JP6779546B2 - 視力回復のための多特性オプシンによる光遺伝学的調節及びその別の用途 - Google Patents

視力回復のための多特性オプシンによる光遺伝学的調節及びその別の用途 Download PDF

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Description

本発明は、概して、合成オプシンによって細胞活性を調節するための組成物及び方法に関する。より具体的には、本発明は、視力回復及び他の治療用途のために、ニューロンに対する光感受性の増強を提供する。
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本明細書に電子的に提出されたテキストフィールドの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。配列表のコンピュータ可読フォーマットコピー(ファイル名:NATE2000WO_SLrtf、日付記録:11/03/17、ファイルサイズ48キロバイト)。
乾燥加齢黄斑変性(AMD)及び網膜色素変性(RP)などの網膜変性疾患において、光から電気化学信号への変換に関与する光受容体(例えば、桿体及び錐体)が変性する。これにより、網膜における光誘導性信号の生成が防止され、視覚系内で次々に起こる視覚感覚に関する事象が破壊される。光受容体細胞の消失及び/又は光受容体細胞の機能の消失は、光感受性の低下及び失明の主な原因である。
視力喪失の課題を満たすために、本開示の原理は、いくつかの光感受性イオンチャンネル分子、並びにそれらの調製方法及び視力回復を含む異なる使用方法を提供する。本発明はまた、本発明の光感受性イオンチャンネルをコードする単離核酸配列、及びかかる核酸配列を含む構築物を含む。
一態様では、本開示は、(i)複数の可視波長で高い光感受性を有し、(ii)安全なウイルスにパッケージングされ得るプラスミドサイズを有する、光感受性イオンチャンネル(多特性オプシン)を合成的に提供する。
加えて、いくつかの態様において本開示は、in vitro又はin vivoでの細胞内の多特性オプシン(MCO)の発現、並びにこれらの合成オプシンによって細胞活性を調節するための方法を提供する。一態様では、多特性オプシンは、可視光及び周辺光活性化に対して高い感受性を有する。いくつかの態様では、細胞内の特定のMCOの発現は、特徴的な光受容体桿体信号と同様の白色光に応答して、長期持続性の内向き電流を生成する。
別の態様では、本開示は、より高い割合のβシート及びより低い割合の不規則構造(すなわち、開裂しにくい)を有する膜上の総タンパク分子(eMCO1)発現を安定化させ、かつeMCO1を発現している細胞中の光誘導性電流を増加させる中で、積極的な役割を果たす安定化バイオマーカーを有する、合成型周辺光活性化可能な高速増強型多特性オプシン(eMCO1)を提供する。
別の態様では、本開示は、標的細胞における遺伝子発現を確認するための安定化バイオマーカーを有する合成型周辺光活性化可能な高速増強型多特性オプシン(eMCO1)を提供する。
本発明の別の態様によれば、増強型多特性オプシン(eMCO1)内に存在する安定化バイオマーカーから放出される光は、安定化バイオマーカー分子から放出/再放出される光によってeMCO1を発現する細胞中の光誘導性電流を増強する。
本発明の別の態様によれば、開示される発明は、視力回復及び他の用途の合成オプシンの使用方法を提供し、合成オプシンのアミノ酸配列は、増強された光感受性、動態及びイオン選択性を提供するように改変される。
本開示は、光感受性を回復させるために、変性した網膜にMCOを送達する方法を提供する。本明細書に提示される結果は、MCOを担持するアデノ関連ウイルスの硝子体内注射後のマウス網膜におけるMCO−レポーターの効率的で安定なin vivo発現を示す。結果はまた、網膜変性のマウスモデルの網膜におけるMCOの発現が、視力の行動回復を可能にすることを実証した。変性した網膜を有するマウスへのMCOの送達後に、放射状アーム水迷路におけるエラーアームの数及びプラットフォームに到達するまでの時間が有意に減少した。特に、視覚的に誘導された行動の改善は、チャネルロドプシン−2オプシンに必要とされるよりもはるかに低い光強度レベルでも観察された。
更に別の態様によれば、本開示は、ヒトの視力を効率的に回復する方法を提供する。この方法は、網膜細胞内で発現されたとき、特徴的な光受容体桿体信号と同様の白色光に対する初期応答後に、より低速な脱分極相を生成するMCOの使用と、眼内にプロモーター−MCO遺伝子を担持するアデノ関連ウイルス(AAV)による、かつ/又はヒトにおける厚い内境界膜を横切る標的網膜層への送達効率を高めるためのプロナーゼE若しくはα−アミノアジピン酸(AAA)と組み合わせた、in vivoでのオプシンの網膜細胞への送達と、を含む。
qPCR分析を使用した生体分布研究は、MCO遺伝子を担持するrAAVを硝子体内に注射されたマウスの異なる組織中のMCO遺伝子の量が無視できることを示した。安全なウイルス媒介性のMCO送達は、患者における多様な網膜変性の効果的な遺伝子治療の可能性を有する。
別の態様では、本開示は、光に対する初期応答後により低速な脱分極相を生成しないオプシンの既存の使用とは対照的に、特徴的な光受容体桿体信号と同様の白色光に対する初期応答後に、より低速な脱分極相を生成するオプシンの使用、ひいては盲目の個人の視力回復を提供する。
本開示は、本明細書に記載のポリペプチドのいずれかをコードする核酸分子を提供する。また、核酸分子は、薬学的に許容される担体を更に含み得る。
本開示は、細胞が、本発明の単離ポリペプチド分子をコードする単離核酸分子と接触しているか、又はこれを含む方法を提供する。好ましくは、細胞は、桿体双極細胞、ON型網膜神経節細胞又はON型双極細胞である。
更に広い態様では、本開示は、オプシンを使用して細胞及び組織の機能を調節するため、及び疾患の診断及び治療に使用するための方法を提供する。
一実施形態では、本発明は、MCO1タンパク質のイオン選択性、光感受性又は動態のうちの少なくとも1つを調節するように変異させた14回膜貫通ドメインを含むMCO1タンパク質を含む、組換え周辺光活性化可能な高速多特性オプシン(MCO1)タンパク質を含む。MCO1タンパク質は配列番号1、3、5、7又は11を有する、請求項1に記載のタンパク質である。一態様では、以下の単一の変異又は変異の組み合わせのうちの1つ以上が、イオン選択性、光感受性又は動態を調節し、この変異は、MCO1配列のアミノ酸132に対応するアミノ酸残基におけるSからCへの置換、MCO1配列のアミノ酸123に対応するアミノ酸残基におけるEからAへの置換、MCO1配列のアミノ酸253に対応するアミノ酸残基におけるDからAへの置換、MCO1配列のアミノ酸120に対応するアミノ酸残基におけるRからAへの置換、MCO1配列のアミノ酸56に対応するアミノ酸残基におけるQからAへの置換、MCO1配列のアミノ酸93に対応するアミノ酸残基におけるKからAへの置換、MCO1配列のアミノ酸90に対応するアミノ酸残基におけるEからAへの置換、MCO1配列のアミノ酸90に対応するアミノ酸残基におけるEからQへの置換、MCO1配列のアミノ酸97に対応するアミノ酸残基におけるEからAへの置換、MCO1配列のアミノ酸101に対応するアミノ酸残基におけるEからAへの置換、MCO1配列のアミノ酸258に対応するアミノ酸残基におけるNからDへの置換、MCO1配列のアミノ酸83に対応するアミノ酸残基におけるEからTへの置換、MCO1配列のアミノ酸123に対応するアミノ酸残基におけるEからTへの置換、又はMCO1配列のアミノ酸63に対応するアミノ酸残基におけるSからDへの置換のうちの少なくとも1つから選択される。
別の実施形態では、本発明は、14回膜貫通ドメインを含み、309〜315の7つのアミノ酸残基(VNKGTGK)が、膜上の遺伝子発現を改善するために請求項1に記載の分子中で欠失しており、S132L変異は、網膜への結合親和性及び光感受性を向上させるため、配列番号1の膜貫通ドメイン2において実施され、オプシンは658個のアミノ酸にコードされ、かつ、MCO2感作細胞は、白色光のパルスに対する初期の急速電流応答後に、ゆっくりと減衰する内向き電流を生成する、組換え周辺光活性化可能な低速多特性オプシン(MCO2)タンパク質を含む。一態様では、単一の変異又は変異の組み合わせは、分子のイオン選択性、光感受性又は動態のうちの少なくとも1つを更に調節する配列番号1のE473A、D603A、R469Aから選択される。別の態様では、膜貫通配列(TPARWVWISLYYAAFYVVMTGLFALCIYVLMQTI)は、MCO1(配列番号1又は2)中のアミノ酸残基315又はMCO2(配列番号3又は4)中のアミノ酸残基308の後に挿入される。
別の実施形態では、本発明は、MCO1配列(配列番号1)及び安定化バイオマーカー配列を含む、組換え周辺光活性化可能な高速増強型多特性オプシン(eMCO1)を含む。一態様では、組換えeMCO1は、
安定化バイオマーカーが、配列番号11の900個のアミノ酸であること、安定化バイオマーカーが、連結配列によって14回膜貫通ドメインの下流に接続されていること、安定化バイオマーカーから放出される光が、膜におけるより高い割合のβシート及びより低い割合の不規則構造を有するeMCO1発現を安定化させ、かつ非改変MCO1より開裂させにくいこと、安定化バイオマーカー分子が、膜を横切るeMCO1のより良好な配向安定化によって、eMCO1を発現する細胞中の光誘導性電流を増強すること、安定化バイオマーカー分子が、安定化バイオマーカー分子から放出/再放出される光によって、eMCO1を発現する細胞中の光誘導性電流を増強すること、プロモーターが、特定の細胞を標的にするために、eMCO1の上流に使用されていること、プロモーター−eMCO1遺伝子がウイルスベクターにパッケージングされていること、細胞が、化学的、ウイルス的又は物理的トランスフェクションを使用して、プロモーター−eMCO1遺伝子でトランスフェクトされ得ること、網膜における安定化バイオマーカー発現を含有するeMCO1の検査(眼底検査による)が、標的組織への遺伝子送達の有効性を決定するための指標であること、安定化バイオマーカーによって放出/再放出される光が、eMCO1発現の存在を判別するために監視され、使用されること、又は発現の喪失が、標的細胞に再び光感受性を与える/標的細胞を機能させるために、プロモーター−eMCO1遺伝子の再送達を必要とすること、のうちの少なくとも1つを更に含む。別の態様では、組換えcMOC1は、レポーター遺伝子が、細胞発現/活性化を検出するためにMCO1遺伝子から下流にあることを更に含み、プロモーター−MCO1−レポーター遺伝子は、ウイルスベクターにパッケージングされ、かつ、細胞は、化学的、ウイルス的又は物理的方法のいずれかを使用してプロモーター−MCO1−レポーター遺伝子によりトランスフェクトされ得る。別の態様では、MCO感作細胞は、光に対して高い感受性を有し、低強度(−0.02mW/mm)の周辺光で活性化され得る。別の態様では、MCO感作網膜ニューロン(例えば、網膜神経節細胞、双極細胞)は、野生型光受容体桿体信号と同様の白色光に対する初期応答後に、より低速な脱分極相を生成する。別の態様では、オプシンは、可視及び近赤外範囲の光の任意の波長に感受性がある。別の態様では、オプシンは、可視及び近赤外範囲内の直接及び間接(例えば、蛍光、燐光、アップ/ダウン転換)照明光を含む単一光子によって活性化される。
別の実施形態では、本発明は、喪失した視力を回復するための方法と、そのためのMCO1、MCO2若しくはeMCO1、又はその突然変異体の使用と、を含む。一態様では、視力喪失は、何らかの変性網膜疾患によるものであり、標的細胞への組換えMCO遺伝子の送達は、送達効率を高めるためのプロナーゼE若しくはα−アミノアジピン酸(AAA)又はその両方と組み合わせた、眼内のプロモーター−MCO遺伝子を担持するウイルスの硝子体内/網膜下注射によって実施されるか、MCO遺伝子の送達は、眼内のプロモーター−MCO遺伝子プラスミドの硝子体内/網膜下注射に続く、化学的若しくは物理的形質導入方法又はこれらの組み合わせのいずれかによって実施されるか、眼内へのMCO遺伝子の送達は、非標的細胞及び器官における望まれない発現、又は治療された眼内における何らかの有害反応若しくは細胞毒性のいずれにも起因しないか、MCO遺伝子の送達後に、視覚的に誘導された有意な行動改善が観察されるか、又は、MCO遺伝子の再注射及びトランスフェクションは、MCO遺伝子発現不足の場合に実施される。
別の実施形態では、本発明は、視力喪失を防止又は遅延させるための方法とそのためのMCO1、MCO2、又はeMCO1の使用と、を含み、MCO遺伝子の送達は、進行性の光受容体喪失の間に網膜細胞に対して実施され、MCO感作網膜細胞の光刺激は、光受容体の喪失を防止又は遅延させるために実施され、かつ、光刺激用量は、最大効果のために最適化される。
別の実施形態では、本発明は、損傷したRGC軸索を再生することによる視力回復のための方法とそのためのMCO1、MCO2又はeMCO1の使用と、を含み、MCO遺伝子の送達は、軸索変性の間又はその後に網膜神経節細胞に対して実施され、MCO感作RGCの光刺激は、変性速度を遅延させ、かつ/又は軸索を再生するために実施され、光刺激用量は、変性を最小限に抑える、かつ/又は軸索再生を最大化するために最適化される。
別の実施形態では、本発明は、ニューロン、心臓細胞を含む異なるタイプの興奮性細胞の刺激のための方法とそのためのMCO1、MCO2又はeMCO1の使用と、を含み、この使用は、化学的、ウイルス的又は物理的形質導入方法のいずれかによるMCO遺伝子の送達を含み、MCOの活性化は、光の照明によって達成され、その効果は、電気/光生理学的に測定される。
別の実施形態では、本発明は、疾患の治療の方法とそのためのMCO1、MCO2又はeMCO1の使用と、を含み、この使用は、化学的、ウイルス的又は物理的形質導入方法のいずれかによる異なる器官へのMCO遺伝子の送達を含み、MCOの活性化は、光の照明によって達成され、その効果は、電気生理学的又は他の機能的及び行動的分析によって測定される。
別の実施形態では、本発明は、配列番号1、3、5、7又は11に対して少なくとも75%、85%、95%又は100%の同一性を含む配列を含むポリペプチドを含み、当該ポリペプチドは、配列番号1、3、5、7又は11のうちの少なくとも1つのタンパク質の光感受性特性を呈する。別の実施形態では、本発明は、配列番号1、3、5、7又は11に対して少なくとも75%、85%、95%又は100%の同一性を有するポリペプチドをコードしている組換え核酸を含み、当該ポリペプチドは、配列番号1、3、5、7又は11のうちの少なくとも1つのタンパク質の光感受性特性を呈する。一態様では、核酸は、配列番号2、4、6又は8に対して75%、85%、95%又は100%の同一性のうちの少なくとも1つを有する。別の実施形態では、本発明は、配列番号1、3、5、7又は11のうちの少なくとも1つに対して75%、85%、95%又は100%の同一性を有する核酸を含むベクターを含む。一態様では、ベクターは、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス又はレンチウイルスベクターから選択される。
別の実施形態では、本発明は、失明の治療を必要とする患者に、配列番号1、3、5、7又は11のうちの少なくとも1つに対して75%、85%、95%又は100%の同一性を有する核酸を含むベクターを投与することを含む、失明の治療する方法を含む。
