KR20200080554A - Ebp50을 포함하는 말초신경손상 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 EBP50 유전자의 말초신경손상 치료 효과에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 말초신경계에서 EBP50이 가지는 손상의 치료 가속화 효능과, EBP50을 포함하는 신규한 말초신경손상 치료용 벡터 및 조성물을 개시한다. 본 발명의 실시예에 따른 벡터 및 상기 벡터를 포함하는 조성물은 EBP50이 기능하는 세포인 슈반세포에 특이적으로 EBP50이 발현될 수 있도록 한다. 이렇게 슈반세포에 도입된 EBP50은 말초신경 손상에 따라 저하된 운동기능은 물론 감각기능의 회복을 가속화하고 신경세포의 재수초화를 촉진하며 상기 회복이 좀더 온전하도록 할 수 있다.

Description

EBP50을 포함하는 말초신경손상 치료용 조성물 {COMPOSITION COMPRISING EBP50 FOR PERIPHERAL NERVE REPAIR}

본 발명은 EBP50 유전자의 말초신경손상 치료 효과에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 EBP50 유전자를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 말초신경손상 치료용 조성물 및 EBP50 단백질을 포함하는 말초신경손상 치료용 조성물에 관한 것이다.

인간의 감각과 운동을 담당하는 말초신경은 외상, 암 치료, 선천성 기형 등 다양한 원인에 의해 손상될 수 있다. 말초신경은 손상시에 재생이 어렵지만 가능한 경우가 많으나, 외상성 말초신경손상의 경우 그 정도에 따라 몇 주에서 1년 정도의 기간이 소요되는 등 그 속도가 충분히 빠르지 않으며, 불완전할 수 있다. 따라서 이같은 손상을 입은 환자는 신체감각과 운동기능이 떨어져 받는 고통을 장시간 경험하게 되어 삶의 질이 크게 떨어지게 되므로, 이러한 과정을 가속화하고 좀더 온전하게 할 수 있는 기술에 대한 수요가 크다. 특히 산업재해와 교통사고의 증가와 더불어 스포츠와 레저가 보편화되면서 신경의 물리적 손상은 발생빈도가 높아지고 손상양상이 다양해지고 있으며, 이에 따라 외상성 말초신경손상에 대한 치료 기술에 대한 수요는 더욱 증가하고 있다.

EBP50 (ERM binding protein 50, Sodium-hydrogen antiporter 3 regulator 1, SLC9A3 regulator 1, SLC9A3R1 또는 Na+/H+ Exchanger Regulatory Factor, NHERF1)은 스캐폴딩 단백질로서, 미세융모 단백질인 Ezrin, Radixin 및 Moesin과 직접 결합하는 것으로 알려져 있다. EBP50은 두 개의 PDZ영역(Postsynaptic density protein, Drosophila disc large tumor suppressor and zonula occludens-1 protein domain) 및 C말단의 ERM영역(Ezrin-Radixin-moesin domain) 등 총 세 개의 기능적 영역을 가지고 있다. 상기와 같은 영역들은 첨단막(apical membrane) 또는 미세융모(microvilli)와 같은 특화된 세포내소기관에서 신호전달복합체를 형성하여 기능하는 데에 필요한 것으로 알려졌다.

신경과 관련하여, Melendez-Vasquez et al.(doi: 10.1073/pnas.98.3.1235)은 EBP50이 슈반세포, 특히 랑비에 결절 부근에 국부화되는(localized) 것을 개시하고 있으며, EBP50은 미세소관(microtubule), 액틴(actin) 등의 세포골격(cytoskeleton)의 재정비와 관련하여 특히 다수의 연구가 되어 있고, 이러한 과정은 일반적으로 슈반세포 기능에 중요한 것으로 알려져 있으나, EBP50이 슈반세포에서 수행하는 기능에 대해서는 직접적으로 알려진 바가 없다. 또한 전술한 PDZ영역을 통해 결합하는 파트너인 PTEN(Phosphatase and tensin homolog), ERBB2 등이 말초신경병(peripheral neuropathy)과 관련이 있다는 것이 보고되었으나, 여기서 EBP50의 관련성 및 역할은 알려지지 않았다.

따라서, EBP50이 신경과 관련하여 수행하는 기능은 물론, 그 신경치료적인 효과에 대해서 밝혀진 바가 아직 없으며, 특히 외상성 말초신경손상의 치료 효능 및 EBP50을 효과적으로 목적세포에 도입한 유전자 치료제에 대해서는 아직 개시된 바가 없다.

본 발명은 전술한 요구를 해결하고자 안출된 것으로서, 본 발명의 일 실시예는 EBP50 유전자를 포함하는 말초신경손상 치료용 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명의 일 실시예는 상기 벡터를 포함하는 말초신경손상 치료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 일 실시예는 EBP50 단백질을 포함하는 말초신경손상 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일측면에 따른 말초신경손상 치료용 벡터는 EBP50 유전자를 포함한다.

여기서, 상기 EBP50 유전자는 서열번호 1에 따른 염기서열로 된 것일 수 있다.

상기 EBP50 유전자는 프로모터를 포함하는 발현 조절 서열이 상기 유전자에 작동하도록 연결되어 있는 것일 수 있다. 상기 프로모터는 CAG프로모터, CMV프로모터, EF1α프로모터, SV40프로모터, PGK1 프로모터, Ubc프로모터, β-Act프로모터 중에서 선택되는 것일 수 있다.

