JP6483115B2 - Ｐｔｅｎ阻害剤からなる損傷神経の治療剤 - Google Patents

Description

本願発明は、損傷を受けた神経の再生方法又は変性を減ずる方法に関係し、損傷を受けた神経に若しくはその近辺に、ホスファターゼ及びテンシン同族体(PTEN)脂質ホスファターゼ阻害ペプチドを、神経再生若しくは神経変性を減ずる有効量を投与することを含む。

成人の哺乳類神経系で、損傷を受けたニューロンの再生は、損傷神経への治癒レスポンスにおいてほとんど生じない。それには、２つの主要な理由があり、成人のCNSニューロンが損傷後に再生しないというのが一の理由である。軸索は、損傷において分泌された細胞外阻害因子によるその阻害だけでなく、急速に老化を通じて減少する、固有の軸索成長能力の損失のために、成人の中枢神経系では再生しない[Schwab et al; 1996, Goldberg et al. 2002; Filbin et al. 2006; Fitch et. al 2008]。しかしながら、神経損傷で分泌された細胞外の阻害因子の排除は、非常に限定されてインビボ軸索再生の引き金となる[Yiu et. al 2006; Hellal et al. 2011] 。 したがって、固有の神経伸張の調節による軸索の再生プロセスの促進は、現在、神経損傷処置の治療標的の焦点である。

PTEN(ホスファターゼ及びテンシン同族体)タンパク質は、２つの部分からなるホスファターゼで、フォスファチジルイノシトール（phosphatidylinositol）3-キナーゼ(PI3K)シグナルパスウェイをネガティブに制御することにより腫瘍抑制物質として重要と考えられる。PI3Kシグナルパスウェイは、タンパク質合成、代謝及び運動性と同様に細胞増殖、生存及び分化のための重要な信号伝達パスウェイである[Zhang et al. 2010]。脂質ホスファターゼとして、PTENは、ホスファチジルイノシトール(3,4,5)三燐酸塩(PIP₃)を、ホスファチジルイノシトール(4,5)ピロ燐酸塩(PIP₂)に、PIP₃の3つの位置を脱燐することにより、転換する触媒であって、PI3K活性に拮抗することでPI3Kシグナルパスウェイを阻害する[Di Cristofano et. al 2010]。PTENの欠失あるいは不活性化は、PI3K活性を増強し、腫瘍形成に結びつく、PDK1、Akt及びラパマイシン（rapamycin）(mTOR）哺乳類の標的を含む、PI3Kシグナルパスウェイの下流のコンポーネントの活性化を促進する[Di Cristofano et. al 2010; Stambolic et al. 1998 ]。

PTENによるPI3K介在シグナリングの制御も、深く、神経系中の神経再生プロセスと関係がある。最近の研究は、PTENタンパク質の阻害あるいはPTEN遺伝子の欠失が、損傷を受けた成人のCNS/PNS神経の、固有の再生結果を、促進することが明らかにされた[Park et. al 2008; Liu et. al 2010; Sun et. al 2012; Christie et. al 2012]。例えば、パーク等は、条件付きのノックアウトマウスを使用する大人のラットレチナール神経節細胞(RGCs)におけるPTENの欠失が、PI3K-Akt-mTORシグナルパスウェイを再活性化することによって、視神経損傷の後に、実際に、強健な軸索再生を促進することを見出した。また、mTORパスウェイの別のネガティブレギュレータの条件付きのノックアウトによって、mTORパスウェイを再活性化することは、軸索再生に導き、それは、PI3K-mTORシグナリングの促進が、固有の軸策再生能力を回復するための主要因子かもしれないことを示す。 さらにリウ等は、PI3Kシグナルパスウェイのアップレギュレートにより、インビボのCNS損傷モデルでPTENの条件付きの欠失が、CNS損傷で減じたニューロンのmTOR活性を実際に増加させ、それは非損傷CST軸索の増強された補い的な成長、及び脊髄損傷後に損傷CST軸索の成功した再生に結びつく、ことを報告した。PNS損傷の場合には、インビトロ及びインビボの両方で、PTENの阻害が、また、軸索造成を増加させる[Christie et. al 2012]。したがって、PI3K-mTORシグナルパスウェイを促進するためのPTEN阻害剤の開発は、損傷した神経系での軸索再生を増強するのによい治療標的である。PTEN阻害剤は、CNSかPNS損傷の後に、神経再生用の他の有効な試薬を含む既存か新規な細胞療法を備えた組合せ治療法において使用されうる。

本検討において、我々は神経再生及び/又はPI3Kシグナルパスウェイの刺激による神経変性からの保護に有効なPTEN阻害剤候補物質を開発した。脂質ホスファターゼのような、PTENの活性化のために、PTENは、適切な方向付けで原形質膜に局在するに違いない[Leslie et. al 2008]。したがって、我々は、ペプチドの形の潜在的なPTEN阻害剤候補を設計するためにPTEN膜局在化のメカニズムを検討した。異なる3つのペプチド−TGN-1、TGN-2及びTGN-3−は、 潜在的PTEN阻害剤として設計され合成され、インビトロのPTEN活性分析を使い、PTEN活性に対するそれらの阻害能が検討された。さらに、我々は、ニューロンの細胞系の使用により、PI3Kシグナルパスウェイの制御に対するそれらの効果を特徴づけた。我々は、PTENのＣ-末端域のフォスフォリレーション（リン酸化）部位をミミックして修飾されたペプチドである、TGN-1及びTGN-2ペプチドが、実際に、インビトロPTEN活性分析において、PTEN脂質ホスファターゼ活性を減じた、ということを見出した。TGN-1ペプチドは、さらに、PC12細胞のAktタンパク質の活性化レベルを増強し、これらのペプチドがPI3K-Aktシグナルパスウェイをアップレギュレートするのに有効であることを示した。ニューロン細胞での神経突起分析は、TGN-1及びTGN-2ペプチドが、神経突起微小管構造の増強による遅れた神経突起変性と同様に神経突起伸張も促進したことを示した。したがって、TGNペプチドは、CNS損傷の後に神経再生のための治療薬として有用である。

1つの態様では、本発明は下記に関する:

1つの態様では、本発明は、神経を再生するか若しくは神経変性を減ずる、ホスファターゼ及びテンシン同族体(PTEN)脂質ホスファターゼ阻害ペプチドの有効量を、損傷神経に若しくはその近辺に、投与することを含む、神経損傷部位での、神経の再生若しくは神経の変性を減じる方法を志向する。該PTEN阻害ペプチドは、修飾PTENペプチド若しくはその断片でありえ、そのリン酸化部位は、リン酸化部位におけるセリン若しくはスレオニンが燐酸化されるように修飾される。燐酸化されるセリン若しくはスレオニンは、Thr-366、Ser-370、Ser-380、Thr-382、Thr-383あるいはSer-385に位置してもよい。燐酸化されるセリン若しくはスレオニンは、Ser-370、Ser-380及び/又はSer-385に位置してもよい。燐酸化されるセリン若しくはスレオニンは、Ser-370、Ser-380及びSer-385に位置してもよい。燐酸化されるセリン若しくはスレオニンは、Ser-380及びSer-385に位置してもよい。該ペプチドは、リン酸化部位及び/又はPDZドメイン結合モチーフのペプチドの断片でありうる。該ペプチドは、さらに、ペプチド・トランスファードメイン(PTD)を含みうる。該神経損傷は、中枢神経系であってもよい。

別の態様では、本発明は、ホスファターゼ及びテンシン同族体(PTEN)脂質ホスファターゼ活性を阻害するペプチドを志向する。PTENペプチド性阻害剤は、修飾PTENペプチド若しくはその断片でありえ、そのリン酸化部位のセリン若しくはスレオニンが燐酸化されるように、そのリン酸化部位が修飾される。燐酸化されるセリン若しくはスレオニンは、Thr-366、Ser-370、Ser-380、Thr-382、Thr-383あるいはSer-385に位置してもよい。燐酸化されるセリン若しくはスレオニンは、Ser-370、Ser-380及び/又はSer-385に位置してもよい。燐酸化されるセリン若しくはスレオニンは、Ser-370、Ser-380及びSer-385に位置してもよい。燐酸化されるセリン若しくはスレオニンは、Ser-380及びSer-385に位置してもよい。該ペプチドは、リン酸化部位及び/又はPDZドメイン結合モチーフのペプチドの断片でありうる。該ペプチドは、さらにペプチド・トランスファードメイン(PTD)を含んでもよい。該神経損傷は、中枢神経系であってもよい。

さらに別の態様では、本発明は、神経細胞とテンシン同族体(PTEN)脂質ホスファターゼ阻害ペプチドとを接触させることを含む、神経細胞の活性を賦活する、神経細胞を増殖する、増強する方法を志向する。

これら及び本発明の他の目的は、本発明の以下の記述、添付の引用図面、及び付加された請求項からより完全に理解されうる。

本発明は、以下の詳細な記述及びイラストレーションの方法で提供される添付図面からより完全に理解されうる。そして、これらは本発明を制限するものではない。

図1A-1Bは、潜在的なPTEN阻害剤としてのTGNペプチドのデザインを示す。 A) PTENのＣ-末端領域の図。PTENのＣ-末端領域は、C2ドメイン(AA186〜403)、リン酸化部位(AA352〜399)、及びPDZドメイン結合モチーフ(400〜403)を含んでいる。リン酸化部位及びPDZドメイン結合モチーフを含んでいる部位(AA352〜403)は、テンプレートとしてTGNペプチド設計に使用された。B) TGNペプチドのアミノ酸配列。TGN-1、TGN-2及びTGN-3ペプチドはPTENリン酸化部位を模倣し、そこで、示された残基は燐酸化によって修飾された。TGN-4ペプチドは、TGN-1のためのスクランブルされたペプチドであり、また、TGN-5ペプチドはTGN-2のためのスクランブルされたペプチドである。

図2A-2Cは、TGNペプチドでのインビトロのPTEN活性分析表わす。 A) マラカイトグリーン分析キットを使用するインビトロのPTEN活性分析のメカニズム。C8-PIP₃は、PTEN基質として使用され、他のリン脂質(DOPCとDOPC)を備えたリポソームとして調製された。C8-PIP₃からPTENによって生産されたリン酸塩イオンは、620nmでリン酸塩イオン・マラカイトグリーン試薬複合体の光学密度をモニターすることにより測定された。B) インビトロのPTEN活性に対するTGNペプチドの効果。TGN-1、TGN-2及びTGN-3ペプチドが、インビトロのPTEN活性分析によってそれらのPTEN阻害効果を検討された。各ペプチドの10μMが、20ngのヒト組み換えPTENタンパク質及び反応ボリューム100μLでのリポソームとしてのC8-PIP₃の0.1 mMとインキュベートされた。TGN-4及びTGN-5ペプチドは、各々、TGN-1及びTGN-2/3ペプチドに特異性ある配列チェックするために使用された。データはすべて、実験の結果を3回繰り返して表わす。C) TGN-1及びTGN-2ペプチドのためのIC₅₀カーブ。IC₅₀値は、用量依存的な方法でTGN-1及びTGN-2ペプチドでのインビトロのPTEN活性分析によって測定され、プリズム5ソフトウェアによって計算した。TGNペプチドに対するIC₅₀値は、TGN-1は19.93μM、TGN-2は4.83μM及びTGN-3は87.12μMである。