上及びその他の箇所に記載される実施形態と関連する詳細を以下に記載する。
以下の図面は、一例を示し、限定するものではない。簡潔さ及び明瞭さのために、所与の構造の全ての特徴が、その構造が現れる全ての図面に常に示されているわけではない。
表1〜表4は、多特性オプシン(MCO)のアミノ酸配列、MCO1、MCO2、MCO1T、MCO2Tを示す。MCO2は、308後のMCO1の変異(S 132 L)及び7つのアミノ酸残基(VNKGTGK(配列番号13))の欠失を含有する。MCO1T及びMCO2Tは、それぞれ315及び308のアミノ酸残基の後に、追加の膜貫通配列(TPARWVWISLYYAAFYVVMTGLFALCIYVLMQTI(配列番号14))を含有する。
表05は、一例として特定の細胞を標的化するためのMCO配列の上流で使用されるプロモーター(mGluR6)のDNA配列を示し、表06は、一例として特定の細胞における発現を確認するためにMCO配列の下流で使用されるレポーター(mCherry)のDNA配列を示す。
表06は、一例として特定の細胞における発現を確認するためにMCO配列の下流で使用されるレポーター安定化(mCherry)のDNA配列を示す。
表07は、増強型多特性オプシン−1(eMCO1)のアミノ酸及びDNA配列を示す。これは、連結配列を有するMCO1配列(表01)及びバイオマーカー安定剤配列(表06)を含有する。
表08は、RaptorXによる理論モデリングを用いた二次構造及び折り畳みに基づくMCO1及びeMCO1の安定性の比較を示す。
レポータータンパク質を有する多特性オプシン(MCO)のドメイン構成を示す。 制限部位(BamH I及びSal I)でクローン化されたMCO遺伝子の挿入を示す典型的な円形マップを示す。 多特性オプシンのアミノ酸鎖の三次元配置の理論モデリングを示す。多特性オプシン、MCO1のアミノ酸鎖の三次元配置の理論モデリングを示す。 多特性オプシンのアミノ酸鎖の三次元配置の理論モデリングを示す。多特性オプシン、MCO2のアミノ酸鎖の三次元配置の理論モデリングを示す。 多特性オプシン、eMCO1のアミノ酸鎖の三次元配置の理論モデリングを示す。 モデルHEK293細胞におけるMCO1の発現を示す。MCO1の発現は、形質膜内に局在化されている。mGluR6−MCO1−mCherryでトランスフェクトされたHEK293細胞の共焦点蛍光画像である。 モデルHEK293細胞におけるMCO1の発現を示す。代表的な細胞を横切る線に沿ったMCO1レポーター蛍光の強度である。 多特性オプシン(MCO1)の機能を示す。光(平均強度:0.024mW/mm)に応答したMCO1発現細胞における内向き電流プロファイルを示す。 多特性オプシン(MCO1)の機能を示す。MCO1の活性化スペクトルである。平均±SEM。 細胞活性によって測定されたMCO1機能に対するmCherryの存在の効果を示す。Port−a−Patch(ポートアパッチ)自動パッチクランプ電気生理学によって測定されたHEK細胞中の内向き電流プロファイル。mGluR6−MCO1−mCherryでトランスフェクトされた細胞において、白色光の強度0.02mW/mmで測定された光電流を示す。 細胞活性によって測定されたMCO1機能に対するmCherryの存在の効果を示す。Port−a−Patch(ポートアパッチ)自動パッチクランプ電気生理学によって測定されたHEK細胞中の内向き電流プロファイル。mGluR6−MCO1でトランスフェクトされた細胞において、白色光強度0.02mW/mmで測定された光電流を示す。 多特性オプシン(MCO2)の機能を示す。HEK293細胞へのMCO2−mCherryのリポフェクション上の蛍光を示す。 多特性オプシン(MCO2)の機能を示す。パッチクランプ電気生理学によって測定された、光(平均強度:0.024mW/mm)に応答したMCO2発現細胞における内向き電流を示す。 細胞のvMCO1トランフェクションを示す。HEK293細胞におけるvMCO1−mCherry発現の三次元再構成、スケールバー:30μmを示す。 細胞のvMCO1トランフェクションを示す。網膜カップ全体におけるvMCO1−mCherry発現の三次元再構成、スケールバー:0.8mmを示す。 MCO1でトランスフェクトされた網膜のパッチクランプ記録を示す。マウス網膜外植片の細胞におけるMCO−1発現を示す。 MCO1でトランスフェクトされた網膜のパッチクランプ記録を示す。光パルス(100ms)列によって誘導された内向き光電流を示す。 vMCO1注射後のrd10マウスにおけるMCO1の用量及び時間依存の層特異的発現を示す。硝子体内vMCO注射の1週間後のrd10マウス網膜カップの蛍光共焦点画像を示す。 vMCO1注射後のrd10マウスにおけるMCO1の用量及び時間依存の層特異的発現を示す。vMCO1の硝子体内注射の8週間後の、rd10マウス網膜カップの蛍光共焦点画像を示す。スケールバー:200μm。 vMCO1注射後のrd10マウスにおけるMCO1の用量及び時間依存の層特異的発現を示す。1.6×1011VG/mLの用量で、vMCO1でトランスフェクトされた網膜カップの折り畳み縁部の焦点蛍光画像を示す。スケールバー:100μm。 vMCO1注射後のrd10マウスにおけるMCO1の用量及び時間依存の層特異的発現を示す。1.6×1012VG/mLの用量での硝子体内注射の16週間後の網膜におけるvMCO1発現の断面図を示す。スケールバー:50μm。 vMCO1注射後のrd10マウスにおけるMCO1の用量及び時間依存の層特異的発現を示す。vMCO1の2つの異なる用量でのrd10マウス網膜におけるMCO1発現の動態を示す。平均±SD。 vMCO1注射後のrd10マウスにおけるMCO1の用量及び時間依存の層特異的発現を示す。1.6×1012VG/mLの用量でのトランスフェクションの16週間後のrd10マウスの網膜におけるMCO1−mCherry発現(バックグラウンド除去法後)の動物間変動を示す。平均+SD。p<0.01 vMCO1注射済み対非注射。 放射状水迷路におけるrd10マウスの行動における視覚的に誘導された改善を示す。硝子体内vMCO1注射前の、白色LED光を備えた放射状水迷路における、視覚的に誘導されたrd10マウスの行動の時間経過画像を示す。 放射状水迷路におけるrd10マウスの行動における視覚的に誘導された改善を示す。vMCO1注射の6週間後の、LED光が点灯した状態でのrd10マウスの行動を示す。 放射状水迷路におけるrd10マウスの行動における視覚的に誘導された改善を示す。光あり及び光なしの状態で迷路の中心にて落下した、vMCO1で処置されたrd10マウスがプラットフォームを見つけるまでの時間を示す。平均±SEM。マウスごとにN=5。 放射状水迷路におけるrd10マウスの行動における視覚的に誘導された改善を示す。光あり及び光なしの状態で迷路のサイドアーム2及び4にて落下した、vMCO1で処置されたrd10マウスがプラットフォームを見つけるまでの時間を示す。平均±SEM。マウスごとにN=5。 放射状水迷路におけるrd10マウスの行動における視覚的に誘導された改善を示す。光あり及び光なしの状態で迷路の縁部アーム3にて落下した、vMCO1で処置されたrd10マウスがプラットフォームを見つけるまでの時間を示す。平均±SEM。マウスごとにN=5。 放射状水迷路におけるrd10マウスの行動における視覚的に誘導された改善を示す。光の存在下及び非存在下でプラットフォームを見つける前に中心にて落下した、vMCO1で処置されたrd10マウスが通過したエラーアームの数を示す。平均±SEM。マウスごとにN=5。 放射状水迷路におけるrd10マウスの行動における視覚的に誘導された改善を示す。光の存在下及び非存在下でプラットフォームを見つける前にサイドアームにて落下した、vMCO1で処置されたrd10マウスが通過したエラーアームの数を示す。平均±SEM。マウスごとにN=5。 放射状水迷路におけるrd10マウスの行動における視覚的に誘導された改善を示す。光の存在下及び非存在下でプラットフォームを見つける前に縁部で落下した、vMCO1で処置されたrd10マウスが通過したエラーアームの数を示す。平均±SEM。マウスごとにN=5。 放射状水迷路におけるrd10マウスの行動における視覚的に誘導された改善の追跡研究を示す。vMCO1を注射されたrd10マウスの視覚的に誘導された行動の改善を試験するために使用される放射状アーム水迷路の概略図を示す。 放射状水迷路におけるrd10マウスの行動における視覚的に誘導された改善の追跡研究を示す。vMCO1注射前に迷路の中心(光強度:0.007mW/mm)から、注射後期間に応じて、rd10マウスがプラットフォームに到達するまでの時間を示す。N=5;平均±S.D。P<0.05。 vMCO1注射前に迷路の近傍アーム(光強度:0.014mW/mm)から、注射後期間に応じて、rd10マウスがプラットフォームに到達するまでの時間を示す。N=5;平均±S.D。P<0.05。 vMCO1注射前にサイドアーム(光強度:0.004mW/mm)から、注射後期間に応じて、rd10マウスがプラットフォームに到達するまでの時間を示す。N=5;平均±S.D。P<0.05。 放射状水迷路におけるrd10マウスの行動の改善の光強度依存性を示す。2つの異なる光強度間での、注射後の期間に応じた、迷路の中心からプラットフォームに到達するまでの時間の比較である。平均±S.D。P<0.01。L0=0.0005mW/mm;L2=0.007mW/mm。明るい周囲レベルは、約0.01mW/mmである。 rd10及びMCO感作rd10マウスの視動性評価を示す。1rpmでの垂直ストライプの回転速度におけるvMCO1注射の前及び8週間後の、rd10マウスの頭部運動数の定量比較を示す。N=4マウス。平均+SD。p<0.05。チャンバの中心における光強度は、0.001mW/mmである。 rd10及びMCO感作rd10マウスの視動性評価を示す。2rpmでの垂直ストライプの回転速度におけるvMCO1注射の前及び8週間後の、rd10マウスの頭部運動数の定量比較を示す。N=4マウス。平均+SD。p<0.05。チャンバの中心における光強度は、0.001mW/mmである。 慢性光曝露後のMCO1感作網膜細胞の生存性を示す。野生型(非盲検)マウスと同様に、vMCO1で処置されたrd10マウスは、光から離れ、遮断することにより(矢印に示されるように、床敷材料を積み上げて)明るい光を回避することを示す。 慢性光曝露後のMCO1感作網膜細胞の生存性を示す。1日8時間の白色光(強度:0.1mW/mm)の照明の4週間後の、vMCO1で処置されたrd10マウスのカスパーゼ−3(緑色)で染色された網膜の蛍光画像を示す。 慢性光曝露後のMCO1感作網膜細胞の生存性を示す。1日8時間の白色光(強度:0.1mW/mm)の照明の4週間後の、野生型マウスのカスパーゼ−3(緑色)で染色された網膜の蛍光画像を示す。 慢性光曝露後のMCO1感作網膜細胞の生存性を示す。野生型マウスとvMCO1で処置されたrd10マウスとの間のアポトーシス網膜細胞の%の定量比較を示す。vMCO1で処置されたrd10マウスの内核層内のアポトーシス細胞は0%である。 rd10マウスにおけるvMCO1注射後の網膜の構造的一体性の評価の結果を示す。vMCO1注射後のrd10マウス網膜のOCT画像を示す。 rd10マウスにおけるvMCO1注射後の網膜の構造的一体性の評価の結果を示す。注射の前及び1週間後の、4匹の異なるrd10マウスの網膜厚の比較を示す。N=10 B−スキャン/マウス。平均+SD。 vMCO1を注射されたrd10マウスにおける免疫毒性の結果を示す。vMCO1注射前、7日後及び14日後の群1(1.6×1010VG/mL)と群2(1.6×1011VG/mL)との間の血漿中のIL−6(プロ炎症マーカー)の定量比較を示す。N=5マウス/群。平均±SD。 vMCO1を注射されたrd10マウスにおける免疫毒性の結果を示す。vMCO1注射の前、7日後及び14日後の群1(1.6×1010VG/mL)と群2(1.6×1011VG/mL)との間の血漿中のIL−10(抗炎症マーカー)の定量比較を示す。N=5マウス/群。平均±SD。 vMCO1を注射されたrd10マウスにおける免疫毒性の結果を示す。vMCO1注射の前、7日後及び14日後の群1(1.6×1010VG/mL)と群2(1.6×1011VG/mL)との間の血漿中のIFN−Y(プロ炎症マーカー)の定量比較を示す。N=5マウス/群。平均±SD。 AAV2にパッケージングされた多特性オプシン(vMCO1)の生体分布を示す。異なる用量及び注射後の期間でのrd10マウスにおけるベクター配列のQPCR検出による、処置された眼の外側の組織におけるベクターDNAは、ごく少量又は検出不可能な量である。N=5マウス/用量/時間点。 vMCO1を注射されたrd10マウスの眼の免疫組織化学を示す。MCO−mCherry(赤色)が、選択的に標的化され、vMCO1の硝子体内注射の8週間後に、rd10マウスのINLで発現されることを示す。アレスチン(緑色)の不在は、光受容体の完全な消失を示唆する。 vMCO1を注射されたrd10マウスの眼の免疫組織化学を示す。vMO1の硝子体内注射の8週間後の、rd10マウスにおけるmCherry(赤色、内因性)を発現する桿体双極細胞中のPKCa染色(緑色)を示す。 vMCO1を注射されたrd10マウスの眼の免疫組織化学を示す。vMC01の硝子体内注射の8週間後の、rd10マウスにおけるmCherry(赤色)を発現するON型双極細胞中のmGluR6染色(緑色)を示す。 vMCO1を注射されたrd10マウスの眼の免疫組織化学を示す。vMCO1のrd10マウスへの硝子体内送達の8週間後の、rd10網膜におけるmCherry(緑色の免疫染色)発現を示す。 vMCO1を注射されたrd10マウスの眼の免疫組織化学を示す。光受容体が変性した網膜で報告されるように、vMCO1の硝子体内注射の18週間後のrd10マウスにおけるGFAP(緑色)を示す。 vMCO1を注射されたrd10マウスの眼の免疫組織化学を示す。CD45(緑色)の発現がないことを示し、vMCO1の硝子体内注射の8週間後のrd10マウスに免疫細胞がないことを示唆している。
電気的及び他の手段による細胞活性の調節は、疾患の進行に関連付けられた細胞特性及び変化の定量的評価を可能にしてきた。光と組み合わせたオプシン(光感受性イオンチャンネルタンパク質)は、細胞活性の調節に使用されてきた。これは、細胞又はネットワーク機能のより良好な理解をもたらし、視力回復、並びに薬物スクリーニングを含む治療用途の可能性を有する。
より高次のニューロンは、変性した網膜の中で無傷であるため、いくつかの刺激方法は、より高次のニューロン(例えば、双極細胞及び網膜神経節細胞)を標的としており、これらは、視覚野に視覚情報を運ぶ。直接的な電気刺激手法は、網膜細胞に電極を機械的に接触させる必要があるが、間接的な刺激手法(例えば、光遺伝学的な刺激)は、このような物理的な接触の必要がない。したがって、間接的な方法は、非侵襲性であるという明確な利点を与える。これに加えて、光遺伝学的刺激を用いつつ、細胞特異性及び高い(単一細胞)解像度を達成することができる。
網膜ニューロンの光遺伝学的刺激を得るために、細胞は概して、オプシン(光感受性分子イオンチャンネル)を発現するようにウイルスによってトランスフェクトされ、活性化されると、オプシンの特徴である特定の可視波長の光に照射されたときに、オプシン発現細胞を脱分極する。例えば、チャネルロドプシン−2(ChR2)を発現する網膜細胞は、青色光に感受性がある。