상기 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 상기 바이러스 벡터는 아데노연관바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터 중에서 선택되는 것일 수 있다. 상기 바이러스 벡터는 아데노연관바이러스 벡터일 수 있고, 상기 아데노연관바이러스 벡터는 혈청형 1 또는 8의 캡시드로 수도타이핑(pseudotyping)된 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일측면에 따른 말초신경손상 치료용 조성물은 상기 벡터를 포함한다.

여기서, 상기 조성물은 상기 벡터를 바이러스 파티클 형태로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 조성물은 말초신경손상 부위에 국부 주입되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일측면에 따른 말초신경손상 치료용 조성물은 EBP50 단백질을 포함한다.

여기서, 상기 EBP50 단백질은 서열번호 2에 따른 아미노산 서열로 된 것일 수 있다.

상기 조성물은 말초신경손상 부위에 국부 주입되는 것일 수 있다.

상술한 과제 해결 수단은 단지 예시적인 것으로서, 본 발명을 제한하려는 의도로 해석되지 않아야 한다. 상술한 예시적인 실시예 외에도, 도면 및 발명의 상세한 설명에 추가적인 실시예가 존재할 수 있다.

본 발명은 말초신경계에서 EBP50이 가지는 손상의 치료 가속화 효능을 최초로 개시하고, 이를 포함하는 신규한 말초신경손상 치료용 벡터 및 조성물을 개시한다.

본 발명의 실시예에 따른 벡터 및 상기 벡터를 포함하는 조성물은 EBP50이 기능하는 세포인 슈반세포에 특이적으로 EBP50이 발현될 수 있도록 한다. 이렇게 슈반세포에 도입된 EBP50은 말초신경 손상에 따라 저하된 운동기능은 물론 감각기능의 회복을 가속화하고 신경세포의 재수초화를 촉진할 수 있다.

본 발명에 따른 벡터 및 조성물은 전술한 바와 같은 효과에 의해, 특히 외상에 의한 말초신경손상의 회복에 걸리는 기간을 단축하고 상기 회복이 좀더 온전하게 이루어질 수 있도록 할 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 C57BL/6 마우스 좌골신경조직의 EBP50 발현.
도2는 손상에 따른 좌골신경 내 EBP50 발현 변화.
도3은 야생형(wildtype, WT) 및 EBP50 KO(-/-) 마우스의 운동기능 및 수초 상태 비교.
도4는 3개월 및 12개월령 야생형 및 이형접합 EBP50 KO(+/-) 마우스의 걸음걸이 비교.
도5는 좌골신경 손상에 대한 야생형 및 EBP50 KO(-/-) 마우스의 운동기능 및 감각기능 회복 추이 비교.
도6은 EBP50 KO(-/-) 마우스 좌골신경 손상 후 본 발명의 실시예에 따른 바이러스 벡터 주입에 따른 운동기능 및 감각기능 회복 추이 비교.
도7은 야생형(WT) 마우스 좌골신경 손상 후 본 발명의 실시예에 따른 바이러스 벡터 주입에 따른 운동기능 및 감각기능 회복 추이 비교.
도8은 야생형(WT) 및 EBP50 KO(-/-) 마우스 좌골신경 손상 후 본 발명의 실시예에 따른 바이러스 벡터 주입에 따른 4주 후 신경 수초 상태 비교.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 의해 본 발명이 한정되지 않으며 본 발명은 후술할 청구범위의 의해 정의될 뿐이다.

덧붙여, 본 발명에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 발명의 명세서 전체에서 어떤 구성요소를 '포함'한다는 것은 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.

또한, 본 발명에서 사용되는 EBP50은 유전자 또는 그 유전자 산물인 전사물 또는 단백질을 교환가능하게(interchangably) 지칭한다.

본 발명의 발명자들은 슈반세포에서 발현되는 EBP50 유전자가 가지는 기능에 대해 연구하던 중, 말초신경의 손상 후 해당 부위에서 EBP50의 발현이 증가하며, EBP50의 녹아웃(KO) 마우스는 야생형(WT)에 비해 운동기능이 저해되고 해당 운동신경 축색돌기의 수초화에 이상이 생길 뿐 아니라 해당신경의 손상 후 운동 및 감각기능의 회복이 지연되는 것을 발견하였다. 이러한 KO 마우스의 말초신경에 물리적 손상을 가하고, EBP50의 발현을 유도함으로써 상기 KO 마우스에서 나타나던 손상 후 회복 지연을 구조(rescue)할 수 있었으며, WT 마우스에 EBP50을 추가로 발현시키고 말초신경의 물리적 손상을 가한 경우에 회복이 가속화되는 것을 확인하였다. 이를 통해 EBP50을 포함하는 벡터가 외상성 말초신경손상의 치료제로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하고, 이를 토대로 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 일측면에 따른 말초신경손상 치료용 벡터는 EBP50 유전자를 포함한다.

여기서, 상기 EBP50 유전자는 바람직하게 서열번호 1에 따른 염기서열로 된 것일 수 있다. 본 발명의 EBP50은 상기 서열번호1에 따른 염기서열로 된 EBP50과 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 갖는 변화된 서열을 가지는 경우를 포함한다. 예컨대, 상기 서열번호1이 코딩하는 단백질의 아미노산 서열은 서열번호2와 같은데, 동일 또는 보존적(conservative, 생화학적 성질이 유사함) 아미노산 서열을 코딩하도록 변화된 염기서열을 가지는 경우, 또는 전술한 EBP50의 신호전달에 중요한 세 개의 영역(domain)의 기능이 유지되는 상태로 변화된 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 가지는 경우 등이 포함된다.

