KR20200124038A - 마이크로rna-381을 유효성분으로 포함하는, pmp22 과발현에 의한 말초신경병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 마이크로RNA-381(miR-381)을 유효성분으로 포함하는, PMP22의 과발현에 의한 말초신경병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 본 발명에 따른 miR-381이 PMP22의 과발현에 의해 유발되는 말초신경병증인 샤르코-마리-투스병 제1A형(CMT1A)에서 PMP22의 발현을 효과적으로 저해하여 손상된 운동능력 및 신경세포의 수초화 형성 증가 등의 생리적 및 행동학적 개선 효과를 확인하였는바, 본 발명에 의하면 miR-381은 PMP22의 과발현에 의해 유발되는 말초신경병증의 예방 또는 치료 용도로써 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

마이크로RNA-381을 유효성분으로 포함하는, PMP22 과발현에 의한 말초신경병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for prevention or treatment of peripheral neuropathy caused by overexpression of PMP22 comprising miR-381 as an effective ingredient}

본 발명은 마이크로RNA-381(miR-381)을 유효성분으로 포함하는, PMP22 과발현에 의한 말초신경병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

샤르코-마리-투스병(Charcot-Marie-Tooth disease; CMT)은 다양한 유전적 및 임상적 이질성을 갖는 주요 유전성 말초신경병증 질환 중 하나이다. 지금까지 약 80개의 원인 유전자가 규명되었으며, 그 중에서 말초 미엘린(myelin) 단백질 22 kDa을 암호화하는 PMP22(Peripheral myelin protein 22)의 중복(CMT type 1A; CMT1A)이 주요 원인 유전자로 알려져 있다. PMP22 단백질의 과발현은 슈반세포(Schwann cell)에서 ER 스트레스 또는 세포사멸을 통해 말초 신경의 탈수초화를 일으키므로, PMP22의 발현 수준을 감소시키는 것이 CMT1A 주요 치료 전략이다(Proc Natl Acad Sci U S A 99(15): 9852-7.). 지금까지는 간접적인 방법을 기반으로 CMT1A의 치료 방법이 개발되어 왔다. 예를 들어, 프로게스테론(Progesterone) 길항제 또는 비타민 C가 PMP22의 발현 수준을 감소시키는 효능을 가진 잠재적 치료제로서 설치류 모델에서 평가되었다. 그러나 이러한 접근법은 인간을 대상으로 한 임상시험에서는 제한된 효과를 보였다. 따라서 PMP22 발현을 직접적으로 조절하는 것이 치료효과를 높이는데 더 효과적일 수 있다.

한편, 마이크로RNA(MicroRNA; miRNA)는 약 22개 뉴클레오타이드의 이중가닥의 RNA 전사체로 존재하는 내인성의 작은 비암호화 RNA이다. miRNAs의 중요성은 발달과 세포 항상성의 조절 기능에서 증명되었다. 구체적으로, 말초 신경계가 발달하는 동안 miRNA의 중요성이 조사되었는데, 예컨대 슈반세포에서 다이서(Dicer)를 제거하면 정상적인 수초화(myelination) 및 축삭 완전성(axonal integrity)이 억제되며, 또한 Dicer의 감소에 따라 슈반세포의 분화 및 수초화가 저해된다고 알려져 있다. PMP22 유전자 발현과 관련해서는, miR-9와 miR-29b와 같은 몇몇 miRNA가 PMP22의 3’UTR을 표적으로 하는 것으로 보고된 바 있다. 질병 치료에 있어서 miRNA는 진핵 세포에서 표적 mRNA의 발현 수준을 조절할 수 있기 때문에, 특정 miRNA를 통한 PMP22의 표적화는 PMP22 과발현에 의한 질환의 치료 전략이 될 수 있다.

본 발명자들은 PMP22의 과발현에 의해 유발되는 말초신경병증의 치료 전략으로 miRNAs의 효능을 연구한 결과, miR-381이 in vitro 및 말초신경병증인 샤르코-마리-투스병 type 1A(CMT1A) 마우스 모델에서 PMP22의 발현을 저해하며, miR-381이 투여된 상기 CMT1A 마우스 모델에서 CMT1A의 표현형적 증상이 개선되는 효과를 확인하였는바, 이로써 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 마이크로RNA-381(miR-381)을 유효성분으로 포함하는, PMP22(Peripheral myelin protein 22) 과발현에 의한 말초신경병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 마이크로RNA-381(miR-381)을 유효성분으로 포함하는, PMP22(Peripheral myelin protein 22) 과발현에 의한 말초신경병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 PMP22 과발현에 의한 말초신경병증은 샤르코-마리-투스병 제1A형(Charcot-Marie-Tooth disease type 1A; CMT1A)일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 miR-381은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 miR-381은 PMP22의 3’ 말단의 비번역 부위(3’untranslated region; 3’UTR)를 표적하여 PMP22의 발현을 저해하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 약학적 조성물은 PMP22의 과발현에 의한 말초신경병증에서 운동 능력 및 신경의 수초 형성을 증가시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 마이크로RNA-381(miR-381)을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, PMP22 과발현에 의한 말초신경병증의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 마이크로RNA-381(miR-381)을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의, PMP22의 과발현에 의한 말초신경병증의 예방 또는 치료용도를 제공한다.