細胞の光感受性を高めるため、又は異なる波長の可視光によって活性化されるように、種々の光によって活性化されるイオンチャンネル(オプシン)が開発されてきた。広帯域可視光によって活性化するために、3つのオプシン(青色のChR2、緑色のC1V1、赤色のReaChrの光感受性)の複合体は、化学的又は物理的方法によって細胞に送達されてきた。しかしながら、このような大型の複合体は、安全なウイルスベクター(すなわち、アデノ関連ウイルス)にパッケージングすることができない。更に、化学的又は物理的な送達方法の使用は、効率性が低く、かつ/又は細胞生存性を損なうため、それらの迅速な有用性は制限される。
これまで視力回復のために開発され利用されたオプシンは、光によって刺激されたときに、特徴的な光受容体桿体信号を生成しない。すなわち、電圧信号は、初期の高速応答後のより低速な脱分極相を有しない。したがって、低光レベルでの有効な光遺伝学的視覚回復は、本発明までは示されてこなかった。
これまで視力回復のために採用されたオプシンは、オプシン感作細胞を刺激するために周辺光レベルを上回る光強度を必要とするため、オプシン感作網膜ニューロンをin vivoで刺激するために、外部の活性刺激装置が設計されてきた(2)。
ヒトにおいては、ウイルス手段(例えば、組換えアデノ関連ウイルス、rAAV)を介した眼の硝子体へのオプシン又は他の遺伝子の送達による、光遺伝学的治療又は他の遺伝子治療方法による視力回復が提案されてきた。しかしながら、ヒトに存在する厚い内境界膜(ILM)のため(3)、rAAV単独による治療用遺伝子の正常な送達は疑わしい。
本アプローチの利点は、特徴的な光受容体桿体信号を生成し、外部の活性刺激装置を必要とせず、結果として既存のオプシンに基づくアプローチによって遭遇する又は今後遭遇する多くの障害を回避し、結果として本発明は、網膜変性疾患による視力喪失の回復に適用可能である、という事実を含む。本発明の更なる利点は、オプシン/他の治療遺伝子を送達する方法が、ヒトの眼の内境界膜を一時的に透過させることができるrAAVと化学薬剤との組み合わせを含む点である。
現在、活性化/阻害と組み合わせた網膜細胞の光遺伝学的感作の使用によって、網膜インプラントの代わりとなる可能性が認められ、高解像度(4)のためにそれぞれ単一のニューロンの付近に電極を配置する必要性が排除されている。光遺伝的刺激は、光活性化可能な分子チャンネル(例えば、チャネルロドプシン−2、ChR2;ハロロドプシン、NpHR)を遺伝子標的化により細胞に導入することによって、高い時間精度(5〜10)を提供する。高い時間的及び空間的な解像度に加え、光遺伝学は、細胞特異性(例えば、使われていない錐体、神経節又は双極細胞)などの電気刺激及び最小限の侵襲性といういくつかの利点を有する(11)。非選択的なカチオンチャンネルであるChR2の光誘発活性化は、ChR2を発現するこれらの細胞のみを脱分極させる。ms−パルス状の青色光によるニューロンの選択的な活性化は、培養物(9)、脳切片並びに小動物(12〜15)で示されている。この光遺伝学的活性化方法は、発光ダイオード(LED)又はレーザー(5、6)から送達することが可能な中強度の光(約0.1mW/mm)のみを必要とするため、細胞活性をin vitro及びin vivoで制御するために非常に有望である。
本開示は、(i)複数の可視波長で高い光感受性を有し、(ii)安全なアデノ関連ウイルスにパッケージングされるほど小さいプラスミドサイズを有する、合成手段によって作製されるいくつかの光感受性イオンチャンネル分子(多特性オプシン)を提供する。本発明はまた、本発明の光感受性イオンチャンネルをコードする単離核酸配列、及びかかる核酸配列を含む構築物を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法を使用して見い出すMCOは、表1〜4、7に示される、かつ配列番号1、3、5、7又は11で表される、アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、MCOは、配列番号1、3、5、7又は11に示される配列に対して少なくとも約70、又は75、又は80、又は85、又は90、又は95、又は96、又は97、又は98、又は99%の同一性を有し、当該MCOは、配列番号1、3、5、7又は11の光感受性特性を有する。いくつかの実施形態では、MCOは、表1〜4、7に示される、かつ配列番号2、4、6、8又は12で表される、核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、MCOをコードする核酸は、配列番号2、4、6、8又は12に示される配列に対して少なくとも約70、又は75、又は80、又は85、又は90、又は95、又は96、又は97、又は98、又は99%の同一性を有し、当該コードされるMCOは、配列番号1、3、5、7又は11の光感受性特性を有する。
MCOをコードする核酸は、それを必要とする患者に送達するためのベクターに組み込まれたときの使用を見い出す。いくつかの実施形態では、ベクターは、当該技術分野において既知であるような、適切なプロモーターを有するプラスミドである。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。本明細書に開示される方法での使用を見出すウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクターなどが挙げられる。
本発明は、いくつかの態様では、in vitro又はin vivoでの細胞内の多特性オプシン(MCO)の発現、並びにこれらの合成オプシンによって細胞活性を調節するための方法を含む。
MCOが疾患の治療に使用される実施例のうちの1つは、網膜の変性疾患に起因する失明である。網膜色素変性(RP)及び加齢黄斑変性(AMD)は、眼内の光受容体の変性を特徴とする疾患を指し、非機能性のニューロン活性及び視覚野へのシグナルの伝播によって視力が損なわれる(16〜20)。AMDは、65歳より上の約1500万人において新しい視力喪失の主原因であり(21)、RPの有病率は、世界中で少なくとも100万人である(22、23)。RPは、常染色体潜性遺伝として最も多くは遺伝しており、症例の大多数が、この遺伝の形態を有する(18、22、24)。更に、視力喪失の程度は、加齢と共に上がっていき(25)、これは、高齢の集団への人口統計学上の変化の主な関心事である。
ほとんどの現行の臨床的治療は、主に、疾患の進行を遅らせることに集中しており(26)、変性を止めることができる治療がなく(27)、変性に起因する視力喪失を回復させることができる網膜プロテーゼ以外の治療がない(28)。部分的な視力回復は、網膜インプラントの侵襲的外科処置を伴う(29)。2つの異なるタイプの網膜インプラント、網膜下インプラント及び網膜上インプラントが開発されている(30)。網膜下インプラントは、光受容体細胞が存在する網膜の領域内で、色素上皮と双極細胞との間に位置付けられる(31)。これらの網膜プロテーゼは、盲目被験体における視覚の生成に成功している(32〜34)。このような網膜下インプラントを使用する不利益としては、(i)埋め込まれた電極が慢性的に損傷することと、(ii)周辺光からのマイクロフォトダイオードによって生成された電流が、隣接するニューロンを刺激するのに不十分であることと、が挙げられる(35、36)。網膜上インプラントは、網膜神経節細胞(RGC)の領域内に配置され、装置は、眼の外側又は眼内レンズ内に配置されたカメラから得た入力に応答して、RGCを刺激することによって機能する(36、37)。網膜上インプラントの欠点としては、(i)外科的埋め込みによる細胞増殖と、(ii)RGCの軸索及び細胞体の両方の電気刺激から生じる不規則な刺激パターンと、が挙げられる(36)。
本質的に侵襲性である以外に、盲目患者における視力回復のためのこれらの方法は、非特異的な細胞活性化に基づくものであり、低数の電極による低空間分解能を有し(より多くの数又はより高い密度の電極は、より多くの電力を必要とし、熱による神経組織の損傷をもたらす)、したがって、低空間分解能で視力を改善することができる。
光遺伝学的方法は、網膜の非特異的な刺激(38)、又はRGCのためのThy1を含むプロモーター特異的な様式で(39〜43)、ON型双極細胞を標的とするmGluR6(44、45)のいずれかによる、盲目マウスモデルにおける視力回復のために採用されてきた。メラノプシン(46)又は光化学遺伝学(47)の使用によってRGCを刺激するための企てもなされてきた。更に、長時間続く錐体光受容体(48)中で発現する、塩素チャンネルであるオプシン(ハロロドプシン)の活性な光刺激の使用は、視力回復のための治療介入の新しい可能性を示している(49)。再感作された光受容体は、網膜回路の機能が働き、皮質回路を活性化させ、視覚によって導かれる行動を媒介することが示されている。
網膜細胞の光遺伝学的刺激による視力回復のための早期のアプローチは、例えば、ChR2(38)及びその他の、周辺光条件より高い光強度を必要とするオプシンを使用する。したがって、視力回復のための周囲環境におけるこのようなオプシン分子の臨床的成功はまだ達成されていない。更に、外部光源又は装置(例えば、LEDアレイ(50))を使用したそのようなオプシンの活性化は、長期使用時に網膜細胞を実質的に損傷させ得る。加えて、これらのオプシン(視力回復のために使用される)は、光パルスに対する高速(ミリ秒)のON及びOFF応答を有する。すなわち、オプシン感作細胞を光で刺激したときに、特徴的な光受容体桿体信号は生成されない。すなわち、電圧信号は、光パルスに対する初期の高速応答後のより低速な脱分極相を有しない。したがって、周辺光レベルでの有効な光遺伝学的視覚回復は、本発明までは示されてこなかった。
開示される発明は、極めて光感受性の高いイオンチャンネルの調製方法及び視力回復を含む異なる使用を含む。いくつかの態様では、細胞内の特定のMCOの発現は、特徴的な光受容体桿体信号と同様の白色光に応答して、長期持続性の内向き電流を生成する。本発明の別の態様によれば、開示される発明は、視力回復及び他の用途のための合成オプシンの使用方法を提供し、合成オプシンのアミノ酸配列は、増強された光感受性、動態及びイオン選択性を提供するように改変される。
本発明で示される結果は、MCOを担持するアデノ関連ウイルスの硝子体内注射後のマウス網膜におけるMCO受容体タンパク質の効率的で安定なin vivo発現を示す。結果はまた、網膜変性のマウスモデルの網膜におけるMCOの発現が、視力の行動回復を可能にすることを実証した。変性した網膜を有するマウスへのMCOの送達後に、放射状アーム水迷路におけるエラーアームの数及びプラットフォームに到達するまでの時間が有意に減少した。特に、視覚的に誘導された行動の改善は、チャネルロドプシン−2オプシン(1)に必要とされるよりもはるかに低い光強度レベルでも観察された。
本発明の更に別の態様によれば、ヒトにおいて効率的に視力を回復する方法が提供される。この方法は、網膜細胞内で発現されたとき、特徴的な光受容体桿体信号と同様の白色光に対する初期応答後に、より低速な脱分極相を生成するMCOの使用と、眼内にプロモーター−MCO遺伝子を担持するアデノ関連ウイルス(AAV)による、かつ/又はヒトにおける厚い内境界膜を横切る標的網膜層への送達効率を高めるためのプロナーゼE若しくはα−アミノアジピン酸(AAA)と組み合わせた、in−vivoでのオプシンの網膜細胞への送達と、を含む。
ここで、本開示は、添付の図面を参照しつつ、以下に更に完全に記載し、本発明のいくつかの例示的な実施形態が示される。しかし、本発明は、多くの異なる形態で具現化されてもよく、本明細書に記載する実施形態に限定されるものと解釈すべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が十分に完全であり、当業者に本発明の範囲を完全に伝えるように与えられる。
実施例1−図1Aは、レポータータンパク質を有する多特性オプシン(MCO)のドメイン構成を示す。これらのMCOは、図1Bに示されている、制限部位でクローン化されたMCO遺伝子の挿入を伴う典型的な円形マップを使用して合成した。MCO遺伝子を、DNA合成装置を使用して合成し、配列を確認した。ゲル電気泳動を、0.8%のアガロースを使用して、増幅したMCO1遺伝子(制限断片を有する制限酵素BamH I及びSal Iによって分類された)に対して実施した。ウエスタンブロットを行って、MCOが網膜細胞で発現されていることを確認した。マウスの網膜を、リポフェクタミンを使用してトランスフェクトし、発現したタンパク質をウエスタンブロット用に抽出した。ウエスタンブロットは、1ステップNBT/BCIP基質を有する一次(抗mCherryポリクローナル)抗体及び二次(ヤギ抗ウサギIgG)抗体を使用して開発した。
実施例2−図2は、ウェブベースのプロトコル(RaptorX)を使用した多特性オプシンのアミノ酸鎖の三次元配置の理論モデリングを示す。RaptorXは、条件付き神経場(CNF)、条件付き確率場の変異体、及びMCOの以下の予測される構造を開発するための複数のテンプレート処理手順を使用する。図2Aは、多特性オプシンMCO1のアミノ酸鎖の三次元配置の理論モデリングを示す。図2Bは、多特性オプシン、MCO2のアミノ酸鎖の三次元配置の理論モデリングを示す。図2Cは、多特性オプシン、eMCO1のアミノ酸鎖の三次元配置の理論モデリングを示す。遺伝子の発現とMCO1及びeMCO1の機能とを調査した。eMCO1は、膜内でより良好に折り畳み/発現し、したがって、MCO1と比較して効果的に機能することが見出された。eMCO1設計では、MCO1とmCherryとの間に特別な要素が配置され、結果としてMCO1遺伝子とmCherryとの間の相互作用が増し、mCherryに、膜内の治療用分子全体(eMCO1)の安定化において積極的な役割を果たさせることになった。表08は、MCO1と比較して、eMCO1において、より高い割合のβシート及びより低い割合の不規則構造(すなわち、開裂しにくい)を示す。更に、eMCO1中のmCherryの存在は、標的組織への遺伝子送達の有効性を決定するための指標として、かつ、異なる時点におけるオプシンの存在を判定するのに役立つ。したがって、オプシン発現喪失の場合、標的細胞の再光感作のためにオプシン遺伝子の再注射を実施することができる。例えば、初期の改善(vMCO−1の注射による)後、視力が経時的に低下する又は失われる場合、網膜におけるmCherry発現の検査(眼底検査による)は、vMCO−1発現が失われた(再注射を必要とする)かどうかを判定するバイオマーカーとして役立つ。mCherry発現が損なわれていない(しかし、視力の改善が失われる/低下する)場合、標的化された網膜細胞が、視覚情報を視覚的皮質に伝える網膜神経節細胞との接続を失っていることを示唆する。
