表达。根据一个实施方案，所述siRNA包含与编码SEQ ID NO：1的核酸的片段互补的序列。根据一些实施方案，所述siRNA与胆固醇缀合。根据一些实施方案，本发明提供了一种药物组合物，其包含选自外泌体、微囊泡或其组合的细胞外囊泡，其中该囊泡装载有能够抑制PTEN表达的siRNA分子并与胆固醇缀合。根据这种实施方案，所述siRNA具有核酸序列SEQ ID NO：2和3。根据其他这种实施方案，所述siRNA具有核酸序列SEQ ID NO：4和5。根据另一个这种实施方案，所述PTEN抑制剂是包含序列SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11的双链siRNA。根据一些实施方案，所述siRNA包含靶向SEQ ID NO：6的核酸序列。根据其他实施方案，所述siRNA包含靶向SEQ IDNO：7的核酸序列。根据一个实施方案，所述siRNA包含与编码SEQ ID NO：1的核酸的片段互补的序列。根据一些实施方案，所述药物组合物配制成鼻内施用。根据另一个实施方案，所述药物组合物配制成病变内施用。根据另一个实施方案，所述药物配制成口服施用。根据一些实施方案，所述药物组合物与软骨素酶ABC共同施用。

根据一个实施方案，本发明提供了一种药物组合物，其包含选自外泌体、微囊泡及其组合的细胞外囊泡，其中所述细胞外囊泡装载有能够抑制PTEN表达的siRNA或shRNA，并且其中所述药物组合物被配制用于鼻内或鞘内施用。根据一个实施方案，所述siRNA或shRNA与胆固醇缀合。根据一个实施方案，所述PTEN抑制剂是双链siRNA，其包含任选地与胆固醇缀合的序列SEQ ID NO：10，和SEQ ID NO：11或其变体。根据另一个实施方案，所述siRNA或shRNA包含核酸序列SEQ ID NO：2和/或3，或其变体。根据另一个实施方案，所述siRNA或shRNA包含核酸序列SEQ ID NO：4和/或3，或其变体。

根据上述任何一个实施方案，本发明的药物组合物可用于治疗神经系统疾病、病症、损伤或病状。根据一个实施方案，所述神经系统疾病是脊髓损伤。

根据一个实施方案，所述膜囊泡是脂质体。因此，根据一个实施方案，本发明提供了一种药物组合物，其包含装载有外源磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)抑制剂的脂质体。术语“脂质体”是指具有被脂质双层包围的内相的微观闭合囊泡。脂质体可以是小的单膜脂质体，例如小的单层囊泡(SUV)，大的单膜脂质体，例如大的单层囊泡(LUV)，还可以是更大的单膜脂质体，例如大的单层囊泡(GUV)，具有多个同心膜的多层脂质体，例如多层囊泡(MLV)，或具有不规则且非同心的多个膜的脂质体，例如多囊泡(MVV)。根据一个实施方案，所述脂质体是SUV。根据其他实施方案，所述脂质体是MLV。

根据一个实施方案，所述脂质体是SUV。根据其他实施方案，所述脂质体是MLV。根据一个实施方案，所述脂质体包含形成脂质体的脂质，该脂质选自磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、鞘氨醇磷脂、二硬脂酰基及其任何组合。根据另一个实施方案，所述形成脂质体的脂质是磷脂酰胆碱。根据一个实施方案，所述磷脂酰胆碱是氢化的大豆磷脂酰胆碱(HSPC)。根据其他实施方案，所述磷脂酰乙醇胺为1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)，并且所述二硬脂酰基为二硬脂酰基乙二醇(DSG)或氧羰基-3-氨基-1,2-丙二醇二硬脂酰基酯(DS)。根据另一个实施方案，所述脂质体包含稳定的聚合物分子，例如聚烷基醚、聚唾液酸、聚乳酸和聚乙醇酸。根据一个实施方案，所述脂质体包含PEG。根据一些实施方案，所述脂质体还包含胆固醇。

根据一个实施方案，所述脂质体装载有PTEN抑制剂。与PTEN抑制剂有关的所有术语和实施方案在本文中均适用。根据一个实施方案，所述PTEN抑制剂是PTEN表达的抑制剂。根据一些实施方案，所述PTEN表达的抑制剂是RNA干扰(RNAi)寡核苷酸。根据一个实施方案，所述RNAi寡核苷酸选自siRNA和shRNA。根据另一个实施方案，所述siRNA包含选自SEQID NO：10、11、2、3、4和5的核酸序列。根据一些实施方案，所述siRNA包含靶向SEQ ID NO：6的核酸序列。根据其他实施方案，所述siRNA包含靶向SEQ ID NO：7的核酸序列。根据另一个实施方案，所述RNAi寡核苷酸如siRNA或shRNA与疏水部分缀合。根据又一个实施方案，所述疏水部分选自固醇、神经节苷脂、脂质、维生素、脂肪酸、疏水肽及其组合。根据一个实施方案，所述siRNA或所述siRNA与胆固醇缀合。

根据本发明的教导，本发明的药物组合物用于治疗受试者的神经系统疾病、病症或病状。因此，根据一些实施方案，所述药物组合物包含装载有外源磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)抑制剂的粒子，用于治疗有需要的受试者的神经系统疾病、病症或病状。根据一些实施方案，所述粒子是膜囊泡。根据一些优选的实施方案，所述膜囊泡是细胞外囊泡。

因此，根据一些实施方案，本发明提供了一种药物组合物，其包含装载有外源磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)抑制剂的细胞外囊泡，用于治疗有需要的受试者的神经系统疾病、病症或病状。

术语“神经系统疾病、病症或病状”是指脑、脊柱和/或连接它们的神经的疾病、病症或病状。

根据一个特定的实施方案，该病状是由于伤害引起的。根据一个实施方案，所述损伤是脊髓损伤，即脊髓损伤(SCI)。根据其他实施方案，所述神经系统疾病、病症或病状是神经元损伤。

术语“脊髓损伤”和“SCI”在本文中可互换使用，是指对脊髓的损伤。根据一个实施方案，所述损伤是创伤的结果。根据另一个实施方案，所述损伤或损害是变性或疾病的结果。根据脊髓和神经根受损的位置，症状可能会大范围变化，例如，从疼痛到瘫痪再到大小便失禁。脊髓损伤被描述为各种程度的“不完全”，从对患者无影响到意味着功能完全丧失的“完全”损伤。脊髓损伤有很多原因，但通常与机动车事故、跌倒、运动损伤和暴力引起的重大创伤有关。因此，根据一个实施方案，SCI选自完整和不完整的SCI。根据一些实施方案，所述脊髓损伤选自急性或慢性SCI。所述脊髓损伤可能易受继发性组织损伤的影响，包括但不限于：胶质瘢痕形成、髓鞘抑制、脱髓鞘、细胞死亡、缺乏神经营养支持、局部缺血、自由基形成和兴奋性毒性。

所述脊髓疾病包括但不限于自身免疫疾病(例如多发性硬化症)、炎性疾病(例如蛛网膜炎)、神经退行性疾病、脊髓灰质炎、脊柱裂和脊髓肿瘤。

可以根据本发明的教导治疗的对象包括哺乳动物对象，例如人、小鼠、大鼠、猴子、狗和猫。在一个实施方案中，所述受试者是人类受试者。

术语“治疗”病状或患者是指采取步骤以获得有益或期望的结果，包括临床结果。有益或期望的临床结果包括但不限于或消除、基本上抑制、减慢或逆转疾病、病状或病症的进展，基本上改善或减轻某种病状的临床或美学症状，基本上防止疾病，病状或病症的临床或审美症状，和避免有害或令人讨厌的症状。治疗还指完成以下一项或多项：(a)减轻病症的严重程度；(b)限制在治疗的病症的特征性症状的发展；(c)限制正治疗的病症的特征性症状的恶化；(d)限制先前患有该病症的患者中该病症的复发；和/或(e)限制以前无该病症症状的患者的症状复发。根据一些实施方案，术语“治疗”包括受伤时的神经再生、轴突增生、星形胶质细胞增生和小胶质细胞增生减少。根据其他实施方案，该术语涵盖与疾病或病状相关的症状的改善。根据一个实施方案，术语“治疗”包括运动参数的改善。根据一个实施方案，运动参数的改善包括与未治疗的受试者相比运动参数改善20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。根据一些实施方案，治疗包括在受伤时减少星形胶质细胞增生和/或小胶质细胞增生。根据一个实施方案，与未治疗的受试者相比，减少星形胶质细胞增生和/或小胶质细胞增生包括减少星形胶质细胞增生和/或小胶质细胞增生的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％。

可以使用任何已知方法来施用本发明的药物组合物。可以使用本领域技术人员已知的多种方法之一来对受试者实施术语“给予”或“施用”物质、化合物或药剂。例如，化合物或药剂可以鼻内(例如，通过吸入)、鞘内(进入椎管内或蛛网膜下腔内)、动脉内、皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、眼、舌下、口服(通过摄入)、大脑内和透皮(通过吸收，例如通过皮肤导管)施用。化合物或试剂还可以通过可再充电或可生物降解的聚合装置或其他装置(例如贴剂和泵或制剂)适当地引入，所述装置为化合物、试剂提供延长、减慢或受控释放。也可以例如一次，多次和/或在一个或多个延长的时期内进行施用。根据一些实施方案，所述组合物每天1、2、3、4、5或6次施用。根据其他实施方案，所述组合物每月1、2、3、4、5或6次施用。在一些实施方案，所述施用包括直接施用(包括自我施用)和间接施用(包括处方药物的行为)。例如，如本文中所使用的，指示患者自我施用药物或由另一人施用药物和/或向患者提供药物处方的医师正在向患者施用药物。根据一个实施方案，本发明的药物组合物通过鼻内施用。根据另一个实施方案，本发明的药物组合物在病变内施用。根据一个实施方案，所述药物组合物口服施用。

根据一个具体实施方案，所述神经系统疾病是神经系统的退行性疾病。根据一个实施方案，所述神经系统的退行性疾病选自帕金森氏病、原发性震颤、亨廷顿氏病、阿尔茨海默氏病、多发性硬化症、ALS和器质性精神病。根据一个实施方案，所述疾病是记忆疾病。在一个实施方案中，所述疾病是一种神经发育障碍，例如自闭症或精神分裂症。根据另一个实施方案，所述疾病是行为疾病，例如精神分裂症、注意力缺陷多动障碍、自闭症、图雷特氏综合症、强迫症以及与神经行为相关的症状。根据一个特定的实施方案，所述神经系统疾病是自闭症谱系障碍(ASD)。