본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 본 발명에 따른 miR-381이 PMP22의 과발현에 의해 유발되는 말초신경병증인 샤르코-마리-투스병 제1A형(CMT1A)에서 PMP22의 발현을 효과적으로 저해하여 손상된 운동능력 및 신경세포의 수초화 형성 증가 등의 생리적 및 행동학적 개선 효과를 나타냄을 확인하였는바, 본 발명에 의하면 miR-381은 PMP22의 과발현에 의해 유발되는 말초신경병증의 예방 또는 치료 용도로써 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 CMT1A 질환의 마우스 모델인 C22 마우스에서 miR-381의 발현수준이 유의하게 감소되어 있음을 확인한 결과로서, 도 1a는 RNAseq을 통해 상기 C22 마우스의 좌골 신경에서 수초화와 관련이 있다고 보고된 여러 miRNAs의 발현 수준을 측정한 결과이고, 도 1b는 RT-qPCR을 통해 야생형(WT) 마우스와 C22 마우스에서 miR-381의 수준을 측정한 결과이다.
도 2는 miR-381이 PMP22의 3’UTR을 표적하여 이의 발현수준을 조절함을 확인한 결과로서, 도 2a는 miR-381의 PMP22 표적 부위를 알아보기 위해 제조한 두 개의 플라스미드 구조를 도시한 것이고, 도 2b는 miR-381 및 miR-9(양성 대조군)의 형질감염에 따른 MYC 단백질의 발현수준을 측정하여 miR-381가 PMP22의 3’UTR을 표적하는지 여부를 검증한 결과이며, 도 2c는 동일한 조건에서 miR-381 및 miR-9에 의한 PMP22 mRNA의 발현수준 변화를 측정한 결과이다.
도 3은 렌티바이러스 벡터를 이용해 C22 마우스의 좌골신경으로 miR-381을 전달한 후 PMP22의 수준 감소를 확인한 결과로서, 도 3a는 대조군 렌티바이러스 벡터(LV-mock) 또는 LV-miR-381을 투여한 C22 마우스(각각 mock 및 miR-381)에서 miR-381의 발현수준을 측정한 결과이고, 도 3b 및 도 3c는 상기 각 C22 마우스에서 인간 PMP22(hPMP22) 및 마우스 PMP22(mPMP22) mRNA의 수준을 각각 측정한 결과이며, 도 3d는 면역형광분석을 통해 대조군 렌티바이러스 벡터를 투여한 야생형 또는 C22 마우스(WT/mock, C22/mock) 및 LV-miR-381을 투여한 C22 마우스(C22/miR-381)에서 PMP22 단백질 수준을 관찰한 결과이다.
도 4는 C22 마우스에서 miR-381 발현에 의한 운동 능력 개선 효과를 확인한 결과로서, 도 4a는 대조군 렌티바이러스 벡터(LV-mock) 또는 LV-miR-381을 투여한 C22 마우스(각각 mock 및 miR-381)에서 로타로드(Rotarod) 분석을 실시한 결과이고, 도 4b 및 도 4c는 상기 각 C22 마우스에서 신경 전기생리학적 평가를 위해 운동 신경 전도 속도(MNCV) 및 복합 활동 전위(CMAP)를 측정한 결과이다.
도 5는 C22 마우스에서 miR-381 발현에 의한 조직병리학적 개선 효과를 확인한 결과로서, 도 5a는 대조군 렌티바이러스 벡터를 투여한 야생형 또는 C22 마우스(WT/mock, C22/mock) 및 LV-miR-381을 투여한 C22 마우스(C22/miR-381)의 신경조직에 대한 톨루이딘 염색 및 전자현미경 이미지를 나타낸 결과이고, 도 5b는 도 5a의 톨루이딘 블루 염색의 정량적 결과이며, 도 5c 및 도 5d는 상기 각 마우스에서 수초화 및 비수초화된 축삭을 측정하여 비교한 결과이고, 도 5e는 양파 껍질 모양의 구조(Onion bulbs) 형성 정도를 측정한 결과이다.

