KR20100136633A

KR20100136633A - 개의 베타-신경 성장 인자 및 이를 함유하는 개의 신경손상 관련 질환 치료용 수의학적 조성물

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Publication number: KR20100136633A
Application number: KR1020090054805A
Authority: KR
Inventors: 윤화영; 정진영
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2009-06-19
Filing date: 2009-06-19
Publication date: 2010-12-29

Abstract

본 발명은 개의 β-NGF(nerve growth factor) 유전자, 상기 유전자를 함유하는 유전자 전달체를 유효성분으로 포함하는 개의 신경손상 관련 질환 치료용 수의학적 조성물 및 개의 β-NGF 유전자를 함유하는 유전자 전달체를 개에게 투여함으로써 개의 신경손상 관련 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

β-NGF, 개, 신경손상, 신경병증

Description

개의 베타-신경 성장 인자 및 이를 함유하는 개의 신경손상 관련 질환 치료용 수의학적 조성물{Dog β-nerve growth factor and veterinary composition for treatment of diseases related to neuronal injury of dog containing the same}

신경 손상의 치료에 대한 많은 연구가 진행되어 있다. 그 중에서, 유전자 치료법은 손상 및 기능 회복의 증진에 대한 병리학적 반응에서 중요한 잠재력을 가지고 있다.

신경 손상의 유전자 치료법에서는, 다양한 신경영양 인자(neurotrophic factor), 벡터 및 동물 모델이 고려될 필요가 있다. 신경보호 유전자 전달에 대한 종래의 많은 연구에서는 단순포진 타입 I 바이러스(herpes-simplex type I virus) 및 아데노바이러스와 같은 바이러스 벡터가 이용되었다. 다양한 신경계의 신경병증 중에서, 말초의 신경병증은 운동, 감각 및 교감신경(sympathetic) 결함을 특징으로 한다. 감각 신경 병증은 종종 당뇨병, 항암제 치료 및 대사 질환과 관련이 있다. 감각 신경 병증의 유도를 위해, 시스플라틴, 탁솔 및 아크릴아미드와 같은 다양한 약물이 이용되어 왔다. 신경 성장 인자(nerve growth factor, NGF) 및 뇌 유래 신경영양 인자인 neurotrophin-3과 같은 유전자 치료법에 이용될 많은 신경영양 인자가 있다.

신경 성장 인자(NGF)는 다른 뉴로트로핀(neurotrophin)과 함께 감각 및 교감신경의 생존과 성숙에 필수적인 성장 인자 중 하나로서 인식되고 있다. NGF는 3개의 서브유니트 α, β 및 γ로 구성되고, 약27kDa의 7S 복합체를 형성하고 있다. 이 복합체는 NGF의 영양적 활성에 온전히 관여하는 두 개의 동일한 118개 아미노산 β쇄를 포함하고 있다.

사람에서, 많은 신경퇴행 질환이 있고, 신경영양 인자로 상기 질환을 치료하려는 많은 시도가 있어왔다. 수의학 분야에서도, 많은 신경퇴행 질환이 존재하지만, 적절한 치료법을 동정하기 위해 더 많은 연구가 진행되어야 한다. 일부 동물에서 임상 실험에 필수적인 종 특이적 β-NGF 서열이 확립되었다. 그러나, 개의 β-NGF의 기능에 대해서는 알려진 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 개의 β-NGF(nerve growth factor)의 기능을 확립하기 위해, 개의 β-NGF 유전자를 클로닝하고, 이를 함유하는 사이토메갈로바이러스를 경막내 투여를 통해 개에게 투여한 후 피리독신으로 신경병증을 유도한 결과 β-NGF가 피리독신에 의한 신경퇴행을 억제함을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 한 목적은 개의 β-NGF 유전자를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 개의 β-NGF 유전자를 함유하는 유전자 전달체를 유효성분으로 포함하는 개의 신경손상 관련 질환 치료용 수의학적 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 개의 β-NGF 유전자를 함유하는 유전자 전달체를 개에게 투여하는 단계를 포함하는 개의 신경손상 관련 질환의 치료방법을 제공하는데 있다.