상기 EBP50 유전자는 프로모터를 포함하는 발현 조절 서열이 상기 유전자에 작동하도록 연결되어 있는 것일 수 있다. 여기서 발현 조절 서열은 프로모터 외에 인핸서(enhancer) 등의 요소를 포함할 수 있고, 기존에 존재하는 발현 조절 서열 외에도 인공적으로 제조되거나 결합되어 발현을 유도할 수 있는 서열 등의 요소를 포함할 수 있음은 당업자에게 자명한 바이다. 상기 프로모터는 CAG프로모터, CMV프로모터, EF1α프로모터, SV40프로모터, PGK1 프로모터, Ubc프로모터, β-Act프로모터 중에서 선택되는 것일 수 있다. 상기 프로모터들은 대체로 세포의 종류에 관계없이 조절대상인 유전자가 안정적으로 발현될 수 있도록 하는 발현 조절 서열로 알려져 있다. 이 중 CMV 프로모터와 PGK1 프로모터는 세포 종류에 따라 발현이 저해될 수 있다는 보고가 일부 존재하므로, 바람직하게 CAG프로모터, EF1α프로모터, SV40프로모터, Ubc프로모터, β-Act프로모터일 수 있고, 더욱 바람직하게 CAG 프로모터일 수 있다. CAG 프로모터는 CMV 인핸서, 닭 β-액틴 프로모터 등을 포함하여 과발현을 유도하는 것으로 알려져 있다. 본 발명은 말초신경, 특히 슈반세포에 추가적으로 EBP50을 발현시키는 것을 목적으로 하므로, 상기 나열한 프로모터들 외에도 상기 세포에서의 유전자 발현을 효과적으로 유도할 수 있는 프로모터가 있다면 사용될 수 있다.

상기 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 바이러스 벡터는 노출된 핵산에 비해 안정적이며, 구조가 단순하고, 게놈 사이즈가 작으며 일부 원하는 정보를 추가할 수 있고, 제조가 손쉬우며, 원하는 분자를 목표세포로 도입하도록 변형하기 쉬운 장점을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 상기 바이러스 벡터는 바람직하게 아데노연관바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터 중에서 선택되는 것일 수 있고, 바람직하게 아데노연관바이러스 벡터일 수 있다. 아데노바이러스 및 폭스바이러스 벡터는 숙주 세포의 게놈 상에 삽입되지 않는 반면 도입된 유전자의 지속력이 낮고 강력한 전신적 면역반응을 일으킬 수 있다. 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터는 숙주 세포의 게놈 상에 삽입되어 도입된 유전자의 지속력이 높지만 발암으로 연결될 수 있는 숙주 세포의 돌연변이 가능성이 있다. 아데노연관바이러스 벡터는 숙주 세포의 게놈 상에 삽입되지 않지만 도입된 유전자의 지속력은 높은 편으로 보고되었으며, 약한 면역반응을 일으킬 수 있다. 상기 아데노연관바이러스 벡터는 혈청형 1 또는 8의 캡시드로 수도타이핑(pseudotyping)된 것일 수 있고, 바람직하게 혈청형 8의 캡시드로 수도타이핑된 것일 수 있다. 바이러스 벡터의 수도타이핑(pseudotyping)은 바이러스 유전물질을 둘러싸고 있는 캡시드나 막단백질 등 외부로 노출된 물질이 최소한 일부 타 바이러스 유래의 것을 포함하도록 패키징하는 것으로, 이렇게 바이러스 벡터의 상기 물질을 교체하여 세포 지향성(tropism)을 원하는 쪽으로 변화시킬 수 있다. 이때, 상기 타 바이러스 유래의 캡시드나 막 물질의 유전정보는 상기 수도타이핑된 바이러스 벡터에 포함되지 않으므로 1차 감염 후 추가적인 감염을 방지하는 효과를 가질 수 있다. 아데노연관바이러스 혈청형 1 (AAV1)은 감각신경 및 슈반세포를, 혈청형8(AAV8)은 대체로 슈반세포를 감염시키는 것으로 보고되었다. 상기 바이러스 벡터들은 독성을 감소(attenuation)시키거나 기타 원하는 특성이 증가되도록 일부 구성요소가 추가적으로 변형, 결실 또는 추가되는 경우가 있다는 것은 당업계에서 일반적인 사항이므로 이에 대한 설명은 생략한다.

본 발명의 다른 일측면에 따른 말초신경손상 치료용 조성물은 상기 벡터를 포함한다.

여기서, 상기 조성물은 상기 벡터를 바이러스 파티클 형태로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 바이러스 파티클은 바이러스의 유전물질 및 이를 둘러싼 코트 또는 캡시드로 구성된 형태이다. 상기 파티클의 효과적인 용량은 환자 체중, 표면적 또는 기관 크기에 따라서 계산될 수 있다. 본 명세서에 기재된 각각의 제형을 수반하는 치료를 위한 적절한 투약량을 결정하기 위한 계산 및 추가적인 정제는 당업계에서 일상적으로 이루어지며, 당업계에서 일상적으로 수행되는 작업의 영역 내에 있다. 적절한 투약량은 적절한 용량-반응 데이터의 사용을 통해 확인될 수 있다.