본 발명자들은 miR-381이 in vitro 및 CMT1A 마우스 모델에서 PMP22의 발현을 저해하며, miR-381이 투여된 상기 CMT1A 마우스 모델에서 CMT1A의 표현형적 증상이 개선되는 효과를 확인하였는바, 이로써 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 마이크로RNA-381(miR-381)을 유효성분으로 포함하는, PMP22(Peripheral myelin protein 22) 과발현에 의한 말초신경병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, “예방”이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 PMP22의 과발현에 의한 말초신경병증을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 PMP22의 과발현에 의한 말초신경병증에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, “말초신경병증(peripheral neuropathy)”이란 운동과 감각 자율신경을 담당하는 여러 신경들로 구성된 말초신경계의 이상으로 유발되는 질환으로, 신경계의 손상 정도와 분포, 손상된 신경의 기능에 따라 달라질 수 있으며, 수초와 축삭의 병변에 따라 탈수초성 신경병증(demyelinating neuropathy)과 축삭변성 신경병증(axonal degeneration)으로 구분된다. 본 발명에 따른 말초신경병증은 말초 미엘린 단백질 22 kDa을 암호화하는 PMP22의 중복에 의해 유발되는 것을 특징으로 하며, 보다 바람직하게는 샤르코-마리-투스병 제1A형(Charcot-Marie-Tooth disease type 1A; CMT1A)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 PMP22(Peripheral myelin protein 22)는 Growth arrest-specific protein 3 (GAS-3)라고도 하며, PMP22 유전자는 주로 말초 신경계의 슈반세포에서 발현되는 160개 아미노산으로 이루어진 22 kDa의 막 투과성 당단백질을 암호화한다. 인간에서 PMP22 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있고, 염색체 17p11.2에 존재하며 약 40kb에 이른다. 상기 유전자는 인간과 설치류 모두에서 보존된 6개의 엑손을 포함하고, 그 중 2개는 5' 비번역 엑손(1a 및 1b)이며 동일한 코딩 서열을 갖는 2개의 상이한 RNA 전사체를 생성한다. PMP22 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있고, 구조적으로 4개의 막 횡단 도메인, 2개의 세포 외 루프(ECL1 및 ECL2), 및 1 개의 세포 내 루프를 특징으로 한다.

PMP22 유전자는 부적절한 세포 내 양으로 인해 단백질 합성과 수초(myelin sheath)의 기능 이상을 일으킬 수 있다. PMP22 유전자의 발현 변화는 샤르코-마리-투스병 제1A형(Charcot-Marie-Tooth disease type 1A; CMT1A), 데제린-소타스병(Dejerine-Sottas disease) 및 압막마비 유전성 신경병증(Hereditary Neuropathy with Liability to Pressure Palsy; HNPP)과 같은 다양한 신경병증과 관련이 있는데, 예컨대 PMP22의 과발현(유전자 중복)은 CMT1A를 유발하고, PMP22의 발현 감소(유전자의 결실 등에 기인)는 HNPP를 초래한다고 알려져 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, “마이크로RNA(microRNA)”란 약 22개의 염기서열로 이루어진 짧은 non-coding RNA를 의미하며, 유전자의 발현 과정에서 전사 후 조절인자(post-transcriptional regulator)로서 기능을 한다고 알려져 있다. 상보적인 염기 서열을 가진 표적(target) mRNA에 상보적으로 결합함으로써 표적 mRNA들을 분해시키거나 단백질로 번역되는 것을 억제한다.

본 발명에 있어서, 상기 miR-381은 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있다. 이때, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 miR-381이 PMP22의 과발현에 의해 유발되는 말초신경병증의 예방 또는 치료용도로 유용하게 이용될 수 있음을 입증하였다.

본 발명의 일실시예에서는, CMT1A 질환의 마우스 모델인 C22 마우스에서 RNAseq을 통해 수초화와 관련된 여러 miRNAs의 발현 프로파일을 분석한 결과, miR-381을 포함한 4종의 miRNA의 유의한 발현 감소를 확인하였으며, 추가적인 분석을 통해 C22 마우스의 좌골 신경에서 miR-381의 수준이 유의하게 감소된 것을 확인하였다(실시예 2 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, miR-381이 PMP22 유전자의 3’UTR을 표적하여 이의 단백질 및 mRNA의 발현을 유의하게 감소시키는 것을 확인하였으며(실시예 3 참조), 렌티바이러스 벡터를 이용하여 C22 마우스에 miR-381을 발현시킨 결과 대조군 렌티바이러스 벡터를 주입한 C22 마우스와 비교할 때, 인간 및 마우스 PMP22 mRNA의 발현이 유의하게 감소하고 PMP22 단백질 역시 효과적으로 감소된 것을 확인하였다(실시예 4 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 상기 miR-381에 의한 PMP22의 수준 감소가 상기 CMT1A의 신경병증성 증상을 개선하는지 여부를 조사한 결과, 로타로스 테스트 및 신경 전기생리학적 평가를 통해 miR-381의 발현이 운동 능력을 효과적으로 개선시키며, 또한 조직병리학적 평가를 통해 슈반세포의 수초화 양상 즉, 수초화된 축삭의 수 및 수초화 두께를 향상시키는 것을 확인하였다(실시예 5 참조).