実施例3−MCOの膜輸送を評価するために、トランスフェクトされたHEK293細胞の細胞膜(対細胞質)におけるMCOの発現を、レポータータンパク質(mCherry)の蛍光強度を用いて定量化した。HEK293細胞を、リポフェクタミン3000(Life Technologies)を使用してMCO構築物でトランスフェクトした。トランスフェクション後、HEK293細胞を、ペトリ皿で10%のウシ胎児血清、0.2mg/mLのゲンタマイシンを含むDMEM/F−12中に維持した。培養物を5%のC0加湿大気中に37℃で維持した。細胞をトランスフェクション後に48時間インキュベートして、MCO発現を可能にした。レポーター(mChery)蛍光の可視化を落射蛍光顕微鏡下で実施した。MCO1及びMCO2を発現しているHEK293細胞の蛍光画像を、それぞれ図3A及び図6Aに示す。更に、細胞膜及び細胞内成分におけるMCO1の相対的発現を定量化するために、強度プロファイルがプロットされている。図3Bは、mGluR6−MCO1−mCherryでトランスフェクトされた代表的なHEK293細胞を横切る線に沿った、MCO1レポーター蛍光の強度を示す。原形質膜へのMCOの有効な交通を暗に意味する有意な細胞内(細胞質)凝集は、観察されなかった。
実施例4−光依存性の内向き光電流を決定するために、MCO−発現細胞を、0.024mW/mmの強度を有する光のパルスに曝露した。超連続レーザー光源(NKT Photonics)に結合された単一モード光ファイバは、光遺伝学的刺激のため、広帯域光を試料に送達した。電力計(818−SL、Newport)を使用して、試料平面における光強度を定量化した。光パルス幅を、Axon Instruments Digidataシステム(Molecular Devices)によって制御された電気生理学的記録システムと同期させた。MCOでトランスフェクトされた細胞を、オールトランスレチナール(ATR、1μM)を用いて4時間インキュベートした後、パッチクランプ実験を行った。
パッチクランプ記録セットアップは、増幅器システム(Axon Multiclamp 700B、Molecular Devices)を使用した倒立型Nikon蛍光顕微鏡(TS 100)プラットフォームを含む。130K−グルコン酸、7KC1、2NaCl、1Mg Cl、0.4 EGTA、10 HEPES、2 ATP−Mg、0.3GTP−トリス及び20スクロース(mM単位)を含有する溶液で満たしたときに、3〜5MΩの抵抗性を達成するため、2段階ピペットプラー(Narshinghe)を使用してマイクロピペットを引っ張った。マイクロピペット電極をマイクロマニピュレータ上に取り付けた。150NaCl、10グルコース、5KC1、2CaCl、1MgClを(mM単位で)含有する細胞外溶液を、10mM HEPES(pH7.3)で緩衝した。−70mVで電圧クランプ内に細胞を保持しながら、光電流を測定した。増幅器からの電気生理学的信号を、パッチクランプソフトウェア(Clampex、Molecular Devices)とインターフェース接続したDigidata 1440(Molecular Devices)を使用してデジタル化した。MCO発現細胞の活性化のため、光刺激ビームを光ファイバによって送達した。pClamp 10ソフトウェアをデータ分析に使用した。図4Aは、パッチクランプ電気生理学によって測定された、光(平均強度:0.024mW/mm)に応答したMCO1発現細胞における代表的な内向き電流を示す。内向き光電流は、ChR2発現細胞中よりもMCO1感作細胞中がはるかに高いことが見い出された。周辺光レベル(0.02mW/mm)でのMCO1感作細胞中の内向き光電流(195±32pA)は、ChR2及び白色オプシンで感作された細胞中とは異なり、活動電位(AP)の閾値を上回る(51)。オプシン感作細胞の光誘発性スパイクの良好な忠実度には、より速い応答時間が必要であることに留意されたい。周辺光活性化可能なMCO1(図2D)のオン応答時間は、2.94±0.70msと測定され、これは、他の高速オプシンについて測定されたものと同様である(52)。しかしながら、オン応答時間は、活性化光の強度に依存し、光強度が低下するにつれて増大することが知られている(53)。
MCO1の活性化スペクトルを得るために、内向き光電流を、異なる波長(帯域幅:30mm)の刺激光を使用して測定した。図4Bでは、MCO1の正規化された活性化スペクトルを示す。安定化バイオマーカーとして作用することに加えて、mCherryは、(i)膜を横切るMCO1のより良好な配向安定化により、及び(ii)安定化バイオマーカー分子から放出/再放出される光がMCO1の活性化を増強することにより、MCO1を発現する細胞中の光誘導性電流を増強する。図5は、Nanion Port−a−Patch自動パッチクランプ電気生理学によって測定されたHEK細胞における内向き電流プロファイルを示す。図5Aは、mGluR6−MCO1−mCherryでトランスフェクトされた細胞において、白色光強度0.02mW/mmで測定された光電流を示す。図5Bは、mGluR6−MCO1でトランスフェクトされた細胞において、白色光強度0.02mW/mmで測定された光電流を示す。増強型MCO1機能に対するmCherryの存在の効果は、ここで明確に実証されている。MCO1は、白色の周辺光に一致する広い活性化スペクトルを有することが見出された。
同じ平均強度(0.024mW/mm)の光に応答したMCO2発現細胞内の内向き光電流を図6Bに示す。0.024mW/mmの光強度でMCO1細胞中に生成されたピーク光電流は、MCO2発現細胞中の−320pAに比べ、−160pAであった。光に応答したMCO1及びMCO2発現細胞における誘導性光電流のオン率は有意には異ならなかったが、MCO2のオフ応答(光の不在下での電流の減衰)は、MCO1より有意に遅いことが見出された(図6B、図4A)。HEK293細胞を発現するMCO2では、活動電位を生成するための閾値ピーク電流(54)は、周辺光レベルである0.02mW/mmの光強度で達成することができる。したがって、周辺光は、網膜細胞を発現するMCOにおいて十分な光電流(活動電位について)を生成することが期待される。図8は、MCO1がトランスフェクトされたrdマウス網膜のパッチクランプ記録を示す。図8Aは、マウス網膜外植片の細胞におけるeMCO−1発現を示す。図8Bは、光パルス(100ms)列によって誘導された内向き光電流を示す。eMCO1の高速の動態及び小さいサイズ(AAVによるパッケージングを可能にする)と組み合わされたスペクトル及び強度感度は、網膜変性を有する被験体の高次網膜ニューロンに光感受性を与えるのに比類なく好適であり、周辺光環境における視力回復を可能にする。
実施例5−MCO1及びMCO2プラスミドを、mGluR6プロモーター及びmCherryレポーターと共に、アデノ関連ウイルス(血清型2)にパッケージングした。合成プラスミドを、BamHl及びSail部位を介してpAAV MCSベクターにクローニングした。AAV物理的力価を、AAV逆位末端配列を選択的に結合するよう設計されたプライマを使用して、定量PCRにより得た。TCID50アッセイを、ATCCプロトコルに従って実施した。精製したウイルスの純度の検証をSDS/PAGEにより確認した。図7Aは、AAV2−mGluR6−MCO1−mCherryでのトランスフェクションの2日後の、mCherryを発現するHEK293細胞の蛍光画像を示す。堅牢な発現が、形態の検出可能な変化がない状態で観察され、トランスフェクトされた細胞が健康であることを確認した。rd10マウスのin vivoトランスフェクションの場合、1μLのAAV2−mGluR6−MCO1−mCherry(vMCO1)の硝子体内注射をON型双極細胞における標的発現のために実施した。MCO発現の均一性を、vMCO1を硝子体内に注射したrd10マウスの網膜カップ全体のz−スライスにおける共焦点mCherry発現からの3D再構築によって確認した(図7B)。実施例6−rd10マウス(網膜変性10、Pde6bにおける自然発生的なミスセンス点変異)は、遅発型の進行性網膜変性を有しており、これはヒトの網膜光変性の表現型とよく似ている。rd10マウスの麻酔後、AAV2−mGluR6−MCO1−mCherry(1μL)溶液(1.6×1012GC/ml)を、強膜を通して硝子体腔に挿入されたHamilton注射器の滅菌針によって注射した。AAV2−mGluR6−MCO1−mCherry溶液を両眼に注射した。全手技の間、緩衝化された塩溶液を用いて角膜を湿ったままの状態にした。rd10マウス網膜におけるvMCO1のin vivoトランスフェクションを、4つの異なる最終用量のvMCO1について実施した。vMCO1注射後の異なる時点で、それぞれの群のマウスを安楽死させ、網膜組織を採取した。共焦点蛍光顕微鏡を、網膜におけるMCO1発現の分析のために実施した。MCOの保持を評価するために、共焦点顕微鏡を用いて、トランスフェクトされた網膜のレポーター蛍光発現レベル(蛍光強度)を評価した。vMCO1注射後の異なる時点で、マウスを屠殺し、網膜を抽出し、共焦点顕微鏡法により撮像した。MCOでトランスフェクトされたrd10マウス網膜は、標的細胞層における細胞膜上のレポーター(mCherry)の明確な発現を示した。vMCO1を注射した眼内での有意な発現とは対照的に、最大16週間監視した、PBSを注射した眼内には、特徴的なmCherry発現(バックグラウンド自己蛍光のみ)は観察されなかった。更に、3つの異なるvMCO1用量の注射の1週間後、mCherry発現(バックグラウンド自己蛍光のみ)の有意な増加は観察されなかった。MCO1発現は、vMCO1の硝子体内注射後4〜8週目に有意に高くなった(図9B)。in vivoウイルストランスフェクションを、rd10マウスモデルの網膜内の双極細胞へのMCO1の送達のために行った。MCO1発現は、標的化された網膜細胞に局在化されることが見出された(図9C)。図9Dは、1.6×1012VG/mLの用量での硝子体内注射の16週間後の網膜におけるMCO1発現の断面図を示す。更に、発現レベルは、注射の4ヶ月後でさえも有意であった。図9Eは、2つの異なる用量のvMCO1におけるrd10マウス網膜内のMCO1発現の動態を示す。図9Fは、1.6×1012VG/mLの用量でのvMCO1のトランスフェクションから16週間後のrd10マウスの網膜におけるMCO1−mCherry発現(バックグラウンド除去法後)の動物間変動を示す。
実施例7−光に向かう、vMCOで処置されたrd10マウスの空間的記憶及び学習能力を試験するために、可視の放射状アーム水迷路を使用した(55)。簡潔に述べると、マウスは迷路の中心に配置され、プラットフォームは、アームのうちの1つの端部で水の表面のすぐ下に配置される。マウスは、視覚的キュー(可視スペクトルを有する光を放出するLED)を利用することによって、プラットフォームの位置を決定することを迅速に学習する。プラットフォーム(アームのうちの1つ)は、泳がなければならない代わりに休憩できるという報酬をマウスに提供した。プラットフォームに到達するまでの時間及びプラットフォームを見つける前に行われたエラーの数は、光の点灯及び消灯条件の両方について定量化された。データ(ビデオ)記録は、マウスがプラットフォームを見つけたとき、又はマウスが泳ぎ疲れることを防止するため、マウスを水中に落下させてから60秒経過する前に停止した。落下場所(中心、サイド、縁部)の選択は、マウスごと及び試験ごとにランダムであった。除外基準は、泳がない(浮く)マウスからなる。この試験における視力は、プラットフォームに到達するまでの時間と、視覚刺激(キュー)の品質が低下するにつれて、マウスがプラットフォームに到達する前に行うエラーの数と、を測定することによって判定された。出生後約10週間で、rd10マウスに、双極細胞を標的とするvMCOを硝子体内注射した。プラットフォームは、マウスが泳がなければならない代わりに休憩できるという報酬を提供した。MCOを担持するウイルスの硝子体内注射は、放射状アーム水迷路アッセイによって評価するとき、rd10マウスの視覚的に誘導された行動の有意な改善をもたらした。出生後約8週間で、rd10マウスに、網膜内の双極細胞に標的化されたMCOを担持するAAVを硝子体内注射した。図10は、放射状水迷路におけるrd10マウスの行動における視覚的に誘導された改善を示す。図10Aは、硝子体内vMCO1注射前の、白色LED光を備えた放射状水迷路における、視覚的に誘導されたrd10マウスの行動の時間経過画像を示す。図10Bは、vMCO1注射の6週間後の、LED光が点灯した状態でのrd10マウスの行動を示す。プラットフォームに到着する前にMCOでトランスフェクトされたrd10マウスが移動した距離及び時間は、rd10マウスよりもはるかに短かった。図10Cは、光あり及び光なしの状態で迷路の中心にて落下した、vMCO1で処置されたrd10マウスがプラットフォームを見つけるまでの時間を示す。平均±SEM。マウスごとにN=5。図10Dは、光あり及び光なしの状態で迷路のサイドアーム2及び4にて落下した、vMCO1で処置されたrd10マウスがプラットフォームを見つけるまでの時間を示す。図10Eは、光あり及び光なしの状態で、迷路の縁部アーム3で落下した、vMCO1で処置されたrd10マウスがプラットフォームを見つけるまでの時間を示す。プラットフォームを見つけるまでの時間と一貫して、MCOでトランフェクトされたrd10マウスが、プラットフォームに到着する前に行ったエラーの数は、トランスフェクションなしのマウス(>2)(56)のそれよりも有意に小さい(<1)。図10Fは、光の存在下及び非存在下でプラットフォームを見つける前に中心で落下した、vMCO1で処置されたrd10マウスが通過したエラーアームの数を示す。図10Gは、光の存在下及び非存在下でプラットフォームを見つける前にサイドアームにて落下した、vMCO1で処置されたrd10マウスが通過したエラーアームの数を示す。平均±SEM。マウスごとにN=5。図10Hは、光の存在下及び非存在下でプラットフォームを見つける前に縁部で落下した、vMCO1で処置されたrd10マウスが通過したエラーアームの数を示す。平均±SEM。マウスごとにN=5。
図11は、放射状水迷路におけるrd10マウスの行動における視覚的に誘導された改善の追跡研究を示す。データを収集して、ベースライン(事前ウイルストランスフェクション)の及び経時的な(4週間ごとに4ヶ月間)視力を決定した。図11Aは、vMCO1を注射されたrd10マウスの視覚的に誘導された行動の改善を試験するために使用される放射状アーム水迷路の概略図を示す。注射の4週間後、全てのマウスは視覚的に誘導された行動を有意に回復し、16週間の試験中継続した。MCOでトランフェクトされたrd10マウスが、プラットフォームに到着する前に行ったエラーの数は、トランスフェクションなしのマウス(>2)(56)のそれよりも有意に小さい(<1)。エラーアームの数と一貫して、MCOでトランフェクトされたマウルが、プラットフォームに到着する前に移動した距離及び時間は、rd10マウスよりもはるかに短い(両方の群についてn=5)。図11Bは、vMCO1注射前に迷路の中心(光強度:0.007mW/mm)から、注射後期間に応じて、rd10マウスがプラットフォームに到着するまでの時間を示す。N=5;平均±S.D。P<0.05。図11Cは、vMCO1注射前に迷路の近傍アーム(光強度:0.014mW/mm)から、注射後期間に応じて、rd10マウスがプラットフォームに到達するまでの時間を示す。N=5;平均±S.D。P<0.05。図11Dは、vMCO1注射前にサイドアーム(光強度:0.004mW/mm)から、注射後期間に応じて、rd10マウスがプラットフォームに到達するまでの時間を示す。N=5;平均±S.D。P<0.05。