根据上述任何一个实施方案，本发明提供了药物组合物，其包含装载有外源磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)抑制剂的膜囊泡，用于治疗受试者的神经元损伤或损害。根据一些实施方案，所述神经元损伤是脊髓损伤。根据另一个实施方案，所述损害是对脑部神经细胞的损害。根据一个实施方案，所述损伤是脑损伤。根据另一个实施方案，所述损伤是由于神经退行性疾病引起的。根据另一个实施方案，所述神经退行性疾病选自帕金森氏病、原发性震颤、亨廷顿氏病、阿尔茨海默氏病、多发性硬化症、ALS和器质性精神病。

因此，根据一些实施方案，本发明提供了药物组合物，其包含装载有外源磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)抑制剂的细胞外囊泡，用于治疗受试者的神经元损伤或损还，其中所述细胞外囊泡源自细胞。

根据一个实施方案，所述细胞外囊泡是外泌体。根据另一个实施方案，所述EV是微囊泡。根据一个实施方案，所述EV选自外泌体、微囊泡及其组合。根据一些实施方案，所述细胞外囊泡衍生自MSC。根据一个实施方案，所述外源PTEN抑制剂是PTEN表达的抑制剂。根据另一个实施方案，所述PTEN表达的抑制剂是siRNA或shRNA。根据一些实施方案，所述siRNA包含选自SEQ ID NO：10、11、2、3、4和5的核酸序列。根据一个实施方案，所述siRNA互补或靶向于选自SEQ ID NO：6和7的序列。根据一个实施方案，所述siRNA包含与编码PTEN蛋白的核酸的片段互补的序列，并抑制其表达。根据一个实施方案，所述PTEN包含SEQ ID NO：1。根据一个实施方案，所述PTEN抑制剂是包含核酸序列10的siRNA。根据另一个实施方案，所述PTEN抑制剂是包含序列SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11的双链siRNA。根据另一个实施方案，所述PTEN抑制剂是包含选自SEQ ID NO：10、11、2、3、4和5的核酸序列的shRNA。根据一个实施方案，所述shRNA靶向或互补于选自SEQ ID NO：6和7的序列。根据一些特定的实施方案，所述shRNA与胆固醇缀合。

根据一些实施方案，本发明提供了药物组合物，其包含选自外泌体、微囊泡或其组合的EV，所述EV装载有能够抑制PTEN表达并缀合胆固醇的siRNA寡核苷酸，用于治疗脊髓损伤。根据这种实施方案，所述siRNA具有选自SEQ ID NO：10、11、2、3、4和5的核酸序列。根据一个实施方案，所述siRNA包含序列SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11。根据一些实施方案，所述药物组合物经鼻内施用。根据另一个实施方案，所述药物组合物在病变内施用。根据另一个实施方案，所述药物组合物口服施用。

根据上述任一个实施方案，所述治疗包括将本发明的药物组合物与软骨素酶ABC裂解酶共同施用。

在一个实施方案中，将编码软骨素酶ABC裂解酶的多核苷酸提供给患者(即，通过基因疗法)。在下文中进一步描述了表达软骨素酶ABC裂解酶的表达构建体。可以将编码软骨素酶ABC裂解酶的多核苷酸上载到粒子中。在另一个实施方案中，所述酶本身提供给患者。

在一个特定的实施方案中，PTEN抑制剂和软骨素酶ABC两者共同配制在相同粒子中。在另一个实施方案中，PTEN抑制剂和软骨素酶ABC以相同的粒子类型(例如，间充质干细胞来源的外泌体)装载，但粒子本身不相同。在另一个实施方案中，PTEN抑制剂和软骨素酶ABC以不同的粒子类型装载(例如，PTEN抑制剂包含在源自间充质干细胞的外泌体中，而软骨素酶ABC包含在源自牙髓的外泌体中，反之亦然)。

根据一些实施方案，所述用途还包括与可用于治疗神经系统病症的治疗剂共同施用，例如神经节苷脂；抗生素、神经递质、神经激素、毒素、神经突促进分子；以及抗代谢物的小分子药物和神经递质分子的前体(例如L-DOPA)，或与能够减轻神系统经病至少一种症状的细胞。

根据一些实施方案，装载有外源磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)抑制剂的粒子是如上文所定义的脂质体。因此，根据一些实施方案，本发明提供了包含装载有PTEN抑制剂的外泌体的药物组合物，用于治疗有需要的受试者的神经系统疾病、病症或病状。根据一些实施方案，所述病状是脊髓损伤。

根据另一方面，本发明提供了一种治疗有需要的受试者的神经元损伤、损害性疾病或病症的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的装载有外源磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)抑制剂的膜囊泡，从而治疗损伤、损害性疾病或病症。上面实施方案和方面的所有术语在此也适用。根据一些实施方案，所述膜囊泡是细胞外囊泡，如上所述。

本发明的膜囊泡可以使用上文定义的多种施用途径施用于待治疗个体，包括移植方法，移植方法的性质取决于植入部位。

术语或短语“移植”、“细胞置换”或“移植”注射在本文中可互换使用，是指将本发明的粒子引入靶组织，例如脑、灰质等。从中获得粒子的间充质干细胞可以源自受体(同种异体的)或非同种异体的或异种的供体。

可以将膜囊泡直接(通过鞘内)移植到脊髓中、静脉内、直接移植入脑部或使其到达脑部的它们的组合。在一个实施方案中，上述粒子是非侵入性地递送的，例如鼻内。还可以考虑其他施用方式，例如全身施用。

对于70kg的人，每次治疗可施用(例如鼻内)的膜囊泡(例如外泌体)的示例剂量可以在1x 106-1x 1020之间或在1x 109-1x 1015之间。

当将膜囊泡施用于受试者时，其术语“治疗有效量”将具有预期的治疗作用，例如治疗神经元损伤，如脊髓损伤。一次剂量施用未必产生完全的治疗效果，可能仅在一系列剂量施用后才产生。因此，可以一次或多次施用来施用治疗有效量。受试者所需的确切有效量将取决于例如受试者的尺寸、健康状况和年龄、认知障碍的性质和程度，选择用于施用的疗法或疗法组合，以及施用方式。技术人员可以通过常规实验容易地确定给定情况的有效量。

根据一些实施方案，鼻内、病变内、肠胃外、局部、全身或口服施用膜囊泡，例如EV。

本文所述的活性成分的毒性和治疗功效可以体外在细胞培养或实验动物中通过标准药学方法来确定。

从这些体外和细胞培养方法以及动物研究中获得的数据可用于制定一系列用于人类的剂量。可以从临床研究中获得更多信息—参见例如，Salem HK等，Stem Cells 2010；28:585-96；和Uccelli等，Lancet Neurol.2011；10:649-56)。

剂量可以根据所采用的剂型和所采用的施用途径而变化。各个医师可以根据患者的病状选择确切的制剂、施用途径和剂量。

对于注射剂，可以将药物组合物的活性成分配制成水溶液，优选配制成生理相容的缓冲液，例如汉克溶液、林格氏溶液或生理盐缓冲液以及如上所述的其他试剂。

剂量和间隔可以分别调整到足以有效治疗神经系统疾病的活性成分水平。实现所需效果所需的剂量将取决于个体特征和施用途径。

取决于待治疗病症的严重性和反应性，粒子的剂量可以是一次或多次施用，治疗过程持续数天至数周或数月，具体取决于何时实现减轻疾病状态。

粒子的施用量当然取决于所治疗的个体、患病的严重程度、施用方式、处方医生的判断等。施用的剂量和时间对个体不断变化的病状进行仔细持续的监控。

施用后，可以追踪粒子以确保它们已经到达目标部位。例如，这可以使用金纳米粒子进行-参见WO 2013/186735 A3。

根据一些实施方案，本发明提供了装载有外源磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)抑制剂的细胞外囊泡，用于制备用于治疗有需要的受试者的神经系统疾病、病症或病状的药物。根据一些实施方案，所述细胞外囊泡是分离的细胞外囊泡。根据一个实施方案，所述神经系统疾病是脊髓损伤。

根据另一个方面，本发明提供了装载有外源磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)抑制剂的脂质双层磷脂膜囊泡。根据一些实施方案，所述膜囊泡是分离的细胞外囊泡。

因此，根据一些实施方案，本发明提供了装载有外源磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)抑制剂的细胞外囊泡，其中细胞外囊泡源自细胞。根据一个实施方案，所述细胞外囊泡选自细胞外囊泡、脂质体，核外粒体和转移体。根据一个实施方案，所述细胞外囊泡选自外泌体、微囊泡及其组合。根据一个实施方案，所述EV是外泌体。根据一个实施方案，所述EV是微囊泡。根据一个实施方案，所述微囊泡的直径为100至1000nm、120至800nm、150至600nm、200至400nm。根据另一个实施方案，所述微囊泡的尺寸为100至300nm或150至250nm。根据一些实施例，所述EV的直径为30至250nm或50至200nm。根据一些实施例，所述EV的直径为70至170nm或80至150nm。

根据上述任何一个实施方案，所述EV源自细胞。根据一个实施例，EV例如外泌体源自表达间充质标志物的细胞。根据一个实施方案，所述细胞是贴壁细胞。根据一些实施方案，所述细胞选自间充质干细胞、口腔粘膜干细胞和嗅鞘细胞。根据一些实施方案，所述细胞是间充质干细胞(MSC)。根据一个实施方案，所述间充质干细胞起源于选自以下的部位：骨髓、脂肪组织、脐带、牙髓、口腔粘膜、外周血和羊水。根据一些实施方案，所述EV源自起源于骨髓的MSC。根据其他实施方案，所述EV源自起源于脂肪组织的MSC。根据一些这样的实施方案，所述EV选自外泌体、微囊泡及其组合。根据一些实施方案，所述细胞表达CD105、CD166、CD29、CD90和CD73标记。根据另一个实施方案，上述细胞表达CD105、CD166、CD29、CD90和CD73，并且不表达CD34、CD45和CD133。根据一些实施方案，所述细胞选自牙髓干细胞(DPSC)、脱落的乳牙干细胞(SHED)，牙周膜干细胞(PDLSC)，牙根尖乳头干细胞(SCAP)和牙囊祖细胞(DFPC)。

所述EV可具有间充质干细胞的至少一种性质。所述粒子可以具有生物学性质，例如生物学活性。所述粒子可以具有MSC的任何生物学活性。所述粒子可以例如具有MSC的治疗或恢复活性。

根据一些实施方案，所述EV源自表达来自神经嵴细胞(NCC)的标志物的细胞。根据一个实施方案，所述细胞是神经嵴细胞。根据一些实施方案，神经嵴细胞是颅神经嵴细胞。根据一个实施方案，所述颅神经嵴细胞选自牙髓干细胞(DPSC)、脱落的乳牙干细胞(SHED)、牙周膜干细胞(PDLSC)、牙根尖乳头干细胞(SCAP)和牙囊祖细胞(DFPC)。根据另一个实施方案，细胞表达如上定义的间充质标志物。