상기 실시예 결과를 통해 본 발명에 따른 miR-381은 PMP22의 발현을 효과적으로 감소시키며 이에 따른 PMP22의 과발현에 의해 유발되는 말초신경병증의 증상을 효과적으로 개선시키는바, 상기 질환의 새로운 치료전략이 될 수 있을 것으로 판단된다.

본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 miRNA-381을 유효성분으로 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제 등으로 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료 또는 진단에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 진단하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성률 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 ㎏ 당 0.001 내지 150 ㎎, 바람직하게는 0.01 내지 100 ㎎을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감 될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 PMP22의 과발현에 의한 말초신경병증의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물의 PMP22의 과발현에 의한 말초신경병증의 예방 또는 치료용도를 제공한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험준비 및 실험방법

1-1. miRNA 염기서열 분석 및 합성

야생형 및 C22 마우스의 좌골 신경에서 total RNA를 분리한 후 TruSeq small RNA library prep kit를 사용하고 Macrogen, Inc.(Seoul, Korea)의 RNA-Seq 기반 작은(small) RNA 염기서열 분석을 통해 miRNA의 발현 수준을 평가하였다. 사용된 miRNAs와 대조군 miRNA는 GenePharma (Shanghai, China)에서 합성하였다.

1-2. Pmp22 및 miRNAs 구조체의 제조

PMP22 및 PMP22-3’UTR을 얻기 위해, 인간의 총 mRNA 및 gDNA를 주형으로 사용하여 PCR 증폭을 실시하였으며, 증폭된 유전자를 pCMV-myc 벡터(Clontech, Mountain View, CA)에 클로닝 하였다. 한편, miRNAs를 발현하는 렌티바이러스 벡터를 제조하기 위해, 렌티바이러스 벡터 pLVX-IRES(Clontech, Mountain View, CA)를 기반으로 LV-mock(miRNA 유사체 음성대조군), LV-miR-381 또는 miR-9 발현 카세트를 제조하였다. 렌티바이러스 입자는 SIRION Biotech(Martinsried, Germany)사를 통해 4.0 x 10⁶의 HEK293T 세포에 렌티바이러스 발현 플라스미드 및 패키징 플라스미드를 동시에 형질감염(transfection)시켜 제조하였다. 형질감염 48시간 후 상등액을 회수하였으며, 렌티바이러스 입자를 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)로 침전시키고 무혈청 CD29 배지(LifeTechnologies, Carlsbad, CA)에 용해시켰다.

1-3. 동물 실험

모든 동물실험은 삼성의료원의 동물실험윤리위원회를 통해 승인 받은 프로토콜에 따라 진행하였다(SMC-20170203001). 하기 실험을 위해, C22 마우스[B6, CBACa-Tg(PMP22)C22Clh/H]를 MRC Harwell(Oxfordshire, UK)에서 구입한 후, 출생 후 6일째에 마우스의 좌골 절흔(sciatic notch)의 원위부에 렌티바이러스 입자를 1회 신경 내로 주입하였다. 상기 신경 내 주입은 33 게이지 바늘에 연결된 10 ㎕ Hamilton 주사기를 이용하여 수행하였다. 운동 협응(Motor coordination)은 마우스가 3주령이 되었을 때부터 수평 회전 막대(21rpm)를 이용한 로타로드(Rotarod) 장치(B.S. Technolab INC)로 평가하였으며, 평가를 위해 회전하는 막대 위에서 마우스가 버티는 시간을 측정하였고, 최대 300초 동안 막대에 머무를 수 있도록 하였다.

1-4. 전기 생리학적 연구

전기생리학적 상태를 평가하기 위해, 렌티바이러스 입자를 투여한 후 10주에 야생형(WT)과 C22 마우스에 대하여 신경전도 연구(nerve conduction study; NCS)를 수행하였다. 간략하게, 마우스를 1.5% 이소플루란(isoflurane)으로 노즈콘(nose cone)을 사용해 마취시킨 후, Nicolet VikingQuest 장치(Natus Medical, San Carlos, CA)를 사용하여 신경전도 연구를 실시하였다. 최대 자극 시 운동 신경 전도 속도(Motor nerve conduction velocity; MNCV)와 복합 근육 활동 전위(compound muscle action potential; CMAP) 진폭은 유전자형과 치료군을 모르는 독립적 검사자를 통해 측정하였다.