最も重要なことに、MCOで処置されたrd10マウスが一系列で放射状水迷路の5つの異なるアームにランダムに配置されたとき、マウスは、1回のエラーもなく全ての他のアームからプラットフォーム(6番目のアーム)を見つけることができた。更に、MCOで処置されたrd10マウスは、周辺光レベルに匹敵する低光強度(0.005〜0.01mW/mm)であっても、視覚的に誘導された作業でより良い成績を収めた。vMCO1で処置したマウスに関する行動の改善の光強度依存性を判定するために、発散するLED光の強度を0.0005〜0.03mW/mmに変更した。vMCO1で処置したrd10マウスがプラットフォームに到着するまでにかかった平均時間は、周辺光の強度レベル0.007mW/mmで<20秒であった。行動スコアは、視覚的に誘導された行動の改善のための光強度及び閾値と相関し、0.004mW/mmであるものと決定された。図12は、放射状水迷路におけるrd10マウスの行動の改善の光強度依存性を示す。2つの異なる光強度間での、注射後の期間に応じた、迷路の中心からプラットフォームに到達するまでの時間の比較である。このとき初めて、オプシンで処置されたマウスは、このような低光レベルで有意に良好な成績を収めることができた。ChR2で処置したマウスを用いた早期の行動研究は、はるかに高い光強度を使用したが、これは、活性照明源を使用しない視力回復における光遺伝学の実際的応用に適していない。実施例8−視運動応答の測定は、ヒト及び動物における視覚系の閾値を測定するために一般的に使用されているため(57、58)、MCO感作網膜を有するrd10マウスの視覚特性の改善を評価するのにこのツールを利用した。この方法の利点は、動物の事前の訓練を必要としないことである。簡潔に述べると、rd10マウスを、回転ストライプに囲まれたプラットフォーム(ドラムの中心に)上に配置した(図10)。様々な速度を有する視運動性刺激を適用し、平均視運動応答及びマウスのスコアを測定した。図13は、rd10マウス及びMCOで感作したrd10マウスの視動性評価を示す。図13Aは、1rpmでの垂直ストライプの回転速度(0.07cpd)におけるvMCO1注射の前及び8週間後の、rd10マウスの頭部運動数の定量比較を示す。チャンバの中心における光強度は、0.001mW/mmである。図13Bは、2rpmでの垂直ストライプの回転速度におけるvMCO1注射の前及び8週間後の、rd10マウスの頭部運動数の定量比較を示す。チャンバの中心における光強度は、0.001mW/mmである。この低光強度であっても、MCOで処置されたマウスは、回転ストライプに応答してその頭部を回転させ、改善された空間的視力を示唆した。実施例9−野生型(非盲検)マウスと同様に、vMCOで処置されたrd10マウスは、光から離れ、遮断することにより、明るい光を回避することが観察された(図14)。
実施例10−オプシンでトランスフェトされた網膜細胞の光に対する慢性曝露は、それらの生存性に関する懸念を引き起こし得る。したがって、網膜細胞生存性に対する光曝露の何らかの有害効果を評価するため、野生型マウス及びMCOが注射されたrd10マウスを、周辺光レベルの強度(すなわち、約0.01mW/mm)より約10倍高い強度(すなわち、(0.1mW/mm)を有する白色光に4週間(1日8時間)曝露した。光曝露の4週間後、MCOでトランスフェクトされたrd10及び野生型(対照)マウスを屠殺し、免疫組織化学分析用に網膜組織を採取した。網膜をアポトーシスマーカーで免疫染色し、共焦点顕微鏡法を用いて撮像した。図14は、慢性光曝露後のMCO1感作網膜細胞の生存性を示す。図14Aは、野生型(非盲検)マウスと同様に、vMCO1で処置されたrd10マウスは、光から離れ、遮断することにより(矢印に示されるように、床敷材料を積み上げて)明るい光を回避することを示す。図14Bは、1日8時間の白色光(強度:0.1mW/mm)の照明から4週間後の、vMCO1で処置されたrd10マウスのカスパーゼ−3(緑色)で染色された網膜の蛍光画像を示す。図14Cは、1日8時間の白色光(強度:0.1mW/mm)の照明の4週間後の、野生型マウスのカスパーゼ−3(緑色)で染色された網膜の蛍光画像を示す。定量的比較(図14D)は、野生型マウス又はMCOが注射されたrd10マウスのいずれにも有意な細胞死が存在しないことを示しており、慢性光曝露下の細胞生存性が損なわれていないことを示している。vMCO1で処置されたrd10マウスの内核層内のアポトーシス細胞は0%である。更に、MCO発現細胞の光感受性は、作用電位を生成するために必要な光強度を有意に低下させるため、MCOの使用は、網膜細胞に対する光誘発性の慢性損傷を最小限に抑えられる。
実施例11−SDOCTを用いた光学切開/撮像を行って、vMCO1の硝子体内注射による眼構造の任意の変化を監視した。rd10マウスにおける硝子体内vMCO注射後の角膜、レンズ、及び網膜lwkのSDOCT画像を、注射前の画像と比較した。図15は、rd10マウスにおけるvMCO1注射後の網膜の構造的一体性の評価の結果を示す。図15Aは、vMCO1注射後のrd10マウス網膜のOCT画像を示す。図15Bは、注射の前及び1週間後の、4匹の異なるrd10マウスの網膜厚の比較を示す。vMCOの硝子体内注射後に、角膜、レンズ、又は網膜への検出可能な変化(例えば、剥離)は観察されなかった。ImageJを使用して、SDOCT画像を分析した。vMCO1注射の前及び1週間後の網膜厚の定量的比較(図15D)は、網膜厚の変化を示していない。
実施例12−遺伝子治療は、過去10年間望まれない副作用(59、60)により物議を醸してきたが、オプシン(例えば、ChR2)は、非毒性であると報告され、免疫応答を生じず、安定した細胞膜特性を維持することが報告されている。したがって、マウスの健康を監視して、本アプローチの安全性を確認した。免疫毒性研究のために、血液を、2回の異なる用量(群1:1.66×1010、群2:1.66×1011GC/mL)のvMCOの硝子体内注射の前、7日後及び14日後に、マウスから血液を採取した(N=5/用量)。麻酔後、硝子体内注射の1週間前に、血液(−0.2mL)を顔面静脈(無菌動物ランセットを使用して)から採取した。vMCO1注射後、血液を分析のために採取した(表6.1)。研究期間の完了後、マウスを安楽死させた。マウスの顔面静脈から血液を採集するために、顎部の側の毛の少ない雀卵斑に場所を定め、ランセットで刺した。血漿中の炎症誘発性(IL−6及びIFN−y)及び抗炎症性(IL−10)サイトカインを、ELISAキットを使用して定量化した。図16は、vMCOの硝子体内用量が安全限度内にあることを示す、炎症性サイトカインのELISA定量の結果を要約している。図16Aは、vMCO1注射の前、7日後及び14日後の群1と群2との間の血漿中のIL−6(炎症誘発性マーカー)の定量的比較を示す。図16Bは、2つの群間の血漿中のIL−10(抗炎症性マーカー)の定量的比較を示す。図16Cは、vMCO1注射の前、7日後及び14日後の2つの群間の血漿中のIFN−Y(炎症誘発性マーカー)の定量的比較を示す。
実施例13−MCOの硝子体内注射による視力の行動的回復を監視した後、マウスを屠殺し、非標的組織試料(眼、心臓、肝臓、筋肉、皮膚など)におけるMCO発現の拡散を分析するために様々な器官を回収した。器官を1.8mLのクライオバイアルに保存し、−80℃で保管した。それぞれのバイアルに、研究番号、動物識別番号、抽出日及び器官名を示したラベルを適切に貼付した。注射後の異なる時点におけるrd10マウスにおけるベクター配列のqPCR検出は、処置された眼の外側の組織にごく少量のMCO−1 DNAを示し、我々の分子及び治療方法の安全性が確認された。眼内のvMCO1の硝子体内投与は、局所的に制限された分布をもたらし、オフターゲット効果を最小限に抑えた。図17は、AAV2にパッケージングされた多特性オプシン(vMCO1)の生体分布を示す。注射後(1週間)の固定時点において、眼内で測定されたベクトルコピー数は、注射量の減少と共に減少することが見出された。更に、注射の4〜8週間後、注射された眼内にはごく少量の又は検出不能な量のベクターDNAが見出された。生体分布研究は、硝子体内注射されたrd10マウスの非標的器官におけるベクターの最小限の又は検出不可能なレベルを示した。異なる用量及び注射後の期間でのrd10マウスにおけるベクター配列のqPCR検出による、処置された眼の外側の組織におけるベクターDNAは、ごく少量又は検出不可能な量である。複数の時点における硝子体内投与を介したvMCO1の投与後の生体分布プロファイル及び導入遺伝子発現の動態は、検出の開始、ピークベクトル/導入遺伝子レベル、及びこれらのレベルの低下/平坦域と一致する。
実施例14−我々のオプシンの安全性、特異性、及び有効性を更に評価するために、vMCO1が注射されたrd10網膜の免疫組織化学を行った。図18は、vMCO1が注射されたrd10マウスの眼の網膜切片の免疫組織化学を示す。図18Aは、MCO−mCherry(赤色)が選択的に標的化され、vMCO1の硝子体内注射の8週間後に、rd10マウスの内核層(INL)で発現されることを示す。アレスチン(緑色)の不在は、光受容体の完全な喪失を示唆している。図18Bは、vMCO1の硝子体内注射の8週間後の、rd10マウスにおけるmCherry(赤色、内因性)を発現する桿体双極細胞中のPKCa染色(緑色)を示す。図18Bは、vMC01の硝子体内注射の8週間後の、rd10マウスにおけるmCherry(赤色)を発現するON型双極細胞中のmGluR6染色(緑色)を示す。図18Dは、vMCO1のrd10マウスへの硝子体内送達の8週間後の、rd10網膜におけるmCherry(緑色の免疫染色)発現を示す。図18Eは、光受容体が変性した網膜で報告されるように、vMCO1の硝子体内注射の18週間後のrd10マウスにおけるGFAP(緑色)を示す。図18Fは、CD45(緑色)の発現がないことを示し、vMCO1の硝子体内注射の8週間後のrd10マウスに免疫細胞がないことを示唆している。
本発明は、本明細書に記載の組成物のうちのいずれか1つを被験体に投与することを含む、視力を改善又は回復する方法を提供する。本発明のMCOの方法の組成物は、(i)MCOプラスミド、(ii)rAAV−MCO、(iii)pAAV−MCO及び(iii)Lenti Virus−MCOを含む、プラスミド又はウイルスベクターに送達及びパッケージングされ得る。本発明の送達は、本発明の分子−MCO(裸のプラスミド又はウイルス)と共に最適化されたAAAの製剤を使用して、網膜の内境界膜を一時的に透過させることにより、その場に応じて行われる。
視力回復のための多特性オプシンによる
光遺伝学的調節及びその別の用途
表01:多特性オプシン−1(MCO1)のアミノ酸及びDNA配列
アミノ酸配列:
MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGSVLVPEDQCYCAGWIESRGTNGAQTASNVLQWLAAGFSILLLMFYAYQTWKSTCGWEEIYVCAIEMVKVILEFFFEFKNPSMLYLATGHRVQWLRYAEWLLTCPVISIHLSNLTGLSNDYSRRTMGLLVSDIGTIVWGATSAMATGYVKVIFFCLGLCYGANTFFHAAKAYIEGYHTVPKGRCRQVVTGMAWLFFVSWGMFPILFILGPEGFGVLSVYGSTVGHTIIDLMSKNCWGLLGHYLRVLIHEHILIHGDIRKTTKLNIGGTEIEVETLVEDESEAGSVNKGTGKMAELISSATRSLFAAGGINPWPNPYHHEDMGCGGMTPTGECFSTEWWCDPSYGLSDAGYGYCFVEATGGYLVVGVEKKQAWLHSRGTPGEKIGAQVCQWIAFSIAIALLTFYGFSAWKATCGWEEVYVCCVEVLFVTLEIFKEFSSPATVYLSTGNHAYCLRYFEWLLSCPVILIRLSNLSGLKNDYSKRTMGLIVSCVGMIVFGMAAGLATDWLKWLLYIVSCIYGGYMYFQAAKCYVEANHSVPKGHCRMVVKLMAYAYFASWGSYPILWAVGPEGLLKLSPYANSIGHSICEIIAKEFWTFLAHHLRIKIHEHILIHGDIRKTTKMEIGGEEVEVEEFVEEEDEDTV(配列番号:1)
DNA配列:
ATGGATTATGGCGGCGCGCTGAGCGCGGTGGGCCGCGAACTGCTGTTTGTGACCAACCCGGTGGTGGTGAACGGCAGCGTGCTGGTGCCGGAAGATCAGTGCTATTGCGCGGGCTGGATTGAAAGCCGCGGCACCAACGGCGCGCAGACCGCGAGCAACGTGCTGCAGTGGCTGGCGGCGGGCTTTAGCATTCTGCTGCTGATGTTTTATGCGTATCAGACCTGGAAAAGCACCTGCGGCTGGGAAGAAATTTATGTGTGCGCGATTGAAATGGTGAAAGTGATTCTGGAATTTTTTTTTGAATTTAAAAACCCGAGCATGCTGTATCTGGCGACCGGCCATCGCGTGCAGTGGCTGCGCTATGCGGAATGGCTGCTGACCTGCCCGGTGATTAGCATTCATCTGAGCAACCTGACCGGCCTGAGCAACGATTATAGCCGCCGCACCATGGGCCTGCTGGTGAGCGATATTGGCACCATTGTGTGGGGCGCGACCAGCGCGATGGCGACCGGCTATGTGAAAGTGATTTTTTTTTGCCTGGGCCTGTGCTATGGCGCGAACACCTTTTTTCATGCGGCGAAAGCGTATATTGAAGGCTATCATACCGTGCCGAAAGGCCGCTGCCGCCAGGTGGTGACCGGCATGGCGTGGCTGTTTTTTGTGAGCTGGGGCATGTTTCCGATTCTGTTTATTCTGGGCCCGGAAGGCTTTGGCGTGCTGAGCGTGTATGGCAGCACCGTGGGCCATACCATTATTGATCTGATGAGCAAAAACTGCTGGGGCCTGCTGGGCCATTATCTGCGCGTGCTGATTCATGAACATATTCTGATTCATGGCGATATTCGCAAAACCACCAAACTGAACATTGGCGGCACCGAAATTGAAGTGGAAACCCTGGTGGAAGATGAATCGGAAGCGGGCTCGGTGAACAAAGGCACCGGCAAAATGGCTGAGCTGATCAGCAGCGCCACCAGATCTCTGTTTGCCGCCGGAGGCATCAACCCTTGGCCTAACCCCTACCACCACGAGGACATGGGCTGTGGAGGAATGACACCTACAGGCGAGTGCTTCAGCACCGAGTGGTGGTGTGACCCTTCTTACGGACTGAGCGACGCCGGATACGGATATTGCTTCGTGGAGGCCACAGGCGGCTACCTGGTCGTGGGAGTGGAGAAGAAGCAGGCTTGGCTGCACAGCAGAGGCACACCAGGAGAAAAGATCGGCGCCCAGGTCTGCCAGTGGATTGCTTTCAGCATCGCCATCGCCCTGCTGACATTCTACGGCTTCAGCGCCTGGAAGGCCACTTGCGGTTGGGAGGAGGTCTACGTCTGTTGCGTCGAGGTGCTGTTCGTGACCCTGGAGATCTTCAAGGAGTTCAGCAGCCCCGCCACAGTGTACCTGTCTACCGGCAACCACGCCTATTGCCTGCGCTACTTCGAGTGGCTGCTGTCTTGCCCCGTGATCCTGATCAGACTGAGCAACCTGAGCGGCCTGAAGAACGACTACAGCAAGCGGACCATGGGCCTGATCGTGTCTTGCGTGGGAATGATCGTGTTCGGCATGGCCGCAGGACTGGCTACCGATTGGCTCAAGTGGCTGCTGTATATCGTGTCTTGCATCTACGGCGGCTACATGTACTTCCAGGCCGCCAAGTGCTACGTGGAAGCCAACCACAGCGTGCCTAAAGGCCATTGCCGCATGGTCGTGAAGCTGATGGCCTACGCTTACTTCGCCTCTTGGGGCAGCTACCCAATCCTCTGGGCAGTGGGACCAGAAGGACTGCTGAAGCTGAGCCCTTACGCCAACAGCATCGGCCACAGCATCTGCGAGATCATCGCCAAGGAGTTTTGGACCTTCCTGGCCCACCACCTGAGGATCAAGATCCACGAGCACATCCTGATCCACGGCGACATCCGGAAGACCACCAAGATGGAGATCGGAGGCGAGGAGGTGGAAGTGGAAGAGTTCGTGGAGGAGGAGGACGAGGACACAGTG(配列番号:2)