본 발명에서, '개의 β-NGF(β-nerve growth factor) 유전자'는 서열번호: 1에 나타낸 염기서열로 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 개의 β-NGF 유전자의 범위는 개로부터 분리된 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 유전자 및 상기 유전자의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 염기의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 적어도 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 유전자와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 유전자를 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 β-NGF 본래의 생리활성을 유지 및 발휘함을 의미한다.

상기 유전자는 당업계에 공지된 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 상기된 β-NGF 유전자 서열을 참조하여 프라이머를 제조한 후 개의 게놈 DNA를 주형으로 하는 PCR을 실시함으로써 제조할 수 있다. 또한, 상기된 β-NGF 유전자 서열을 참조하여 화학적 합성법 또는 DNA 자동 합성 장치를 이용하여 합성할 수도 있다.

본 발명에서, 'β-NGF를 함유하는 유전자 전달체'는 당해 분야에 공지된 재조합 DNA 방법을 참조하여 작제될 수 있다.

본 발명에서, β-NGF 유전자를 세포로 전달하기에 유용한 바이러스 (또는 바이러스 벡터)로는 아데노바이러스(adenovirus), 아데노부속바이러스(adeno-associated virus), 레트로바이러스(retrovirus), 렌티바이러스(lentivirus), 단순포진바이러스(herpes simplex virus), 알파바이러스(alpha virus), 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 등이 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에서 β-NGF 유전자를 세포로 전달하기에 유용한 비바이러스 벡터로는 전술한 바이러스 벡터를 제외한 통상적으로 유전자의 세포내 전달에 사용되는 모든 벡터를 의미하며, 그러한 예로는 진핵세포에서 발현 가능한 다양한 플라스미드 및 리포좀 등이 있다.

한편, 본 발명의 β-NGF를 함유하는 유전자 전달체는 상기 β-NGF 유전자가 세포내에서 전사되도록 하기 위해서 프로모터에 작동가능하게 연결되어야 할 것이다. 프로모터는 RNA 중합효소에 대한 결합 부위를 포함하고, 암호화 영역의 상류(upstream)에 위치할 수 있다. 상기 프로모터는 진핵세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터라면 어떤 것이든지 무방하나, 바람직한 프로모터는 CMV(Cytomegalovirus), SV40(Simian virus 40), TK(Thymidine kinase), RSV(Respiratory syncytial virus), CMV5 등으로부터 유래된 프로모터이다.

또한, 본 발명의 β-NGF를 함유하는 유전자 전달체는 진핵세포의 복제원점을 포함할 수 있으며, β-NGF를 암호화하는 핵산분자의 효율적인 전사 또는 해독을 위하여 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 코작(Kozak), 인핸서, 막 표적화 및 분비를 위한 신호서열, IRES(Internal Ribosome Entry Site) 등으로 이루어진 조절서열을 포함할 수 있다.

여기서, 이용된 용어 '작동가능하게 연결된'이란 핵산 서열간의 결합이 기능적으로 연관되어 있는 것을 의미한다. 임의의 핵산서열이 작동가능하게 연결된 경우는 임의의 핵산서열이 다른 핵산서열과 기능적으로 관련성을 가지도록 위치해 있는 경우이다. 본 발명에 있어서, 임의의 전사 조절서열이 β-NGF를 암호화하는 핵산분자의 전사에 영향을 미치는 경우, 상기 전사 조절서열이 상기 핵산분자와 작동가능하게 연결되어 있다고 말한다.

본 발명의 β-NGF를 함유하는 유전자 전달체를 세포로 도입하는 방법은 공지 기술을 토대로 실시될 수 있으며, 예를 들면 칼슘 포스페이트 형질감염(calcium phosphate transfection), DEAE-덱스트란 매개 형질감염(DEAE-dextran mediated transfection), 양이온 지질-매개 형질감염(cationic lipid-mediated transfection) 등이 이용될 수 있다.

본 발명에서 '신경손상 관련 질환'은 이에 제한되는 것은 아니지만, 퇴행성 신경질환 및 신경병증을 예시로 들 수 있다. 상기 신경병증은 특히 감각 신경병증일 수 있다.