1-5. 톨루이딘 염색 및 전자현미경

LV-miR-381을 투여하고 15주 후에 WT 및 C22 마우스에서 좌골 신경을 생검한 후 현미경 분석을 통해 영향을 받은 샘플의 병리학적 검사를 실시하였다. 보다 구체적으로, 시료를 4℃에서 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde) 용액에 2.5% 글루타르알데하이드(glutaraldehyde)로 밤새 고정시킨 다음, 1% OsO4에서 1시간 동안 배양한 후, 시료를 에탄올 시리즈에서 탈수시키고, 프로필렌 옥사이드에 통과시킨 후, 에폭시 수지(Epok 812, Oken, Japan)에 침지시켰다. 다음으로, 조직을 준-절편(1μm)으로 절단하고 5 내지 10초 동안 톨루이딘 블루(toluidine blue)로 염색하였다. 이후 준-절편을 Bx51 정립 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)으로 이미지화하고 Cell sense(Olympus)를 사용하여 분석하였다. 초미세 절편(65 nm)은 200 메쉬의 니켈 그리드 상에 수집하고 2% 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)에서 15분, 시트르산 납에서 5분 동안 염색하였다. 이후 Hitachi HT7700 전자현미경으로 100 kV에서 관찰하였으며, 그 결과 마우스 당 약 300개의 축삭을 확인하였다.

1-6. RNA의 정량 분석

마우스에 LV-miR-381을 투여하고 15주 후에 RNeasy Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 슈반세포(Schwann cell) 또는 좌골 신경에서 총 RNA를 분리하였다. 다음으로, SuperScript^TM Ⅱ 역전사 효소(Thermo Fisher, Rockford, IL)를 사용하여 상기 RNA를 역전사시킨 후, 생성된 cDNA를 주형으로 하기 프라이머를 사용하여 PCR 증폭을 실시하였다. 이후 SYBR Green PCR master mix와 ABI QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System(Applied Biosystems, Waltham, MA)을 사용하여 실시간 PCR(Real-time PCR)을 수행하였다. 또한 miRNA의 수준을 정량화하기 위해 성숙(mature) miRNA에 특이적인 TaqMan 프라이머(Applied Biosystems)를 사용하여 RT-qPCR을 수행하였다.

유전자	방향	서열 (5'-3')	서열번호
인간 PMP22	Forward	ATCGTCAGCCAATGGATCGTG	4
	Reverse	AGAAACAGTGGTGGACATTTCC	5
마우스 actin	Forward	GTGACGTTGACATCCGTAAAGA	6
	Reverse	GCCGGACTCATCGTACTCTCC	7
랫트 GAPDH	Forward	TGCCACTCAGAAGACTGTGG	8
	Reverse	TTCAGCTCTGGGATGACCTT	9

1-7. 웨스턴 블롯팅 및 면역조직화학염색

표준 웨스턴 블롯팅(Western blotting)을 수행하기 위해 RIPA 완충액(Biosesang, Seoul, Korea)을 사용하여 용해(lysis) 후 총 단백질을 얻었으며, 사용한 항체는 다음과 같다: 항-myc(Abcam, Cambridge, UK), 항-GAPDH 및 항-토끼 IgG(Cell signaling technology, Beverly, MA). 면역조직화학염색(Immunohistochemistry)은 4 μm의 조직 절편에 대하여 항-PMP22 항체(Abcam)와 Alexa Fluor 594 2차 항체(Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA)를 사용하여 실시하였다. 단백질 수준의 정량은 ZEN2019 프로그램을 통해 수행하였다.

1-8. 통계 분석

모든 값은 평균±표준 오차(SEM)로 표현하였고, 제시된 데이터의 통계적 유의성은 student’s t-검정으로 평가하였으며, 유의성 수준은 p <0.05로 설정하였다.

실시예 2. CMT1A 마우스에서 수초형성과 관련된 miRNAs의 발현수준 변화 분석

종래 수초화(myelination)와 관련이 있다고 보고된 miRNAs의 발현 수준이 CMT1A 질환의 마우스 모델에서 변화하는지 여부를 확인하기 위해, RNAseq을 이용하여 miRNA의 발현 프로파일을 분석하였다. 그 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이 CMT1A의 마우스 모델인 C22 마우스의 좌골 신경에서 miR-19b, miR-206, miR-381 및 miR-486의 발현수준이 야생형(WT)에서 보다 감소되어 있는 것을 확인하였으며, 이와는 반대로 miR-23a 및 miR-450a의 발현수준은 증가되어 있는 것을 확인하였다. 그 중에서도 본 발명자들은 miR-381에 중점을 두고 후속 연구를 진행하였다. 흥미롭게도, 추가적으로 NGS에 기초한 프로파일을 확인하기 위해, 정량적 PCR을 사용하여 miR-381의 발현수준을 분석한 결과 도 1b에 나타낸 바와 같이 C22 마우스의 좌골 신경에서 miR-381의 발현 수준이 야생형의 30%까지 현저히 감소되어 있음을 확인하였다.