상기 조성물은 말초신경손상 부위에 국부 주입되는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 국부 주입은 주사기를 통해 직접 손상된 신경 부위에 찔러 주입하는 것일 수 있다. 상기 국부 주입 시 신경 부위를 정교하게 살펴 주입하기 위한 절개, 주입 효율을 높이기 위한 전기천공(electroporation) 등 추가적인 조치가 동반될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일측면에 따른 말초신경손상 치료용 조성물은 EBP50 단백질을 포함한다.

여기서, 상기 EBP50 단백질은 서열번호 2에 따른 아미노산 서열로 된 것일 수 있다. 본 발명의 EBP50 단백질은 상기 서열번호 2에 따른 아미노산 서열을 가지는 경우 외에도, 상기 서열로 된 단백질과 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 갖는 변화된 서열을 가지는 경우를 포함한다. 예컨대, 동일 또는 보존적(conservative, 생화학적 성질이 유사함) 아미노산 서열을 가지는 경우 또는 전술한 EBP50의 신호전달에 중요한 세 개의 영역(domain)의 기능이 유지되는 상태로 변화된 아미노산 서열을 가지는 경우 등이 포함된다.

상기 단백질은 세포 내 전달, 안정성, 지속성 등의 효과를 갖도록 화학적 변형을 거치거나, 약제학적으로 허용되는 첨가제 또는 장치와 함께 상기 조성물에 포함될 수 있다. 상기 단백질의 세포 내 전달을 위한 변형에는 HIV의 Tat 유래 arginine-rich sequence, HSV-1의 VP22 유래 서열, 초파리의 pAntp유래 서열, 인간 Hoxa-5 유래 서열 등 CPP(cell-penetrating peptide 또는 protein-transduction domains, PTD)로 불리는 펩타이드와의 연결 등을 예로 들 수 있다. 상기 펩타이드와의 연결은 in-frame으로 상기 단백질과의 융합단백질이 되도록 하거나, 그 외 다양한 생화학적 기술 (예컨대 특정 아미노산에 대한 conjugation 등)에 따라 만들 수 있다. 상기 단백질의 세포 내 전달 효율과 안정성을 높이기 위해 예컨대 페길레이션(PEGylation), 각종 폴리머 마이셀(polymeric micelle) 등의 기술을 적용할 수 있으며, 상기 단백질은 지속적인 전달을 위해 예컨대, 서방성 제제나 스텐트 등의 장치와 결합할 수 있다.

상기 조성물은 말초신경손상 부위에 국부 주입되는 것일 수 있다. 국부 주입에 대해서는 전술한 바 있으므로 설명을 생략한다.

상기 본 발명의 일측면들에 따른 조성물에는 상기 EBP50 유전자 또는 단백질 이외에도 약학적으로 허용되는 염, 담체, 부형제, 비히클 및 치료효과를 좀더 증진시킬 수 있는 기타 첨가제 등이 다양하게 첨가될 수 있음은 당업자에게 자명한 사항이므로, 이에 대한 구체적 설명은 제외하기로 한다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

실시예1. EBP50 포함 바이러스 벡터의 제조

AAV-CAG-GFP 벡터의 EcoRI/BamHI 위치에 EBP50 유전자를 삽입하고 GFP를 제거하여 AAV-CAG-EBP50을 제조하였다. 간단히 설명하자면, Human EBP50 유전자를 EcoRI과 BamH site가 생성되도록 디자인된 프라이머 세트(5-gcaaagaattggatcc ATGGACTACAAGGACG-3' 5'-gcttgatatcgaattc tcagaggttgctgaagag-3) 와 Pfu DNA polymerase (2.5 u/ul) 를 이용하여 증폭하고 EcoRI과 BamHI 으로 cutting하였다. 상기 cutting된 EBP50유전자를 T4 DNA ligase를 이용하여 상기 벡터에 삽입하였다. 완성된 플라스미드 DNA를 E. coli DH5 α에 형질전환하여 증폭하고 plasmid DNA mini kit (Labopass)를 이용하여 정제하였다. 완성된 벡터 플라스미드는 염기서열분석을 실시하여 확인하였다 (Cosmo Genetech, Korea).

상기 AAV-CAG-GFP 및 제조된 벡터 플라스미드(AAV-CAG-EBP50)들은 각각 상기 도입유전자(transgene, 각각 GFP 및 EBP50)가 AAV2의 inverted terminal repeats 사이에 들어가 있는 상태이며, 이들을 각각 AAV2/8 캡시드에 패키징되도록 pseudotyping하여 바이러스 파티클(각각 AAV2/8-CAG-GFP 및 AAV2/8-CAG-EBP50)을 생성하였다. 이후 상기 바이러스 파티클들은 KIST virus facility(http://virus.kist.re.kr)에서 Iodixanol gradient ultracentrifugation 방법으로 정제되었고, 결과물은 각각 1.3-1.6XE13 genome copies/ml (GC/ml)의 역가(titer)를 가지며, 이하 실험예에서 바이러스 벡터로 지칭한다.