図3A-3C は、TGN-1ペプチドが、インビボで、Akt活性化レベルを増加させ、PI3K-Aktシグナリングを促進することを示す。 A) TGN-1を使用して、PTEN活性をブロックすることによるAkt活性化のメカニズム。PI3KシグナルパスウェイでのTGN-1の導入は、PI3Kシグナリングを促進し、Akt活性化(燐酸化)レベルを促進する。B) PC12細胞リゼートをもつウェスタンブロット・データ。PC12細胞は、TGN-1ペプチド(10μM、100μM))あるいはTGN-4ペプチド(10μM)のいずれかで処理され、24時間インキュベートされた。抗フォスフォAkt抗体を使用するウェスタンブロット・データは、TGN-1が用量依存的な方法で、特異的に、内生的なAkt活性化レベルを促進することを示した。C) PTENとβ-アクチンの発現レベルは、陽性の充填コントロールとしてもモニターされた。

図4A-4Bは、神経突起変性に対する神経栄養性の効果及び神経保護効果をもたらすTGN-1及びTGN-2ペプチドを表わす。Ａ）分化したPC12細胞が、1時間、Nocodazole(0.5μM)でまず処理され、さらに72時間、NGF(10ng/mL)及びTGNペプチド(TGN-1及びTGN-2、100μM/各々)を含んでいる新鮮培地でインキュベートした。相対的な神経突起安定性が、イメージJソフトウェアを使用して、免疫蛍光検査法イメージからの緑/赤蛍光信号強度の比率として計算された。全ての蛍光信号強度は、緑/赤比率計算のために、各サンプル当たり少なくとも3回測定され、及び標準化された(培地のみ=100%)。 Ｂ）分化したPC12細胞での神経突起伸張の定量。PC12細胞は、24時間、NGF(50ng/ml)を含んでいる分化用培地で処理され、さらに2日間TGNペプチド(100μM/各々)でインキュベーションを続けた。TGN-4ペプチドは、TGN-1のためのネガティブコントロールとして使用された。神経突起定量は、3日目で、分光測定法で神経突起定量キット(ミリポア社)を使用され、及び標準化された(培地のみ=100%)。

図5は、細胞膜表面でのPTENの界面活性化の仮説モデルを示す。PTENは、インビボで２つの立体構造状態をもつと現在考えられ、完全にその脂質ホスファターゼ活性を発現するために膜に局在化するために構造変化を受けることが提案されている。PTENの可溶化型は、閉鎖構造を持った不活性な状態であり、そこでは、PTENのＣ-末端領域の燐酸化されたサイトが、PTEN膜会合を防ぐために、PTEN活性部位及びC2ドメインを、空間的にマスクする。「リン酸化部位」での燐酸化された残基が、脱燐酸化される場合、PTENは、その構造を、閉鎖型から開放型に変更する。この段階では、PTENのC2ドメインに局在する多数の膜結合モチーフは露出され、膜と会合させる準備ができている。さらに、PTEN活性部位の結合ポケットは、膜表面に存在するPIP₃基質へのアクセスに利用可能である。Ｃ-末端のPDZドメインの結合モチーフの補助タンパク質(NHERF1)PDZドメインへの結合と同様に、Ｎ-末端PIP₂の結合モチーフとの膜表面でのPIP₂の結合は、PTENが、その脂質ホスファターゼ活性が生じるのに必要なその適切な位置において細胞膜表面に局在化されたのちに、おこる。

本願発明において、「a」及び「an」は、単一及び複数の対象物の両方を参照するために使用される。

ここに使用される、損傷した神経若しくは神経系の"近くへの"細胞の注入の近くとは、損傷部位での損傷神経細胞の神経再生若しくは変性の防止の効果的な結果を達成するために、注入サイトと損傷領域の間で、十分に接近している領域を、意味する。したがって、損傷した神経の、あるいはその神経の近くへの細胞の注入は、損傷部位で又は効果的なポリペプチドを発現するのに注入細胞にとって十分に接近するどこかを含み、そして該ポリペプチドは直接若しくは間接に神経再生若しくは神経変性防止効果を発揮する。末梢神経、特に脊髄損傷では、損傷部位で細胞が漏れる傾向があるので、注人は、損傷部位の上流になされうる。

ここに使用される、「神経突起」とは、神経細胞の細胞本体からな何らかの突出を意味する。この突出は、軸索若しくは樹状突起でありえる。未成熟な若しくは発生中のニューロン（神経細胞）が、特に培養における細胞のものが、対象とされるときにしばしばつかわれる。というのは、分化が完成する前には、軸索を樹状突起から区別するのが難しいからである。

ここに使用される、「神経の再生」とは、中枢神経系(CNS)あるいは末梢神経系(PNS)のいずれかでの、神経損傷での、新しい神経細胞、ニューロン、神経膠、軸索、ミエリンあるいはシナプスの生成を意味する。再生は、PTENの阻害によるPI3K-mTOR-仲介シグナリングの活性化によって回復された固有の神経再生能力によって引き起こされる。

ここに使用される、神経変性の減弱若しくは抑制というのは、中枢神経系(CNS)あるいは末梢神経系(PNS)における神経損傷によって起される軸索、神経膠あるいはミエリン鞘構造の変性を遅延することを意味する。この減弱若しくは抑制は、PTEN阻害によって活性化される、PI3K-mTOR-仲介シグナリングと密接に関連したニューロンの微小管構造安定化によって達成される。

ホスファターゼ及びテンシン同族体(PTEN)

PTENアミノ酸配列は以下のとおりである:

PTENタンパク質は、現在、PI3K-Akt-mTORシグナリングを促進することにより、減弱された固有の神経再生能力を回復するという、成人CNS系で損傷した神経を再生するために治療用材料を開発することのポピュラーな標的になっている[Park et. al 2008; Liu et. al 2010; Sun et. al 2012]。新規なPTEN阻害剤の開発は、PTEN活性制御分子を開発するためのよい戦略であると考えられる。不運にも、PTENタンパク質のX線の結晶構造[Lee et. al 1999]は、直接にPTEN基質結合を阻害する有効なPTEN阻害剤の設計にとって重要である、PTEN基質(PIP₃)結合ステータスに十分な情報を提供していない。代替的に、PTENがその活性について原形質膜を標的とするメカニズムは集中的に検討中にある。ホスファチジルイノシトール(3、4、5)ピロ燐酸塩(PIP₃)、PTEN酵素の基質、は、細胞の細胞膜脂質二重層で見つかったリン脂質のメンバーであるが、PTENタンパク質は可溶のタンパク質として元々生産され、構造変化を通じてその脂質ホスファターゼ活性のために界面的に活性化されなければならなず、それは適切な方向付けでPTEN膜会合に続く[Das et. al 2003; Leslie et. al 2008]。 PTEN C2ドメインにあるいくつかの荷電アミノ酸及び結合モチーフは、細胞膜表面でPTENタンパク質を接着する、主要なアンカーであると考えられる[Lee et. al 1999; Georgescu et. al 2000; Leslie et. al 2008]。他の結合モエティーを使用する付加的な結合は、PTENが、生じるPTENの脂質ホスファターゼ活性のために細胞膜上で適切に方向付けされることが必要である[Chambell et. al 2003; Walker et. al 2004; Odriozola et. al 2007]。

PTENのＣ-末端領域中の非構造的な部分(AA 352-399)は、「リン酸化部位」と呼ばれ、この部位が燐酸化修飾サイトとして知られている6つのセリン/スレオニン(Thr-366、Ser-370、Ser-380、Thr-382、Thr-383及びSer-385)残基を含んでいる[Lee et. al 1999; Vazquez et. al 2001]。従来の研究は、この「リン酸化部位」中のこれらの6つの残基の変異あるいは欠失が、より大きな腫物抑制活性に導き、PTEN膜親和性を増強し、タンパク質安定性を減少したことを明らかにした[Vasquez et. al 2001; Das et. al 2003; Okahara et. al 2004; Rahdar et. al 2009]。

現在、PTENタンパク質は、2つの構造状態(図4)があると信じられている。「閉鎖」構造では、PTNは、不活性である、というのは、「リン酸化部位」を含むPTENのＣ-末端領域が、細胞膜へのPTEN会合及び活性部位へのPIP₃アクセスを防いでいる、PTEN活性部位ポケットと同様に、C2ドメインに局在する膜結合モチーフをマスクするからである。他方、PTENは、「開放」構造状態で、界面的に活性になり、そこでは、PTEN活性部位ポケット及びC2ドメインは、両方非マスク状態であり、完全に細胞膜及びその基質PIP₃に曝される。さらに、「リン酸化部位」のこれらの6セリン/スレオニン残基の燐酸化状態は、PTEN界面活性化の重要な要素であると考えられ、というのは、閉鎖構造から開放構造へのPTENタンパク質の構造変化を直接コントロールするからである[Das et. al 2003, Vasquez et. al 2006; Odriozola et. al 2007, Rahdar et. al 2009]。

現在示唆されたモデル(図5)によれば、膜表面でのPTENの界面活性化に必要な3ステップがある。

１）「リン酸化部位」での燐酸化セリン/スレオニン残基の脱燐が、「閉鎖」から「開放」構造へのPTEN構造変化の引き金となり、それはPTENタンパク質を、細胞膜と会合させ、細胞膜に局在するPIP₃基質にPTEN活性部位ポケットを露出させる。

２）その後、C2ドメインの多数の膜を結合モチーフが、膜表面でPTENタンパク質をアンカーさせるために細胞膜と相互作用する。

３）細胞膜でのＮ-末端PIP₂結合部位(AA6-15)とPIP₂分子の間の付加的相互作用[Walker et. al 2004]は、補助NHERF1タンパク質のPDZドメインとＣ-末端のPDZドメイン結合部位(AA400-403)の結合[Takahashi et. al 2006; Molina et. al 2010]と同様に、さらに両方とも、細胞膜表面でのPTEN方向付けの調節に必要である。