根据上述任何一个实施方案，所述EV分离自细胞。因此，根据一些实施方案，所述EV是分离的EV，例如分离的外泌体和/或分离的微囊泡。根据一个实施方案，所述EV与残余亲代细胞的比率比初始材料时高至少2、3、4、5、6、8或10倍，或者在某些有利的实施方案中至少高出50、100或1000倍。材料。根据一些实施例，所述EV是无细胞的EV。

所述EV可以通过多种方式生产或分离。这样的方法可以包括从间充质干细胞(MSC)或神经嵴细胞(NCC)分离EV。根据一些实施方案，分离的细胞外囊泡是无细胞的。

根据上述任一个实施方案，所述细胞外囊泡包含如以上任一个方面和实施方案中所定义的PTEN抑制剂。根据一个实施方案，所述细胞外囊泡装载有PTEN抑制剂。根据一个实施方案，分离的细胞外囊泡装载有所述PTEN抑制剂。根据一个实施方案，所述PTEN抑制剂抑制或下调PTEN活性。根据另一个实施方案，所述PTEN抑制剂抑制或下调PTEN表达。

根据一个实施方案，所述外源PTEN抑制剂是蛋白或肽。根据另一个实施方案，所述外源PTEN抑制剂是小分子。根据一些实施方案，所述外源PTEN抑制剂是PTEN表达的抑制剂。根据一个实施方案，所述PTEN表达的外源抑制剂是多核苷酸试剂或寡核苷酸试剂。根据另一个实施方案，所述外源PTEN抑制剂是RNA干扰寡核苷酸。根据一个实施方案，所述RNA干扰寡核苷酸是siRNA。根据另一个实施方案，所述RNA干扰寡核苷酸是shRNA。根据一个实施方案，PTEN抑制剂是siRNA。根据一个实施方案，所述siRNA具有选自SEQ ID NO：10、11、2、3、4和5的核酸序列。根据一个实施方案，所述PTEN抑制剂是具有序列SEQ ID NO：10的siRNA。根据另一个实施方案，所述PTEN抑制剂是包含序列SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11的双链siRNA。根据一个实施方案，所述siRNA包含与编码PTEN蛋白的核酸的片段互补的序列，并抑制其表达。根据一个实施方案，所述siRNA包含与编码SEQ ID NO：1的核酸的片段互补的序列。因此，根据一个实施方案，用具有核酸序列SEQ ID NO：2和3或SEQ ID NO：4和5的siRNA装载细胞外囊泡。根据某些实施方案，用具有SEQ ID NO：10和11的核酸序列的siRNA装载分离的细胞外囊泡。根据一个实施方案，上述siRNA包含一种序列，该序列是选自SEQ ID NO：10、11、2、3、4和5的核酸序列的变体，并且具有与原始序列至少80％的序列同一性。根据另一个实施方案，所述分离的细胞外囊泡装载有包含SEQ ID NO：10和11的核酸序列的shRNA。根据一个实施方案，所述shRNA包含SEQ ID NO：2和3的核酸序列。根据另一个实施方案，所述shRNA包含核酸序列SEQ ID NO：4和5。根据另一个实施方案，所述siRNA包含与序列SEQID NO：6或7互补的核酸。根据又一个实施方案，所述shRNA包含选自SEQ ID NO：8和9的序列。根据一些实施方案，所述寡核苷酸抑制剂，例如siRNA或shRNA，包含疏水部分。根据一些实施方案，所述疏水部分是固醇、神经节苷脂、脂质、维生素、脂肪酸、肽或其组合。根据一个实施方案，所述固醇为胆固醇。

根据一个特定的实施方案，本发明提供了源自间充质干细胞的分离的外泌体，其装载有抑制PTEN表达的siRNA分子。根据一个实施方案，所述siRNA包括，例如与胆固醇部分缀合。根据一个实施方案，所述siRNA包含选自SEQ ID NO：10、11、2、3、4和5的核酸序列并与胆固醇缀合。根据另一个实施方案，所述siRNA包含核酸序列SEQ ID NO：10和11。根据一些实施方案，所述siRNA包含靶向SEQ ID NO：6的核酸序列并与胆固醇缀合。根据其他实施方案，所述siRNA包含靶向SEQ ID NO：7的核酸序列并与胆固醇缀合。

根据一些实施方案，装载有外源磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)抑制剂的分离的细胞外囊泡可用于治疗神经系统疾病、病症、损害或病状。根据一个实施方案，所述神经系统疾病是脊髓损伤。因此，根据一个实施方案，本发明提供了用于治疗脊髓损伤的细胞外囊泡，其中所述膜囊泡装载有外源磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)抑制剂。根据一个特定的实施方案，所述神经系统疾病是神经系统的退行性疾病。根据一个实施方案，所述神经系统的退行性疾病选自帕金森氏病、原发性震颤、亨廷顿氏病、阿尔茨海默氏病、多发性硬化症、ALS和器质性精神病。根据一个实施方案，所述疾病是记忆疾病。在一个实施方案中，所述疾病是一种神经发育障碍，例如自闭症或精神分裂症。根据另一个实施方案，所述疾病是行为疾病，例如精神分裂症、注意力缺陷多动障碍、自闭症、图雷特氏综合症、强迫症以及与神经行为相关的症状。

根据一些实施方案，所述细胞外囊泡还包含软骨素酶ABC或编码其的多核苷酸。根据另一个实施方案，装载有PTEN抑制剂的EV还包含软骨素酶ABC或编码其的多核苷酸。

根据一些实施方案，本发明提供了包含根据上述任一个实施方案的分离的细胞外囊泡的药物组合物。根据一些实施方案，所述药物组合物用于治疗神经系统疾病、病症、损害或病状。根据一个实施方案，所述药物组合物用于治疗脊髓损伤。

根据一些实施方案，膜囊泡是脂质体。根据一个实施方案，所述脂质体是SUV。根据其他实施方案，所述脂质体是MLV。根据一个实施方案，所述脂质体包含形成脂质体的脂质，所述脂质选自由磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、鞘氨醇磷脂、二硬脂酰基及其任何组合。根据另一个实施方案，形成脂质体的脂质是磷脂酰胆碱。根据一个实施方案，所述磷脂酰胆碱是氢化的大豆磷脂酰胆碱(HSPC)。根据其他实施方案，所述磷脂酰乙醇胺为1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)，和所述二硬脂酰基为二硬脂酰基乙二醇(DSG)或氧羰基-3-氨基-1,2-丙二醇二硬脂酰基酯(DS)。根据另一个实施方案，所述脂质体包含稳定的聚合物分子，例如聚烷基醚、聚唾液酸、聚乳酸和聚乙醇酸。根据一个实施方案，所述脂质体包含PEG。根据一些实施方案，所述脂质体还包含胆固醇。

根据另一方面，本发明提供了一种制备装载有本发明的外源PTEN抑制剂的细胞外囊泡的方法。根据一些实施方案，所述细胞外囊泡是外泌体。根据另一个实施方案，所述EV是微囊泡。根据另一个实施方案，所述EV是微囊泡和外泌体的组合。所述外泌体和微囊泡如上述任一个实施方案和方面定义。根据一些实施方案，所述EV源自表达间充质标志物的细胞。根据一个实施方案，表达间充质标志物的细胞选自间充质干细胞、口腔粘膜干细胞和嗅鞘细胞。根据另一个实施方案，所述EV源自神经嵴细胞，例如颅神经嵴细胞。根据一个实施方案，EV诸如外泌体源自间充质干细胞。根据一些实施方案，所述MSC分离自选自骨髓、脂肪组织、牙髓、口腔粘膜、外周血和羊水的组织。根据一些实施方案，所述间充质干细胞通常表达以下标记：CD105、CD166、CD29、CD90和CD73，并且不表达CD34、CD45和CD133。

所述方法可以包括从间充质干细胞条件培养基(MSC-CM)或神经嵴细胞条件培养基(NCC-CM)分离EV。可以例如通过基于EV的任何特性将其与未结合的组分分开而分离EV。例如，可以基于分子量、大小、形状、组成或生物学活性来分离EV。

在分离过程中、之前或之后，可以对条件培养基进行过滤或浓缩，或过滤和浓缩都进行。例如，可以通过膜过滤，例如截留尺寸或分子量的膜。可能会进行切向力过滤或超滤。

例如，可以使用如本文其他地方的“分子量测定”中所述的用具有适当分子量或截留分子量的膜过滤。

可以将任选过滤或浓缩或过滤且浓缩的条件培养基进行进一步的分离手段，例如柱色谱法。例如，可以使用具有各种柱的高效液相色谱法(HPLC)。所述柱可以是尺寸排阻柱或结合柱。

所述粒子的一种或多种性质或生物学活性可以用于在细胞条件培养基的分离过程中追踪其活性。作为实例，可以使用光散射、折射率、动态光散射或紫外线可见检测器来追踪粒子。例如，诸如心脏保护活性之类的治疗活性可用于跟踪分级期间的活性。

以下段落提供了如何获得间充质干细胞EV例如外泌体的具体非限制性实例。

可通过在培养基中培养间充质干细胞对其进行调节来产生间充质干细胞EV。上述培养基可以包含DMEM。上述DMEM可以不包含酚红。上述培养基可以补充有胰岛素、转铁蛋白或硒蛋白(ITS)或其任何组合。它可以包含FGF2。它可以包含PDGF AB。FGF2的浓度可以为约5ng/ml FGF2。PDGF AB的浓度可以为约5ng/ml。上述培养基可包含谷氨酰胺-青霉素-链霉素或-巯基乙醇，或其任何组合。

可以将细胞培养大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天或更长时间，例如3天。可以通过将细胞与培养基分离来获得条件培养基。可以将条件培养基例如以500g离心。可以通过滤膜浓缩。所述膜可以包括＞1000kDa的膜。所述条件培养基可以浓缩约50倍或更多。

可以对所述条件培养基进行液相色谱法，例如HPLC。所述条件培养基可以通过尺寸排阻分离。可以使用任何尺寸排阻基质，例如琼脂糖凝胶。作为实例，可以使用6x 40mm的TSK Guard柱SWXL或7.8x 300mm的TSK凝胶G4000 SWXL。洗脱缓冲液可包含任何生理介质，例如盐水。它可以包含20mM磷酸盐缓冲液和150mM NaCl，pH 7.2。所述色谱系统可以以0.5ml/min的流速平衡。洗脱模式可以是等度的。220nm处的UV吸光度可用于跟踪洗脱进度。可以使用准弹性光散射(QELS)检测器检查馏分的动态光散射(DLS)。

可以保留表现出动态光散射的馏分。例如，发现通过上述通用方法生产的馏分以11-13分钟的保留时间例如12分钟洗脱，表现出动态的光散射。该峰中粒子的rh约为45-55nm。这样的馏分包括间充质干细胞EV，例如外泌体。