실험예1. 말초신경의 EBP50 발현 분석

말초신경계에서 EBP50이 수행하는 기능을 이해하기 위해, C57BL/6 마우스 좌골신경을 EBP50 및 S100B에 대해 면역염색 후 DAPI로 카운터염색하였다. 이때, 마우스는 0.1M PBS(pH 7.4)으로 희석한 0.9% NaCl 및 4% 파라포름알데히드 (paraformaldehyde, PFA)를 이용하여 심장관류-고정(intracardiac perfusion-fixation)하고, 좌골신경은 4% PFA에 24시간 침지고정하였다. 동결보호를 위해 신경을 0.1M PBS에 희석한 30% 수크로즈에 72시간 인큐베이션 후 Tissue-Tek에 임베딩하여 10-μm 두께로 횡절단하였다. 단편은 0.4% Triton X-100 처리 후 1% Bovine serum albumin 및 4% normal donkey serum 으로 1시간 동안 상온에서 blocking하였다. 상기 단편은 1차 항체(rabbit anti-EBP50 antibody, 1:500 dilution, Thermo Scientific; mouse polyclonal anti-S100B antibody, 1:500 dilution, Wako)와 4℃ overnight 인큐베이션 후, 2차 항체(FITC-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody and Cy3-conjugated donkey anti-mouse IgG antibody, Jackson ImmunoResearch Laboratory)와 상온에서 1시간 인큐베이션하였다. 수초 염색을 위해 FluoroMyelin-Green이 1:300로 사용되었다(Molecular Probes). 이후 단편을 마운팅 후 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole) 포함 젤라틴을 이용하여 카운터염색하였다. 이미지는 공초점현미경(Zeiss LSM710)을 이용하여 얻었다.

도1A와 같이 횡단편을 확인한 결과, EBP50은 일부 축색돌기 주변으로 도넛 또는 반달형태로 존재하였고, 슈반세포 마커인 S100B와 함께 슈반세포의 세포질 부위에 공존하였다(colocalized). 종단편(도1B) 및 teased fiber(도1C)로부터, EBP50이 특히 랑비에 결절에 강하게 발현되어 있음을 알 수 있었다.

실험예2. 압궤손상에 따른 좌골신경의 EBP50발현 변화 분석

손상반응에 있어 EBP50이 수행하는 기능이 있는지 알아보기 위해, 마우스의 좌골신경에 압궤손상(crush injury)을 가하였다. 마우스를 2% 이소플루레인이 담긴 상자에 2 내지 3분 넣어 마취시킨 후 MiniVent (Harvard Apparatus, Holliston, MA)에 올렸다. 면도기와 제모크림을 이용하여 절개부위의 털을 제거한 후 증류수로 씻어낸 후 베타딘을 바른 다음, 70% 에탄올로 닦은 후 베타딘을 다시 가하였다. 수술 도중에는 이소플루레인을 1%로 낮추었다. 대퇴골 이두박근이 노출되도록 우측 좌골절흔 아래를 절개하고 대퇴부 중간 부위의 좌골신경을 미세겸자로 30초 2회 (10초 간격) 눌러 압궤손상키고, 신경을 제자리에 돌려둔 다음 6.0 나일론봉합사로 피부를 봉합하였다. 손상 전 및 손상 후7, 14, 28일 차에 각각 좌골신경을 채취하고(도2A) 상기 좌골신경에 대해 Western blot(도2B-C) 및 면역염색(도2D-E)을 수행하였고, 두 실험 모두에서 손상 후 EBP50이 증가한 것으로 나타났다.

실험예3. EBP50 KO 운동기능 및 말초신경 수초화 분석

수초화에 있어 EBP50이 갖는 기능을 알아보기 위해, EBP50 -/-(KO) 마우스의 운동기능 및 수초화를 분석하였다.

EBP50 유전자형에 따른 동물실험과 관련하여, 각 동물은 <표1>의 프라이머를 이용하여 게놈DNA에 대한 PCR로 유전자형을 확인하였으며, 이때, 야생형(WT) allele의 경우 363 bp로, KO allele의 경우 500 bp로 밴드를 확인할 수 있었다(도3A).

ID #	서열
#1	5'-TTC GGC CTC ATT CTG GTC-3'
#2	5'-GAG AAG GGT CCA AAT GGC TA-3'
#3	5'-CGC CTT CTT GAC GAG TTC TT-3'

EBP50 KO 마우스의 운동기능을 알아보기 위해, rotarod test, gait analysis, hanging test를 수행하였다. 이때, Rotarod test의 경우, 마우스를 4rpm으로 회전하는 바에 올리고, 회전율을 0.12rpm/s로 증가시켜 마우스가 떨어질 때까지 걸리는 시간(latency time)을 측정하여 평가하였다. 이때, 한 번의 훈련을 거친 후 3 내지 5회로 시험을 진행하였다. Hanging test는 1mm 직경의 철사 12mm2로 이루어진 43cm2의 철망을 이용하였는데, 상기 철망은 마우스가 반대쪽으로 오르는 것을 막기 위해 나무 beading으로 둘러싸여 있었다. 테스트는 마우스를 상기 철망에 올려 뒤집은 후 매달리기가 유지되는 최장시간(latency)을 초 단위로 재었으며, 각 시험은 최장 180초로 이루어졌다. Gait analysis를 통해서는 Sciatic functional index (SFI), stride angle, stride length, plantar length를 구하였다. 즉, 마우스의 앞발과 뒷발에 서로 다른 색의 잉크를 바른 직후 하얀 종이가 깔린 트랙에서 걷도록 한 다음, 발자국을 스캔하여 ImageJ(NIH) 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 이때, SFI를 얻기 위해 발자국 길이(PL, print length, 뒤꿈치부터 셋째 발가락 끝까지의 길이), 발가락 퍼짐(TS, toe spread, 첫번째와 다섯번째 발가락 사이 거리), 중위 발가락 퍼짐 (ITS, intermediary toe spread, 두번째와 네번째 발가락 사이 거리)을 마우스의 시험(experimental) 및 대조(normal) 측(side) 모두에서 측정하고, 다음과 같은 식에 넣어 SFI를 계산하였다: SFI = -38.3(EPL-NPL)/NPL + 109.5(ETS-NTS)/NTS + 13.3(EITS-NITS)/NITS - 8.8. 이때, SFI가 10~-10인 경우 정상으로 판단하였다.