실시예 3. in vitro 에서 miR-381에 의한 PMP22의 발현수준 조절 확인

본 발명자들은 miR-381이 PMP22 발현을 조절할 수 있는지 여부를 검증하기 위해, miRNA 표적 예측 데이터베이스인 miRDB(http://mirdb.org/)를 이용해 PMP22의 3’UTR의 c.*995에서 c*1001까지의 서열을 miR-381의 표적으로 예측하였다. 이후 상기 결과에 근거하여 두 개의 플라스미드를 제조했는데, 도 2a에 도시된 바와 같이 하나는 인간 PMP22의 암호화 영역을 포함하고 다른 하나는 인간 PMP22의 3’UTR의 전체 길이를 추가적으로 포함하는 것으로 하였다. 상기 시스템을 이용하여, 랫트 슈반세포주인 RT4 세포 내로 상기 벡터들을 형질감염시킨 후 MYC 단백질의 발현수준 변화를 관찰하였다. 이때, miR-9 역시 PMP22의 3’UTR을 표적으로하는 것으로 알려져 있으므로(c.*435에서 c.*441) [http://mirdb.org/], miR-9의 활성을 양성대조군으로 하여 평가하였다. 그 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이 miR-9를 형질감염시킨 경우 3’UTR이 측면에 위치하는 PMP22를 선택적으로 표적한다는 것을 발견하였다. miR-381의 경우에도 형질감염시켰을 때 3’UTR이 존재하는 경우에 선택적으로 PMP22 수준이 감소된 것을 확인하였다. 또한, 도 2c에서 볼 수 있는 바와 같이 PMP22 mRNA의 발현 수준 변화를 통해 miR-381이 PMP22의 3’UTR을 표적하는 것을 입증하였으나, 감소된 비율(대조군의 74.6 %)은 단백질 수준에서 거의 완전히 감소만큼 현저한 수준으로 나타나지는 않았다.

실시예 4. miR-381의 in vivo 전달을 통한 좌골 신경에서 PMP22의 수준 감소 확인

다음으로, 본 발명자들은 miR-381이 마우스 모델의 좌골 신경에서 PMP22의 발현 수준을 조절할 수 있는지 여부를 조사하고자 하였다. 마우스의 좌골 신경으로 miR-381을 전달하기 위해 상기 실시예 1-2의 방법에 따라 인간 miR-381을 클로닝하고 CMVIE 프로모터의 제어 하에 miR-381을 발현하는 렌티 바이러스 입자(LV-miR-381)를 제조하였다. 다음으로, 인간 PMP22 서열 7 카피를 갖는 C22 마우스 모델의 좌골 신경에 LV-miR-381 또는 대조군 렌티 바이러스 벡터(LV-mock)를 투여하였다. 이어서 마우스의 유전자형을 분석한 후 3주령에 그룹을 분류하였다. 이후 렌티바이러스를 매개로 투여된 miR-381이 좌골 신경에 효과적으로 전달되는지 여부를 알아보기 위해, 먼저 투여 15주 후에 C22 마우스의 좌골 신경에서 qRT-PCR을 통해 miR-381의 발현수준을 분석하였다.

그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이 LV-mock 투여 마우스와 비교할 때 LV-miR-381을 투여한 C22 마우스에서 miR-381의 발현 수준이 유의하게 증가된 것을 확인하였으며, 도 3b에서 볼 수 있는 바와 같이 miR-381의 증가된 발현수준과 일치하게 LV-miR-381이 투여된 C22 마우스에서 인간 PMP22의 발현수준이 유의하게 감소된 것을 확인하였다(LV-mock이 투여된 C22 마우스의 67.0%). 또한, 도 3c에 나타낸 바와 같이 인간 및 마우스에서 miR-381 및 PMP22 3’UTR 서열 모두 어느 정도 보존되어 있기 때문에, LV-miR-381이 투여된 마우스에서 마우스 PMP22의 발현 수준 역시 LV-mock이 투여된 C22 마우스의 51.7%로 감소된 것으로 나타났다. 나아가 도 3d에 나타낸 바와 같이 면역형광분석을 통해 감소된 PMP22의 mRNA 수준에 따라, LV-miR-381이 투여된 C22 마우스의 좌골신경에서 인간 PMP22의 단백질 수준이 감소된 것을 확인하였다(LV-mock가 투여된 C22 마우스의 45.3%).

실시예 5. CMT1A 마우스에서 miR-381에 의한 생리적 및 행동학적 개선 확인

다음으로, 본 발명자들은 miR-381에 의한 PMP22 수준의 감소가 C22 마우스의 비정상적인 신경병성 표현형의 개선과 관련이 있는지를 조사하고자 하였다. 먼저 운동 능력 조정에 미치는 영향을 분석하기 위해 Rotarod 분석을 실시하였다. 그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이 LV-miR-381이 투여된 C22 마우스(miR-381)의 경우 9주령(투여 후 8주)부터 운동 능력이 유의하게 향상된 결과를 나타내었다.