본 발명의 수의학적 조성물은 수의학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 부형제 및 희석제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 수의학적 조성물에 포함될 수 있는 부형제 및 희석제로는, 락토스, 텍스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 세탄올, 스테아릴알코올, 유동파라핀, 솔비탄모노스테아레이트, 폴리소르베이트 60, 메틸파라벤, 프로필파라벤 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 수의학적 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향신료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 의한 수의학적 조성물은 동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 좌제, 멸균 주사용액, 멸균 외용제 등의 형태일 수 있다. 이렇게 제형화된 본 발명의 수의학적 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥, 경막 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다.

본 발명의 수의학적 조성물은 동물의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.1 내지 100mg/kg의 양을 1일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 또한, β-NGF의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라 증감될 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 의하면, 개의 β-NGF는 피리독신에 의해 유도된 신경병증, 특히 감각 신경의 퇴행을 억제함으로써, 개의 β-NGF는 신경손상과 관련된 각종 질환을 치료하는데 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1: 재료 및 방법>

1-1. 개 β-NGF의 클로닝

건강한 성체 수컷 잡종견의 편도 조직으로부터 게노믹 DNA를 DNeasy Tissue Kit(Qiagen, Germany)를 이용하여 추출하였다. 사람 및 마우스 β-NGF 유전자를 이용하여 프라이머를 제작하여 dβ-NGF의 일부 서열을 증폭하였다. 프라이머 NGF-1F(5'-TCAGCATTCCCTTGACACWG-3'-서열번호: 3) 및 NGF-1R(5'-AGCCTTCCTGCTGAGCAC-3'-서열번호: 4)을 이용한 PCR은 94℃에서 1분, 44℃에서 1분 및 72℃에서 1분의 조건으로 35회 수행하였다(도 1). 또한, 프라이머 NGF-2F(5'-AGTTCTCGGTGTGCGACAG-3'-서열번호: 5) 및 NGF-2R(5'-GCCCAGGAGAGTGTGGAG-3'-서열번호: 6)을 이용한 PCR은 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 1분의 조건으로 35회 수행하였다(도 1). 프라이머 NGF-1F 및 NGF-1R을 이용하였을 때 약 600bp의 PCR 산물이, 프라이머 NGF-2F 및 NGF-2R을 이용하였을 때 약 400bp의 PCR 산물이 예상되었다. 프라이머 NGF-1F 및 NGF-2R을 이용해서 오버랩핑(overlapping) PCR을 실시하여 부분적 dβ-NGF의 PCR 산물을 조합하였다. 이 오버랩 PCR은 94℃에서 1분, 58℃에서 1분 및 72℃에서 1분의 조건으로 35회 수행하였다. 이 PCR 산물의 크기는 1.5% 아가로스 겔 전기영동을 이용하여 약 660bp(pcDNA1)임을 확인하였다. pcDNA1의 클로닝은 pCR2.1 벡터(Invitrogen, USA)로 수행하였고, 플라스미드 DNA는 Escherichia coli TOP10 세포(Invitrogen, USA)로부터 플라스미드 정제 키트(NucleoGen Biotechnology, Korea)를 이용하여 추출하였다. 상기 플라스미드는 Takara-Korea Biomedical Inc.에 의해 서열분석되었다. 남은 dβ-NGF DNA는 추정 된 개(Canis familiaris)의 신경 성장 인자 베타의 서열을 기초로 인공적으로 합성하였다(GeneBank sequence entry XM_540250; NCBI, USA)(도 1에서 네모 박스로 표시된 염기 서열). 오버랩핑 PCR을 수행하여 합성된 올리고뉴클레오타이드와 pcDNA1을 조합하였다. 5'-GGCAGATCTATGTCCATGTTG-3'(서열번호: 7) 서열을 갖는 센스 프라이머(Bgl2 + NGF-F) 및 5'-GGAGAATTCTCAGGCTCGTTCT-3'(서열번호: 8) 서열을 갖는 안티센스 프라이머(EcoRI + NGF-R)가 상기 오버랩 PCR에 이용되었다. 센스 프라이머는 BglII(TaKaRa Bio, Japan) 제한부위를 가지며 안티센스는 EcoRI (TaKaRa Bio, Japan) 제한부위를 갖는다. PCR은 94℃에서 1분, 53℃에서 1분, 72℃에서 1분의 조건으로 35회를 수행하였다. 수득된 PCR 산물은 725bp(pcDNA2)일 것으로 예상되었다. pcDNA2를 클로닝하고 뉴클레오타이드 서열을 분석하였다. pcDNA2 클론은 pdβ-NGF(presumed dog β-NGF)로 명명되었다.