我々は、図4に示される、特に「リン酸化部位」及びPDZドメイン結合部位(AA 352-403)において、PTEN膜局在化モデルに基づき、潜在的なPTEN阻害剤としてTGNペプチドを設計した。潜在的なPTEN阻害剤としてのTGNペプチドの基本概念は、膜結合に必要なPTEN活性部位及びC2ドメインをマスクすることによって、PTEN及び細胞膜表面間の、会合を防ぐことである。Ser370とSer385が、カゼイン・キナーゼIIによって優先的に燐酸化されるので[Miller et. al 2002]、他の残基が変異させられる場合[Odriozola et. al 2007]以上に、ホスファターゼ活性と同様に膜局在化も増加される。したがって、これらの２つのセリン残基のうちの少なくとも1つが、すべてのTGNペプチド（TGN-1におけるSer370／385、TGN-2／TGN-3におけるSer385)に含まれていた。さらに、380及び385部位での燐酸化セリン残基は、現在、実際の基質PIP₃へのアクセスからPTEN活性部位の触媒ポケットをマスクする「偽基質」の一部であると考えられる[Odriozola et. al 2007]。該ペプチドは、TGNペプチドのすべてで、これらの2つのセリン残基(Ser 380及びSer 385)を含むようにデザインされた。

TGN-1ペプチド配列は、PTENリン酸化部位のAA 365〜388部位を模倣し、3つの燐酸化された修飾残基(Ser370、Ser380及びSer385)をもつ4つのセリン/スレオニン残基(Thr366、Ser370、Ser380及びSer385)を含んでいる。TGN-2及びTGN-3ペプチドは、Ｃ-末端PDZドメイン−結合モチーフ(ITKV)と同様に、2つの燐酸化されたセリン残基も(Ser380とSer385)含み、PTENタンパク質のAA376-403部位を模倣する。TGN-1及びTGN-2ペプチドの両方のセリン残基だけが、スレオニン残基の燐酸化が、インビボでの第2の修飾に帰着し、さらに、変異させられた時、PTEN膜結合親和性を変更することにそれほど有効ではないので、インビボのPTENのリン酸化部位を模倣するために燐酸化された[Odriozola et. al 2007; Rahdar et. al 2009]。TGN-3ペプチドにおいて、2つのセリン残基(Ser380とSer385)が比較のためにバリンで置換された。さらに、TGN-1及びTGN-2/3ペプチドの配列は、配列特異性を検査するためにスクランブルされた。また、これらのペプチドは、TGN-4及びTGN-5ペプチドとしてそれぞれ名づけられた。

組み換えヒトPTENタンパク質及び基質としてのC8-PIP₃での、インビトロの活性分析及びIC₅₀は、TGN-1及びTGN-2ペプチドが用量依存的な方法においてインビトロでPTEN活性を特異的に阻害することを示した（図２）。C8-PIP₃は、他のリン脂質分子(DOPC/DOPS)と共に、合成脂質小胞(細胞膜脂質二重層を模倣するシステム)として、PTENタンパク質に導入された。活性分析結果は、TGN-1及びTGN-2ペプチドが、直接に、PTENタンパク質と相互作用し、基質(C8-PIP₃)がPTEN活性部位に結合するのを阻止するために、PTEN−小胞膜会合に介入することにより、PTEN活性をインビトロで阻害できることを示唆した。実際、インビトロで、リポソーム形状の代わりにのみ、C-8 PIP₃脂質の直接の添加でのPTEN活性分析は、PTEN活性を呈さない(データ示していない)。TGN-2ペプチドと比べられたTGN-3ペプチドによる多くの減小された阻害効果は、セリン残基(Ser380とSer385)での、燐酸化修飾は、TGNペプチドによるインビトロのPTEN阻害の重要な因子であることを示唆する。さらに、TGN-2ペプチドは、TGN-1ペプチド(TGN-1に対するIC₅₀値は19.93μMで、TGN-2のために4.83μMである)より、インビトロのPTEN活性に関し、ほぼ４倍高い阻害効果を示した。TGN-1及びTGN-2ペプチド間の構造の主な差異は、TGN-2ペプチドが、PDZドメイン結合モチーフ(AA 399〜403)を含んでいる、PTENのＣ-末端領域(AA389〜403)の最後の15のアミノ酸配列を含むということである。活性分析がインビトロの状態で行なわれ、TGN-2ペプチドに存在する該最後の15のアミノ酸配列が、PTEN−小胞膜会合に、より効率的に介入するために、PTENタンパク質へのより高い結合親和性を提供するか、又はTGN-1ペプチドより、PTEN活性部位で基質結合ポケットをより効果的にマスクすることが、説明されうる。

さらに、TGN-1ペプチドは、ニューロン細胞のPI3K-Aktシグナルパスウェイを制御するために、PTEN活性をブロックするのに有効である(図3)。内在性若しくは過剰発現 PTENを含んでいるPC12細胞が、24時間TGN-1で培養され、Aktタンパク質の活性化(燐酸化)レベルが抗フォスフォ Akt抗体を使用して、ウェスタンブロットによって検査された。TGN-1ペプチドで処理された細胞溶解物中のAktタンパク質の燐酸化レベルは、PI3K活性に拮抗するためにTGN-1ペプチドが特異的にPTENを阻害することを示し、TGN-4ペプチドあるいはDMSOで処理された溶解物よりはるかに高かった。したがって、TGN-1ペプチドは、PTEN活性を抑制することによりPI3K-Aktシグナルパスウェイを促進するのに有効である。

微小管安定化が、軸索の再生能力及びニューロンの極性化の促進により脊髄損傷を治療することにとって重要であると考えられるので[Sengottuvel et al 2011, Hellal et al 2011, Witte et al 2008]、我々は、分化したニューロン細胞での神経突起変性を引き起こすためにNocodazoleを採用し、TGNペプチドが、微小管安定化によって神経保護効果を示すかどうかをテストした。微小管安定が、α-チューブリン・アセチル化レベルに密接に関係する[Takemura et al 1992]ので、我々は安定化した神経突起を、抗アセチル化α−チューブリン抗体で免疫染色した。免疫蛍光検査法データ(図4A)は、TGN-1及びTGN-2ペプチドが、神経突起変性を遅延ために、実際に、神経突起微小管構造を安定化させることを実証した。さらに、TGN-1ペプチドの添加は、特異的に、ニューロンの細胞分化プロセスでの、神経突起伸出を促進する(図4B)。したがって、TGN-1及びTGN-2ペプチドは、神経突起変性に対する神経保護作用と同様に神経栄養性の効力をも示す。

従来の研究で、Odriozola et.alは、Ｃ-末端のリン酸化部位クラスタ(AA368 〜 390)、TGN-1ペプチド配列に似ている、を包含する合成のフォスフォミミックなペプチド(Cp-23、Cp23DE)は、PTEN触媒作用の阻害をインビトロで仲介することを報告した。さらに、GFP融合フォスフォミミックペプチドでトランスフェクトされた293T細胞での分析は、PTEN膜会合のレベルを減少させて、かつフォスフォ-Aktレベルを上昇させると示された。しかしながらOdriozolaらで使用されたフォスフォミミックペプチド(Cp-23、Cp23DE)は、PTEN「リン酸化部位」のAA 368〜390部位だけを模倣し、本TGNペプチドでのように非燐酸化セリン残基を含む。 実際、Odriozolaペプチド(Cp23)及びTGN-1ペプチドは、ほとんど同一のアミノ酸配列を共有するが、TGN-1ペプチドの阻害能は、インビトロのIC₅₀値(TGN-1に対するIC₅₀値は19.93μMで、Cp23は〜 1033μMである)の比較により、Odriozolaペプチド(Cp23)よりほとんど50倍高い。さらに、Odriozolaペプチド(Cp23(1033μM)とそのスクランブルペプチド(Cp23-Der、945μM))間の、IC₅₀値にほぼ差はなかった。しかしながら、TGN-1ペプチドは、そのスクランブルペプチドTGN-4(図2B)よりはるかに高い阻害効果を示し、それはTGN-1ペプチドが、Odriozolaペプチド(Cp23)がそうすることに失敗する時、インビトロで、PTEN活性について、配列特異的に阻害効果を発揮することを示す。さらに、TGN-2ペプチドは、PDZドメイン結合モチーフを含む付加的15アミノ酸残基を含んでいることにより、Odriozolaペプチド(Cp23)とは異なり、それは、PTEN阻害(TGN-2に対するIC₅₀値は4.93μMである)に有効なことを既に示されている。さらに、TGN-1及びTGN-2ペプチドは、細胞へこれらのペプチドを直接導入することができるように、それらのＮ-末端部にPTD(ペプチド・トランスファードメイン)配列を含んでおり、そこでは、Odriozolaペプチドは、GFPと融合され、細胞へトランスフェクトされる必要がある。したがって、TGN-1及びTGN-2ペプチドは、インビトロ及びインビボで、有効なPTEN阻害能力を保持する。

我々は、「リン酸化部位」を含むPTENのＣ-末端領域の模倣により、ペプチドを開発した。TGN-1及びTGN-2は、ニューロン細胞でPTEN活性のブロッキングにより、インビトロでのPTEN活性及びアップレギュレートされたPI3K-Aktシグナルパスウェイに関し、特異的で有効な阻害効果を示した。PTENの阻害によるPI3K-Akt-mTORシグナリングの促進は、CNS損傷での、神経再生に有効であると知られているので[Saijilafu et al 2013]、創造されるペプチドは、CNS損傷のための治療若しくは処置剤として有用である。TGNペプチドと分化ニューロン細胞を使用する神経突起分析は、TGN-1及びTGN-2ペプチドが、神経突起微小管構造の増強による変性神経突起における神経保護効果と同様に、明白に神経組織栄養性の効力を示すことを実証した。したがって、これらのペプチドは、神経変性の進行を遅延することと同様に、CNS損傷を含む神経損傷後の神経再生の治療標的である。

ペプチド設計
本発明のペプチドは、PTEN阻害剤として、ここに「TGNペプチド」とも呼ばれ、テンプレートとしてPTENのＣ-末端領域(アミノ酸残基352 〜 403)を使用して設計された。

TGNペプチドのすべては、PTD(ペプチド・トランスファードメイン)配列を含み、それは膜透過性を増加させるためにＮ-末端部にRRRRRRRR(配列番号2)を含みうることが好適である。

TGNペプチドは、配列番号1のPTENアミノ酸配列のアミノ酸残基352 〜 403内のＰＴＥＮのいずれかの断片、又はその配列の一部として、配列番号1のPTENアミノ酸配列のアミノ酸残基352 〜 403部分を含んでいるPTENの断片でありうる。好ましくは、TGNペプチドは、このペプチド断片に存在するセリン若しくはスレオニンの燐酸化を含んでいる。好ましくは、セリン又はスレオニンのサイトは、配列番号1のPTENタンパク質の、366、370、380、382、383、あるいは385である。

TGNペプチドは、少なくとも10アミノ酸残基長、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、あるいは少なくとも40アミノ酸残基長でありえる。セリン若しくはスレオニン残基、あるいはそのコンビネーションの少なくとも1つの燐酸化が、該ペプチドに含まれることが好適である。

