TWI818006B - Mir-17~92作為運動神經元(mn)退化疾病之治療或診斷標的 - Google Patents

Mir-17~92作為運動神經元(mn)退化疾病之治療或診斷標的 Download PDF

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Abstract

本發明係關於mir-17~92 作為運動神經元(MN)退化疾病之候選治療或診斷標的。mir-17~92 在脊髓MN中之表現持續整個成年期且尤其在SOD1G93A 小鼠中MN損失開始前減少。因此，mir-17~92 可用作ALS之候選治療標的。

Description

MIR-17~92作為運動神經元(MN)退化疾病之治療或診斷標的
本發明係關於微RNA(miRNA)，尤其作為運動神經元(MN)退化疾病之候選治療或診斷標的之mir-17~92的領域。
ALS，亦稱為路-蓋里格氏病(Lou Gehrig's disease)，係一種侵襲上位及下位運動神經元之破壞性成年發病型神經退化性疾病。隨之發生進行性且最終致命之肌肉麻痹，通常在疾病發作的2至5年內導致死亡。ALS大多為偶發性的，但有約10%之病例為家族性的。全球發病率為每年每100,000人中有約2-3例病例。在約75%之ALS患者中，遠端支配肢體之MN(limb-innervating MNs)，尤其是控制快速肢體動作之快縮易疲勞(fast-twitch fatigable，FF)MN通常係首先經歷退化之MN亞型，因此患者最初經歷手臂或腿無力或萎縮。其他MN亞型隨後受到影響，且在3至5年內，患者遭受完全癱瘓且最終因呼吸衰竭而死亡。用於治療ALS之唯一市售藥物(利魯唑(Riluzole))具有適度作用，可改善肌肉功能，但具有較強副作用且對患者存活期無明顯影響。最近，美國食品與藥物管理局(US Food & Drug Administration，FDA)批准一種新藥物(依達拉奉(Edaravone))，但其功效有待評估。迄今為止，尚無用於此致命疾病的有 效治癒方法。
有若干基因之致病性突變已與家族性及偶發性ALS相關聯，包括SOD1、TARDBP、FUS/TLS、VAPB、OPTN等。超氧化物歧化酶1(SOD1)基因中之顯性突變佔家族性ALS(fALS)之15-20%。儘管SOD1在ALS中之確切病理作用仍不清楚，但已確立一系列攜帶fALS SOD1突變體之轉殖基因小鼠，其重演ALS發展之病理性表型，包括作為疾病發作之第一病徵的肢體無力，且提供用於研究ALS機制之有價值模型。在此等fALS-SOD1轉殖基因模型中進行之累積研究表明，多個細胞機制之失調共同地促成ALS發展。研究最深入的一個路徑係內質網(ER)壓力(Kikuchi H等人(2006)Spinal cord endoplasmic reticulum stress associated with a microsomal accumulation of mutant superoxide dismutase-1 in an ALS model.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103(15)：6025-6030)，其主要在易損的FF-MN中觀察到。亦已將RNA代謝與ALS病理學相關聯，因為有許多經識別之疾病相關基因編碼RNA結合蛋白，諸如TARDBP、FUS及HNRNPA1。值得關注的是，此等致病基因亦參與miRNA生物發生及代謝。近期的研究進一步揭示，miRNA表現之失調出現在ALS小鼠模型及患者中(Eitan C及Hornstein E(2016)Vulnerability of microRNA biogenesis in FTD-ALS.Brain Res 1647：105-111)。