그 결과, 야생형(WT)에 비해 KO의 경우 rotarod performance 부문에서 버티는 시간이 더 짧은 것으로 나타났으며(도3B), 정상범위이긴 하나 낮은 SFI를 보였다(도3C). 다음으로, 3개월령 KO마우스의 좌골신경에 대해 전술한 바와 같이 fluoromyelin 염색을 수행한 결과, WT에 비해 수초화된 축색돌기 수에는 차이가 없으나, 비정상적으로 함입된(infolded) 수초가 많이 나타나(도3E-G), EBP50이 정상적인 운동기능 및 수초화에 중요함을 확인할 수 있었다.

실험예4. EBP50 이형접합 KO(+/-)의 운동기능 분석

EBP50의 dose에 따른 효과를 알아보기 위해, 3개월 및 12개월령 EBP50 이형접합 KO(+/-)의 gait analysis를 전술한 바와 같이 수행하여 비교하였다. 3개월령에서는 WT과 EBP50+/- 간에 차이가 나타나지 않았으나, 12개월령에서는 EBP50+/-에서 stride angle이 적어지고, stride length가 감소하였으며, plantar length가 길어져(도4A-C), 생후 시간이 흐르면서 운동기능 및 발바닥 근육에 이상이 발생하는 것으로 나타났다.

실험예5. 압궤손상에 따른 EBP50 KO의 운동 및 감각기능 회복추이 분석

다음으로, 12주령 마우스의 오른쪽 뒷다리 좌골신경에 전술한 프로토콜에 따라 압궤손상을 가하고, EBP50 KO 마우스의 손상 후 기능적 회복을 분석하였다. 운동기능을 확인하기 위해 Hanging 및 Rotarod test를 전술한 바와 같이 수행하고, toe spreading-reflex score 및 toe spreading score를 분석하였다. 이때, Toe spreading-reflex score의 경우, 마우스의 꼬리를 잡아 들어올려 2초간 발가락 움직임을 관찰하여 다음과 같이 점수화함으로써 구했다: 무반응(0), 움직임에 대한 신호(1), 외전(abduction, 2), 발가락 퍼짐(extension)을 동반한 외전(3). 각 점수화는 디지컬 카메라에 담긴 행동 비디오를 분석하여 수행되었다. Toe spreading score는 발가락 움직임을 관찰하여 다음과 같이 점수화함으로써 구했다: 퍼짐(spreading) 없음(0), 모든 발가락을 중간 정도 퍼뜨림(1), 온전한 퍼짐(2). 이때, 온전한 퍼짐(full spreading)은 넓고 완전하게 최소한 2초간 발가락이 뻗어져 있는 것으로 정의되었다. 손상 반대측에서 온전한 반응이 나타난 마우스에서 시험하였고, 각 시험은 최소한 45분 간격을 두고 2회 반복해서 진행하였다.

Hanging test, Rotarod test, toe spreading-reflex score, toe spreading score 분석 결과, 손상 후 모든 시점에서 WT에 비해 낮은 수치가 나타나(도5B-F), 운동기능의 회복이 늦춰졌다는 것을 확인할 수 있었다.

다음으로, 감각기능을 확인하기 위해 toe pinch 및 pin-prick test를 수행하였다. 이때, Toe pinch test는 손상된 측의 뒷다리의 각 발가락을 끝이 납작한 겸자로 꼭 집어 즉각적으로 발을 빼내는 반응이 있을 경우 기능적인 민감도가 있는 것으로 기록하는 방식으로 이루어졌다. 모든 발가락에 민감도가 없는 것으로 나타난 경우 손상되지 않은 측(contralateral)에 동일한 과정을 수행하였으며, 이때 항상 즉각적인 반응이 있었다. 겸자로 집는 과정은 동일한 시험자에 의해 동일한 수준의 힘을 가해 진행하였다. Pin-prick test는 Austerlitz insect pin black(사이즈 000, 길이 39 mm, 직경 0.25 mm, Ento spinx, Czech Republic)을 발바닥 표면에 발을 움직이거나 피부를 뚫지 않도록 가볍게 찔러 이루어졌다. 발바닥의 가장 바깥쪽, 즉 좌골신경의 감각 필드에 해당하는 부분을 다섯 개(A-E, 도5H 및 도6G)로 나누고, 발가락에 가까운 부위부터 뒤꿈치쪽으로 이동하며 각 부위 2회씩 찔렀고, 이에 대해 해당 마우스가 재빨리 발을 뺄 경우 해당 부위에 반응이 있는 것으로 보고 1점을 부과하고 다음 부위로 넘어가는 식으로 수행되었다. 자극은 5-8초 간격으로 가하여 직전 자극과 행동 간 분명한 관계가 나타나도록 하였다.