1-2. 재조합 pdβ-NGF 플라스미드의 작제

재조합 pdβ-NGF(rpdβ-NGF) 플라스미드를 작제하는데 CMV 벡터(phCMV1; Gene Therapy Systems, USA)를 이용하였다. phCMV 벡터 및 pcDNA2를 BglII 및 EcoRI 제한 효소로 소화시키고 1.5% 아가로스 겔에서 분리한 후 정제하였다. 정제된 phCMV1 및 pcDNA2의 라이게이션은 T4 DNA 리가제(TaKaRa Bio, Japan)를 이용하여 수행하였다. rpdβ-NGF 플라스미드를 Escherichia coli TOP10 세포로 형질전환하고 DNA는 플라스미드 정제 키트로 추출하였다.

1-3. 재조합 pdβ-NGF의 생산

형질감염을 위해 준비한 rpdβ-NGF 플라스미드 및 분리한 phCMV1 벡터 플라스미드는 단백질, RNA 및 화합물의 오염이 없고(A₂₆₀/A₂₈₀의 비율 1.9) 0.4mg/ml의 최종 농도를 보였다.

양이온 리포좀 매개 형질감염 기술(Gene therapy systems, USA)을 수행하여 두 개의 플라스미드를 CHO(Chinese hamster ovary)(Korean Cell Line Bank, Korea) 세포에 전달하였다. 형질감염 후 4일째에 상층액을 회수하여 0.22-㎛ 필터(Millipore, USA)로 여과시켰다.

1-4. 재조합 pdβ-NGF 단백질 측정 및 생물학적 검정(bioassay)

pdβ-NGF 단백질 양은 Duoset ELISA(Enzyme-Linked Inmmunosorbent Assay) development system(R&D Systems, USA)을 이용하여 측정하였다. 상기 시스템은 검출 항체로서 항-사람 β-NGF를 이용하는 샌드위치 ELISA를 사용하고 제조업자의 설명서에 따라 수행하였다. pdβ-NGF 단백질의 생활성은 레트의 크롬친화세포종(pheochromocytoma) 세포주(PC12 세포; Seoul National University, Korea)를 이용하여 측정하였다. PC12 세포를 24구 조직 배양 플레이트(Falcon, USA)에 5 x 10⁴ 세포/ml의 밀도로 플레이팅하였다. rpdβ-NGF-형질감염 CHO 세포의 상층액 1ml를 PC12 세포에 첨가하였다. CMV로 형질감염된 CHO 세포의 상층액을 음성 대조군으로 이용하였다. PC12 세포는 현미경을 통해 매일 모니터링되었다.

1-5. 동물

약 2연령의 10 마리 잡종견(5마리 수컷 및 5마리 암컷)이 본 실시예에서 이용되었다. 체중은 4 내지 6kg이었다. 이들 중에서 2 마리는 음성 대조군에, 4 마리는 양성 대조군에, 4 마리는 유전자 치료를 이용한 실험군에 배치하였다. 모든 개는 임상적으로 양호한 건강 상태인 것으로 판정되었고, 신경학적으로 정상이고, Institute of Laboratory Animal Resources, Seoul National University (SNU-060623-1)로부터 고유의 허가 번호를 부여받았다. 실험 기간 동안 모든 개는 동물 관리 및 이용 지침서(Institute of Laboratory Animal Resources, Seoul National University)에 따라 관리되었다. 검사 견의 체중은 검사 기간 동안 매일 아침 측정하였다.