根据一个实施方案，所述外源PTEN抑制剂是PTEN表达的抑制剂。根据一个实施方案，所述外源PTEN是RNA干扰寡核苷酸。根据一个实施方案，所述RNA干扰寡核苷酸是siRNA。根据另一个实施方案，所述RNA干扰寡核苷酸是shRNA。根据一些实施方案，所述RNAi寡核苷酸与疏水部分缀合。根据一个实施方案，所述疏水部分选自固醇、神经节苷脂、脂质、维生素、脂肪酸、肽及其组合。根据一些实施方案，所述RNA干扰寡核苷酸与胆固醇缀合。因此，在一个实施方案中，所述RNAi，例如siRNA，与胆固醇缀合。

应当理解，所述多核苷酸或寡核苷酸如siRNA或shRNA也可直接装载到EV中。在一个实施方案中，通过电穿孔和/或使用转染剂将RNAi寡核苷酸直接装载至EV。在替代实施方案中，在没有电穿孔和/或没有转染剂的情况下进行装载。

根据一个实施方案，将EV与RNAi寡核苷酸抑制剂一起温育足以允许粒子装载基于核酸的抑制剂的一段时间。对于特定类型的货物，可以优化足以允许EV装载基于核酸的抑制剂货物的持续时间，并且如果被修饰为包括疏水修饰，则可以对修饰类型的货物而优化。通常，约1小时或更短的温育足以使核酸货物有效地装载粒子。在许多情况下，疏水修饰的货物可以在非常短的时间内，例如在5分钟内有效地装载到外泌体中。因此，在一些实施方案中，在5分钟或更短例如1-5分钟的温育期间内发生有效的装载。在示例性的实施方案中，在5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟等的温育期间内发生有效装载。在其他实施方案中，可以在1小时内、2小时内，3小时内、4小时内、5小时内、6小时内、7小时内、8小时内、9小时内、10小时内、12小时内、24小时内等等发生有效装载。

用寡核苷酸装载EV不是高度依赖温度的。在示例性的实施方案中，外泌体在37℃或约37℃下装载。在其他实施方案中，EV(例如外泌体)可在室温或约室温下装载。在其他实施方案中，外泌体可以在4℃或约4℃下装载。

根据一些实施例，可以在不使用超速离心的情况下装载EV。根据另一个实施方案，所述装载还包括超速离心。根据一些实施例，所述制备方法还包括纯化或分离所装载的EV的步骤。根据一个实施方案，通过离心进行分离，例如超速离心。根据另一个实施方案，通过过滤进行分离。根据一个实施方案，纯化后的EV与残余亲代细胞的比率比其在初始材料中高至少2、3、4、5、6、8或10倍，或者在某些有利的实施方案中比其高至少50、100或1000倍。根据一些实施例，所述EV是无细胞的EV。

根据一些实施方案，本发明提供了一种制备EV例如外泌体的方法，该方法包括将EV与胆固醇缀合的RNAi寡核苷酸(例如siRNA或shRNA)在25至42℃的温度下温育0.5至5小时。

根据一个实施例，该方法进一步包括使用离心例如超速离心来分离装载的EV的步骤。根据一些实施方案，可以使用另一种疏水部分代替胆固醇。根据一个实施方案，所述RNAi寡核苷酸是siRNA。根据一个实施方案，所述siRNA包含核酸序列SEQ ID NO：2。根据另一个实施方案，所述siRNA包含核酸序列SEQ ID NO：3。根据某些实施方案，所述siRNA包含核酸序列SEQ ID NO：4。根据另一个实施方案，所述siRNA包含核酸序列SEQ ID NO：5。根据一些实施方案，所述siRNA包含核酸序列SEQ ID NO：10。根据其他实施方案，所述siRNA包含核酸序列SEQ ID NO：11。根据另一个实施方案，所述siRNA与核酸序列SEQ ID NO：6互补。根据一个实施方案，所述siRNA靶向核酸序列SEQ ID NO：6。根据一些实施方案，所述RNAi寡核苷酸是shRNA。根据一个实施方案，所述siRNA或shRNA包含核酸序列SEQ ID NO：2和3。根据另一个实施方案，所述siRNA或shRNA包含核酸序列SEQ ID NO：4和5。根据另一个实施方案，所述siRNA包含核酸序列SEQ ID NO：10和11。在另一个实施方案中，所述shRNA包含与SEQID NO：6或7互补的核酸序列。根据又一个实施方案，所述shRNA包含选自SEQ ID NO：8和9的核酸序列。根据一些实施方案，所述shRNA或siRNA包含与编码PTEN蛋白的核酸的片段互补的序列，并抑制其表达。根据一个实施方案，所述PTEN包含氨基酸SEQ ID NO：1。

在一些实施方案中，使用本文所述的方法将超过50％的疏水修饰的寡核苷酸货物装载至外泌体。因此，在一些实施方案中，将疏水修饰的寡核苷酸货物以5％至40％的效率装载至外泌体。因此，在一个实施方案中，将疏水修饰的寡核苷酸货物以10至35％、15至30％或20至25％的效率装载至外泌体。例如，将疏水修饰的寡核苷酸货物以5％或更高、10％或更高、15％或更高、20％或更高、25％或更高、30％或更高、35％或更高、40％或更高，或50％或更高的效率装载到外泌体。本文所述的方法导致将疏水修饰的寡核苷酸掺入所有或几乎所有被处理的外泌体中。例如，与疏水修饰的寡核苷酸一起温育的外泌体的至少80％装载有所述寡核苷酸。在一些实施方案中，将疏水修饰的寡核苷酸货物掺入与所述寡核苷酸一起温育的至少90％的外泌体中。因此，可以容易地获得其中至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或更多外泌体装载有寡核苷酸货物的外泌体群体。在一个实施方案中，至少99％的外泌体装载有疏水修饰的寡核苷酸。

EV(例如外泌体)可以在每个粒子(例如外泌体)上装载超过500个的寡核苷酸分子，例如每个外泌体至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少1200、至少1500、至少2000、至少2500、至少3000或更多个寡核苷酸。在一个实施方案中，外泌体包含每个外泌体平均约500-3000个寡核苷酸。在另一个实施方案中，外泌体包含每个外泌体平均约500-1000个寡核苷酸。在另一个实施方案中，外泌体包含每个外泌体平均约1000-1500个寡核苷酸。在另一个实施方案中，外泌体包含每个外泌体平均约1000-2000个寡核苷酸。在另一个实施方案中，外泌体包含每个外泌体平均约1000-3000个寡核苷酸。在另一个实施方案中，外泌体包含每个外泌体多达约3000个寡核苷酸。可以装载到外泌体中的疏水修饰寡核苷酸货物的量允许产生外泌体，其中疏水修饰寡核苷酸货物占据了外泌体膜的很大比例。例如，可以生产EV(例如外泌体)，其中寡核苷酸货物占据粒子表面积的约1-10％，例如占据粒子表面积的约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。根据一些实施方案，所述寡核苷酸货物是RNAi寡核苷酸，例如siRNA或shRNA。根据其他实施方案，所述疏水修饰的寡核苷酸是与疏水部分例如胆固醇部分缀合的RNAi寡核苷酸。

根据一些实施方案，脂质双层磷脂膜囊泡是脂质体。根据这样的实施方案，所述脂质体以与针对EV描述的相同方法装载。

根据其他实施方案，装载有PTEN RNAi抑制剂的EV可以获自人工装载有RNAi寡核苷酸或编码并能够在细胞内表达或产生所述RNAi抑制剂的多核苷酸的细胞。在这种情况下，上述多核苷酸/寡核苷酸试剂在能够以组成型或诱导型方式指导该试剂表达的顺式作用调节元件(例如启动子)的控制下连接到核酸构建体中。

可以使用适当的基因递送载体/方法来递送核酸剂(转染、转导等)。任选地，使用适当的表达系统。合适的构建体的实例包括但不限于pcDNA3、pcDNA3.1(+/-)、pGL3、PzeoSV2(+/-)、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto，它们都可从Invitrogen Co.商购获得。

表达构建体也可以是病毒。病毒构建体的实例包括但不限于腺病毒载体、逆转录病毒载体、牛痘病毒载体、腺相关病毒载体、多瘤病毒载体、α病毒载体、弹状病毒载体、慢病毒载体和疱疹病毒载体。

病毒构建体，例如逆转录病毒构建体，包括至少一个转录启动子/增强子或基因座定义元件，或通过其他方式控制基因表达的其他元件，所述其他方式例如交替剪接、核RNA输出或后RNA信使的转录修饰。此类载体构建体还包括包装信号、长末端重复序列(LTR)或其部分，以及适用于所用病毒的正链和负链引物结合位点，除非它已经存在于病毒构建体中。另外，这种构建体通常包括用于从其所处的宿主细胞分泌肽的信号序列。优选地，为此目的的信号序列是哺乳动物信号序列或本发明的肽变体的信号序列。任选地，所述构建体还可包含指导聚腺苷酸化的信号，以及一个或多个限制位点和翻译终止序列。举例来说，这样的构建体通常将包含5'LTR、tRNA结合位点、包装信号、第二链DNA合成的起点以及3'LTR或其一部分。

优选地，用于感染的病毒剂量为至少103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015或更高的pfu或病毒粒子。

可通过向基因片段的末端添加两个相反的启动子来合成双链RNA，其中一个启动子位于紧邻基因的5'，而相对的启动子位于紧邻基因的3'。然后可以用适当的聚合酶转录dsRNA。

在另一个实施方案中，多核苷酸或寡核苷酸试剂可以与培养中的细胞一起温育，从而导致细胞有效吸收核酸。对于这样的实施方案，优选地，所述核酸试剂被疏水修饰，如下文进一步描述。

不管本文所述的用于以核酸试剂装载粒子的方法如何，细胞都可以温育足以产生EV的例如外泌体的一段时间。从培养基中分离的外泌体包含装载有被细胞吸收、产生或表达的核酸分子的外泌体。因此，在一个实施方案中，提供了一种用寡核苷酸货物装载EV的方法，包括将能够产生EV(例如产生外泌体)的细胞与寡核苷酸一起温育足以使寡核苷酸被细胞内化的一段时间，将细胞培养足以分泌外泌体的一段时间，并从培养基中分离装载有寡核苷酸的外泌体。

根据一些实施方案，本发明提供了根据上述任一个实施方案制备的分离的细胞外囊泡。根据另一个实施方案，本发明提供了包含根据上述任一个实施方案制备的细胞外囊泡的药物组合物。根据一些实施方案，这种分离的细胞外囊泡和药物组合物可用于治疗神经系统疾病或病状例如脊髓损伤。

在至少一些实施方案中，本发明的粒子或药物组合物可以以单位剂型预包装在准备使用的注射器中。所述注射器可以标记有粒子名称及其来源。标记还可以包括与粒子的功能有关的信息。所述注射器可以包装在也标记了关于粒子的信息的包装中。