微RNA(miRNA)係內源性非編碼小RNA，其對脊髓中細胞命運決定及神經元存活起關鍵作用。最新的研究揭示，引起ALS之致病性突變足以抑制Dicer複合物活化，此係由壓力顆粒(stress granule，SG)之細胞溶質大分子組裝介導，導致miRNA生物發生之整體下調。然而， 與ALS有關之miRNA的確切功能及集合尚未完全確定。儘管缺少肌肉特異性miRNA mir-206可加快fALS-SOD1 G93A 小鼠模型中MN損失之發生(Williams AH等人(2009)MicroRNA-206 delays ALS progression and promotes regeneration of neuromuscular synapses in mice.Science 326(5959)：1549-1554)，但MN特異性miRNA是否亦參與MN存活之細胞自主調節仍不清楚。Dicer活性之條件性損失可阻斷小鼠胚胎MN譜系中之miRNA生物發生，導致包括支配肢體之MN在內之一小組MN的選擇性退化(Chen JA及Wichterle H(2012)Apoptosis of limb innervating motor neurons and erosion of motor pool identity upon lineage specific dicer inactivation.Frontiers in neuroscience 6：69)。mir-17~92係富集在MN之miRNA叢集(MN-enriched miRNA cluster)，對於控制胚胎支配肢體之MN(LMC-MN)存活至關重要(Tung YT等人(2015)Mir-17~92 Governs Motor Neuron Subtype Survival by Mediating Nuclear PTEN.Cell reports 11(8)：1305-1318)。此保護作用係由抑制Nedd4-2及Ndfip1對PTEN之單泛素化，隨後抑制Nedd4-2及Ndfip1對核PTEN(nPTEN)之單泛素化且隨後抑制nPTEN易位所介導。
本發明出人意料地發現，mir-17~92在脊髓MN中之表現持續整個成年期，且其尤其在SOD1 G93A 小鼠中MN損失開始之前減少。此時還伴隨SOD1 G93A 小鼠之脊髓MN中nPTEN之積聚。重要的是，藉由遺傳學方法或成體自身互補型腺相關載體血清型9(Self-Complementary Adeno-Associated Virus serotype 9，scAAV9)遞送使SOD1 G93A MN中mir-17~92過度表現可明顯延遲運動缺陷且延長壽命。此等發現將mir-17~92確定為 ALS之候選治療標的。
本發明提供一種治療或預防個體之運動神經元退化疾病之方法，其包含向該個體投與治療或預防有效量的一或多個編碼mir-17~92叢集之成員之基因或轉殖基因。
本發明亦提供一種改善患有運動神經元退化疾病之個體之運動缺陷及延長該個體之壽命的方法，其包含向該個體投與有效量的一或多個編碼mir-17~92叢集之成員之基因或轉殖基因。在一個實施例中，該方法可延遲或預防MN退化之發作或降低發展MN退化之風險。
某些實施例包括將mir-17~92叢集之一或多個成員遞送至個體之中樞神經系統中。特定言之，將微mir-17~92叢集之一或多個成員遞送至個體之脊髓中。
本發明亦提供一種在活體外篩選保護ALS中之運動神經元亞型之藥物的方法，其包含(i)提供帶有包含fALS基因及報導體基因之轉殖基因之幹細胞株；(ii)將藥物與該細胞株一起培養；(iii)引導該細胞分化成運動神經元細胞及表現；及(iv)若自該幹細胞株產生運動神經元亞型，則判定該藥物有效地保護ALS中之運動神經元亞型。
本發明進一步提供一種用於診斷個體之ALS中之運動神經元亞型的方法，其包含提供生物樣品及偵測mir-17~92叢集之一或多個成員或者nPTEN之存在，其中失調之mir-17~92成員或nPTEN之存在指示對個體之ALS中之運動神經元亞型的診斷或對ALS中運動神經元亞型之易感性。