1つの態様では、TGNペプチドが、そのペプチドの長さによって制限されていないことが認識されるべきである。少なくとも、ペプチドの一部が、アミノ酸残基352〜403内に存在することが好まれる。

この点では、例証されたTGN-1ペプチドは、3つの燐酸化されたセリン残基；
VTPDVpSDNEPDHYRYpSDTTDpSDPE(配列番号3)（pS =燐酸化セリン）
をもつ24アミノ酸である。PTDがＮ-末端で付着される場合、
RRRRRRRR-VTPDVpSDNEPDHYRYpSDTTDpSDPE−アミド(配列番号4)
は32アミノ酸残基を持つ。

別の例証されたペプチドは、TGN-2ペプチドであり、それには2つの燐酸化セリン残基；HYRYpSDTTDpSDPENEPFDEDQHTQITKV(配列番号5)
をもつ28アミノ酸である。 PTDがＮ-末端で付着される場合、
RRRRRRRR-HYRYpSDTTDpSDPENEPFDEDQHTQITKV−アミド(配列番号6)
は36アミノ酸残基を持つ。

TGN-3ペプチドは、TGN-2ペプチドと同じアミノ酸配列をもつが、残基は修飾されず、また、2つのセリン残基がバリンHYRYVDTTDVDPENEPFDEDQHTQITKV(配列番号7)
に置換された。PTDがＮ-末端で付着される場合、
RRRRRRRR-HYRYVDTTDVDPENEPFDEDQHTQITKV−アミド(配列番号8)
である。

TGN-4ペプチドは、TGN-1ペプチド；
SDDEYTDNPDSRYVSDTPVDTEH(配列番号9)
のスクランブルペプチドとして設計された。PTDがＮ-末端で付着される場合、
RRRRRRRR-SDDEYTDNPDSRYVSDTPVDTEHアミド(配列番号10)
である。また、TGN-5ペプチドは、TGN-2/TGN-3スクランブルペプチド
DEHDTEYTPDYRQETHFNSQPTDKSDVI(配列番号11)
のために設計された。PTDがＮ-末端(RRRRRRRR)に付着される場合
DEHDTEYTPDYRQETHFNSQPTDKSDVIアミド(配列番号12)
である。

化学的に修飾されたペプチド
ポリペプチドによる治療は、短い循環半減期及び蛋白質分解及び低い可溶性の問題をもつ。発明性のあるバイオ薬剤の薬物動態学と薬力学の特性を改善するために、アミノ酸配列の操作のような方法は、免疫原性を減少させるか増加させ、かつ蛋白質分解を減少させるように作られうる；免疫グロブリン及びアルブミンのような血清蛋白質との該ペプチドの融合あるいは結合がなされうる；保護及び徐放リリース用の発明性のあるペプチド及び抗体のようなバイオ薬剤のドラッグ・デリバリー担体に組み込まれてもよい；また、天然若しくは合成ポリマーへの結合も考慮されうる。特に、合成ポリマー結合体、PEG化あるいは N-アシル化のようなアシル化、S‐アシル化、アミド化及びその他などが考慮されうる。

神経組織
神経組織は、脊索の影響下で、胚の外胚葉に由来する。外胚葉はその後、分化する厚くなった神経板を形成するように誘導され、また、端部は中枢神経系のすべてが由来する神経管を形成するために結局融合する。中枢神経系は、脳、脳神経及び脊髄から成る。末梢神経系は、神経冠と呼ばれる神経溝の隣の細胞に由来する。

神経組織は複雑な統合コミュニケーションネットワークで身体の全体にわたって分布される。神経細胞(ニューロン)は、大変単純なものから大変複雑な高次回路からなる回路で他のニューロンと連絡する。ニューロンは実際のメッセージ送信及び統合を行い、一方、膠細胞と呼ばれる他の神経組織細胞は、ニューロンを、ニューロンの栄養、デイフェンス、保護、及び支援によってサポートする。脳には、ニューロンより、約10倍多い膠細胞が存在する。膠細胞は、ニューロンの機能に必要とされた微環境を創造し、また、時々、それらは神経のプロセッシング及び活性を助ける。ニューロンは興奮性の細胞である。これは、適切に刺激された時、離れた細胞へ情報を送信するために、細胞膜上に伝播する活性電位を開始することができることを意味する。ニューロンは、刺激の受理、送信及び処理をおこないうる独立した機能ユニットである。

一般に、ニューロンは３部分から成り； 細胞体、そこでは、核及び細胞器官が局在し； 樹状突起、それは細胞体から伸びるプロセスであり、それは環境あるいは他のニューロンから刺激を受け取る； 及び軸索、それは神経インパルスの送信用の細胞体から他の細胞に伸びる長い単一のプロセスである。 軸索は、通常その遠心端で分岐し、また、別の細胞上で終了する各分ブランチには、球根状端部をもつ。隣接した細胞と端末球の相互作用は、シナプスと呼ばれる構造を形成する。シナプスは、信号を受け取り、かつそれを電位に変換するために特定化される。

ヒト生体で見つけられたほとんどのニューロンは多極で、それらは、一つが軸策であり、残りが樹状突起である、２つの細胞プロセス以上を持つことを意味する。網膜若しくは嗅粘膜の双極ニューロンは、1つの樹状突起プロセスと細胞体から離れる軸索をもつ。脊髄神経節で見つかった偽単極神経細胞は、細胞体を通過することなく、軸策に直接到達するために、樹上突起によって、知覚インパルスをピックアップできる。ニューロンは、又、機能によって分類されうる。感覚ニューロンは、知覚刺激の受理及び送信に関係する。運動ニューロンは、インパルスを、筋肉と腺をコントロールするために送る。他のニューロン、介在ニューロン、は、機能的なネットワークの一部としてニューロン間の仲介として働く。

シナプスは、細胞の信号を広めるために特異化された機能性細胞ジャンクションである。殆どのシナプスは、化学的シナプスであり、そこではプレシナプス末端の小胞が、プレシナプス膜が刺激されたとき、シナプス間隙へ解放される化学的メッセンジャーを含む。化学的メッセンジャーは、ポストシナプス膜中の受容体に結合するためにシナプス間隙を横切って拡散する。これは、細胞のアクションを達成するポストシナプス膜の極性化状態の変化を引き起こす。特別のタイプのシナプスは、神経筋接合部である。35を超える神経伝達物質が知られている。また、その大部分は、小分子(一酸化窒素、アセチルコリン)、カテコールアミン(ノルエピネフリン、セロトニン)あるいは神経刺激性のペプチド(エンドルフィン、バソプレッシン)である。一旦使用されたならば、神経伝達物質は、プレシナプスの細胞によって、酵素による分解、拡散あるいはエンドサイトーシス（貪食細胞運動）によって速やかに排除される。

いくつかのニューロンはミエリンと呼ばれる絶縁材料で包まれる。この脂質リッチな材料は膠細胞:末梢神経系のシュワン細胞によって、及び中枢神経系の乏突起神経膠細胞（オリゴエンドロサイト）によって形成される。 絶縁は、脱分極されねばならない膜表面エリアの減少によりより速い神経伝導を可能にする。ミエリン化ニューロンにおいて、神経インパルスは、軸索の長さを超えて、あるミエリン化（髄鞘）がないセグメントから別のセグメントへジャンプする。ある神経組織を、脳の大きな末梢神経及び白質ように白く見せるのは、組織内のミエリン鞘であり、ニューロン細胞体の不足である。星状細胞と呼ばれる他の膠細胞は、構造的完全性、ニューロン栄養性及び神経組織の微環境の維持に関係する。星状細胞は、ギャップ結合によって互いとの直接コミュニケーションをし、ローカルの環境の制御によって、それらの支配下のニューロンの存続に影響することができる。上衣細胞は、脊髄及び脳の心室にラインし、また脳脊髄液を分泌する。小膠細胞と呼ばれる他の小さな膠細胞は、成人の中枢神経系で、修復と炎症に関係する食細胞である。

神経組織は、電気的インパルスを受け取り送信することができる活動的な組織である。中心細胞タイプは、ニューロンと呼ばれる。ニューロンは、通常、細胞体、インプットを受け取る樹状突起、及び電位を送信する軸索がある。

ニューロンは、感覚、運動、分泌若しくは連合ニューロンとして分類されうる。それらは、しばしば、伝導速度、直径、及びミエリンと呼ばれる特別のリポタンパク質絶縁の存在若しくは欠如によって分類される。タイプAファイバーは、ミエリン化し、12-120m/秒で、インパルスを送信しうる。さらに、タイプBは、ミエリン化繊維だが、それらは、単に3-5m/秒でインパルスを送信する。タイプCファイバーは、髄鞘がなく（非ミエリン化であり）、直径が小さく、非常に遅い(2.5m/秒)。タイプAファイバーの一例は、腓腹筋に神経を分布させる運動ニューロンである。自律性の節前遠心性ニューロンは、タイプBファイバーの例であり、また、拡散する痛みに関する情報を伝える感覚ニューロンは、遅いタイプCファイバーの例である。

感覚ニューロンは、環境からのあるタイプの情報を検出するのに適している。これらは、圧力又は伸張のようなものを感じる機械的刺激受容体、温度受容体、網膜中の光受容体及び味蕾若しくは嗅覚用の化学受容体を含んでいる。連合ニューロン若しくは介在ニューロンは、通常脊髄と脳で見つかり、それらは、遠心性の運動若しくは分泌神経に知覚求心性のニューロンを接続する。

ニューロンは、シナプスと呼ばれる構造によって互いと通信する。軸索は、多数の小さな小胞を含んでいる1つ以上の端末ボタンで終わる。これらの小さな小胞は、神経伝達物質と呼ばれる化学物質で満たされる。他のノルエピネフリン、セロトニン及びGABAのような他の化学物質は、ニューロンに依存して使用されうるが、アセチルコリンは、多くの場合シナプスでの神経伝達物質である。インパルスが軸索を下って送られ、端末ボタンに達するとき、小胞はニューロン膜と融合し、また、神経伝達物質がリリースされる。その後、化学物質は、受信ニューロンのシナプス後膜上の化学物質特異的受容体へ、狭いシナプス間隙を横切って拡散する。

受容体と神経伝達物質の相互作用は、新インパルスシナプス後ニューロンを導きうる、膜電位の変化を引き起こす。酵素アセチルコリンエステラーゼは、アセチルコリンをブレイクダウンしかつ刺激を終了するためにシナプスに存在する。他の神経伝達物質は、ブレイクダウンされるか、あるいは刺激を終了するためにシナプス前部ニューロンへバックアップされる。

中枢神経系では、多くのニューロンが、単一のニューロンに集まってもよい。シナプス前部のニューロンの各々が、シナプス後部のニューロンと共に、そのシナプスへ神経伝達物質をリリースする場合、統合され合計されるローカルの膜電位が生じる。これらの入力信号は、阻害的であるかもしれないしあるいは刺激的かもしれない。結果として生じる合計された膜電位がそのニューロン用の最小のしきい値に達すれば、活性電位が開始されうる。