术语“包含”、“包括”、“具有”和“含有”在本文中可互换使用，并具有“至少部分由……组成”的含义。当解释本说明书中包括术语“包含”的每个陈述时，也可以存在不同于该术语或由术语开头的那些特征。诸如“包含”的相关术语将以相同的方式解释。术语“具有”和“包含”也可以包含“由……组成”和“基本上由……组成”的含义，并且可以用这些术语代替。术语“由……组成”不包括未明确描述或列出的任何组分、步骤或过程。术语“基本上由……组成”是指所述组合物或组分可以包括另外的成分，但是仅在所述另外的成分不实质上改变所要求保护的组合物或方法的基本和新颖特征的情况下。

如本文所用，术语“约”在指代诸如量、时间持续时间等的可测量值时，意在涵盖指定值的+/-10％或+/-5％，+/-1％，甚至+/-0.1％的变化。

如本文所使用的，单数形式“一个”，“一种”和“该”包括复数引用，除非上下文另外明确指出。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括其混合物。

在整个本申请中，本发明的各种实施方案可以以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对本发明范围的不灵活的限制。因此，应该将范围的描述视为已具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对范围1到6的描述应被视为已明确公开了1到3、1到4、1到5、2到4、2到6、3到6等的子范围，以及该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5和6。这与范围的广度无关。

无论何时在本文中指出数值范围，均意味着包括在指明范围内的任何引用数字(分数或整数)。短语在第一指示数字和第二指示数字之间的“范围/范围之间”和从第一指示数字“到”第二指示数字的“范围”在本文中可互换使用，并且意在包括第一和第二指示数字以及它们之间的所有小数和整数。

如本文所用，术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和过程，包括但不限于已知方式或容易从已知方式开发的那些方式、手段、技术和过程，通过从业者的化学、药理、生物学、生化和医学艺术。

应当理解，为清楚起见，在单独的实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。相反，为简洁起见，在单个实施方案的上下文中描述的本发明的各种特征，也可以单独地或以任何合适的子组合或在本发明的任何其他所述的实施方案中合适地提供。在各种实施方案的上下文中描述的某些特征不应被认为是那些实施方案的必要特征，除非该实施方案没有那些要素就不能工作。

如上文所述且如以下权利要求书所述，本发明的各种实施方案和方面在以下实施例中得到实验支持。

根据本发明的另一方面，提供了源自神经嵴细胞的外泌体，其用于治疗脊髓损伤。

实施例

现在参考以下实施例，其与以上描述一起以非限制性方式示出了本发明的一些实施方案。

通常，本文中使用的命名法和本发明中使用的实验室步骤包括分子、生化、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中有详尽的解释。

材料和方法

间充质干细胞的制备

源自骨髓的人MSC购自Lonza(瑞士巴塞尔)。如先前所述培养细胞并扩增。在收集外泌体之前，将细胞在无外泌体的血小板中培养，和三天后收集培养基。用PKH26(Sigma)标记MSC-exo5分钟，并使用超速离心(100,000g，2小时，4℃)洗涤。用200μl PBS重悬沉淀。

外泌体纯化方案

人MSC购自Lonza(瑞士巴塞尔)。培养细胞并扩增。用无外泌体的血小板裂解物(Rabin Medical Center,以色列)培养细胞，三天后，收集培养基。使用标准差分离心方案纯化外泌体，该方案包括分离培养液并以300g离心10分钟。回收上清液，以2,000g离心10分钟，然后以10,000g离心30分钟。然后将上清液通过0.22μm过滤器，并以100,000g离心70分钟。含有外泌体和蛋白的沉淀物在PBS中洗涤，然后以100,000g离心70分钟。将沉淀重悬于200μl无菌PBS中。所有离心均在4℃下进行。使用NanoSight技术、电子显微镜和蛋白印迹表征外泌体，钙调蛋白作为负标记，以及CD9和CD81作为正标记。

间充质干细胞外泌体(MSC-Exo)荧光标记

用PKH26/PKH67(Sigma)标记MSC-Exo 5分钟，然后使用超速离心(100,000g，2h，4℃)用PBS洗涤。将小丸重悬于200μlPBS中。对于PTX实验，将MSC-Exo与5μl PTX在37℃下悬浮10分钟，然后用PKH26标记，并在100,000g下离心2h。MSC-Exo+PKH67和MSC-Exo+PTX+PKH26一起施用于同一只大鼠(n＝3)。

金纳米粒子(GNP)的合成和缀合

将3.75毫升亚油酸(18％)、油酸(65％)、棕榈酸(16％)和乙醇(1％)、200毫克NaOH和15毫升乙醇的混合物加入到30毫升DDW中。将该溶液搅拌5分钟。然后在搅拌的同时添加50毫克的HAuCl4，接着添加5ml的抗坏血酸(0.05M)，再搅拌一分钟。然后将PEG7溶液(2.26×10-3g)添加到GNP溶液中，并将混合物搅拌1小时。然后使用NaOH将pH调节至9，并将溶液再搅拌1小时。加入80毫升正己烷后，将溶液搅拌1小时。然后使用HCl溶液(37％)将所得混合物的pH调节至7。将混合物置于漏斗中以进行相分离(有机相和水相)。使用真空蒸发水相。接下来，将过量的碳二亚胺(1.87×10-3g)和N-羟基琥珀酰亚胺(Thermo FisherScientific，Inc.，Rockford，IL)(2.12×10-3g)添加到溶液中，然后添加2GF(Sigma-Aldrich以色列公司)(1.75×10-3g)。将总共2.8×1010个外泌体(在1ml盐水中的200μl外泌体)与葡萄糖包被的GNP(35mg/mL，100μl)一起温育3小时。然后将外泌体离心2h(100,000g，4℃)。

GNP表征

使用透射电子显微镜(JEM-1400，JEOL)测量GNP的大小和形状，并使用紫外可见光谱仪(UV-1650PC；Shimadzu Corporation，日本京都)、ζ-电位(ZetaSizer 3000HS；英国马尔文的Malvern Instruments)和动态光散射将其进一步表征。

GNP量化

火焰原子吸收光谱仪(SpectrAA 140；安捷伦科技公司，加利福尼亚州圣克拉拉)用于确定几个主要器官(心脏、肺脏、肺脏、肾脏和脾脏)中的金含量。将解剖的组织用1ml王水(硝酸与盐酸的1：3混合物)融解，使其蒸发，然后稀释至4ml的总体积。通过0.45nm注射过滤器过滤样品后，使用校准曲线确定金浓度，该校准曲线使用已知金浓度的溶液制备。使用电感耦合等离子体光谱法(ICP)确定脑和脊髓损伤中的金含量。新鲜提取组织并在550℃下燃烧5h。然后将5ml 1％HNO3添加到融解的组织中，并通过0.45μm过滤器过滤。与金标准曲线相关联测定样品中的金浓度。

外泌体

在

管中将外泌体(40μl，约1010个外泌体)装载0.1nmol cy3-MAPK-siRNA(Advirna Company)，并在37℃下温育1-3小时。然后，对该悬浮液进行Nanosight分析。荧光与无荧光外泌体的浓度比定义为装载效率。

对于体内实验，在向鼻内施用给SCI大鼠之前，在37℃下将40μl外泌体装载0.1nmol PTEN-siRNA(Advirna公司)，持续2-3h。装载有PTEN-siRNA的外泌体称为ExoPTEN。

背根神经节(DRG)神经元的轴突生长

解剖成年Sprague-Dawley大鼠(200-250g)胸和腰椎水平的背根神经节，并将其浸入冰冷的汉克平衡盐溶液(HBSS)中。用HBSS洗涤DRG，将其转移至包含4ml 2.5mg/ml II型胶原酶(Worthington)的小盘中，使用手术刀片将其切成小块，并在37℃下温育40分钟。将溶液以200g离心3分钟以去除胶原酶，重悬于2ml培养基中，该培养基含有F12培养基(Gibco，11765)、10％胎牛血清(Gibco)、100U/ml青霉素(Biological Industries，Beit-Haemek)、以色列)、100ug/ml链霉素，通过1毫升移液器吸头研磨～20次。将细胞在预先涂有层粘连蛋白(Sigma，L2020)的15毫米盖玻片的12孔板中以每孔5X104的密度铺板5小时。然后，将DRG培养基替换为常规DRG培养基，含有40μl外泌体、装载在40μl外泌体中的0.1nmol非靶向对照(NTC)siRNA、0.1nmol PTEN siRNA，或0.1nmol PTEN siRNA。

被siRNA靶向的PTEN的序列如SEQ ID NO：6所示(5'-GAGTTCTTCCACAAACAGAA-3')。使用包含与胆固醇缀合的核酸序列5'-GAGUUCUUCCACAAACAGAA-3'(SEQ ID NO：10)的一条链和核酸序列5'-UUCUGUUUGUGGAAGAACUC-3'(SEQ ID NO：11)的双链siRNA来抑制PTEN表达。

接种后24小时，将细胞用4％多聚甲醛(PFA)固定10分钟，用PBS清洗3次，每次5分钟，在0.3％Triton X-100中透化10分钟，用PBS清洗3次，每次5分钟，在5％牛血清中封闭2h，然后与含小鼠抗微管蛋白(Promega，1：500)的5％牛血清中在4℃下温育过夜。接下来，将样品与驴抗小鼠Alexa488(Invitrogen，1：800)和DAPI(1：1000)温育3小时。用PBS洗涤3次后，装入样品并在共聚焦显微镜(LSM700)下观察。使用IMARIS软件(版本8.20)处理图像，以量化神经突分支水平、最大分支水平、神经突数量、神经突总长度。参数设置如下，并应用于每张图像：最大直径60μm，最细直径0.6μm，起点阈值10μm至60μm，种子点阈值10μm，以球形区域直径24μm去除起点周围的种子点，最大间隙长度允许为60μm。

脑和脊髓的体外CT扫描：

取出脑和脊髓样品，放入4％多聚甲醛中固定3天，然后在150mg/mL的用7.5％多聚甲醛稀释的非离子碘化造影剂(洛他米多，Bayer Schering Pharma，日本)中4℃浸泡7天，以区分不同的灰质和白质。在CT成像之前，将样品从溶液中取出，吸干，然后放入样品支架中进行成像。样品架用塑料膜密封以防止脱水。使用标称分辨率为35μm、0.2mm的铝滤光片和45kV的管电压的微型CT扫描仪(Skyscan High Resolution Model 1176)对样品进行离体微型CT扫描。使用由GPU加速的SkyScanNRecon软件，用改良的Feldkamp算法进行重建。应用环伪影减少、高斯平滑(3％)和光束硬化校正(25％)。使用SkyScan CT-Volume(“CTVol”)软件和SkyScan CT-Voxel(“CTVox”)软件中的RGBA传递函数生成体积渲染的三维(3D)图像。