상기와 같은 감각기능 검사 결과, 손상 후 모든 시점에서 WT에 비해 낮은 수치가 나타나(도 5G-H), 운동기능과 마찬가지로 감각기능 역시 그 기능적 회복이 늦춰졌음을 확인할 수 있었으며, 이러한 결과는 EBP50이 말초신경손상의 회복 과정에 중요하다는 것을 가리킨다.

실험예6. 실시예1에 따른 바이러스 벡터 주입의 효과 분석

실험예5에서 확인한 EBP50 KO의 압궤손상 후 회복 지연을 EBP50 도입을 통해 rescue할 수 있는지 확인하고자, 실시예1에 따른 바이러스 벡터(AAV2/8-CAG-EBP50)를 좌골신경 내에 주입하고, 1주일 후 압궤손상을 가하였다(도6A). 바이러스 벡터의 주입은 전술한 압궤손상시 절개와 같은 방식으로 절개하고, 노출된 좌골신경을 뭉뚝한 겸자로 살짝 들어올린 다음 Hamilton syringe에 달린 34-구경 무딘 바늘을 manipulator로 이를 통해 45° 각도로 3 μl의 PBS 또는 2.5X10⁷ pfu의 바이러스가 포함된 PBS를 5분에 걸쳐 주입한 다음 나일론봉합사로 절개부위를 봉합하여 진행하였다. 대조군에는 AAV2/8-CAG-EBP50 대신 AAV2/8-CAG-GFP바이러스를 주입하였다. 운동기능을 확인하기 위해 전술한 바와 같이 Rotarod, Hanging, Toe spreading reflex, toe spreading test를 진행한 결과, AAV2/8-CAG-EBP50 주입 후 좌골신경에 손상을 가한 EBP50 KO은 대조군에 비해 높은 performance를 보여(도6B-E), 손상된 운동기능의 회복이 가속화된 것으로 나타났다. 또한, toe pinch 및 pin-prick test 결과(도6F-G), 대조군에 비해 손상 후 대체로 높은 수치를 보여, 손상된 감각기능의 회복 역시 가속화된 것을 확인할 수 있었다.

다음으로, WT마우스에서 EBP50 도입을 통해 압궤손상의 회복에 영향을 미칠 수 있는지 확인하기 위해, 실시예1에 따른 바이러스 벡터(AAV2/8-CAG-EBP50)를 좌골신경 내에 주입하고, 1주일 후 압궤손상을 가하였다(도7A). Rotarod, Hanging, Toe spreading reflex, toe spreading test를 진행한 결과, AAV2/8-CAG-EBP50 주입 후 좌골신경에 손상을 가한 EBP50 KO은 대조군에 비해 높은 performance를 보여(도7B-E), 손상된 운동기능의 회복이 가속화된 것으로 나타났다.

마지막으로, EBP50의 도입이 압궤손상 후 신경세포의 재수초화에 미치는 영향을 알아보기 위해 AAV2/8-CAG-EBP50 도입 및 손상 4주 후 마우스에 대한 조직학적 검사를 수행하였다. 그 결과, WT 및 KO 모두에서 재수초화 중인 신경의 수가 증가한 것을 확인할 수 있었다(도8).