表02:多特性オプシン−2(MCO2)のアミノ酸及びDNA配列。MCO1配列(表−01)の308後の変異(S 142 L)及び7個のアミノ酸残基(VNKGTGK)の欠失を含有する。
アミノ酸配列:
MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGSVLVPEDQCYCAGWIESRGTNGAQTASNVLQWLAAGFSILLLMFYAYQTWKSTCGWEEIYVCAIEMVKVILEFFFEFKNPSMLYLATGHRVQWLRYAEWLLTCPVILIHLSNLTGLSNDYSRRTMGLLVSDIGTIVWGATSAMATGYVKVIFFCLGLCYGANTFFHAAKAYIEGYHTVPKGRCRQVVTGMAWLFFVSWGMFPILFILGPEGFGVLSVYGSTVGHTIIDLMSKNCWGLLGHYLRVLIHEHILIHGDIRKTTKLNIGGTEIEVETLVEDESEAGSMAELISSATRSLFAAGGINPWPNPYHHEDMGCGGMTPTGECFSTEWWCDPSYGLSDAGYGYCFVEATGGYLVVGVEKKQAWLHSRGTPGEKIGAQVCQWIAFSIAIALLTFYGFSAWKATCGWEEVYVCCVEVLFVTLEIFKEFSSPATVYLSTGNHAYCLRYFEWLLSCPVILIRLSNLSGLKNDYSKRTMGLIVSCVGMIVFGMAAGLATDWLKWLLYIVSCIYGGYMYFQAAKCYVEANHSVPKGHCRMVVKLMAYAYFASWGSYPILWAVGPEGLLKLSPYANSIGHSICEIIAKEFWTFLAHHLRIKIHEHILIHGDIRKTTKMEIGGEEVEVEEFVEEEDEDTV(配列番号:3)
ヌクレオチド配列:
ATGGACTATGGCGGAGCATTGAGTGCAGTTGGGCGAGAATTGCTGTTCGTGACGAATCCCGTTGTTGTAAACGGAAGTGTACTGGTGCCAGAAGACCAATGTTATTGCGCGGGCTGGATAGAGTCGCGCGGAACGAATGGAGCACAGACAGCGTCCAACGTACTGCAATGGCTCGCCGCTGGTTTCTCTATCCTGTTGTTGATGTTCTACGCATATCAAACGTGGAAAAGCACCTGCGGGTGGGAGGAAATATATGTGTGTGCCATCGAGATGGTAAAAGTAATTTTAGAGTTTTTTTTTGAATTCAAGAACCCCTCAATGTTGTACCTTGCTACGGGGCATAGAGTTCAATGGCTTCGGTATGCGGAATGGCTCTTGACATGTCCAGTAATACTAATTCATCTTAGTAACTTAACGGGACTCTCTAACGACTATTCACGGCGTACCATGGGACTACTGGTGTCAGACATTGGGACGATAGTATGGGGAGCGACGAGCGCAATGGCTACAGGCTACGTAAAGGTTATCTTTTTCTGCCTCGGGCTTTGTTACGGCGCGAATACCTTCTTTCATGCCGCAAAGGCCTACATAGAGGGTTACCATACCGTACCGAAAGGGCGGTGCCGGCAAGTCGTCACAGGAATGGCTTGGCTCTTCTTTGTGAGTTGGGGAATGTTCCCTATCCTATTTATCTTAGGGCCTGAGGGTTTCGGCGTGCTTAGTGTTTACGGCAGTACGGTCGGTCACACGATCATCGACCTGATGTCAAAGAATTGCTGGGGCTTGCTTGGTCATTATTTGCGTGTGTTAATCCACGAACATATTCTGATTCATGGTGACATCCGAAAAACTACCAAACTCAATATTGGCGGCACAGAGATAGAGGTTGAAACGTTGGTCGAGGACGAGTCTGAAGCGGGGTCAATGGCGGAACTAATTTCATCTGCAACACGGTCGCTATTTGCTGCCGGGGGGATAAATCCCTGGCCCAACCCGTATCACCACGAAGATATGGGATGCGGAGGGATGACTCCCACAGGAGAGTGTTTTTCGACCGAATGGTGGTGTGACCCCTCGTACGGGTTATCAGATGCAGGCTATGGTTATTGTTTCGTGGAGGCCACGGGTGGTTATTTAGTCGTAGGGGTAGAGAAGAAACAGGCATGGCTTCATTCCCGGGGAACCCCCGGGGAGAAAATTGGAGCTCAGGTATGCCAGTGGATAGCGTTTTCTATCGCGATAGCTCTCCTGACTTTTTATGGATTTTCGGCTTGGAAGGCCACGTGCGGATGGGAAGAGGTATACGTATGTTGCGTCGAAGTGCTTTTCGTAACTCTGGAAATATTTAAAGAATTCTCAAGTCCGGCCACAGTTTATTTGAGCACTGGCAACCACGCCTATTGTTTGCGGTATTTTGAGTGGCTATTATCTTGCCCTGTTATTCTTATACGGTTATCAAACCTATCGGGTCTGAAGAATGATTATTCCAAGAGAACCATGGGCCTAATTGTCAGTTGCGTCGGGATGATCGTGTTCGGGATGGCCGCGGGTCTTGCAACGGACTGGCTTAAGTGGCTATTATACATCGTCAGCTGCATTTACGGTGGTTACATGTACTTTCAAGCGGCTAAGTGCTATGTGGAGGCGAACCATTCAGTCCCGAAAGGCCACTGTCGCATGGTGGTTAAGTTAATGGCGTATGCGTACTTCGCTTCGTGGGGTTCATATCCAATCCTGTGGGCGGTCGGACCTGAAGGTCTCCTGAAACTGAGCCCCTATGCGAACTCCATAGGACATTCCATCTGTGAGATCATCGCCAAGGAATTCTGGACCTTCTTAGCTCACCATTTGCGGATTAAGATCCATGAACACATTCTCATTCACGGTGATATTAGGAAAACTACCAAGATGGAGATAGGTGGAGAAGAGGTGGAGGTAGAAGAGTTTGTAGAAGAGGAGGACGAGGACACTGTAGTATCAAAGGGGGAAGAAGACAAT(配列番号:4)
表03:多特性オプシン−IT(MCOIT)のアミノ酸及びDNA配列。これは、MCO1の315個のアミノ酸残基(表−01)の後の、追加の膜貫通配列(TPARWVWISLYYAAFYVVMTGLFALCIYVLMQTI)を含有する。
アミノ酸配列:
MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGSVLVPEDQCYCAGWIESRGTNGAQTASNVLQWLAAGFSILLLMFYAYQTWKSTCGWEEIYVCAIEMVKVILEFFFEFKNPSMLYLATGHRVQWLRYAEWLLTCPVISIHLSNLTGLSNDYSRRTMGLLVSDIGTIVWGATSAMATGYVKVIFFCLGLCYGANTFFHAAKAYIEGYHTVPKGRCRQVVTGMAWLFFVSWGMFPILFILGPEGFGVLSVYGSTVGHTIIDLMSKNCWGLLGHYLRVLIHEHILIHGDIRKTTKLNIGGTEIEVETLVEDESEAGSVNKGTGKTPARWVWISLYYAAFYVVMTGLFALCIYVLMQTIMAELISSATRSLFAAGGINPWPNPYHHEDMGCGGMTPTGECFSTEWWCDPSYGLSDAGYGYCFVEATGGYLVVGVEKKQAWLHSRGTPGEKIGAQVCQWIAFSIAIALLTFYGFSAWKATCGWEEVYVCCVEVLFVTLEIFKEFSSPATVYLSTGNHAYCLRYFEWLLSCPVILIRLSNLSGLKNDYSKRTMGLIVSCVGMIVFGMAAGLATDWLKWLLYIVSCIYGGYMYFQAAKCYVEANHSVPKGHCRMVVKLMAYAYFASWGSYPILWAVGPEGLLKLSPYANSIGHSICEIIAKEFWTFLAHHLRIKIHEHILIHGDIRKTTKMEIGGEEVEVEEFVEEEDEDTV(配列番号:5)
ヌクレオチド配列
ATGGATTACGGAGGAGCACTGAGCGCTGTTGGCCGCGAGTTGCTATTTGTGACCAACCCCGTCGTGGTCAATGGCAGCGTCCTTGTGCCTGAGGATCAATGTTATTGCGCTGGGTGGATTGAATCCCGAGGTACAAATGGTGCCCAGACGGCAAGCAACGTTTTGCAATGGCTAGCAGCTGGGTTTTCAATTCTACTTTTAATGTTTTACGCTTATCAAACCTGGAAGAGTACATGTGGCTGGGAGGAAATTTATGTCTGCGCTATTGAAATGGTTAAAGTAATTTTGGAATTTTTTTTTGAATTTAAGAATCCATCAATGTTGTATCTTGCCACAGGTCACAGGGTCCAATGGCTCCGATACGCGGAATGGCTTCTAACTTGCCCTGTTATTTCCATTCACCTAAGCAATCTGACTGGCCTTTCGAATGACTATAGCAGACGCACCATGGGACTGTTAGTTAGTGACATAGGGACTATAGTTTGGGGTGCCACTAGCGCCATGGCGACCGGTTATGTTAAAGTAATTTTTTTCTGCCTTGGGTTGTGTTATGGCGCTAACACTTTTTTCCACGCTGCTAAAGCATATATAGAAGGGTACCATACGGTGCCCAAAGGAAGATGTCGCCAAGTAGTTACAGGGATGGCGTGGCTGTTCTTTGTGAGCTGGGGGATGTTCCCTATACTGTTTATCCTTGGTCCAGAGGGTTTTGGAGTCCTAAGCGTGTACGGCAGTACTGTTGGGCATACTATAATAGATTTGATGAGCAAAAACTGCTGGGGGCTTCTCGGGCATTATTTACGAGTTCTTATTCACGAACATATTTTAATTCATGGGGATATCAGAAAAACAACGAAACTAAATATAGGAGGCACGGAAATAGAGGTTGAAACGCTCGTCGAAGACGAATCAGAGGCCGGCTCCGTGAATAAGGGAACTGGTAAAACTCCTGCTCGCTGGGTATGGATATCGCTTTACTACGCAGCATTTTACGTAGTTATGACTGGGCTTTTTGCTTTGTGCATATACGTGCTAATGCAGACGATTATGGCTGAGCTAATTTCATCTGCAACTAGATCCCTTTTCGCGGCAGGAGGGATCAACCCCTGGCCCAATCCATATCATCATGAAGATATGGGCTGTGGCGGTATGACCCCAACTGGTGAGTGCTTTTCTACCGAATGGTGGTGTGATCCGAGTTACGGTCTGTCAGATGCTGGGTATGGTTATTGCTTTGTCGAAGCCACGGGGGGATACCTTGTCGTCGGAGTAGAGAAAAAACAGGCCTGGCTCCATTCCCGGGGGACCCCAGGAGAGAAGATAGGGGCCCAAGTTTGCCAGTGGATCGCATTTAGTATTGCGATCGCATTACTGACATTCTATGGTTTCTCAGCGTGGAAGGCAACCTGCGGCTGGGAGGAGGTTTACGTATGCTGTGTTGAGGTACTGTTCGTAACCCTTGAGATTTTCAAAGAGTTTTCTTCTCCGGCGACGGTCTATCTCAGTACCGGTAACCATGCATATTGTTTACGTTATTTCGAATGGTTGCTTTCTTGCCCAGTGATTTTGATACGCTTGAGTAATTTATCTGGCCTAAAGAACGACTATAGCAAGCGAACCATGGGACTTATTGTATCTTGTGTTGGCATGATAGTTTTTGGTATGGCAGCCGGGCTCGCCACTGACTGGCTGAAGTGGTTGCTCTATATAGTGAGCTGTATTTATGGTGGCTACATGTACTTTCAGGCGGCCAAGTGTTACGTTGAAGCAAACCATTCGGTACCTAAAGGACATTGCCGTATGGTAGTTAAGCTGATGGCGTATGCGTACTTCGCGAGCTGGGGCAGCTACCCCATTCTGTGGGCGGTGGGACCAGAGGGGTTACTTAAGTTGTCGCCCTATGCTAATTCAATAGGCCATAGCATCTGTGAGATTATCGCGAAGGAATTTTGGACTTTCCTAGCACATCACCTTCGAATTAAAATACACGAACACATACTCATTCACGGGGACATACGCAAGACAACCAAGATGGAAATCGGAGGTGAGGAAGTGGAAGTAGAGGAGTTTGTAGAGGAGGAAGATGAGGACACGGTT(配列番号:6)
表04:多特性オプシン−2T(MCO2T)のアミノ酸及びDNA配列。これは、MCO2の308個のアミノ酸残基(表−02)の後の追加の膜貫通配列(TPARWVWISLYYAAFYVVMTGLFALCIYVLMQTI)を含有する。
アミノ酸配列:
MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGSVLVPEDQCYCAGWIESRGTNGAQTASNVLQWLAAGFSILLLMFYAYQTWKSTCGWEEIYVCAIEMVKVILEFFFEFKNPSMLYLATGHRVQWLRYAEWLLTCPVILIHLSNLTGLSNDYSRRTMGLLVSDIGTIVWGATSAMATGYVKVIFFCLGLCYGANTFFHAAKAYIEGYHTVPKGRCRQVVTGMAWLFFVSWGMFPILFILGPEGFGVLSVYGSTVGHTIIDLMSKNCWGLLGHYLRVLIHEHILIHGDIRKTTKLNIGGTEIEVETLVEDESEAGSPARWVWISLYYAAFYVVMTGLFALCIYVLMQTIMAELISSATRSLFAAGGINPWPNPYHHEDMGCGGMTPTGECFSTEWWCDPSYGLSDAGYGYCFVEATGGYLVVGVEKKQAWLHSRGTPGEKIGAQVCQWIAFSIAIALLTFYGFSAWKATCGWEEVYVCCVEVLFVTLEIFKEFSSPATVYLSTGNHAYCLRYFEWLLSCPVILIRLSNLSGLKNDYSKRTMGLIVSCVGMIVFGMAAGLATDWLKWLLYIVSCIYGGYMYFQAAKCYVEANHSVPKGHCRMVVKLMAYAYFASWGSYPILWAVGPEGLLKLSPYANSIGHSICEIIAKEFWTFLAHHLRIKIHEHILIHGDIRKTTKMEIGGEEVEVEEFVEEEDEDTV(配列番号:7)