免疫荧光分析

解剖脊髓，在4％PFA中固定过夜，用30％蔗糖溶液冷冻保护过夜，并包埋在最佳切割温度化合物(OCT)中，并使用低温恒温器(Leica CM1850，德国)进行纵向切片(20μm)。将切片在0.5％Tween溶液中透化，用5％牛血清封闭，然后与兔抗微管蛋白(Abcam，1：500)、兔抗GFAP(1：1000，Millipore)、小鼠抗CD11b(1：500，BioRad)或小鼠抗CD31(1:50，BD)抗体在4℃温育过夜。接下来，将切片与山羊抗兔Alexa647(Invitrogen，1：800)和DAPI(1：1000)温育3h，盖上盖玻片，并用共聚焦显微镜(LSM700)成像。

脊髓损伤模型

所有动物实验均严格按照以色列理工学院批准的协议进行。由对治疗不知情的实验者实施动物随机化。手术过程中用甲苯噻嗪(10-15mg/kg)和氯胺酮(60-90mg/kg)的混合物麻醉成年雌性Sprague-Dawley大鼠，维持剂量为1-2％的异氟烷(美国哈佛大学设备)。在第9至第11胸椎水平椎板切除后，使用微剪刀(Kent Scientific，美国)在T10水平完全横断脊髓。提起吻部和尾侧残端以确保完全横断，并在产生的间隙内循环通过一个钩子(肯特科学公司，美国)，以确认没有纤维残留在椎管的底部。在该研究中评估的组被指定为横断对照组(n＝15)、鼻内外泌体对照组(n＝10)、鼻内ExoPTEN(n＝7)、病变内PTEN-siRNA(n＝3)和病变内ExoPTEN(n＝4)。然后缝合肌肉层和皮肤，并将大鼠置于温度控制的温育室中。对于鼻内治疗，在手术后2-3小时以及每24小时对大鼠鼻内给予40μl盐水、40μl外泌体或40μlExoPTEN，持续5天。对于病变内治疗，当脊髓受到损伤时，仅给大鼠一次40μlPTEN-siRNA(0.1nmol)或40μl ExoPTEN。每天进行两次膀胱按摩，直到恢复膀胱功能。每天注射抗生素(头孢唑林，25mg/kg，每天两次)，持续1周。术前和术后3天，以0.01-0.05mg/kg的剂量施用丁丙诺啡(拜耳)。向所有大鼠施用环孢菌素(10mg/kg/d)(诺华公司)1周。

行为分析

不知情的实验者使用Basso，Beattie和Bresnahan(BBB)运动量表方法对运动恢复进行评估和评分。植入后2-3天进行测量，然后每7天进行一次测量。为了避免昼夜节律变化，所有测量均在一天的同一时间进行。基线BBB定义为手术后第一次测试时记录的值。每周分数是每个日历周中获得的最低分数。使用von Frey纤毛试验评估感觉恢复。将具有弯曲力梯度的纤毛(Bioseb)施加到脚掌上，以引起伤害感受性反应(脚掌迅速缩回刺激)。缩回阈值定义为在3个试验的至少2个试验中(试验之间至少30s)诱发阳性反应的最小力量。

MRI

用9.4T孔径扫描仪(Bruker Biospec，德国埃特林根)进行MRI，使用圆柱形体积线圈(内径86mm)进行信号激发，使用单通道表面线圈(内径20mm)进行信号接收。使动物处于麻醉下(0.5-1.5％异氟醚)并补充氧气(0.5L/min)。在成像过程中(Small AnimalInstruments，Stony Brook，纽约，NY)监测呼吸，并使用恒温调节的循环热水保持体温。在DTI成像之前，使用RARE序列获取矢状和轴向T2加权解剖扫描，以确定DTI扫描切片的几何形状。RARE采集参数为：0.8毫米厚度，FOV＝3x3厘米，矩阵尺寸＝192x192，(空间分辨率＝156x156μm2)，重复/回波时间(TR/TE)＝1200/16.22ms，4个平均值。使用具有以下参数的EPI-DTI序列获得DTI成像：30个非共线梯度方向，3个A0图像，b＝1000s/mm2，diff持续时间(δ)＝2.6，diff分离(Δ)＝11，2个平均值，厚度为0.8毫米，FOV＝3x3厘米，矩阵尺寸为192x192，(空间分辨率为156x156μm2)。使用ExploreDTI软件(Leemans等，2009)进行DTI计算和光纤跟踪。获得的张量在频谱上分解为其特征分量。本征值用于计算分数各向异性(FA)图。在每个切片中手动分割脊髓的感兴趣区域(ROI)(白和灰质)。使用确定性(流线型)纤维追踪技术进行了纤维束成像，终止于FA低于0.2的体素，或区域方向变化高于30°(Basser等，2000)，步距0.078mm，纤维长度0.2-100mm。通过手动选择的ROI的光纤绘制为流线。

电生理学

在第8周，进行电生理学以记录神经信号通过病变的传播。氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉后，将大鼠置于立体定位仪中，在头部皮肤中线切开。颅骨暴露，在中线右侧2mm，前囟点的前-1.0mm和后+4.0mm处分别植入两个电刺激螺钉电极。螺钉电极连接到刺激器的输出端子。暴露出腿后部的坐骨神经，并插入两个银线钩形电极。将另一根电线插入腿部的脚垫中，并用作接地电极。放大后的信号在0.1到3kHz之间进行带通滤波(带有7DA驱动放大器的7P511 AC宽带前置放大器，美国乔治亚州沃里克市Grass Technologies公司)，被数字化(NI USB-6341模数转换器，National Instruments)，在10kHz获取并存储在运行WinWCP软件包的个人计算机上(由英国斯特拉斯克莱德大学的John Dempster博士提供)。根据第一只动物的后肢收缩和可靠的坐骨神经复合动作电位(CAP)的出现来选择刺激强度，并在整个实验过程中保持这种强度。

蛋白印迹

将病变的脊髓节段和肝脏置于含有蛋白酶抑制剂混合物(100mM PMSF、2mg/ml亮肽素、50mM邻氨基苯甲酸钠、50mM抑肽酶，Sigma)的RIPA溶液中(1％脱氧胆酸钠(DOC)(Sigma)、1％100x-Triton(Biolab)、50mM Tris-HCl(Sigma)、150mM NaCl(Sigma)、5mMEDTA(Sigma))。将组织匀浆并用4-12％SDS-PAGE分离20μg总蛋白，然后转移到硝酸纤维素膜上90分钟。用2％BSA在含有0.1％Tween20(TBST)的tris缓冲盐水中封闭3小时后，将膜与抗PTEN(小鼠单克隆；目录号#9556，Cell Signaling)以1：1000，或膜与作为上样对照的抗β-肌动蛋白(兔单克隆；目录号#8457，Cell Signaling)以1：1000，在2％BSA，TBST中温育过夜。第二天，在三次TBST漂洗后，将膜与抗兔IgG-HRP(1：5000，NA934V，GE Healthcare)或抗小鼠IgG-HRP(1：5000，NA931V，GE Healthcare)在室温下温育2小时。该印迹曝光于增强的化学发光试剂(目录号#1705061(BioRad)，然后在LAS-3000成像系统(FujiFilm)中曝光而显色。

RT-qPCR

使用Qiagen RNeasy Mini试剂盒提取病变脊髓组织和肝脏的总RNA，并根据制造商的说明使用High Capacity cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems)合成第一链DNA。在QuantStudio 12K Flex实时PCR系统上进行实时定量PCR。引物包括PTEN(ThermoFisher，Assay ID：Rn00477208)或GAPDH(Thermo Fisher，Assay ID：Rn01775763-g1)。扩增反应条件为：95℃20s，接着40个循环的95℃3s，60℃30s，在10μl反应物中，复制。相对表达水平使用ΔΔCt方法确定，其中感兴趣的基因已标准化为GAPDH表达。

神经解剖学追踪

为了追踪皮质脊髓轴突，在第6周用生物素化的葡聚糖胺(BDA)对大鼠进行顺行性示踪。如上所述，在氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉下，将大鼠置于立体定位框架中。将头皮头发剃毛并用乙醇擦拭该区域，在感觉运动皮层上方的颅骨上钻一些小孔。使用带有拉动式玻璃微量移液器的汉密尔顿微注射器在每个位点2分钟内注射1μl10％BDA(MW10,000，D1956，Molecular Probes)，每次注射间隔2分钟，注射到每个半球8个位点，使用以下坐标：AP+1.0，ML±2.0；AP 0，ML±1.5；AP-1.0，ML±1.5；AP-2.0，ML±1.5；DV 1.5mm。完成所有注射后，将头皮缝合，将大鼠留在恢复室内直至恢复。在第8周，将大鼠用氯胺酮和甲苯噻嗪深度麻醉，并经心内灌注4％PFA。收获含有病变的脊髓节段，在30％蔗糖中冷冻保护，包埋在OCT中并纵向切片，切成20微米厚的切片。将切片在PBS和0.1％Triton X-100中洗涤3次，与Alexa Fluor594缀合的抗生蛋白链菌素(1：500，Invitrogen，S32356)在4℃下温育过夜，在PBS中冲洗3次，固定并盖上盖玻片。

统计分析

使用MATLAB/Prism 5软件(美国)进行统计分析。使用双因素非配对t检验比较两组。除非另有说明，否则其余数据都是使用单因素或双因素ANOVA，事后Tukey多次比较进行分析。所有分组数据均以平均值±SEM表示。显著性水平：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。

实施例1-鼻内MSC-Exo穿过血脑屏障，并迁移至脊髓

从间充质干细胞外泌体(MSC-Exo)分离出的外泌体的平均大小为111±64nm，浓度为40.43x108个粒子/ml(图S1D-E)。用Cryo-TEM可视化的MSC-Exo显示出典型的球形。为了检查MSC-Exo是否可以穿过BBB，我们用金纳米粒子(GNP)标记了MSC-Exo，如Betzer等，2017，ACS Nano 11，10883-10893中所述。装载有GNP的MSC-Exo的Cryo-TEM成像表明GNP被外泌体摄取(图1)。为了检查在鼻内(IN)施用后MSC-Exo是否可以穿越血脑屏障，在完全脊髓横断后三小时IN施用装载GNP的MSC-Exo。施用后24小时的微型CT扫描显示，脊髓病变区域有明显的GNP积累，而脑部则没有(图2，上图)。相反，在健康对照组中，GNP主要定位在脑和嗅球中(图2，下图)。电感耦合等离子体(ICP)评估证实，与健康对照组相比，受伤大鼠的T10脊髓节段区域中的GNP含量明显更高(图3A，单因素ANOVA F(3，8)＝27.5，p＜0.001，Tukey)。类似地，与健康大鼠相比，受伤的T10脊髓节段区域累积的IN施用的PKH26(红色亲脂性染料)标记的外泌体的量明显更高(图4，t(14)＝3.21，p<0.01)。CNS的定性微型CT扫描和定量ICP测试，以及脊髓病变的免疫荧光染色显示，MSC-Exo穿透了血脑屏障，并归巢到脊髓病变中。出乎意料的是，MSC-Exo在脊髓损伤大鼠的损伤区域明显更高，而健康大鼠则在脑部。