종합해보면, AAV2/8-CAG-EBP50를 이용하여 EBP50을 슈반세포로 효과적으로 도입할 수 있으며, 상기와 같은 EBP50의 도입을 통해 손상된 말초신경의 운동 및 감각기능의 회복을 촉진할 수 있다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Catholic Kwandong University Industry Foundation <120> COMPOSITION COMPRISING EBP50 FOR PERIPHERAL NERVE REPAIR <130> P20180303KR <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1077 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgagcgcgg acgcagcggc cggggcgccc ctgccccggc tctgctgcct ggagaagggt 60 ccgaacggct acggcttcca cctgcacggg gagaagggca agttgggcca gtacatccgg 120 ctggtggagc ccggctcgcc ggccgagaag gcggggctgc tggcggggga ccggctggtg 180 gaggtgaacg gcgaaaacgt ggagaaggag acccaccagc aggtggtgag ccgcatccgc 240 gccgcactca acgccgtgcg cctgctggtg gtcgaccccg agacggacga gcagctgcag 300 aagctcggcg tccaggtccg agaggagctg ctgcgcgccc aggaagcgcc ggggcaggcc 360 gagccgccgg ccgccgccga ggtgcagggg gctggcaacg aaaatgagcc tcgcgaggcc 420 gacaagagcc acccggagca gcgcgagctt cggcctcggc tctgtaccat gaagaagggc 480 cccagtggct atggcttcaa cctgcacagc gacaagtcca agccaggcca gttcatccgg 540 tcagtggacc cagactcccc ggctgaggct tcagggctcc gggcccagga tcgcattgtg 600 gaggtgaacg gggtctgcat ggaggggaag cagcatgggg acgtggtgtc cgccatcagg 660 gctggcgggg acgagaccaa gctgctggtg gtggacaggg aaactgacga gttcttcaag 720 aaatgcagag tgatcccatc tcaggagcac ctgaatggtc ccctgcctgt gcccttcacc 780 aatggggaga tacagaagga gaacagtcgt gaagccctgg cagaggcagc cttggagagc 840 cccaggccag ccctggtgag atccgcctcc agtgacacca gcgaggagct gaattcccaa 900 gacagccccc caaaacagga ctccacagcg ccctcgtcta cctcctcctc cgaccccatc 960 ctagacttca acatctccct ggccatggcc aaagagaggg cccaccagaa acgcagcagc 1020 aaacgggccc cgcagatgga ctggagcaag aaaaacgaac tcttcagcaa cctctga 1077 <210> 2 <211> 358 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ser Ala Asp Ala Ala Ala Gly Ala Pro Leu Pro Arg Leu Cys Cys 1 5 10 15 Leu Glu Lys Gly Pro Asn Gly Tyr Gly Phe His Leu His Gly Glu Lys 20 25 30 Gly Lys Leu Gly Gln Tyr Ile Arg Leu Val Glu Pro Gly Ser Pro Ala 35 40 45 Glu Lys Ala Gly Leu Leu Ala Gly Asp Arg Leu Val Glu Val Asn Gly 50 55 60 Glu Asn Val Glu Lys Glu Thr His Gln Gln Val Val Ser Arg Ile Arg 65 70 75 80 Ala Ala Leu Asn Ala Val Arg Leu Leu Val Val Asp Pro Glu Thr Asp 85 90 95 Glu Gln Leu Gln Lys Leu Gly Val Gln Val Arg Glu Glu Leu Leu Arg 100 105 110 Ala Gln Glu Ala Pro Gly Gln Ala Glu Pro Pro Ala Ala Ala Glu Val 115 120 125 Gln Gly Ala Gly Asn Glu Asn Glu Pro Arg Glu Ala Asp Lys Ser His 130 135 140 Pro Glu Gln Arg Glu Leu Arg Pro Arg Leu Cys Thr Met Lys Lys Gly 145 150 155 160 Pro Ser Gly Tyr Gly Phe Asn Leu His Ser Asp Lys Ser Lys Pro Gly 165 170 175 Gln Phe Ile Arg Ser Val Asp Pro Asp Ser Pro Ala Glu Ala Ser Gly 180 185 190 Leu Arg Ala Gln Asp Arg Ile Val Glu Val Asn Gly Val Cys Met Glu 195 200 205 Gly Lys Gln His Gly Asp Val Val Ser Ala Ile Arg Ala Gly Gly Asp 210 215 220 Glu Thr Lys Leu Leu Val Val Asp Arg Glu Thr Asp Glu Phe Phe Lys 225 230 235 240 Lys Cys Arg Val Ile Pro Ser Gln Glu His Leu Asn Gly Pro Leu Pro 245 250 255 Val Pro Phe Thr Asn Gly Glu Ile Gln Lys Glu Asn Ser Arg Glu Ala 260 265 270 Leu Ala Glu Ala Ala Leu Glu Ser Pro Arg Pro Ala Leu Val Arg Ser 275 280 285 Ala Ser Ser Asp Thr Ser Glu Glu Leu Asn Ser Gln Asp Ser Pro Pro 290 295 300 Lys Gln Asp Ser Thr Ala Pro Ser Ser Thr Ser Ser Ser Asp Pro Ile 305 310 315 320 Leu Asp Phe Asn Ile Ser Leu Ala Met Ala Lys Glu Arg Ala His Gln 325 330 335 Lys Arg Ser Ser Lys Arg Ala Pro Gln Met Asp Trp Ser Lys Lys Asn 340 345 350 Glu Leu Phe Ser Asn Leu 355

Claims (14)

1. EBP50 유전자를 포함하는 말초신경손상 치료용 벡터.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 EBP50 유전자는 서열번호 1에 따른 염기서열로 된 것인 말초신경손상 치료용 벡터.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 EBP50 유전자는 프로모터를 포함하는 발현 조절 서열이 상기 유전자에 작동하도록 연결되어 있는 것인 말초신경손상 치료용 벡터.
   
4. 제4항에 있어서,
   상기 프로모터는 CAG프로모터, CMV프로모터, EF1α프로모터, SV40프로모터, PGK1 프로모터, Ubc프로모터, β-Act프로모터 중에서 선택되는 것인 말초신경손상 치료용 벡터.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 벡터는 바이러스 벡터인 말초신경손상 치료용 벡터.
   
6. 제5항에 있어서,
   상기 바이러스 벡터는 아데노연관바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터 중에서 선택되는 것인 말초신경손상 치료용 벡터.
   
7. 제5항에 있어서,
   상기 바이러스 벡터는 아데노연관바이러스 벡터인 말초신경손상 치료용 벡터.
   
8. 제7항에 있어서,
   상기 아데노연관바이러스 벡터는 혈청형 1 또는 8의 캡시드로 수도타이핑(pseudotyping)된 것인 말초신경손상 치료용 벡터.
   
9. 제1항에 따른 벡터를 포함하는 말초신경손상 치료용 조성물.
   
10. 제9항에 있어서,
    상기 조성물은 상기 벡터를 바이러스 파티클 형태로 포함하는 말초신경손상 치료용 조성물.
    
11. 제9항에 있어서,
    상기 조성물은 말초신경손상 부위에 국부 주입되는 것인 말초신경손상 치료용 조성물.
    
12. EBP50 단백질을 포함하는 말초신경손상 치료용 조성물.
    
13. 제12항에 있어서,
    상기 EBP50 단백질은 서열번호 2에 따른 아미노산 서열로 된 것인 말초신경손상 치료용 조성물.
    
14. 제12항에 있어서,
    상기 조성물은 말초신경손상 부위에 국부 주입되는 것인 말초신경손상 치료용 조성물.
    
    

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