活性電位は、跳躍伝導によって1つの方角に細胞体から離れて移動する。最も速いニューロンが、ランビエ結節と呼ばれる裸のニューロン膜の結節（ノード）によって分離された目立たないセグメントによって整えられたミエリン鞘でカバーされる。跳躍伝導では、電位は、ノードからノードまでジャンプし、それによって、薄膜エリアの減少が、活性電位の伝導及び伝導促進に関係する。

神経系で見つかった非神経細胞は、膠細胞と呼ばれる。星状細胞は、最も多数のもので、ニューロンの支援及び栄養を提供する。小膠細胞（Microglia）は、神経の組織に特有の小さな食細胞である。脊髄の心室系及び中心管を並べて、脳脊髄液を作る細胞は、上衣細胞と呼ばれる。中枢神経系では、乏突起膠細胞は、多数のニューロンのミエリン鞘のセグメントを形成する。末梢神経系では、ミエリン鞘のセグメントは、それぞれ単一のシュワン細胞によって作られる。

中枢神経系
中枢神経系(CNS)は、脳と脊髄から成る。髄膜(硬膜、クモ膜及び軟膜)は、頭蓋骨及び椎骨による保護に加えて、CNSを保護し、栄養をあたえる。脳脊髄液は、クモ膜下腔、脊柱及び脳の心室の中心管に見られる。軟膜は、最も内側の層で、神経組織に付着する。軟膜と硬膜の間に、クモ形類の層が存在する。タフな繊維の硬膜が、ちょうど頭脳の下に存在する。

脳は、前脳部、中脳及び脳幹の3つの基本的なエリアに分割することができる。前脳部は視床、視床下部、基底核及び大脳を含んでいる。大脳は、意識的な考え、感覚の解釈、すべての随意運動、心的能力及び感情の基本である。

大脳の組織は、構造と機能的なエリアに分割することができる。大脳の表面は、脳回(尾根)及び溝(溝)へ巻き込まれる。皮質知覚及び運動野は、それぞれ、ポスト中央脳回及び中心溝に位置する。感覚野は、視床処理後に伝えられる身体の対向面から知覚情報を受け取る。より多くの感覚神経端末を備えたそれらの身体各部は、より多くの感覚中枢によって表わされる。運動野は、対側性のボデー部の髄意筋運動をコントロールし、連合野は、運動の開始にとって重要である。

大脳は脳の最大部分で、2つの、右と左の、半球に分割され、いくつかの葉部をもつ。前頭葉は、運動野、ブローカの言語野、連合野を含み、そして知能と行為における機能を含む。頭頂葉は、感覚野を含み、感覚及び聴覚機能を含む。主要な視覚連合野は、後頭葉に位置し、また、側頭葉は、聴覚連合野、匂い及び記憶保存のための野を含んでいる。

視床は、大脳皮質と脳幹の間に位置する。嗅覚以外の知覚の入力は、すべて、脳の他のエリアへ伝えられる前にここで処理される。視床下部は、視床の下に位置し、内部刺激及び内部環境のメンテナンスを処理する。血圧、温度、心拍数、呼吸、水代謝、浸透圧、空腹及び神経内分泌系の活性の、瞬間瞬間の無意識のコントロールが、ここで扱われる。下垂体後葉からオキシトシンとADHを遊離する神経内分泌細胞の核は、視床下部に位置する。

基底核(尾状核、淡蒼球、黒質、視床下核、赤核)は、大脳の各半球内に埋め込まれたニューロンのグループである。それらは、複雑な、運動制御、情報処理及び無意識の総体的な故意の動作のコントロールに関係する。

脳幹は、延髄と脳橋を含む。延髄は、呼吸、心臓及び血管運動反射のコントロール用の重要な機能的なエリア及び中継中枢を含む。脳橋は、呼吸の制御に関係する呼吸調節中枢を含む。

小脳は、脳幹上に位置し、そして、身体の位置、移動、姿勢及び平衡に関して、どこか他で処理された知覚情報を使用する。動作は、小脳においては始められない。しかし、それは協調運動に必要である。

末梢神経系
末梢神経系は、神経、神経中枢、脳の外側に位置した脊柱及び脳神経、及び脊髄を含んでいる。12の脳神経は、脳幹にある核から発生し、匂い、視覚、唾液分泌、心拍数及び皮膚感覚のような様々な自律機能をコントロールするインパルスを担持し、特定位置に移動する。脳神経は、それらが感覚・運動のコンポーネントを担持するという点でしばしば混合されるが、しかし、それらは、単に運動又は感覚線維のみを持ちうる。次の表に、脳神経とそれらの機能をリストする。

表１- 脳神経

末梢神経系の知覚の部分は、様々なタイプの受容体からインプットされ、それを処理し、中枢神経系に送る。知覚の入力は、皮膚上の圧迫感か熱でのような外部源又は固有受容性感覚(ジョイントと筋肉の位置感覚)のような内部源から由来しうる。特異的な脊髄神経によって支配された皮膚のエリアは、デルマトームと呼ばれる。求心性線維は、知覚の入力を集めて、脊髄を上へ移動し、視床に収斂し、大脳の感覚皮質に最終的に終わる。より多くの感覚受容体をもつエリア、つまり指先か唇は、脳の感覚皮質上のより大きなエリアに相当する。固有受容性の情報を担持するファイバーは、小脳に、同様に、分散する。知覚システムは、ほとんどすべて、視床の部分へインパルスを送信する。大脳皮質は、知覚刺激の意識的な認識及び解釈に関係する。

筋肉と腺への運動入力は、自律及び身体の遠心性のシステムによって生じる。ジョイント、腱及び筋肉のCNS神経支配は、身体の遠心性のシステムによって伝わる。いくつかの筋肉レスポンスは、脊髄反射によって扱われる。この一例は、指が、熱ストーブに接触する時見られた引っ込み反射である。痛の感覚が脳に達するかなり前に、指を除く運動が、単純な脊髄反射によって生じる。明白に、これは一層の傷を回避する保護機構である。腺と平滑筋への運動入力は、通常、自律システムによって生じる。

ほとんどの器官は、自律神経系の両方のブランチから入力を受け取る。1つのブランチは、一般的に興奮性で、その一方で、他方は、その器官又は組織において阻害的である。自律性のシステムの交感神経性ブランチは、生理的なストレスに対して身体を準備するように作用する。交感神経性ブランチの刺激は、身体が、そこで応答において応じる若しくは戦うように準備する、ガス上でのステッピングのようである。増加した心拍数、気道の拡大、及び保存グリコーゲンからのグルコースの動員の様な効果が見られる。交感神経は、1st胸椎から4th腰椎に生じる。それらには、脊柱に沿って位置するチェーン神経中枢のうちの1つで終わる、短い節前神経がある。アセチルコリンは、ノルエピネフリンが大多数の交感神経端末でリリースされる、標的組織に移動する、長い節後神経を備えたシナプスの神経伝達物質である。汗腺か骨格筋血管を神経支配するもののような、少数の交感性の節後ニューロンは、アセチルコリンをリリースする。

副交感神経のブランチは、CNSの頭蓋及び仙骨部から生ずるニューロンを経て交感神経性ブランチを平衡化させるために作用する。例えば、副交感神経の刺激は、エアーウェイを収縮させて、心拍数を減少させる。それは、消化、排尿及び勃起のような活性を休息させることを制御する。長い節前神経は、端末器官に近いシナプスでアセチルコリンをリリースする。短い節後神経は、さらにエフェクター組織においてアセチルコリンをリリースする。

治療組成物
1つの態様において、本発明は、神経変性によって特徴づけられる様々な疾病の治療に関する。この態様で、発明性のある治療化合物は、ニューロンの変性を阻害する化合物の提供により、該疾病に苦しむ若しくは苦しみがちのヒト患者に投与されうる。特に、該疾病は、脳の神経変性疾患、特に海馬及び大脳皮質における神経細胞の損失、縮小された神経伝達物質、脳血管性の変性、背骨中の砕かれた神経及び/又は認識能の損失に関係している。

治療用化合物の製剤化は、当該技術分野において一般に知られている（レミングトンの製薬学、１７巻、マック・パブリッシング社、イーストン、ペンシルバニア州、アメリカ）。例えば、１日、体重１ｋｇあたり約0.05μｇから約20ｍｇが投与されうる。投薬レジメは、最適の治療効果を提供するために調節されうる。例えば、いくつかの分割投与量で毎日投与されうる。あるいは、治療状況に応じて、投与量は比例して減少されうる。活性化合物は、経口、静脈 (そこでは水可溶)、筋肉内、皮下、鼻腔、皮内あるいは座薬あるいは注入 〔例えば、腹腔内ルートによって、あるいは細胞、例えば患者（レシピーエント）へ養子性に移送され及びインビトロで抗原に敏感にされた樹状突起細胞又は単球のような細胞、の使用によって分子のスローリリースを使用する〕のような通例的な方法で投与される。投与ルートによって、ペプチドは前記活性成分を不活性化しうる酵素、酸及び他の自然な条件の攻撃からそれを保護する材料に覆われることが必要でありうる。

例えば、ペプチドの低い親油性は、酸性の加水分解によって胃でペプチド結合を分解することができる酵素によって、胃腸管においてそれらが破壊されることを可能にするだろう。非経口的投与以外の方法によってペプチドを投与するために、それらはその不活性化を防ぐ材料によって覆われる若しくは共に投与されるだろう。例えば、ペプチドは、アジュバントと投与されうる、又は酵素阻害物質と若しくはリポソームにおいて共投与されうる。ここに考慮されたアジュバントは、レゾルシノール、ポリオキシエチレンオレイルエーテル及びn-ヘキサデシルポリエチレンエーテルのような非イオン性界面活性剤を含む。酵素阻害物質は、膵臓トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロホスフェート(DEP)及びトラジロールを含む。リポソームは、一般的なリポソームと同様に水中油中水型のCGF乳剤も含む。

活性化合物は、非経口的にあるいは腹腔内に投与されうる。分散（懸濁）は、グリセリン液状ポリエチレングリコール、及びその混合、及び油において、調製することができる。保存と使用の通常の条件のもとでは、これらの調製は、微生物の成長を防ぐために防腐剤を含んでいる。