为研究经鼻内施用后MSC-Exo的生物分布，在施用后24小时，采用火焰原子吸收光谱法(FAAS)量化主要器官(肝脏、肺脏、心脏、肾脏和脾脏)的GNP。在健康大鼠和受伤大鼠的肺脏、心脏和脾脏中，MSC-Exo水平之间没有发现显著差异。但是，与受伤的大鼠相比，健康大鼠的肝脏和肾脏中发现了更高的水平，这表明完整大鼠中MSC-Exo的排泄更快(图4，右图，单因素ANOVA F(9，10)＝12.92，p<0.001，Sidak的多重比较检验)。

我们进一步表明用百日咳毒素阻断PKH26(红色)-标记外泌体的趋化因子受体会大大降低MSC-Exo迁移至病变的能力。为了确定在脊髓损伤中是否存在特定细胞类型优先摄取MSC-Exo，在给受伤2-3h后的大鼠IN施用PKH26-Exo后24小时，对受损节段中的神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞进行了免疫染色。我们发现，MSC-Exo主要位于神经元中，而在星形胶质细胞和活化的小胶质细胞中少得多(图5，单因素ANOVA，F(2，13)＝11.59，p>0.01，Tukey)。

实施例2.装载到MSC-Exo中的PTEN-siRNA在体外促进健壮的DRG神经元向外生长。

如材料和方法中所述，用胆固醇缀合的非编码cy3-MAPK-siRNA装载MSC-Exo。Nanosight分析显示有效的cy3-MAPK-siRNA装载(33.64％)(图6)。

为了测试由包含siRNA的MSC-Exo传递的PTEN抑制作用是否能调节轴突生长，然后将自传递的PTEN-siRNA装载到MSC-Exo(以下称为ExoPTEN)中，加到培养中的背根神经节(DRG)神经元。与仅用培养基、非靶向对照siRNA(NTC-siRNA)，MSC-Exo或仅PTEN-siRNA处理的神经元相比，在ExoPTEN处理后一天，DRG神经元具有更复杂、分支和拉长的形态(图7)。在中位分支水平，用ExoPTEN处理的神经元表现出明显更高的分支点的数量(图8，单因素ANOVA，p<0.001，Tukey)。ExoPTEN处理的神经元的神经突总长度、神经突数量、分支点和最大分支水平均显著较高；更具体地说，分别比未经任何处理的神经元高6.6倍、6.6倍、6.8倍、2.3倍(图9，单因素ANOVA，均为p<0.001，Tukey)。单独的MSC-Exo和PTEN-siRNA都诱导DRG神经元的生长达到相似的程度，但不如ExoPTEN处理那么明显。

实施例3.鼻内ExoPTEN使脊髓损伤中的PTEN表达沉默

为了检查ExoPTEN在体内的沉默作用，从完全脊髓横断之日起连续5天鼻内施用ExoPTEN。在第8周时，对从SCI区域提取的蛋白进行的蛋白印迹分析表明，与未经处理的SCI大鼠相比，经ExoPTEN处理的PTEN蛋白水平降低了59％(图10A，Kruskal-Wallis检验，p＝0.0627)。在各组之间，肝脏组织中的蛋白水平未发现显著变化(图10B，p＝0.8643)。同时，RT-qPCR分析显示，与未治疗的SCI大鼠相比，经ExoPTEN处理的PTEN基因表达降低了32％(图10C，p＝0.1520)，而在肝脏中该基因表达却相当(图10D，p>0.9999)。

实施例4.鼻内ExoPTEN能使完全SCI大鼠明显恢复功能

为评估ExoPTEN治疗的神经保护潜力，将完全SCI大鼠分为五组：(1)不治疗，(2)病变内(IL)PTEN-siRNA治疗，(3)病变内单次施用ExoPTEN，(4)IN施用外泌体连续5天和(5)IN使用ExoPTEN连续5天(从受伤之日开始)。每周对大鼠进行BBB运动评分，持续8周。与所有其他治疗组相比，IN施用ExoPTEN五天导致明显的运动恢复(分别达到F(4，300)＝35.72，p<0.0001，F(8，300)＝2.931p<0.001)。更具体地说，在第8周，ExoPTEN(IN)组的平均BBB运动评分(图11A)达到7.75±2.14，与未治疗的横断大鼠的平均0.39±0.14评分形成鲜明对比(p<0.001)。观察到鼻内用ExoPTEN治疗的组与鼻内用空外泌体治疗的组之间存在统计学显著差异(图11A)。第8周在PTEN-siRNA(IL)、ExoPTEN(IL)和外泌体(IN)组测量到轻微但无统计学意义(所有p>0.05)的改善，BBB运动评分分别为2.17±1.48、2.50分别为±1.21、2.00±1.23(图11A)。在整个8周中，用ExoPTEN(IN)治疗的大鼠中有28.6％的BBB运动评分≥14，反映出一致的足底踩踏、脚趾清除和一致的前肢-后肢协调，而其他治疗组均未达到此运动水平的改善(图11B)。ExoPTEN(IN)治疗的大鼠体重增长也快于其他组，并在第5周达到稳定状态(图11C)。此外，在第8周时，大鼠体重与BBB运动评分之间呈正相关(图11D，皮尔森相关系数＝0.6819，p<0.0001)。在后肢进行带弯曲力梯度(6、8、10、15、26、60、100、180、300g)的Von Frey纤毛测试，以确定爪缩回阈值，作为感觉恢复的指标。在健康大鼠中诱发爪子缩回的临界阈值设置为60g，低于该阈值则认为缩回反应是异常性疼痛。SCI后，没有大鼠对300g的纤毛作出反应，表明感觉功能完全消失。ExoPTEN(IL)和ExoPTEN(IN)的正常感觉反应分别在第4周时达到了25％和33.3％，在第8周时保持不变。此外，外泌体(IN)组中有25％的大鼠在第8周时获得了感觉恢复。相反，未治疗组和PTEN-siRNA(IL)组在8周内未显示任何感觉恢复(图11E)。ExoPTEN(IN)动物(7.0±0.7天)恢复反映膀胱功能的尿反射应答的时间最快，其次是未治疗的大鼠(8.9±0.7天)(图11F，单因素ANOVA，p＝0.4079，Tukey)。图11G显示了用对照、外泌体和ExoPTEN治疗的损伤后8周大鼠恢复的差异。

实施例5.鼻内ExoPTEN诱导结构组织和电生理传导

为了评估脊髓的结构完整性，在未治疗的SCI动物、外泌体(IN)或ExoPTEN(IN)治疗的SCI动物和完整大鼠中进行了9.4T常规MRI和扩散张量成像(DTI)。在横断对照中，距受伤正中心尾侧4mm观察到严重的脊髓萎缩，而这种变性在外泌体和ExoPTEN组中不太明显。距受伤正中心吻侧4mm定量横截面积，SCI组之间无明显差异(图12A，单因素ANOVA，F(3，11)＝0.6120，p＝0.6212)，但与ExoPTEN治疗组相比，横断对照中距受伤正中心尾侧4mm处横截面积显著减小(图12B，2.5±0.5mm2对4.2±0.3mm2，p<0.05)。弥散张量成像(DTI)图像显示，横断组的吻侧和尾侧残端完全断开，外泌体组出现部分桥接，ExoPTEN组出现最明显的桥接。与外泌体或未治疗的SCI组相比，用ExoPTEN治疗的大鼠的损伤部位吻侧和尾侧的分数各向异性(FA)记录较高，但仍低于完整大鼠(横断对照、外泌体、ExoPTEN和完整大鼠分别为0.2856、0.2938、0.3293、0.5055，图12C)。未治疗组、外泌体组和ExoPTEN SCI组之间平均扩散率(MD)记录未显示差异。此外，在用ExoPTEN治疗的大鼠中，观察到高振幅的运动诱发电位(MEP)从运动皮层通过病变传播到坐骨神经，而在外泌体组中测量到了低振幅信号(图12D，1.283±0.085mV vs.0.662±0.162mV，分别地，p＝0.0273)。ExoPTEN治疗组的MEP延迟短于外泌体治疗组(图12E，31.03±3.05ms vs 38.49±6.78ms，p＝0.3726)。再次横断吻侧致脊髓病变后所有信号均消失。

实施例6.鼻内ExoPTEN改善病变微环境并再生皮质脊髓轴突

为确定运动恢复的基础细胞机制，对未治疗、外泌体(IN)治疗和ExoPTEN(IN)治疗的动物的脊髓病变分别进行β-III-微管蛋白、CD11b、GFAP和CD31染色以检测轴突再生、小胶质细胞增生、星形胶质细胞增生和血管生成。在ExoPTEN治疗的大鼠中，β-III-微管蛋白的表达明显高于外泌体治疗的大鼠，而未治疗的SCI大鼠中几乎检测不到(图13A，p<0.0001)。CD11b阳性小胶质细胞是未治疗的横断组中最丰富的细胞类型，而在外泌体和ExoPTEN组中的丰富性则要低得多(F(2，24)＝25.18，p<0.0001)，两者之间无显著差异(图13B，组2，p＝0.9818。对于GFAP+星形胶质细胞观察到相似的表达谱(图13C)。我们发现，在未治疗的横断大鼠中通过CD31+细胞检测，检测到最低的血管生成水平(图13D)。

皮质脊髓束(CST)负责身体和后肢的自愿运动控制。为了研究鼻内ExoPTEN治疗是否可以再生该特定通道，我们使用生物素化的右旋糖酐胺(BDA)追踪其轨迹，其被注射到未治疗的、外泌体(IN)或ExoPTEN(IN)治疗的SCI大鼠的体动皮质中。我们发现，在未治疗的SCI组中，BDA阳性纤维未能穿透病灶(图14，上图)，而在外泌体治疗组中，在病灶内可见BDA阳性纤维，但未延伸到尾侧残端(图14，中图)。相反，在ExoPTEN组中，可以清楚地看到BDA阳性纤维穿透并延伸到病灶之外(图14，下图)。

尽管已经结合本发明的特定实施例描述了本发明，但是显然，对于本领域技术人员来说许多替代、修改和变化将是显而易见的。因此，旨在涵盖落入权利要求的精神和广泛范围内的所有这样的替代、修改和变化。尽管以上已经通过本发明的优选实施例描述了本发明，但是在不脱离权利要求所限定的本发明的精神和实质的情况下，可以对其进行修改。

序列表

<110> 技术研究及发展基金有限公司

雷蒙特亚特特拉维夫大学有限公司

<120> 包含PTEN抑制剂的囊泡及其用途

<130> TECH-075 PCT

<150> 62/649648

<151> 2018-03-29

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 403

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Thr Ala Ile Ile Lys Glu Ile Val Ser Arg Asn Lys Arg Arg Tyr