1-6. 개에서 유전자 형질감염

rpdβ-NGF를 포함한 CMV 벡터를 앞서 준비하였다. 이 플라스미드를 경막내 영역으로 전달하는데 양이온 중합체 형질감염 시약(Polyplus transfection, France)을 이용하였다. 각 플라스미드는 in vivo-jetPET-Gal 시약을 이용하여 10-N/P 비율(복합체의 이온 밸런스 측정값)로 농축하였다. 첫 번째, 준비된 플라스미드를 200㎕의 5%(w/v) 글루코오스로, 적절한 양의 in vivo-jetPET-Gal 시약을 200㎕의 5%(w/v) 글루코오스에 희석하였다. 두 번째, 200㎕의 in vivo-jetPET-Gal 용액을 플라스미드 용액에 첨가한 후 실온에서 15분간 정치하였다. 세 번째, 그 혼 합물을 유전자 치료군의 개(n=4)에게 경막내 주입을 통해 27-게이지(gauge) 바늘을 이용하여 주입하였다. 이 투여 전에, 유전자 치료군의 개는 졸레틸(zoletil)로 마취시켰다.

1-7. 피리독신 중독

벡터 접종 후 24시간째에 유전자 치료군(n=4)과 양성 대조군(n=4)의 개를 피리독신(Sigma, France)으로 중독시켰다. 피리독신 주입 전 즉시 증류수에 조제하고(100mg/ml), 7일 동안 하루에 한번 아침에 피하로 150mg/kg의 양으로 투여하였다. 음성 대조군의 개(n=4)에게는 비히클(염화나트륨의 등장성 멸균 수용액)을 공급하였다.

1-8. 체위 반응 측정

체위 반응(wheelbarrowing, hopping, extensor postural thrust, placing, tonic neck reaction and proprioceptive positioning) 측정이 검사 기간 동안 매일 아침 모든 개에게 수행되었다.

1-9. 전기생리학적 기록

모든 개를 아트로핀(0.1mg/kg 체중, 근육 주사)으로 전마취시켰다. 마취는 디아제팜(diazepam)으로 유도하고 반폐쇄식법(semiclosed system)을 통하여 이소플루란(isoflurane)으로 유지시켰다. 피하 온도를 37~38℃로 유지시켰다. 모든 기 록 동안에 Neuropack2(Nihon Kohden, Japan)가 이용되었다. 모든 측정은 왼쪽 뒷다리에서 수행되었다. 경골 신경에 대해 최대상 자극 1Hz, 0.5ms를 이용하여 M 파동이 기록되었다. 자극 전위는 원위 경골 신경에 위치시켰다. 기록 전위는 발바닥 골간(interosseous) 근육에 위치시켰다. 접지 전극을 자극 전위와 기록 전이 사이에 위치시켰다. 기록 전위는 양극성 바늘 전위이었다. 호프만 리플렉스(Hoffman(H)-reflex)는 최대상 자극 1Hz, 0.5ms를 이용하여 기록되었다. 자극 전위는 후크(hook) 근처의 경골 신경에 위치시키고 기록 전위와 접지 전위는 경골의 M 파동이 측정되는 위치와 동일한 위치에 위치시켰다. 모든 측정은 적어도 8회 수행되었다. 전기생리학적 기록은 실험 전 한차례 실험 기간 후 한 차례로, 총 2회 수행되었다.

1-10. 형태학적 분석

실험 기간 후(실험 시작일로부터 10일째), 개를 고용량의 틸레타민(Tiletamine)/졸라제팜(zolazepam) 및 프로포폴(propofol)로 마취시키고, 0.1M의 PBS(phosphate-buffered saline)로 경막내 주입(perfusion) 후 0.1M PBS에 녹인 4% 파라포름알데히드로 안락사를 유도하였다. 주입 후, 조직(허리 척추 (L₄), L₄의 좌우측 후근절 및 좌골 신경)을 신속히 제거하여 동일한 고정제에서 4~6시간 동안 후고정시킨 후 파라핀으로 포매하였다. 조직을 박절기(Reichert-Jung, Germany)를 이용하여 5㎛의 두께로 연속적으로 절편을 만들고 젤라틴 코팅된 슬라이드 상에 부유 시켰다. 이어서, 절편을 자일렌에서 탈파라핀화시킨 후 농도가 감소하는 일련의 에탄올에서 재수화시킨 다음 헤마톡실린과 에오신으로 염색하였다. 절편을 IMT2000 디지털 카메라(iMTechnology, Korea)가 부착된 Olympus BX51 현미경(Olympus, Japan)을 이용하여 관찰하고 이미지는 IMT200을 통해 Adobe Photoshop 버전 6.0 소프트웨어를 이용하여 캡쳐하였다.