注射用途に適している薬剤の剤型は、滅菌水溶液（水可能）若しくは分散、及び滅菌水溶液若しくは分散の要時調製用滅菌粉末を含む。すべての場合に、剤型は滅菌であらねばならないし、容易な注射器使用が可能な程度に流動性であらねばならない。それは、製造と保存の条件下で安定であらねばならないし、バクテリアと菌類のような微生物の汚染に対して保護されねばならない。担体は、例えば、水、エタノール、多価アルコール(例えばグリセリン、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど)、それら適切な混合物及び植物油を含む、分散媒若しくは溶媒でありうる。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散の場合の必要な粒子サイズの維持によって、及びスーパーファクタンの使用によって、維持することができる。微生物のアクションの防止は、例えば、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チオメルサール等の様々の抗菌薬及び抗真菌薬によって可能となる。多くの場合、例えば砂糖、塩化ナトリウム等の等張剤を含むことは望ましい。注射可能な組成物の延長された吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン等の吸収遅延剤の該組成物での使用によって可能となる。

滅菌注射用溶液は、必要な上記列挙された様々な他の成分をもつ適切な溶剤中に、必要量の活性化合物を導入し、その後除菌ろ過することにより調製される。一般に、分散は、基礎的な分散媒と上記列挙されたものから必要な他の成分を含んでいる滅菌ビークル中に、様々な滅菌活性成分を導入することにより調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合には、好ましい調製法は、真空乾燥及び凍結乾燥法であり、それは先に滅菌ろ過された溶液から、何らかの所望の付加的な成分と活性成分の粉末を生産する。

上記のように、ペプチドが適切に保護される場合、活性化合物は、例えば、不活性な希釈剤若しくは同化可能な食用の担体と共に、経口投与されうる、あるいは、それはハード若しくはソフトシェルのゼラチンカプセルに包埋されるうる、あるいは、それは圧縮されてタブレットに詰め込まれうる、あるいは、それは、食事の食品と共に直接導入されてもよい。経口投与のために、活性化合物は賦形剤と共に導入され、摂取可能なタブレット、バッカル錠、トローチ、カプセル、万能薬、懸濁、シロップ、ウエハーなどの剤型で使用されうる。このような組成物及び製剤は、活性化合物を重量によって少なくとも1%含んでいるべきである。組成物と製剤のパーセンテージは、無論、変えることができ、ユニットの重量の約5〜約80%の間に、通例的に、あってもよい。このような治療上有用な組成物中の活性化合物の量は、適切な投薬量が達成可能である。本発明の好適な組成物若しくは製剤は、経口投与剤型ユニットが、約0.1μgと2000mgの間の活性化合物を含んでいるように、調製される。

タブレット、ピル、カプセルなどはさらに次のを含んでいてもよい：トラガカントゴム、アカシア、コーンスターチあるいはゼラチンのような結合剤；リン酸カルシウムのような補形剤；コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸などのような崩壊剤； マグネシウム・ステアリン酸塩のような潤滑剤；及び、ショ糖、ラクトーゼあるいはサッカリンのような甘味剤が加えられてもよい、あるいはペパーミント、ウィンターグリーン油あるいはチェリー香料のような香料添加剤。 ユニット投薬剤型がカプセルである場合、それは、上記のタイプの材料に加えて、液体の担体を含んでいてもよい。種々の他の材料は、コーティングとして存在、あるいはそうでなければ投薬ユニットの物理的な剤型を修飾するために存在してもよい。例えば、タブレット、ピルあるいはカプセルは、シェラック、砂糖あるいは両方でコーティングされてもよい。シロップ若しくはエリキシールは、活性化合物、甘味剤としてのシュークロス、防腐剤としてのメチル及びプロピルパラベン、チェリー若しくはオレンジ香料のような香料と染料を含んでいてもよい。もちろん、どんなユニット投薬剤型を調製するのにも使用されるどんな材料も、使用された量において薬学的に純粋で、本質的に無毒であるべきである。さらに、活性化合物は、持続性製剤及び製剤化に組み入れられてもよい。

ここに使用されたように、"薬学的に許容される担体及び/又は希釈剤"は、いずれかの及び全ての溶剤、分散媒体、抗菌及び抗真菌薬コーティング、等張及び吸収遅延剤及びその他同種のものを含んでいる。薬学的活性物質用のそのような媒体及び剤の使用は、当該技術分野において著名である。なんらかの従前の媒体あるいは剤も、活性成分と相いれない場合を除き、該治療組成物でのそれらの使用は包含される。補足的な活性成分も組成物に組み入れることができる。

投与のしやすさ及び投薬量の均一性のために、ユニット投薬剤型で、非経口組成物を製剤化することは特に有利である。ここに使用されるようなユニット投薬剤型とは、処置される哺乳動物への単一投薬量として適した物理的個別ユニットを指す；各ユニットは、必要とされた薬学的担体と共同して所望の治療効果を生むと意図された活性剤の前もって定義した量を含んでいる。 本発明のユニット投薬剤型用の明細は、次によって及び直接依存して明示される；(a)活性剤の格別の特徴及び成し遂げられべき格別の治療効果、及び(b)肉体の健康が害されて疾患状態の生命体における、疾患の治療のための活性物質の調合技術における固有的な制限。

主要な活性成分は、ユニット投薬剤型における、適切な薬学的に許容される担体と共に、その有効量で、調製される。ユニット投薬剤型は、例えば、0.5μgから約2000 mgまで幅の量で、主要な活性化合物を含むことができる。比率で表現されと、活性化合物は、担体の約0.5μg/mlから一般に存在する。補足的活性成分を含んでいる組成物の場合には、投薬量は、前記成分の通常投与量及び投与方法を参考に決定される。

デリバリシステム
様々なデリバリシステムは知られており、本発明の化合物を投与するために使用することができる、例えば、リポソーム中へのカプセル化、微粒子、マイクロカプセル、化合物を発現することができる組み換えの細胞、受容体を媒介としたエンドサイトーシス、レトロウイルスか他のベクターなどの一部としての核酸組成物等。導入の方法は、以下を含み、制限されない、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、また経口ルート等。化合物若しくは組成物は、何らかの都合のよいルートによって投与でき、例えば、注入若しくはボラス投与によって、上皮若しくは粘膜の裏を通じた吸収によって（例えば口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など）可能であり、そして、他の生物学的活性剤と共に投与されうる。投与は全身的でもあるいは局所的でもよい。さらに、脳室内・鞘内への注入を含む任意の適切なルートによって中枢神経系へ、本発明の製薬化合物あるいは組成物を導入することが望ましいかもしれない；脳室内注射は、タンク、例えばオンマイヤレザバイアー、に付けられた、脳室内カテーテルによって促進されうる。 経肺投与も使用することができる、例えば吸入器若しくはネビュライザーの使用によって、及びアエロゾル化製剤との剤型化のよって使用できる。

特別な実施態様では、投与を必要とするエリアへ本発明の製薬化合物あるいは組成物をローカルに投与することが望ましい；例えば、制限されるのでなく、手術中の局所注入、例えば手術後の創傷被覆との組み合わせでの局所投与、注射によって、 坐薬によって、カテーテルによって、又は移植によってなしとげられ、この移植は、多孔性、非多孔性、若しくはゼラチン状の材料で、シラスチック膜のような膜若しくは繊維を含む。好適には、抗体若しくは本発明のペプチドを含むタンパク質を投与するとき、タンパク質が吸収しない材料使うことに留意がいる。別の実施態様では、化合物若しくは組成物は、小胞、特にリポソームで運ばれうる。また別の実施態様では、化合物若しくは組成物は、制御リリースシステムで運ばれうる。1つの実施態様では、ポンプが使用されうる。別の実施態様では、高分子材料が使用されうる。また別の実施態様では、制御リリースシステムは、治療標的の近くに置くことができ、例えば、全身投与のある分画のみを必要とする脳が例示される。

組成物は、その投与がされる動物が耐えることができ、及びその他の点でその動物への投与に適しているならば、「薬理学的にあるいは生理学的に許容可能である」といえる。そのような薬剤は、投与された量が生理学上意義ある場合に、「治療上有効な量」において投与されるといえる。その存在が、投与患者において生理的に検出できる変化を結果的にもたらす場合、その薬剤は生理的に意味があるといえる。

本発明は、ここに記述された特定の実施態様によって、その発明の範囲を制限するものではない。確かに、ここに記述されたものに加えて、本発明の様々な修飾は、上述の記述及び添付された図面から当業者には明白となる。そのような修飾は、付加請求項の権利範囲内にあることが意図される。以下の実施例は、制限のためではなく、本発明の例証として示される。

実施例１ 材料と実験方法
実施例１．１
ラット副腎骨髄性PC12クロム親和性細胞腫ニューロン細胞は、ATCC(Manassaa, VA)から購入した。ダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)、ウシ胎仔血清(FBS)及びウマ血清を含む細胞培養材料は、Mediatech社(Manassaa, VA)から購入した。2.5 S神経成長因子は、BD Biosciences社（Bedford, MA 01730）から購入した。ニューロンのクラスIII ベータ−チューブリンに対するTUJ-1単クローンウサギ抗体は、Covance社（Gaithersburg, MD）から購入した。アセチル化アルファ−チューブリンに対する単クローンマウス抗体はSant Cruz Biotech社（Sanat Cruz, CA）から購入した。ヤギ血清、テキサスレッド登録商標ヤギ抗ウサギIgG抗体、アレクサ・フルーアー登録商標488ヤギ抗マウスIgG抗体、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、Dilactate(DAPI)及びAlamarBlue登録商標は、Molecular Probes-Invitrogen(Eugene、OR))から購入した。Nocodazoleは、シグマ・オールドリッチ(St.Louis, MO)から購入した。神経突起伸出分析キットは、ミリポア(Billerica、MA)から購入した。全ての脂質は、Avanti Polar Lipid社(Alabaster、Al35007)から購入した。組み換えヒトPTENタンパク質及びマラカイトグリーン・リン酸塩検出キットは、R&D Systems社(MIneneapolis、MN554313)から購入した。ヒトPTEN c-DNAは、OriGene社(Rockville、MD20850)から購入した。LipofectamineTM2000トランスフェクション試薬は、InvitrogenTMから購入した。トリス−グリシン勾配ミニ・ゲル(10〜20%)は、NovexTMから購入した。全ての抗体は、Santa Cruz Biotechology社（Santa Cruz、CA95060）から購入した。他のすべての材料は、Fisher Scientific社から購入した。