1 5 10 15

Gln Glu Asp Gly Phe Asp Leu Asp Leu Thr Tyr Ile Tyr Pro Asn Ile

20 25 30

Ile Ala Met Gly Phe Pro Ala Glu Arg Leu Glu Gly Val Tyr Arg Asn

35 40 45

Asn Ile Asp Asp Val Val Arg Phe Leu Asp Ser Lys His Lys Asn His

50 55 60

Tyr Lys Ile Tyr Asn Leu Cys Ala Glu Arg His Tyr Asp Thr Ala Lys

65 70 75 80

Phe Asn Cys Arg Val Ala Gln Tyr Pro Phe Glu Asp His Asn Pro Pro

85 90 95

Gln Leu Glu Leu Ile Lys Pro Phe Cys Glu Asp Leu Asp Gln Trp Leu

100 105 110

Ser Glu Asp Asp Asn His Val Ala Ala Ile His Cys Lys Ala Gly Lys

115 120 125

Gly Arg Thr Gly Val Met Ile Cys Ala Tyr Leu Leu His Arg Gly Lys

130 135 140

Phe Leu Lys Ala Gln Glu Ala Leu Asp Phe Tyr Gly Glu Val Arg Thr

145 150 155 160

Arg Asp Lys Lys Gly Val Thr Ile Pro Ser Gln Arg Arg Tyr Val Tyr

165 170 175

Tyr Tyr Ser Tyr Leu Leu Lys Asn His Leu Asp Tyr Arg Pro Val Ala

180 185 190

Leu Leu Phe His Lys Met Met Glu Glu Thr Ile Pro Met Phe Ser Gly

195 200 205

Gly Thr Cys Asn Pro Gln Phe Val Val Cys Gln Leu Lys Val Lys Ile

210 215 220

Tyr Ser Ser Asn Ser Gly Pro Thr Arg Arg Glu Asp Lys Phe Met Tyr

225 230 235 240

Phe Glu Phe Pro Gln Pro Leu Pro Val Cys Gly Asp Ile Lys Val Glu

245 250 255

Phe Phe His Lys Gln Asn Lys Met Leu Lys Lys Asp Lys Met Phe His

260 265 270

Phe Trp Val Asn Thr Phe Phe Ile Pro Gly Pro Glu Glu Thr Ser Glu

275 280 285

Lys Val Glu Asn Gly Ser Leu Cys Asp Gln Glu Ile Asp Ser Ile Cys

290 295 300

Ser Ile Glu Arg Ala Asp Asn Asp Lys Glu Tyr Leu Val Leu Thr Leu

305 310 315 320

Thr Lys Asn Asp Leu Asp Lys Ala Asn Lys Asp Lys Ala Asn Arg Tyr

325 330 335

Phe Ser Pro Asn Phe Lys Val Lys Leu Tyr Phe Thr Lys Thr Val Glu

340 345 350

Glu Pro Ser Asn Pro Glu Ala Ser Ser Ser Thr Ser Val Thr Pro Asp

355 360 365

Val Ser Asp Asn Glu Pro Asp His Tyr Arg Tyr Ser Asp Thr Thr Asp

370 375 380

Ser Asp Pro Glu Asn Glu Pro Phe Asp Glu Asp Gln His Thr Gln Ile

385 390 395 400

Thr Lys Val

<210> 2

<211> 27

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Exemplary siRNA sequences that are contemplated for inhibition of

PTEN

<400> 2

guuagcagaa acaaaaggag auaucaa 27

<210> 3

<211> 27

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Exemplary siRNA sequences that are contemplated for inhibition of

PTEN

<400> 3

uugauaucuc cuuuuguuuc ugcuaac 27

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Exemplary siRNA sequences that are contemplated for inhibition of

PTEN

<400> 4

cagccguucg gaggauuauu cgucutt 27

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Exemplary siRNA sequences that are contemplated for inhibition of

PTEN

<400> 5

agacgaauaa uccuccgaac ggcugtt 27

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Exemplary sequence to which the PTEN siRNA may be targeted

<400> 6

gagttcttcc acaaacagaa 20

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Exemplary sequence to which the PTEN siRNA may be targeted

<400> 7

gtatagagcg tgcagataa 19

<210> 8

<211> 10

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Examples of oligonucleotide sequences that can be used to form

the loop

<220>

<221> n

<222> (10)..(10)

<223> n=a, u, t, c, g or absent

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> n is a, c, g, or u

<400> 8

uucaagagan 10

<210> 9

<211> 10

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Examples of oligonucleotide sequences that can be used to form

the loop

<220>

<221> n

<222> (10)..(10)

<223> n=a, u, t, c, g or absent

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> n is a, c, g, or u

<400> 9

uuuguguagn 10

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> artificial sequence

<400> 10

gaguucuucc acaaacagaa 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> artificial sequence

<400> 11

uucuguuugu ggaagaacuc 20

Claims

1.一种药物组合物，其包含装载有外源磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)抑制剂的细胞外囊泡。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述细胞外囊泡选自外泌体、微囊泡、核外粒体、外囊泡及其组合。

3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述细胞外囊泡是外泌体。

4.根据权利要求1至3任一项所述的药物组合物，其中所述细胞外囊泡源自表达间充质标志物的贴壁细胞。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其中所述表达间充质标志物的贴壁细胞选自间充质干细胞(MSC)和嗅鞘细胞。

6.根据权利要求4或5所述的药物组合物，其中所述贴壁细胞选自牙髓干细胞(DPSC)、脱落的乳牙干细胞(SHED)、牙周膜干细胞(PDLSC)、牙根尖乳头干细胞(SCAP)和牙囊祖细胞(DFPC)。

7.根据权利要求1至6任一项所述的药物组合物，其中所述贴壁细胞表达神经嵴细胞的标志物。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，其中所述神经嵴细胞是颅神经嵴细胞。

9.根据权利要求1至8任一项所述的药物组合物，其中所述外源PTEN抑制剂是PTEN表达的抑制剂。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，其中所述PTEN表达的外源抑制剂是RNA干扰(RNAi)寡核苷酸。

11.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述RNAi寡核苷酸选自siRNA和shRNA。

12.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述RNAi寡核苷酸选自：(i)包含选自SEQID NO：10、11、2、3、4和5的核酸序列的siRNA；(ii)靶向选自SEQ ID NO：6和7的核酸序列的siRNA；和(iii)包含(i)和(ii)的核酸变体的siRNA，所述变体与原始序列具有至少80％的序列同一性。

13.根据权利要求10至12任一项所述的药物组合物，其中所述RNAi寡核苷酸还包含疏水部分。

14.根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述疏水部分选自固醇、神经节苷脂、脂质、维生素、脂肪酸、疏水肽，及其组合。

15.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述固醇是胆固醇。

16.根据权利要求1至15任一项所述的药物组合物，其中所述细胞外囊泡是分离的细胞外囊泡。

17.根据权利要求1至16任一项所述的药物组合物，其还包含软骨素酶ABC或包含软骨素酶ABC的细胞外囊泡。

18.根据权利要求1至17任一项所述的药物组合物，其被配制用于通过选自鼻内、病变内、鞘内、静脉内、肌内、皮下、舌下、口服和脑内施用途径的施用途径进行施用。

19.根据权利要求1至18任一项所述的药物组合物，用于治疗受试者的神经元损伤或损害。

20.根据权利要求19所述的用途的药物组合物，其中所述神经元损伤或损害是脊髓损伤(SCI)。

21.根据权利要求20所述的用途的药物组合物，其中所述细胞外囊泡是源自MSC并装载有抑制PTEN表达的siRNA的外泌体。

22.根据权利要求21所述的用途的药物组合物，其中所述siRNA包含选自SEQ ID NO：10、11、2、3、4和5的核酸序列。

23.根据权利要求22所述的用途的药物组合物，其中所述siRNA与胆固醇部分缀合。

24.根据权利要求19至23任一项所述的用途的药物组合物，其中所述用途包括鼻内施用所述组合物。

25.根据权利要求19至23任一项所述的用途的药物组合物，其中所述用途还包括施用软骨素酶ABC。

26.根据权利要求25所述的用途的药物组合物，其中装载有外源PTEN抑制剂的细胞外囊泡和软骨素酶ABC以单一的药物组合物或以不同的药物组合物施用。

27.装载有外源磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)抑制剂的分离的细胞外囊泡，其中所述细胞外囊泡源自细胞。

28.根据权利要求27所述的分离的细胞外囊泡，其中所述细胞外囊泡选自外泌体、微囊泡及其组合。

29.根据权利要求27或28所述的分离的细胞外囊泡，其中所述细胞外囊泡源自表达间充质标志物的贴壁细胞。

30.根据权利要求29所述的分离的细胞外囊泡，其中所述表达间充质标志物的贴壁细胞选自间充质干细胞和嗅鞘细胞。

31.根据权利要求27至30任一项所述的分离的细胞外囊泡，其中所述细胞外囊泡源自表达来自神经嵴细胞的标志物的贴壁细胞。

32.根据权利要求27至31任一项所述的分离的细胞外囊泡，其中所述外源PTEN抑制剂是RNA干扰(RNAi)寡核苷酸。

33.根据权利要求32所述的分离的细胞外囊泡，其中所述RNAi寡核苷酸选自siRNA和shRNA。

34.根据权利要求33所述的分离的细胞外囊泡，其中所述RNAi寡核苷酸选自：(i)包含选自SEQ ID NO：10、11、2、3、4和5的核酸序列的siRNA；(ii)靶向选自SEQ ID NO：6和7的核酸序列的siRNA；和(iii)包含(i)和(ii)的核酸变体的siRNA，所述变体与原始序列具有至少80％的序列同一性。

35.根据权利要求32至34任一项所述的分离的细胞外囊泡，其中所述RNAi寡核苷酸包含疏水部分。

36.根据权利要求35所述的分离的细胞外囊泡，其中所述疏水部分选自固醇、神经节苷脂、脂质、维生素、脂肪酸、肽，及其组合。

37.根据权利要求36所述的分离的细胞外囊泡，其中所述固醇是胆固醇。

38.根据权利要求27所述的分离的细胞外囊泡，其中所述囊泡是装载有抑制PTEN表达的胆固醇缀合的siRNA分子的外泌体，其中所述外泌体源自间充质干细胞。

39.根据权利要求38所述的分离的外泌体，其中所述siRNA包含选自SEQ ID NO：10、11、2和4的核酸序列。

40.根据权利要求27至39任一项所述的分离的外泌体，所述分离的外泌体还包含软骨素酶ABC或编码其的多核苷酸。

41.一种治疗有需要的受试者的神经元损伤或损害的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的装载有外源磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)抑制剂的细胞外囊泡，从而治疗所述损伤或损害，其中所述细胞外囊泡源自细胞。