<실시예 2: 결과>

2-1. 생체외(in vitro) 실험

뉴클레오타이드 서열 분석 결과, pcDNA1에 클로닝된 유전자는 다른 포유류의 β-NGF 유전자와 높은 정도의 서열 상동성을 보였다. pcDNA1 서열은 사람(GeneBank sequence entry NM_002506;NCBI, USA) 및 마우스(GeneBank sequence entry NM_013609;NCBI, USA)의 β-NGF와 각각 86% 및 83% 서열 상동성을 공유하였다. 인공적으로 합성된 dβ-NGF DNA의 남은 부분은 dβ-NGF ORF(open reading frame)의 5' 영역에 속하고 132 bp를 포함한다. 오버랩핑 PCR을 수행하여 합성된 올리고뉴클레오타이드와 pcDNA1을 조합하였고, 수득된 PCR 산물은 725bp(pcDNA2)이었다. 다시, 뉴클레오타이드 서열 분석은 클론된 유전자가 다른 포유류의 β-NGF 유전자와 높은 정도의 서열 상동성을 가짐을 보여주었다. pcDNA2 클론은 pdβ-NGF(presumed dog β-NGF)(도 1)(서열번호: 1)로 명명되었다. 합성된 올리고뉴클레오타이드 서열이 추가되면서, 사람(GeneBank sequence entry NM_002506;NCBI, USA) 및 마우스(GeneBank sequence entry NM_013609;NCBI, USA)의 β-NGF와 비교하였을 때 상동성이 각각 85% 및 81%로 감소되었다. 추정된 pdβ-NGF의 아미노산 서열(서열번호: 2)은 사람(GeneBank sequence entry NM_002506;NCBI, USA) 및 마우스(GeneBank sequence entry NM_013609;NCBI, USA)와 각각 90% 및 82% 상동성을 보였다.

CHO 세포로의 형질감염 후 4일째에 pdβ-NGF 단백질을 상층액으로부터 수득하였다. 여과된 상층액은 사람 β-NGF를 이용한 샌드위치 ELISA로 측정되었다. 그 결과, 상층액에 53pg/ml의 pdβ-NGF 단백질이 존재함을 확인하였다. pdβ-NGF 단백질의 생활성은 래트 크롬친화세포종 세포주(PC12 세포; Seoul National University, Korea)를 이용하여 측정되었다. 여과된 상층액으로의 치료 후 7일째에, 작은 개수의 PC12 세포는 신경돌기 증식을 보인 반면에, 음성 대조군의 PC12 세포는 고유한 형태를 유지하였다(도 2).

2-2. 생체내(In vivo) 실험

체중 측정 결과, 양성 대조군에서만 체중 감소가 있었다. 음성 대조군 또는 유전자 치료군에서는 체중 변화가 없었다. 양성 대조군에서 체중 차이는 통계적으로 유의적이었다(p<0.05). 음성 대조군과 유전자 치료군에서 체중 차이는 통계적으로 유의적이지 않았다(p<0.05).

양성 대조군의 모든 개는 먼저 그리고 두드러지게 후사반부(hindquarter)를 포함한 운동실조를 특징으로 하는 신경 질환을 보였다. 양성 대조군의 모든 개는 피리독신 주입 후 3일째에 체위 반응 검사(wheelbarrowng, hopping, extensor postural thrust, placing, tonic neck reaction and proprioceptive positioning)에 의해 확인된 바와 같이 후사반부를 포함한 고유감각의(proprioceptive) 비정상을 보이기 시작하였다. 피리독신 주입 4일째에, 모든 개는 서있을 때 뒷다리를 뻣뻣하게 지탱하였다. 이러한 상황은 피리독신 주입 종료일까지 지속되었다. 반면에, 음성 대조군과 유전자 치료군의 모든 개는 체위 반응 검사 동안에 정상이었다.