本發明進一步提供一種用於診斷個體之ALS中之運動神經元亞型或對ALS中運動神經元亞型之易感性的套組，其包含一或多種用於 偵測生物樣品中mir-17~92叢集之一或多個成員或者nPTEN之存在的試劑。
圖1A至K展示需要mir-17~92來維持成體脊髓MN。(A)說明mir-17~92如何藉由直接靶向Nedd4-2 E3泛素接合酶及其接頭Ndfip1，由此抑制正在發育之LMC-MN中促凋亡nPTEN之積聚來控制PTEN細胞內之定位(subcellular localization)(Tung等人，2015)。此研究還旨在揭示mir-17~92/nPTEN軸參與ALS中MN退化之可能。(B)在P40時腰椎脊髓之ChATon MN中miR-17表現之代表性原位雜交。虛線劃分脊髓邊緣與灰質之界限。比例尺為50μm。(C)示意性說明成體脊髓中之神經元分佈。對背側非MN區及腹側MN區中之個別神經元細胞體進行雷射捕獲顯微切割且進行RNA提取。(D)經天藍B(Azure B)染料染色之半腹角區的代表性冷凍切片。右圖中之數字係在顯微切割期間由顯微切割軟體自動分配。比例尺為50μm。LCM表示雷射捕獲顯微切割。(E及F)關於經雷射顯微切割之細胞中之ChAT及mir-17~92叢集個別成員的qPCR分析。捕獲背側非MN作為對照。(平均值±s.d.，n=4隻小鼠。在所關注之群組間進行雙尾t檢驗。*P<0.05)。FC：倍數變化。(G及I)關於在P30時mir-17~92 MN△小鼠之腰椎半腹角切片中ChATon MN之免疫染色及其數目定量揭示MN明顯損失。(平均值±s.d.，n
Figure 108111841-A0305-02-0006-3
3隻小鼠，*P<0.05，雙尾t檢驗)。(H及J)在P30時腓腸肌(GA)肌肉之神經肌肉接合處(neuromuscular junction，NMJ)。mir-17~92 MN△小鼠呈現NMJ神經支配之明顯減弱。α-BTX：α-金環蛇毒，用以偵測菸鹼型乙醯膽鹼受體(AChR)。(平均值±s.d.，n=3隻小鼠，*P<0.05，雙尾t檢驗)。(K)如在刺激坐骨神經後於GA肌肉中誘發複合肌 肉動作電位(compound muscle action potential，CMAP)所揭示，mir-17~92 MN△小鼠中神經肌肉功能減退。CMAP之定量係藉由計算最大峰間值測定(平均值±s.d，n=6隻小鼠，*P<0.05，雙尾t檢驗)。
圖2A至J展示症狀發生前SOD1 G93A MN中之mir-17~92/nPTEN失調。(A及B)關於腰椎半腹角區之切片中ChATon MN之免疫染色及其數目定量揭示自P100開始，SOD1 G93A MN明顯損失。白色虛線劃分脊髓界限。比例尺為50μm。(n
Figure 108111841-A0305-02-0007-4
4隻小鼠，平均值±s.d.，*P<0.05，雙因素變異數分析(two-way ANOVA))。(C及D)(C)中展示在不同階段腰椎脊髓之半腹側ChATon MN中miR-17表現之代表性原位雜交且(D)中展示miR-17之定量。應注意，SOD1 G93A MN中之miR-17表現在P80時開始下降，隨後SOD1 G93A 中之MN明顯減少。比例尺為50μm。(n
Figure 108111841-A0305-02-0007-5