ヌクレオチド配列:
ATGGACTATGGAGGAGCACTGTCAGCCGTTGGGAGAGAGTTGTTGTTTGTTACCAATCCTGTAGTAGTCAATGGCAGTGTGCTTGTACCAGAGGATCAATGCTACTGTGCCGGGTGGATAGAGTCCCGGGGAACCAACGGGGCACAAACTGCGAGTAACGTTCTGCAATGGCTAGCAGCAGGCTTTAGCATACTGCTACTAATGTTCTATGCTTACCAAACATGGAAGTCGACTTGCGGGTGGGAGGAGATATACGTCTGCGCAATTGAAATGGTCAAGGTTATTCTCGAGTTCTTCTTCGAATTCAAAAACCCATCAATGTTATACTTAGCGACAGGACATCGAGTCCAGTGGTTACGTTACGCCGAGTGGCTCCTGACGTGCCCGGTAATTTTAATCCACCTCTCTAATTTGACCGGACTTTCCAATGATTACAGTCGAAGAACTATGGGGCTATTAGTCTCTGACATCGGGACTATTGTCTGGGGTGCGACTAGCGCTATGGCTACCGGGTATGTAAAAGTCATCTTCTTCTGTTTAGGACTGTGCTACGGCGCGAATACATTCTTTCACGCTGCGAAAGCTTATATTGAAGGCTATCACACTGTACCTAAAGGTCGGTGTAGGCAGGTCGTCACCGGTATGGCGTGGTTGTTCTTCGTATCATGGGGAATGTTTCCAATCTTGTTTATACTAGGTCCCGAAGGATTTGGAGTGTTGTCCGTTTACGGATCAACAGTAGGCCACACTATTATCGATTTGATGTCTAAAAACTGCTGGGGGCTTTTAGGTCACTATCTAAGGGTGCTCATTCATGAGCACATATTAATCCATGGCGATATCAGAAAGACGACGAAACTGAATATTGGAGGCACTGAGATCGAAGTAGAGACGCTTGTCGAAGACGAATCCGAAGCTGGTAGCCCCGCACGCTGGGTCTGGATATCTTTGTACTATGCCGCCTTCTATGTTGTTATGACAGGACTCTTTGCTTTATGCATCTATGTCCTAATGCAAACTATTATGGCTGAACTTATATCATCGGCAACAAGGAGTTTATTTGCGGCTGGGGGAATAAATCCGTGGCCCAACCCCTACCATCATGAAGATATGGGTTGCGGCGGCATGACCCCGACAGGGGAATGCTTCTCGACGGAGTGGTGGTGTGATCCTTCTTATGGACTGAGTGATGCTGGGTATGGCTATTGCTTCGTAGAGGCTACGGGGGGGTACTTGGTCGTTGGAGTCGAGAAAAAACAGGCATGGTTACATAGCAGGGGGACTCCTGGAGAGAAAATAGGTGCCCAGGTTTGTCAATGGATTGCTTTCTCGATTGCAATAGCTCTGTTAACGTTCTATGGGTTCTCCGCGTGGAAGGCTACTTGTGGCTGGGAAGAGGTATATGTTTGTTGTGTTGAAGTTCTATTTGTAACACTTGAGATATTTAAAGAATTTTCTTCACCCGCAACGGTCTACTTAAGTACAGGCAATCATGCATACTGTCTAAGATACTTCGAATGGCTCTTATCATGTCCGGTGATCTTAATTCGACTCTCGAACCTCTCTGGACTCAAGAATGACTATAGTAAGAGGACTATGGGACTCATTGTGTCGTGCGTTGGTATGATTGTGTTTGGTATGGCGGCAGGGCTGGCTACGGACTGGCTAAAGTGGCTGCTATATATAGTGAGCTGTATCTATGGCGGTTACATGTATTTCCAGGCGGCCAAGTGTTATGTCGAGGCGAATCACTCGGTCCCCAAAGGTCATTGTCGGATGGTGGTCAAGCTTATGGCGTACGCATATTTCGCCAGCTGGGGATCGTACCCGATACTTTGGGCCGTTGGCCCAGAAGGGCTACTAAAGTTGAGCCCGTACGCCAATTCAATTGGGCATAGTATCTGTGAGATAATTGCTAAGGAGTTTTGGACGTTTTTAGCTCACCATCTGAGAATTAAGATTCATGAGCACATCTTAATTCACGGGGATATCCGCAAGACTACCAAGATGGAGATAGGTGGGGAGGAGGTGGAGGTAGAAGAGTTTGTAGAAGAAGAGGATGAAGATACTGTA(配列番号:8)
表05:一例として特定の細胞を標的化するためにMCO配列の上流で使用されるプロモーター(mGluR6m)のDNA配列。
CAGGGNNGATTGATTATTGACTAGTGATCTCCAGATGGCTAAACTTTTAAATCATGAATGAAGTAGATATTACCAAATTGCTTTTTCAGCATCCATTTAGATAATCATGTTTTTTGCCTTTAATCTGTTAATGTAGTGAATTACAGAAATACATTTCCTAAATCATTACATCCCCCAAATCGTTAATC TGCTAAAGTACA(配列番号:9)
表06:一例として特定の細胞における発現を確認するためにMCO配列の下流で使用されるレポーター安定化(mCherry)のDNA配列。
ATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGGAACGGCCCGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAG TAA(配列番号:10)
表07:増強型多特性オプシン−1(e−MCO1)のアミノ酸及びDNA配列。これは、連結配列を有するMCO1配列(表01)及びバイオマーカー安定剤配列(表06)を含有する。
アミノ酸配列:
MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGSVLVPEDQCYCAGWIESRGTNGAQTASNVLQWLAAGFSILLLMFYAYQTWKSTCGWEEIYVCAIEMVKVILEFFFEFKNPSMLYLATGHRVQWLRYAEWLLTCPVICIHLSNLTGLSNDYSRRTMGLLVSDIGTIVWGATSAMATGYVKVIFFCLGLCYGANTFFHAAKAYIEGYHTVPKGRCRQVVTGMAWLFFVSWGMFPILFILGPEGFGVLSVYGSTVGHTIIDLMSKNCWGLLGHYLRVLIHEHILIHGDIRKTTKLNIGGTEIEVETLVEDEAEAGAVNKGTGKMAELISSATRSLFAAGGINPWPNPYHHEDMGCGGMTPTGECFSTEWWCDPSYGLSDAGYGYCFVEATGGYLVVGVEKKQAWLHSRGTPGEKIGAQVCQWIAFSIAIALLTFYGFSAWKATCGWEEVYVCCVEVLFVTLEIFKEFSSPATVYLSTGNHAYCLRYFEWLLSCPVILIRLSNLSGLKNDYSKRTMGLIVSCVGMIVFGMAAGLATDWLKWLLYIVSCIYGGYMYFQAAKCYVEANHSVPKGHCRMVVKLMAYAYFASWGSYPILWAVGPEGLLKLSPYANSIGHSICDIIAKEFWTFLAHHLRIKIHEHILIHGDIRKTTKMEIGGEEVEVEEFVEEEDEDTVVSKGEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIKQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVNIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYK(配列番号:11)
ヌクレオチド配列:
ATGGATTATGGCGGCGCGCTGAGCGCGGTGGGCCGCGAACTGCTGTTTGTGACCAACCCGGTGGTGGTGAACGGCAGCGTGCTGGTGCCGGAAGATCAGTGCTATTGCGCGGGCTGGATTGAAAGCCGCGGCACCAACGGCGCGCAGACCGCGAGCAACGTGCTGCAGTGGCTGGCGGCGGGCTTTAGCATTCTGCTGCTGATGTTTTATGCGTATCAGACCTGGAAAAGCACCTGCGGCTGGGAAGAAATTTATGTGTGCGCGATTGAAATGGTGAAAGTGATTCTGGAATTTTTTTTTGAATTTAAAAACCCGAGCATGCTGTATCTGGCGACCGGCCATCGCGTGCAGTGGCTGCGCTATGCGGAATGGCTGCTGACCTGCCCGGTGATTTGCATTCATCTGAGCAACCTGACCGGCCTGAGCAACGATTATAGCCGCCGCACCATGGGCCTGCTGGTGAGCGATATTGGCACCATTGTGTGGGGCGCGACCAGCGCGATGGCGACCGGCTATGTGAAAGTGATTTTTTTTTGCCTGGGCCTGTGCTATGGCGCGAACACCTTTTTTCATGCGGCGAAAGCGTATATTGAAGGCTATCATACCGTGCCGAAAGGCCGCTGCCGCCAGGTGGTGACCGGCATGGCGTGGCTGTTTTTTGTGAGCTGGGGCATGTTTCCGATTCTGTTTATTCTGGGCCCGGAAGGCTTTGGCGTGCTGAGCGTGTATGGCAGCACCGTGGGCCATACCATTATTGATCTGATGAGCAAAAACTGCTGGGGCCTGCTGGGCCATTATCTGCGCGTGCTGATTCATGAACATATTCTGATTCATGGCGATATTCGCAAAACCACCAAACTGAACATTGGCGGCACCGAAATTGAAGTGGAAACCCTGGTGGAAGATGAAGCGGAAGCGGGCGCGGTGAACAAAGGCACCGGCAAAATGGCTGAGCTGATCAGCAGCGCCACCAGATCTCTGTTTGCCGCCGGAGGCATCAACCCTTGGCCTAACCCCTACCACCACGAGGACATGGGCTGTGGAGGAATGACACCTACAGGCGAGTGCTTCAGCACCGAGTGGTGGTGTGACCCTTCTTACGGACTGAGCGACGCCGGATACGGATATTGCTTCGTGGAGGCCACAGGCGGCTACCTGGTCGTGGGAGTGGAGAAGAAGCAGGCTTGGCTGCACAGCAGAGGCACACCAGGAGAAAAGATCGGCGCCCAGGTCTGCCAGTGGATTGCTTTCAGCATCGCCATCGCCCTGCTGACATTCTACGGCTTCAGCGCCTGGAAGGCCACTTGCGGTTGGGAGGAGGTCTACGTCTGTTGCGTCGAGGTGCTGTTCGTGACCCTGGAGATCTTCAAGGAGTTCAGCAGCCCCGCCACAGTGTACCTGTCTACCGGCAACCACGCCTATTGCCTGCGCTACTTCGAGTGGCTGCTGTCTTGCCCCGTGATCCTGATCAGACTGAGCAACCTGAGCGGCCTGAAGAACGACTACAGCAAGCGGACCATGGGCCTGATCGTGTCTTGCGTGGGAATGATCGTGTTCGGCATGGCCGCAGGACTGGCTACCGATTGGCTCAAGTGGCTGCTGTATATCGTGTCTTGCATCTACGGCGGCTACATGTACTTCCAGGCCGCCAAGTGCTACGTGGAAGCCAACCACAGCGTGCCTAAAGGCCATTGCCGCATGGTCGTGAAGCTGATGGCCTACGCTTACTTCGCCTCTTGGGGCAGCTACCCAATCCTCTGGGCAGTGGGACCAGAAGGACTGCTGAAGCTGAGCCCTTACGCCAACAGCATCGGCCACAGCATCTGCGACATCATCGCCAAGGAGTTTTGGACCTTCCTGGCCCACCACCTGAGGATCAAGATCCACGAGCACATCCTGATCCACGGCGACATCCGGAAGACCACCAAGATGGAGATCGGAGGCGAGGAGGTGGAAGTGGAAGAGTTCGTGGAGGAGGAGGACGAGGACACAGTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGA C GAGCTGTACAAGTAA(配列番号:12)
Figure 0006779546
「1つ(a)」及び「1つ(an)」という用語は、本開示が明示的に他の意味であることを必要としていない限り、1つ以上であると定義される。用語「実質的に」は、当業者に理解されるように、必ずしも完全ではないが大部分は指定されているもの(及び指定されているものを含む、例えば、実質的に90度は90度を含み、実質的に平行は平行を含む)として定義される。任意の開示される実施形態では、「実質的に」、「おおよそ」、「約」という用語は、明記されているものの「〜[パーセント]以内に」と置き換えられてもよく、このパーセントは、0.1%、1%、5%、10%を含む。
更に、特定の様式で構成される分子又は方法は、少なくともその様式で構成されるが、具体的に開示されるもの以外の様式で構成されてもよい。
「〜を含む(comprise)」(及び含む(comprise)の任意の形態、例えば、「comprises」及び「comprising」)、「〜を有する(have)」(及び有する(have)の任意の形態、例えば、「has」及び「having」)、「〜を含む(include)」(及び含む(include)の任意の形態、例えば、「includes」及び「including」)及び「〜を含有する(contain)」(及び含有する(contain)の任意の形態、例えば、「contains」及び「containing」)との用語は、包括的な接続動詞である。結果として、1つ以上の要素「〜を含む(comprises)」、「〜を有する(has)」、「〜を含む(includes)」又は「〜を含有する(contains)」装置は、1つ以上の要素を含むが、1つ以上の要素のみを有することに限定されない。同様に、1つ以上の工程「〜を含む(comprises)」、「〜を有する(has)」、「〜を含む(includes)」又は「〜を含有する(contains)」方法は、1つ以上の工程を含むが、1つ以上の工程のみを有することに限定されない。