모든 치료군에서 전기생리학적 리딩(reading)을 기록하여 M 파동 및 H 리플렉스를 측정하였다. 음성 대조군, 양성 대조군 및 유전자 치료군의 모든 개에서 M 파동의 진폭은 피리독신 투여 전 및 후에 현저한 차이를 보이지 않았다. 그러나, 양성 대조군에서 피리독신 독성화 전 및 후에 H 리플렉스에서 현저한 차이가 있었다. 피리독신 독성화 전에 H 리플렉스의 진폭은 0.52±0.06mV이었다. 그러나, 피리독신 독성화 후, 양성 대조군에서 일관되게 H 리플렉스가 검출되지 않았다. 음성 대조군과 유전자 치료군에서 H 리플렉스는 피리독신 독성화 전 및 후 변하지 않았다.

조직병리학적으로, 음성 대조군의 L₄의 측면, 배쪽 또는 등쪽 섬유단 또는 회색질에는 병변이 없었다(도 3A). 양성 대조군에서는 액손과 미엘린이 공포형성(vacuolation)이 동반되며 파괴되었다. 유전자 치료군에서는 팽창된 액손아 L₄의 배쪽 섬유단에서 간헐적으로 확인되었다(도 3C).

음성 대조군에서는 L₄의 DRG에 병변이 없었다(도 4A). 그러나, 양성 대조군 에서는 L₄의 DRG의 신경에서 심각한 염색질융해(chromatolysis)가 관찰되었다. 또한 신경에서 공포형성이 관찰되었다. 간헐적으로, 일부 신경은 괴사되었고, 농축핵(pyknotic nuclei)과 호산성 세포질(eosinophilic cytoplasm)을 특징적으로 보였다(도 4B). 유전자 치료군에서도 일부 신경은 농축핵과 호산성 세포질을 나타내었다(도 4C).

음성 대조군의 말초 신경(좌골 신경)의 액손 또는 미엘린에는 병변이 없었다(도 5A). 양성 대조군의 말초 신경(좌골 신경)의 미엘린에는 심각한 공포형성이 확인되었다(도 5B). 유전자 치료군의 말초 신경(좌골 신경)에는 미엘린의 약한 공포형성이 확인되었다(도 5C).

도 1은 클로닝에 사용된 프라이머와 함께 pdβ-NGF(presumed dog β-NGF) ORF(open reading frame)의 뉴클레오타이드 및 추정된 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

도 2는 여과된 상층액(pdβ-NGF 단백질) 유 또는 무 상태에서 배양된 PC12 세포를 나타낸 것이다(A: 음성 대조군, B: 실험군).

도 3(A)는 음성 대조군의 L₄의 정상 배쪽 섬유단을 나타낸 것이고, (B)는 양성 대조군의 L₄의 배쪽 섬유단으로, 공포형성이 동반된 액손 및 미엘린의 파괴를 보여주는 것이고, (C)는 유전자 치료군의 L₄의 배쪽 섬유단으로, 간헐적으로 팽창된 액손을 나타낸 것이다.

도 4(A)는 음성 대조군의 L₄의 DRG(dorsal root ganglia)를 나타낸 것이고, (B)는 양성 대조군의 L₄의 DRG로, 심각한 세포질용해, 공포형성(화살표머리) 및 간헐적인 농축핵과 호산성 세포질(화살표)을 보여주는 것이며, (C)는 유전자 치료군의 L₄의 DRG로, 일부 신경에서 농축핵과 호산성 세포질(화살표)을 나타낸 것이다.

도 5(A)는 음성 대조군의 정상 좌골 신경을 나타낸 것이고, (B)는 양성 대조군의 좌골 신경으로, 미엘린의 심각한 공포형성(화살표)을 보여주고 있으며, (C)는 유전자 치료군의 좌골 신경으로, 미엘린의 약한 공포형성(화살표)을 나타낸 것이 다.