나아가 LV-miR-381 투여군에서의 운동 능력 향상과 말초 신경의 구조적 및 기능적 개선과의 관련성을 확인하기 위해, 신경 전기 생리학적 평가를 실시하였다. 그 결과, 도 4b 및 도 4c에 나타낸 바와 같이 인간 PMP22를 과발현하는 LV-mock가 투여된 C22 마우스(mock)의 경우 느린 운동 신경 전도 속도(motor nerve conduction velocity; MNCV) 및 감소된 복합 활동 전위(compound action potential; CMAP)를 나타낸 반면, LV-miR-381를 투여한 C22 마우스(miR-381)의 경우에는 투여 후 10주 후부터 LV-mock가 투여된 C22 마우스에 비해 MNCV가 유의하게 증가되었고, CMAP도 향상되었으나 그 차이가 통계적으로 유의하게 나타나지는 않았다.

다음으로, 좌골 신경의 준-절편을 이용하여 LV-miR-381에 의한 조직병리학적 개선 효과를 분석하였다. 먼저 톨루이딘 블루 염색 관찰 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이 LV-mock가 투여된 야생형 마우스(WT/mock)에 비해 LV-mock가 투여된 C22 마우스(C22/mock)의 경우 수초화된 축삭(myelinated axon)의 수, 축삭의 직경 및 슈반세포의 수초화의 전반적인 두께가 감소한 것으로 나타났다. 그러나 LV-miR-381를 투여한 C22 마우스(C22/miR-381)의 경우에는 수초화된 축삭의 수와 수초 형성의 두께가 증가된 것을 확인하였으며, LV-miR-381이 투여된 마우스에서 수초화 양상이 향상되는 결과를 전자현미경 관찰을 통해서도 확인할 수 있었다. 그러나 양 C22 마우스 군간에 수초화 섬유 및 축삭의 직경에서는 별다른 차이가 없는 것으로 나타났다. 나아가 톨루이딘 블루 염색 결과를 정량적으로 분석하기 위해, 총 외부 직경에 대한 내부 축삭 직경의 비율인 g-비율을 측정하였으며, 그 결과 도 5b에 나타낸 바와 같이 LV-mock가 투여된 C22 마우스(mock)에 비해 LV-miR-381이 투여된 C22 마우스(miR-381)의 g-비율이 더 낮은 기울기를 나타내었으며, 이는 miR-381의 발현에 의한 비정상적인 수초화가 감소되었다는 것을 의미한다.

또한, 도 5c 및 도 5d에 나타낸 바와 같이 수초화된 축삭 및 비수초화된 축삭의 수를 직접적으로 측정한 결과를 통해 LV-mock가 투여된 C22 마우스(C22/mock)에서 감소된 수초화된 축삭의 수가 miR-381을 발현시킨 마우스(C22/miR-381)에서 회복된 것을 확인하였으며, 더욱이, 도 5e에서 볼 수 있는 바와 같이 LV-miR-381이 투여된 C22 마우스 군에서 탈수초화된 신경 주위에 결합 조직이 축적되면서 두꺼워져 나타나는 양파 껍질 모양의 구조(Onion bulbs) 형성이 유의하게 감소된 것으로 나타났다.