装置、システム及び方法のいずれかの実施形態が、記載されている工程、構成要素及び/又は特徴のいずれかを含む(comprise)/含む(include)/含有する/有するのではなく、これらからなるか、又は本質的にこれらからなっていてもよい。したがって、特許請求の範囲のいずれかにおいて、「〜からなる」又は「本質的に〜からなる」は、その他の様式で包括的な接続動詞を用いる所与の特許請求の範囲を変えるために、上に引用した包括的な任意の接続動詞で置き換えることができる。
記載されておらず、示されていない場合であっても、本開示によって明示的に禁止されていない限り、又は実施形態の性質から明示的に禁止されていない限り、ある実施形態の1つ以上の特徴を他の実施形態に適用してもよい。以下、ここに開示する発明を、単なる説明のために与えられる実施例として更に記載するが、したがって、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
いくつかの参考文献は、刊行物、特許及び特許明細書を含んでいてもよく、
本発明の記載に引用され、記載されている。このような参考文献の引用及び/又は説明は、単に、本発明の説明を明確にするために与えられており、このような任意の参考文献が、本明細書に記載する本発明の「従来技術」であることを認めたものではない。本明細書で引用され、記載される全ての参考文献は、その全体が本明細書に参考として組み込まれ、それぞれの参考文献が、個々に参考として組み込まれるのと同じ程度まで、組み込まれる。
本明細書及び実施例は、実例となる実施形態の構造及び使用の完全な説明を与える。特定の具体性をもって、又は1つ以上の個々の実施形態を参照しつつ、特定の実施形態を記載してきたが、当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、開示された実施形態の多くの改変を行うことができる。このように、デバイスの種々の実例となる実施形態を、開示される特定の形態に限定することは意図していない。むしろ、特許請求の範囲に入る全ての改変及び代替を含み、示されているもの以外の実施形態は、示されている実施形態の特徴の一部又は全てを含んでいてもよい。例えば、構成要素は、省略されてもよく、又は単一の構造として合わされてもよく、及び/又は接続が置換されてもよい。更に、適切な場合、匹敵する特性又は異なる特性を有し、同じ問題又は異なる問題に対処する更なる実施例を作り出すために、上に記載されるいずれかの実施例の態様を、記載される任意の他の実施例の態様と組み合わせてもよい。同様に、上に記載した長所及び利点は、1つの実施形態に関連していてもよく、又はいくつかの実施形態に関連していてもよいことが理解されるだろう。
更に、特許請求の範囲は、「〜のための手段」又は「〜のための工程」という句をそれぞれ用い、所与の特許請求の範囲にこのような限定が明示的に引用されていない限り、ミーンズプラスファンクション又はステッププラスファンクションの限定を含むことを意図しておらず、また、含むと解釈すべきではない。
参考文献又は他の文献の具体的な開示内容が、本発明の任意の一般的な態様を予測するために考慮され得る程度まで、本発明の開示は、既に開示したこのような任意の種を放棄するという条件で含まれることを理解すべきである。本発明の態様は、このような文献の開示内容によって予測されないが、本明細書に開示された予想できない優れた結果の少なくとも一部分によって、これらの刊行物の開示内容から自明でもない。
特許請求の範囲のそれぞれについては、先行の請求項が請求の用語又は要素に関して適切な記載を先に提供している限り、それぞれの従属請求項は、独立請求項にも、また、それぞれの請求項に対する先行の従属請求項のそれぞれにも従属し得る。
参考文献
以下の参考文献は、上述のものに対する補助的な例示的な手順又は他の詳細を与える程度まで、具体的に参考として組み込まれる。
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Claims (20)

  1. イオン選択性、光感受性又は動態を調節する、1つ以上の単一の変異又は変異の組み合わせを含む、配列番号1を有する組換え周辺光活性化可能な高速多特性オプシンタンパク質、ここで、前記変異は、少なくとも以下のうちの1つから選択される:
    配列番号1を有する多特性オプシンタンパク質のアミノ酸132に対応するアミノ酸残基におけるSからCへの置換;
    配列番号1を有する多特性オプシンタンパク質のアミノ酸123に対応するアミノ酸残基におけるEからAへの置換;
    配列番号1を有する多特性オプシンタンパク質のアミノ酸253に対応するアミノ酸残基におけるDからAへの置換;
    配列番号1を有する多特性オプシンタンパク質のアミノ酸120に対応するアミノ酸残基におけるRからAへの置換;
    配列番号1を有する多特性オプシンタンパク質のアミノ酸56に対応するアミノ酸残基におけるQからAへの置換;
    配列番号1を有する多特性オプシンタンパク質のアミノ酸93に対応するアミノ酸残基におけるKからAへの置換;
    配列番号1を有する多特性オプシンタンパク質のアミノ酸90に対応するアミノ酸残基におけるEからAへの置換;
    配列番号1を有する多特性オプシンタンパク質のアミノ酸90に対応するアミノ酸残基におけるEからQへの置換;
    配列番号1を有する多特性オプシンタンパク質のアミノ酸97に対応するアミノ酸残基におけるEからAへの置換;
    配列番号1を有する多特性オプシンタンパク質のアミノ酸101に対応するアミノ酸残基におけるEからAへの置換;
    配列番号1を有する多特性オプシンタンパク質のアミノ酸258に対応するアミノ酸残基におけるNからDへの置換;
    配列番号1を有する多特性オプシンタンパク質のアミノ酸83に対応するアミノ酸残基におけるEからTへの置換;
    配列番号1を有する多特性オプシンタンパク質のアミノ酸123に対応するアミノ酸残基におけるEからTへの置換;又は
    配列番号1を有する多特性オプシンタンパク質のアミノ酸63に対応するアミノ酸残基におけるSからDへの置換。
  2. 配列番号3を有する組換え周辺光活性化可能な低速多特性オプシンタンパク質であって:
    14回膜貫通ドメインを含み;
    309〜315の7つのアミノ酸残基(VNKGTGK)は、膜上の遺伝子発現を改善するために請求項1に記載の前記タンパク質中で欠失しており;
    S132L変異は、網膜への結合親和性及び光感受性を向上させるため、配列番号1の膜貫通ドメイン2において実施され;
    前記オプシンは、658個のアミノ酸でコードされ;及び
    多特性オプシン感作細胞は、白色光のパルスに対する初期の高速電流応答後に、ゆっくりと減衰する内向き電流を生成する;
    タンパク質。
  3. 単一の変異又は変異の組み合わせが、前記タンパク質のイオン選択性、光感受性又は動態のうちの少なくとも1つを更に調節する、配列番号3のE473A、E603A、L469Aから選択される、請求項2に記載のタンパク質。
  4. 膜貫通配列(TPARWVWISLYYAAFYVVMTGLFALCIYVLMQTI)が、配列番号5を有する多特性オプシン中のアミノ酸残基315の後に挿入される、又は膜貫通配列(PARWVWISLYYAAFYVVMTGLFALCIYVLMQTI)が、配列番号7を有する多特性オプシン中のアミノ酸残基308の後に挿入される、請求項1〜3の何れか一項に記載のタンパク質。
  5. 配列番号11を有する組換え周辺光活性化可能な高速増強型多特性オプシン;又はアミノ酸132に相当するアミノ酸残基でSがCに置換される変異を有する、アミノ酸304、308に相当するアミノ酸残基でSがAに置換される変異を有する、及びアミノ酸610に相当するアミノ酸残基でEがDに置換される変異を有する、配列番号1を含む、配列番号11を有する組換え周辺光活性化可能な高速増強型多特性オプシン。
  6. 配列番号10のDNA配列から翻訳される、227個のアミノ酸である安定化バイオマーカー:
    ここで、前記安定化バイオマーカーが、連結配列によって配列番号1を有する多特性オプシンの下流に接続されている;
    ここで、前記安定化バイオマーカーが、配列番号1を有する非改変多特性オプシンと比べて、膜におけるより高い割合のβシート及びより低い割合の不規則構造を有する配列番号11を有する多特性オプシンの発現を安定化させ、かつ、より開裂しにくい;
    ここで、前記安定化バイオマーカーが、膜を横切る配列番号11を有する多特性オプシンタンパク質のより良好な配向安定化によって、配列番号11を有する多特性オプシンタンパク質を発現する細胞中の光誘導性電流を増強する;
    ここで、前記安定化バイオマーカーが、前記安定化バイオマーカー分子から放出又は再放出される光によって、配列番号11を有する多特性オプシンタンパク質を発現する細胞中の光誘導性電流を増強する;
    ここで、プロモーターが、特定の細胞を標的にするために、配列番号11を有する多特性オプシンタンパク質をコードする配列番号12を有する遺伝子の上流で使用される;
    ここで、前記配列番号12を有する遺伝子が、ウイルスベクターにパッケージングされる;
    ここで、細胞が、化学的、ウイルス的又は物理的トランスフェクションを使用して、前記配列番号12を有する遺伝子でトランスフェクトされることがある;
    ここで、網膜における安定化バイオマーカーを含有する配列番号11を有する多特性オプシンの発現の検査(眼底検査による)が、標的組織への遺伝子送達の有効性を判定するための指標である;
    ここで、前記安定化バイオマーカーによって放出又は再放出される光が、配列番号11を有する多特性オプシンの発現の存在を判定するために使用される;又は
    ここで、配列番号11を有する多特性オプシンの発現の喪失が、標的細胞に再び光感受性を与える又は標的細胞を機能させるために、前記配列番号12を有する遺伝子の再送達を必要とする;
    のうちの少なくとも1つを更に含む、請求項5に記載の組換えタンパク質。
  7. 細胞発現/活性化を検出するために、配列番号1若しくは5を有する多特性オプシン、配列番号3若しくは7を有する多特性オプシン、又は配列番号11を有する多特性オプシンをコードする遺伝子の下流にレポーター遺伝子があることを更に含み、ここで、前記多特性オプシンをコードする遺伝子と並んでいる前記レポーター遺伝子は、ウイルスベクターにパッケージングされ;及び細胞は化学的、ウイルス的又は物理的方法のいずれかを使用して前記多特性オプシンをコードする遺伝子と並んでいる前記レポーター遺伝子によってトランフェクトされ得る、請求項1〜5の何れか一項に記載の組換え多特性オプシンタンパク質。
  8. 多特性オプシン感作細胞が、光に対して高い感受性を有し、低強度(〜0.02mW/mm)の周辺光で活性化される、請求項1〜7の何れか一項に記載のタンパク質。
  9. 多特性オプシン感作網膜細胞が、野生型光受容体桿体信号と同様の白色光に対する初期応答後に、より低速な脱分極相を生成する、請求項2〜4の何れか一項に記載のタンパク質。
  10. 前記オプシンが、可視及び近赤外範囲の光の任意の波長に感受性がある、請求項1〜7の何れか一項に記載のタンパク質。
  11. 前記オプシンが、可視及び近赤外範囲内に、蛍光、燐光、アップ/ダウン変換のうちの少なくとも1つを含む直接及び間接の照明光によって活性化される、請求項1〜7の何れか一項に記載のタンパク質。
  12. 光受容体が喪失される、若しくは光受容体の機能が喪失される、又は光誘導性信号の伝達が喪失されることから生じる喪失又は低下した視力を回復させる際に使用するための、請求項1〜7の何れか一項に記載のタンパク質。
  13. 光受容体が喪失される、又は光受容体の機能が喪失されることによる視力喪失が、何らかの変性網膜疾患によるものである;
    標的細胞への組換え多特性オプシン遺伝子の送達は、送達効率を高めるためのプロナーゼE若しくはα−アミノアジピン酸(AAA)又はその両方と組み合わせた、眼内のプロモーター−多特性オプシン遺伝子を担持するウイルスの硝子体内又は網膜下注射によって実施される;
    前記多特性オプシン遺伝子の送達は、眼内のプロモーター−多特性オプシン遺伝子プラスミドの硝子体内又は網膜下注射に続く、化学的若しくは物理的形質導入方法又はこれらの組み合わせによって実施される;
    プロモーター−多特性オプシン遺伝子を担持するウイルス又は前記プロモーター−多特性オプシン遺伝子プラスミドの、眼内への送達は、内境界膜の剥離が先行する;
    眼内への前記多特性オプシン遺伝子の送達は、非標的細胞及び器官における望まれない発現、又は治療された眼内における何らかの有害反応若しくは細胞毒性のいずれも引き起こさない;
    多特性オプシン遺伝子の送達後に、視覚的に誘導された有意な行動改善が観察される;又は
    前記多特性オプシン遺伝子の再注射及びトランスフェクションは、多特性オプシン遺伝子発現不足の場合に実施される;
    請求項12に記載のタンパク質。
  14. 前記多特性オプシンタンパク質をコードする遺伝子の送達は、進行性の光受容体の喪失の間に網膜細胞に対して実施され;多特性オプシン感作網膜細胞の光刺激は、前記光受容体の喪失を防止又は遅延させるために実施され;及び、光刺激用量は、最大効果のために最適化される、視力喪失を防止又は遅延させる際に使用するための請求項1〜7の何れか一項に記載の組換えタンパク質。
  15. 前記多特性オプシンタンパク質をコードする遺伝子の送達が、軸索変性の間又はその後に網膜神経節細胞に対して実施され;多特性オプシン感作RGCの光刺激は、前記軸索の変性速度を遅延させ、かつ/又は前記軸索を再生するために実施され;並びに、光刺激用量は、前記変性を最小限に抑えるかつ/又は前記軸索再生を最大化するために最適化される;
    損傷したRGC軸索を再生することによって視力を回復させる際に使用するための請求項1〜7の何れか一項に記載のタンパク質。
  16. ニューロン、心臓細胞を含む様々な種類の興奮性細胞を刺激する際に使用するための請求項1〜7の何れか一項に記載のタンパク質:
    ここで、前記使用は、化学的、ウイルス的又は物理的形質導入方法のいずれかによる前記多特性オプシンタンパク質をコードする遺伝子の送達を含み;
    ここで、多特性オプシンの活性化は、光の照明時に達成され;及び
    ここで、その効果は、電気/光生理学的に測定される。
  17. 興奮性及び抑制性細胞の機能不全又は活動過剰を含む疾患を治療する際に使用するための請求項1〜7の何れか一項に記載のタンパク質:
    ここで、前記使用は、化学的、ウイルス的又は物理的形質導入方法のいずれかによる異なる器官への前記多特性オプシンタンパク質をコードする遺伝子の送達を含み;
    ここで、多特性オプシンの活性化は、光の照明時に達成され;及び
    ここで、効果は、電気生理学的又は他の機能的及び行動的分析によって測定される。
  18. 配列番号1、3、5、7又は11のうちの少なくとも1つのタンパク質の光感受性特性を呈する、前記配列番号1、3、5、7又は11に対して少なくとも90%以上の同一性を含む配列を含む、ポリペプチド。
  19. 配列番号2、4、6、8又は12のうちの少なくとも1つを有する、請求項18に記載のポリペプチドをコードする組換え核酸。
  20. アデノウイルス、アデノ関連ウイルス又はレンチウイルスベクターから選択される、請求項19に記載の核酸を含むベクター。
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