実施例１．２ ペプチド設計
潜在的なPTEN阻害剤としてのTGNペプチドは、テンプレートとしてPTENのＣ-末端領域(AA352 〜 403)を使用して設計された。全てのTGNペプチドは、膜透過性を増加させるためにそれらのＮ-末端部にPTD(ペプチド・トランスファードメイン)配列(RRRRRRRR)を含んでいる。TGN-1ペプチドは、3つの燐酸化されたセリン残基を持つ３２アミノ酸である〔MW = 4244.18 Da、配列: RRRRRRRR-VTPDVpSDNEPDHYRYpSDTTDpSDPE‐アミド(配列番号4)、pS =燐酸化されたセリン〕。TGN-2ペプチドは、2つの燐酸化されたセリン残基をもつ３６アミノ酸である〔MW = 4776.28 Da、配列: HYRYpSDTTDpSDPENEPFDEDQHTQITKV‐アミド(配列番号6)、pS =燐酸化されたセリン〕。TGN-3ペプチドは、TGN-2ペプチドと同じアミノ酸配列をしているが、残基は修飾されておらず、また、2つのセリン残基が、バリンに置換されている〔MW = 4640.99 Da、配列: RRRRRRRR-HYRYVDTTDVDPENEPFDEDQHTQITKV‐アミド(配列番号8) 〕。TGN-4ペプチドは、TGN-1ペプチドのスクランブルペプチドとして設計され〔MW = 4004.19 Da、配列: RRRRRRRR-SDDEYTDNPDSRYVSDTPVDTEH‐アミド(配列番号10) 〕及びTGN-5ペプチドは、TGN-2/TGN-3のスクランブルペプチドとして設計された〔MW = 4616.88 Da、配列: RRRRRRRR-DEHDTEYTPDYRQETHFNSQPTDKSDVI‐アミド(配列番号12) 〕。全てのペプチドは、21st Century Biochemicals社(Marlboro、MA01752 )によって合成された。 純度は、>95%であり、HPLCによって確認された。

実施例１．３ インビトロPTEN活性分析
インビトロPTEN活性分析は、ホスファチジルイノシトール三燐酸塩(PIP₃)をホスファチジルイノシトール・ピロ燐酸塩(PIP₂)に変換し、かつリン酸塩イオン(Pi)を生産するPTEN脂質ホスファターゼ活性をチェックするために設計した。1,2-dioctanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol-3,4,5-triphosphate(C8-PIP₃)は、PTEN基質として使用され、脂質ホスファターゼとしてのPTENが界面酵素であるので、他のリン脂質で脂質小胞(リポソーム)として調製された。リポソーム調製のために、C8-PIP₃、DOPS(1,2-dioeloyl-sn-glycero-phosphoserine)及びDOPC(1,2-dioeloyl-sn-glycero-phosphocholine)が、0.1 mM C8-PIP₃、0.25mM DOPS及び0.25mM DOPCの終濃度に、リポソーム・バッファー(50 mMトリス、100mM NaCl、10mM MgCl2、5mM DTT、pH = 8.0)と混合された。その後、脂質混合物は、リポソームを調製するために30分4℃で超音波処理された。超音波処理の後、リポソーム溶液は、残存脂質を除去するために簡潔に遠心分離機にかけられた。

PTEN活性分析のために、20ngの組み換えヒトPTENタンパク質が、完成されたリポソーム溶液の40μLと混合された。PTEN分析バッファー(1mMトリス、20mM DTT及び0.5%NP-40、pH = 8.0)は、最終ボリュームとして100μLまで加えられた。その後、反応混合物は、30分間37℃ウォーターバスでインキュベートされた。インキュベーションの後に、PTENタンパク質によって生産された無機リン酸塩イオンが、マラカイトグリーン・リン酸塩検出キットを使用して検出された。第1に、各反応混合物の50あるいは100μLが、96ウェルプレートに移され、そして、マラカイト試薬Aの10あるいは20μLが、それぞれ、加えられ、10分間室温でインキュベートされた。インキュベーション終了後、マラカイト試薬Bの10あるいは20μLが各サンプルに再び加えられ、さらに、室温で20分間インキュベーションされた。リン酸塩イオンの検出は、分光測定器を使い、620nmのOD(光学密度)を測定することにより行なわれた。組み換えPTEN活性に関し、TGNペプチド(10μM)の阻害効果を決定するために、各々のTGNペプチドが、１mM濃度でDMSO溶液で調製され、そして、TGNペプチド溶液の1μLが、組み換えPTENタンパク質、リポソーム及びPTEN分析バッファーと混合され、そして、上記のプロトコルに従って、PTEN活性について分析された。

実施例１．４ - インビトロのIC₅₀分析
IC₅₀値は、TGN-1及びTGN-2ペプチドの異なる濃度で、PTEN活性分析をインビトロで行なうことにより測定された。IC₅₀分析用のTGN-1あるいはTGN-2ペプチドの濃度範囲は、それぞれ、0.1、1、10、30、60と100μM及び0.05、0.1、0.5、1、5、10と100μMだった。全てのデータは実験を3回繰り返して表わし、また、IC₅₀値は、プリズム5ソフトウェア(GraphPadソフトウェア)によって計算された。

実施例１．５ - PC 12細胞培養
PC12ラット・クロム親和性細胞腫細胞が、6ウェルプレートに植え付け(0.6x10⁶細胞/ウェル)され、7.5%FBS及び7.5%ヤギ血清を含むDMEM培地で培養された。細胞培養密度が、約60 〜70%に達した後、NGF(神経成長因子、50ng/mL)が、分化のためにPC12細胞に加えられ、さらに5日間インキュベートされた。その後、DMSO溶液に異なる量のTGNペプチドを含んでいる新鮮培地が、各ウェルに加えられ、24時間さらにインキュベートされた。PTEN 高発現のために、PC12細胞が、6-ウェルプレートに植え付け(1.0x10⁶細胞/ウェル)され、上記のようにNGF(50ng/mL)で分化された。DNA-Lipofectamine 2000混合物は、Opti-MEMの500μlへのヒトPTEN c-DNAの約2〜2.5μgを最初に加えることにより、トランスフェクトされる細胞の各々ウェルのために調製された。Lipofectamine 2000TM試薬の3.75-8.75μlが、上記の希釈DNA溶液に続いて加えられ、優しく混合され、そして、室温で25分間インキュベートされた。 6ウェルプレート中のPC12細胞の成長用培地は、新鮮培地で交換され、また、DNA-Lipofectamine 2000混合物の500μlが、トランスフェクションのために各ウェルに加えられた。トランスフェクトされた細胞は、遺伝子組み換え発現のために分析する前に、24-48時間のポストトランスフェクション用の5.0% CO₂インキュベーターによって37℃で培養された。

実施例１．６ - PC12細胞での神経突起分析
ラット副腎髄質PC12ラット・クロム親和性細胞腫ニューロン細胞が、5%CO₂インキュベーターにおいて37℃で維持されたT-75cm²フラスコ中で、7.5%ウシ胎仔血清(FBS)、7.5%ウマ血清(ES)及び0.5%ペニシリン・ストレプトマイシンを補充された。細胞は、フラスコから、優しく機械的に分離し、50%集密で分けられ、分離比率1:7で増殖された。

神経突起保護分析のために、PC12細胞が、2.08x10⁵細胞/足場(経験的に最適な種をまく密度として決定された)の植付密度で6-ウェルプレートに植え付けされ、細胞集密が60〜70%に到達するまで、24-48時間インキュベートされた。その後、PC12細胞は、72-120時間NGF(50ｎｇ/mL)で分化させた。神経突起変性を模倣するために、分化したPC12細胞が、Nocodazole(0.5μM)で処理された。37℃で1時間のインキュベーションの後、Nocodazoleを含んでいる古い培地は、さらなる72時間のために、NGF(10ｎg/mL)及び/又はTGNペプチド(終濃度としての100μM)を含む新鮮培地に切り替えられた。神経突起の残存が、以下の免疫蛍光検査法分析によって分析された。

神経突起伸出分析は、PC12細胞が、1.0x10⁵細胞/ウェルの植付密度で、6ウェルプレートにまかれた。細胞集密が、60〜70%に達した後、PC12細胞の分化が、NGF(50ng/mL)を加えることにより始められた。24時間のインキュベーションの後、TGNペプチド(終濃度としての50μM)が、6ウェルプレート中のウェルに加えられ、さらに2日間インキュベートされた。神経突起状態は、下記の神経突起伸出キット(ミリポア)を使用して、分光測定器で定量された。

実施例１．７ - ウェスタンブロット
培養後に、PC12細胞は6-ウェルプレートから集められ、細胞ペレットを作るため、ベンチトップ遠心分離機で、遠心分離した(RT で13,000rpm、5min)。上澄みは廃棄され、また、細胞ペレットは、1x PIPA緩衝液(Invitrogen)の3〜500μLで再懸濁された。再懸濁された細胞は、液体窒素及び37℃ウォーターバス(3-4回)を使用して、凍結・融解サイクルで溶解され、その後、27G針の注射器を使用して、再懸濁細胞の繰り返し噴霧を続けた。溶解された細胞は、4℃で、20分10,000gで遠心分離機にかけられ、そして、上澄みが集められ、BCAタンパク濃度キット(Thermo Scientific)を使用して、総タンパク濃度が分析された。

ウェスタンブロットは、抗フォスフォ Akt抗体を使用して、PC12細胞における、内生Aktタンパク質の燐酸化レベルを検討するために行なわれた。SDS-PAGEは、NovexTM勾配ミニ・ゲル(10〜20%)を使用して行なわれた。SDS-PAGEゲル中の細胞溶解サンプル及びタンパク質は、PVDF膜へ移され、その後、ブロッキング溶液(0.1%トゥイーン-20を含む1X TBSバッファーにおける5%ミルク)でのインキュベーションを続けた。抗フォスフォ Akt抗体は、1:500希釈 (0.1%トゥイーン-20を含む1X TBSのバッファー)で一次抗体として使用された。HRP結合抗ウサギ抗体は、1:8000希釈比で２次抗体として使用された。内生的若しくは過剰発現PTENタンパク質の発現レベルが、抗PTEN抗体(1:400希釈比)を使用して検査された。β−アクチン発現レベルもローディングコントロール（負荷管理）のために分析された。

実施例１．８ - 神経突起定量
全神経突起の定量化のために、分光測定器をもつ神経突起伸出分析キット(ミリポア)を使用した。ミリセル（Millicell）挿入物((EMD Millipore, Billerica, Massachusetts, USA)の下側が、37℃で2時間、新鮮な細胞外マトリックス(ECM)タンパク質(10μg/mLコラーゲン)でコートされた後、PC12細胞は、２４ウェルプレートの各ウェル中に置かれた、挿入物毎に植え付けされた。細胞は、付着のために15分間室温で保持され、次に、合計700μl分化用培地が、1ウェルごとに加えられた(それぞれ、膜の下と上に、600μl及び100μl)。神経突起は、3日間伸出をさせ、次に、挿入物は、室温で20分間−200℃メタノールで固定され、その後、新鮮なPBSで濯いだ。次に、前記挿入物は、室温で30分間 400μl神経突起染色溶液中におかれ、そして、細胞体が湿らせた綿球によって削除された後、各挿入物は100μl神経突起染色抽出バッファー(ミリポア)上に置かれた。最後に、その溶液は96ウェルプレートへ移され、562nmの吸光度を読むことにより分光測定器で定量された。