종합적으로, 상기 결과들은 좌골신경에서 miR-381 의 발현이 CMT1A 마우스 모델의 표현형적인 증상을 개선시킬 수 있다는 것을 나타낸다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> SAMSUNG LIFE PUBLIC WELFARE FOUNDATION Dong-A University Research Foundation For Industry-Academy Cooperation SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY Foundation for Corporate Collaboration <120> Pharmaceutical composition for prevention or treatment of peripheral neuropathy caused by overexpression of PMP22 comprising miR-381 as an effective ingredient <130> PD19-001 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 75 <212> RNA <213> hsa-miR-381 <400> 1 tacttaaagc gaggttgccc tttgtatatt cggtttattg acatggaata tacaagggca 60 agctctctgt gagta 75 <210> 2 <211> 1828 <212> DNA <213> human_PMP22 <400> 2 agttacaggg agcaccacca gggaacatct cggggagcct ggttggaagc tgcaggctta 60 gtctgtcggc tgcgggtctc tgactgccct gtggggaggg tcttgcctta acatcccttg 120 catttggctg caaagaaatc tgcttggaag aaggggttac gctgtttggc cgggcagaaa 180 ctccgctgag cagaacttgc cgccagaatg ctcctcctgt tgctgagtat catcgtcctc 240 cacgtcgcgg tgctggtgct gctgttcgtc tccacgatcg tcagccaatg gatcgtgggc 300 aatggacacg caactgatct ctggcagaac tgtagcacct cttcctcagg aaatgtccac 360 cactgtttct catcatcacc aaacgaatgg ctgcagtctg tccaggccac catgatcctg 420 tcgatcatct tcagcattct gtctctgttc ctgttcttct gccaactctt caccctcacc 480 aaggggggca ggttttacat cactggaatc ttccaaattc ttgctggtct gtgcgtgatg 540 agtgctgcgg ccatctacac ggtgaggcac ccggagtggc atctcaactc ggattactcc 600 tacggtttcg cctacatcct ggcctgggtg gccttccccc tggcccttct cagcggtgtc 660 atctatgtga tcttgcggaa acgcgaatga ggcgcccaga cggtctgtct gaggctctga 720 gcgtacatag ggaagggagg aagggaaaac agaaagcaga caaagaaaaa agagctagcc 780 caaaatccca aactcaaacc aaaccaaaca gaaagcagtg gaggtggggg ttgctgttga 840 ttgaagatgt atataatatc tccggtttat aaaacctatt tataacactt tttacatata 900 tgtacatagt attgtttgct ttttatgttg accatcagcc tcgtgttgag ccttaaagaa 960 gtagctaagg aactttacat cctaacagta taatccagct cagtattttt gttttgtttt 1020 ttgtttgttt gttttgtttt acccagaaat aagataactc catctcgccc cttccctttc 1080 atctgaaaga agatacctcc ctcccagtcc acctcattta gaaaaccaaa gtgtgggtag 1140 aaaccccaaa tgtccaaaag cccttttctg gtgggtgacc cagtgcatcc aacagaaaca 1200 gccgctgccc gaacctctgt gtgaagcttt acgcgcacac ggacaaaatg cccaaactgg 1260 agcccttgca aaaacacggc ttgtggcatt ggcatacttg cccttacagg tggagtatct 1320 tcgtcacaca tctaaatgag aaatcagtga caacaagtct ttgaaatggt gctatggatt 1380 taccattcct tattatcact aatcatctaa acaactcact ggaaatccaa ttaacaattt 1440 tacaacataa gatagaatgg agacctgaat aattctgtgt aatataaatg gtttataact 1500 gcttttgtac ctagctaggc tgctattatt actataatga gtaaatcata aagccttcat 1560 cactcccaca tttttcttac ggtcggagca tcagaacaag cgtctagact ccttgggacc 1620 gtgagttcct agagcttggc tgggtctagg ctgttctgtg cctccaagga ctgtctggca 1680 atgacttgta ttggccacca actgtagatg tatatatggt gcccttctga tgctaagact 1740 ccagaccttt tgtttttgct ttgcattttc tgattttata ccaactgtgt ggactaagat 1800 gcattaaaat aaacatcaga gtaactca 1828 <210> 3 <211> 160 <212> PRT <213> human_PMP22 <400> 3 Met Leu Leu Leu Leu Leu Ser Ile Ile Val Leu His Val Ala Val Leu 1 5 10 15 Val Leu Leu Phe Val Ser Thr Ile Val Ser Gln Trp Ile Val Gly Asn 20 25 30 Gly His Ala Thr Asp Leu Trp Gln Asn Cys Ser Thr Ser Ser Ser Gly 35 40 45 Asn Val His His Cys Phe Ser Ser Ser Pro Asn Glu Trp Leu Gln Ser 50 55 60 Val Gln Ala Thr Met Ile Leu Ser Ile Ile Phe Ser Ile Leu Ser Leu 65 70 75 80 Phe Leu Phe Phe Cys Gln Leu Phe Thr Leu Thr Lys Gly Gly Arg Phe 85 90 95 Tyr Ile Thr Gly Ile Phe Gln Ile Leu Ala Gly Leu Cys Val Met Ser 100 105 110 Ala Ala Ala Ile Tyr Thr Val Arg His Pro Glu Trp His Leu Asn Ser 115 120 125 Asp Tyr Ser Tyr Gly Phe Ala Tyr Ile Leu Ala Trp Val Ala Phe Pro 130 135 140 Leu Ala Leu Leu Ser Gly Val Ile Tyr Val Ile Leu Arg Lys Arg Glu 145 150 155 160 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human_PMP22_Forward <400> 4 atcgtcagcc aatggatcgt g 21 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human_PMP22_Reverse <400> 5 agaaacagtg gtggacattt cc 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse_actin_Forward <400> 6 gtgacgttga catccgtaaa ga 22 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse_actin_Reverse <400> 7 gccggactca tcgtactctc c 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rat_GAPDH_Forward <400> 8 tgccactcag aagactgtgg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rat_GAPDH_Reverse <400> 9 ttcagctctg ggatgacctt 20

Claims (5)

1. 마이크로RNA-381(miR-381)을 유효성분으로 포함하는, PMP22(Peripheral myelin protein 22) 과발현에 의한 말초신경병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 PMP22의 과발현에 의한 말초신경병증은 샤르코-마리-투스병 제1A형(Charcot-Marie-Tooth disease type 1A; CMT1A)인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 miR-381은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 miR-381은 PMP22의 3’말단의 비번역 부위(3’untranslated region; 3’UTR)를 표적하여 PMP22의 발현을 저해하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 약학적 조성물은 PMP22의 과발현에 의한 말초신경병증에서 운동 능력, 신경 축삭의 수초화 양상을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.

Images