<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Veterinary composition for treatment of diseases related to neuronal injury of dog containing beta-nerve growth factor <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 726 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 1 atgtccatgt tgttctacac tctgatcaca gctcttctga tcggcatccg ggcagaaccg 60 catccagaga gccatgtccc agcaggacac gccatccccc acgcccactg gactaagctt 120 cagcattccc ttgacacagc cctccgcaga gcccgcagcg ccccggccgg ggcaatagct 180 gccagggtga cagggcagac ccgcaacatc actgtggatc ccaaactctt taaaaagcgg 240 cgactgcgtt cgccccgcgt gctgttcagc acgcaccccc cacctgtggc tgcggacgct 300 caggacctgg acctggaggc cggcagcacc gcctccgtca acaggactca caggagcaag 360 cggtcttcgt cccaccctgt cttccaccgg ggggagttct cggtgtgcga cagcgtcagc 420 gtgtgggtgg gcgacaagac cacagccacc gacatcaagg gcaaggaggt gatggtgctg 480 ggagaggtga acattaacaa cagtgtgttc aaacagtact tctttgagac caagtgccgg 540 gaccccaccc ccgtggacag cgggtgcagg ggcatcgact ccaagcactg gaactcctac 600 tgcaccacca cccacacctt cgtcaaggcg ctgaccatgg acggcaagca ggctgcctgg 660 cggttcatcc ggatcgacac ggcctgcgtg tgcgtgctca gcaggaaggc cgggagacga 720 gcctga 726 <210> 2 <211> 241 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 2 Met Ser Met Leu Phe Tyr Thr Leu Ile Thr Ala Leu Leu Ile Gly Ile 1 5 10 15 Arg Ala Glu Pro His Pro Glu Ser His Val Pro Ala Gly His Ala Ile 20 25 30 Pro His Ala His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu 35 40 45 Arg Arg Ala Arg Ser Ala Pro Ala Gly Ala Ile Ala Ala Arg Val Thr 50 55 60 Gly Gln Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Lys Leu Phe Lys Lys Arg 65 70 75 80 Arg Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr His Pro Pro Pro Val 85 90 95 Ala Ala Asp Ala Gln Asp Leu Asp Leu Glu Ala Gly Ser Thr Ala Ser 100 105 110 Val Asn Arg Thr His Arg Ser Lys Arg Ser Ser Ser His Pro Val Phe 115 120 125 His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly 130 135 140 Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu 145 150 155 160 Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu 165 170 175 Thr Lys Cys Arg Asp Pro Thr Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile 180 185 190 Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val 195 200 205 Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg 210 215 220 Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Gly Arg Arg 225 230 235 240 Ala <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tcagcattcc cttgacacwg 20 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 agccttcctg ctgagcac 18 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 agttctcggt gtgcgacag 19 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gcccaggaga gtgtggag 18 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ggcagatcta tgtccatgtt g 21 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ggagaattct caggctcgtt ct 22

Claims

서열번호: 1에 나타낸 염기서열로 이루어지는 개의 β-NGF(nerve growth factor) 유전자.
제 1항에 따른 유전자를 함유하는 유전자 전달체를 유효성분으로 포함하는 개의 신경손상 관련 질환 치료용 수의학적 조성물.
제 2항에 있어서,

상기 유전자 전달체는 CMV(cytomegalovirus)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 2항에 있어서,

경막내 투여용으로 제형화된 것을 특징으로 하는 조성물.
제 2항에 있어서,

상기 신경손상 관련 질환은 퇴행성 신경질환 또는 신경병증인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 5항에 있어서,

상기 신경병증은 감각 신경병증인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 따른 유전자를 함유하는 유전자 전달체를 개에게 투여하는 단계를 포함하는 개의 신경손상 관련 질환의 치료방법.
제 7항에 있어서,

상기 유전자 전달체는 CMV(cytomegalovirus)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 7항에 있어서,

경막내를 통해 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7항에 있어서,

상기 신경손상 관련 질환은 퇴행성 신경질환 또는 신경병증인 것을 특징으로 하는 방법.
제 10항에 있어서,

상기 신경병증은 감각 신경병증인 것을 특징으로 하는 방법.
제 7항에 있어서,

상기 유전자 전달체는 양이온 리포좀과 혼합하여 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.