実施例１．９ - 免疫蛍光検査法
細胞培養の後、成長用培地は除去され、また、細胞は15分間室温で10%ホルマリンによって固定された。その後、細胞はPBSの0.5Mグリシン溶液で洗われ、5% PBSヤギ血清及び0.2%トリトン-X溶液によって40℃で夜通しブロックされた。一次抗体で免疫染色するために、細胞は、安定した神経突起染色のために、アセチル化αチューブリン（１：１００希釈）に対する単クローンマウス抗体で、及び全神経突起染色ために、ニューロンのクラスIIIβ-チューブリン(１：２００稀釈)に対するTUJ-1単クローンウサギ抗体で、４０℃で夜通し培養された。細胞が、1X PBSのバッファー(10分/洗浄)で、3回洗われ、２次抗体として、TUJ-1抗体のためにテキサスレッド商品名ヤギ抗ウサギIgG（１：２００希釈）とアセチル化αチューブリン抗体のためにアレクサ・フルーオール商品名488ヤギ抗マウスIgG(１：２００稀釈)が、加えられ、４０℃で夜通しインキュベートされた。続いて、細胞は、1X PBSバッファー(10分/洗浄)及び1μg/ml 4',6-Diamidino-2-Phenylindoleによって三度洗浄された； Dilactate(DAPI)が、細胞核を染色するために、第2の洗浄ステップの後に加えられた。最終洗浄後に、細胞は、蛍光顕微鏡を使用して検査されるために調製された。励起と発光波長は、アレクサ・フルーオール商品名488‐IgG（グリーン）のために488nm/519nm、 テキサスレッド商品名ヤギ抗ウサギIgG（赤）のために595/615nm、DAPIのために405nm/461nmである。細胞の蛍光イメージは、異なる拡大で得られ、「ImageJ」イメージプロセシング及び分析プログラム(Wayne Rasbandによるパブリックドメイン、NIH、ベテスダ、メリーランド、USA)によって分析された。

実施例２ 結果

実施例２．１ - TGNペプチドは、テンプレートとして、PTENリン酸化部位を使用して設計された。
インビボでの脂質ホスファターゼとしてのPTEN活性のブロッキングは、神経損傷の後に軸索再生に有効であると知られている（Park et. al 2008, Christie et. al 2012）。我々は、細胞膜表面上のPTEN局在化をブロックする潜在的なPTEN阻害剤を設計するために、PTEN細胞膜会合メカニズムを検討した。従来の研究 （Lee et. al 1999; Leslie et. al 2008）によって、PTENタンパク質は、2つの機能的なドメイン−ホスファターゼドメイン及びC2ドメイン−、及び、燐酸化脱燐プロセスを経てPTENタンパク質の構造変化をコントロールするための"スイッチ"として働く、Ｃ-末端領域に"リン酸化部位"を保持する（Das et. al 2003; Leslie et. al 2008）。PTENの完全な脂質ホスファターゼ活性のために、リン酸化部位での燐酸化セリン/チロシン残基の脱燐が、PTEN膜会合で、PTENコンフォメーションを変更するためにおこる。Ｎ-末端PIP₂の結合モチーフ及びＣ-末端のPDZドメイン結合モチーフを経た付加的結合は、完全なPTEN活性に必要な適切な位置の細胞膜上にPTENタンパク質を局在化する（Walker et. al 2004; Molina et. al 2010）。かくして、我々は、PTEN膜会合を阻害することによる、潜在的なPTEN阻害剤としてのTGNペプチドを設計するためのテンプレートとして、PTEN"リン酸化部位"プラスPDZドメイン結合モチーフを使用することに決めた(図1A)。

TGN-1ペプチドは、「リン酸化部位」のアミノ酸配列(365-388)を模倣し、TGN-2とTGN-3ペプチドは、「リン酸化部位」及びPDZドメイン結合モチーフ (399-403)を含む、Ｃ-末端領域のアミノ酸配列(376-403)を模倣する。「リン酸化部位」でのセリン残基の燐酸化は、PTENコンフォメーション変更にとって重要であるので（Leslie et. al 2008; Odriozola et. al 2007 ）、TGN-1ペプチドは、「リン酸化部位」内に３つの燐酸化されたセリン残基(Ser 370、Ser380及びSer385)含めるように修飾される。TGN-2ペプチドは、2つの燐酸化セリン残基(Ser380とSer385)を含む。TGN-3ペプチドにおいて、2つのセリン残基(Ser380とSer385)が、比較のためにバリンに変えられた。TGN-4及びTGN-5ペプチドは、各々、TGN-1及びTGN-2ペプチド配列をスクランブルするために設計された。全てのTGNペプチドは、また、細胞膜透過性を増加させるために、Ｎ-末端で、ペプチド・トランスファードメイン(PTD)として8つのアルギニン残基を含むように修飾された。

実施例２．２ - TGN-1及びTGN-2ペプチドは、インビトロのPTEN活性において、特異的阻害効果を示す。
合成されたTGNペプチドは、インビトロでのPTEN活性分析を使用して、それらのPTEN阻害効果に関してテストされた。ジ・オクタノイル・ホスファチジルイノシトール3、4、5三燐酸塩(diC8-PIP₃)は、PTENの基質に選ばれ、2つの異なるリン脂質〔ジオレイルホスファチジルコリン(DOPC)及びジオレイルホスファチジルセリン (DOPS)で、脂質小胞(リポソーム)として調製された。脂質は、リポソーム・バッファーと混合され、超音波処理によってリポソームに調製された(総脂質濃度= 0.6 mM)。調製したリポソーム(diC8-PIP₃の0.1 mM)は、C8-PIP₃をC8-PIP₂に変換し及びリン酸塩イオンを生産することで、PTEN活性の分析のために、室温で30分間、20ng組み換えヒトPTENタンパク質とインキュベートされた。PTENによって生産されたリン酸塩イオンは、マラカイトグリーン試薬キットを使用して測定された(図2A)。 各TGNペプチドの10μMが、PTEN活性に関し、その阻害効果について検査された。図2Bで見られるように、TGN-1及びTGN-2ペプチドの両方は、著しくPTEN活性をブロックした(PTEN活性は、TGN-1で54%に、TGN-2で31%に、ポジティブコントロールに比べ、減少した)。他方、TGN-1あるいはTGN-2と比較して、TGN-2ペプチドは限定された阻害を示した(86%)。さらに、TGN-4及びTGN-5 ペプチドの両方は、PTEN活性の意味ある阻害を示さず、TGN-1及びTGN-2ペプチドによるPTEN阻害が配列特異的であることを示している。インビトロで、組み換えPTENタンパク質及びdiC8-PIP₃脂質分子を使用するPTEN活性分析は、単に、PTEN活性を呈さなかった(データは示されない)。

TGNペプチドについてのIC₅₀値も、用量依存的な方法において(0〜100μM範囲)、TGNペプチドによるPTEN活性をインビトロで測定された。 TGN-1、TGN-2及びTGN-3ペプチドについて計算されたIC₅₀値は、それぞれ19.93μM、87.12μM及び4.83μMだった(図2C)。

実施例２．３ - TGN-1ペプチドは、PI3K-Aktシグナルパスウェイをインビボで促進する。
ニューロン細胞のPI3KシグナルパスウェイにおけるTGN-1ペプチドの効果は、PC12ラット・クロム親和性細胞腫細胞系で決定された。PTEN過剰発現であるいは自然な状態でのPTEN c-DNAでトランスフェクトされた、分化PC12細胞が、24時間37℃で、TGN-1ペプチド(10μM及び100μM)若しくはTGN-4ペプチド(10μM)とインキュベートされた。図3Aの図形で見られるように、TGN-1ペプチドが実際にPTEN活性をブロックし、PI3K活性におけるPTEN拮抗効果を抑制する場合、PI3KシグナルパスウェイのAktタンパク質の活性化(燐酸化)レベルが、増加する。抗フォスフォ Aktタンパク質抗体を使用するウェスタンブロット・データは、TGN-1ペプチドで処理されたPC12細胞の内生Aktタンパク質の活性化(燐酸化)レベルが、TGN-1ペプチド用量依存的に、増加したことを示した(図3B及び3C)。TGN-4ペプチドあるいはDMSOのいずれかで処理されたPC12細胞は、Aktタンパク質の活性化レベルを増加せず、これはAKTタンパク質燐酸化レベルの促進は、TGN-1ペプチドによって、特異的な引き金となことを示唆する。内生PTEN(図3B)若しくは過剰発現のPTEN(図3C)の発現レベルが、TGNペプチドあるいはDMSOによる処理での活性に差を示さないので、TGN-1ペプチドが、PI3KシグナルパスウェイでのPTENのダウンレギュレーション効果を抑制し、かつPI3K-Aktシグナルパスウェイを促進するために、特異的に、PTEN活性を阻害することは明らかである。

実施例２．４ - TGN-1及びTGN-2ペプチドは、ニューロン細胞カルチャーでの神経保護を含む神経栄養効果を示す。
我々は、分化したニューロン細胞での神経突起変性に対するTGNペプチドの影響を検討した。神経突起変性は、細胞をノコダゾール（Nocodazole）と接触させることにより、細胞の神経突起微小管ダイナミクスをインターフェアーすることにより、PC12細胞で引き起こされた。分化したラットPC12細胞は、Nocodazole(0.5μM)で最初に処理され、72時間NGF(50ng/mL)及びTGNペプチド(100μM)を含む新鮮培地でインキュベートされた。2つの異なるチューブリン抗体(安定な神経突起のためにアセチル化α−チューブリン抗体 及びトータル神経突起のためにTUJ-1β‐チューブリン抗体)を使った免疫蛍光検査法は、TGN-1及びTGN-2ペプチドが、明白に、微小管安定化により、Nocodazole誘導神経突起変性を遅らせたということを示した(図4A)。我々は、さらにPC12細胞の神経突起伸出に対するTGNペプチドの効果を検討した。分化PC12細胞へのTGNペプチドの添加は、実際に、神経突起分化を促進した(TGN-1によって2.4倍増加及びTGN-2によって1.6倍増加、図4B)。TGN-1及びTGN-2ペプチドは、成熟した神経突起を変性から保護する活性と同様に神経栄養効果も示した。

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ここに引用された参照文献のすべては、その全体において、参照によって本発明に組み込まれる。

当業者は、ほんのルーチン実験にすぎない手段を使い、ここに特異的に記述された、本発明の特定の実施態様への多くの等価物を認識し、又は確認できるものと考える。

Claims (3)

1. 神経の再生又は神経損傷部位の神経変性を減ずる薬剤であって、損傷神経、神経再生若しくは神経変性に対し若しくはその近辺に、配列番号３〜６から選択されるいずれか１のアミノ酸配列からなるペプチドの有効量を投与することを特徴とする、薬剤。
2. 神経損傷が、中枢神経系である、請求項１の薬剤。
3. 神経細胞を、配列番号３〜６から選択されるいずれか１のアミノ酸配列からなるペプチドとインビトロで接触させることを含む、神経細胞の、成長、増殖若しくは細胞活性の増強方法。