4隻小鼠，平均值±s.d.，*P<0.05，雙因素ANOVA)。(E)來自對照小鼠及SOD1 G93A 小鼠之腹側角區冷凍切片之雷射捕獲的示意性說明。僅對具有規則形狀之大MN(完整MN)進行顯微切割。(F~H)關於在P100時自SOD1 G93A 小鼠雷射捕獲之MN的qPCR分析。(F)ChAT之表現相當證實僅收集完整MN。(G)在MN損失之前，SOD1 G93A MN展現mir-17~92叢集成員之下調。(H)SOD1 G93A MN中的mir-17~92標的，包括PTEN、Ndfip1及Nedd4-2上調。資料展示為SOD1 G93A MN相對於Ctrl MN之倍數變化(FC)。(平均值±s.d.，n=4隻小鼠，*P<0.05，雙尾t檢驗)。(I及J)(I)中展示在不同階段，腰椎脊髓之ChATon MN中PTEN之免疫染色。最右側圖中以黃色正方形展示高倍數放大的突出顯示之PTEN細胞。白色虛線描繪MN核。比例尺為10μm。(J)在P100時，關於ChATon MN中之核與細胞溶質PTEN強度比的定量指示在SOD1 G93A MN中nPTEN積聚。(平均值 ±s.d.，n
Figure 108111841-A0305-02-0008-6
4隻小鼠，*P<0.05，雙因素ANOVA)。
圖3A至G展示SOD1 G93A LMC-MN更易發生退化且展現早期mir-17~92減少。(A)Ctrl及SOD1 G93A ESC分化成具有Hb9：：RFP；Foxp1：：GFP雙報導體之有絲分裂後MN的示意性說明。為加快MN退化，將環匹阿尼酸(cyclopiazonic acid，CPA)引入MN中且藉由流動式細胞測量術測定MN亞型之存活率。評定經媒劑(DMSO)處理之MN作為無壓力對照。(B及C)來自Ctrl(藍)及SOD1 G93A (紅)Hb9：：RFP；Foxp1：：GFP ESC之各MN亞型的存活率在CPA或媒劑處理後每6小時藉由流動式細胞測量術定量。將指定時間點時各MN亞群之百分比針對0小時(亦即，即將處理前)之百分比歸一化。相較於經處理之Ctrl LMC-MN，SOD1 G93A LMC-MN在CPA處理後30小時至48小時經歷顯著細胞損失。相比之下，Ctrl及SOD1 G93A 非LMC-MN兩者對於CPA處理具有較高抗性。(由n=3個獨立實驗得到的平均值±s.d.)。(D~G).處理後24小時的FACS純化之MN亞型。各群體中mir-17~92成員(D及E)及其標的(PTEN、Nedd4-2、Ndfip1)(F及G)之表現係藉由qPCR測定。將miRNA/mRNA水準針對相應Ctrl亞型歸一化。深紫色突出顯示經CPA處理組，而淡紫色表示僅用媒劑處理之組。(至少3個獨立實驗之平均值±s.d.，*P<0.05，雙尾t檢驗)。
圖4A至E展示SOD1 G93A LMC-MN呈現PTEN之早期核易位，從而導致其對於ALS之易損性。(A)在CPA處理24小時後關於分離之MN中PTEN亞細胞定位之免疫染色。紅色虛線描繪MN核之邊界。比例尺為10μm。(B)關於GFPoff RFPon非LMC-MN及GFPon RFPon LMC-MN中之核與細胞溶質PTEN平均強度比的定量。(平均值±s.d.，n=3個獨立實驗，*P<0.05，雙尾t檢驗)。(C)在胚胎脊髓中卵內(in ovo)電穿孔期間所進行 之階段的示意性說明。(D)針對腰椎脊髓切片之免疫染色展示在GFP-PTEN-NLSelec脊髓之電穿孔側處Foxp1on LMC MN減少，而Lhx3on非LMC神經元對異位GFP-PTEN之表現具有較大抗性。(E)關於Foxp1on LMC MN及Lhx3on非LMC神經元之定量。資料展示為電穿孔側相對於對側之細胞數目的倍數變化。(平均值±s.d.，n=5/6個胚胎，*P<0.05，單因素ANOVA)。
圖5A至H展示SOD1 +/L144F 人類誘導型多潛能幹細胞(Induced pluripotent stem cell，iPSC)源性MN中之hsa-mir-17~92/nPTEN路徑之持續性失調。(A)CRISPR-Cas9介導之基因校正的示意性描繪。SOD1 +/L144F 突變(G至C突變)周圍之基因組序列以紅色突出顯示。在嚮導RNA(guide RNA)識別序列下加下劃線。引入含有經校正G(以藍色突出顯示)的99個核苷酸之單股寡核苷酸作為用於同源定向修復(HDR)之模板。(B)藉由DNA測序確定Ctrl-SOD1 +/+細胞株中之經校正鹼基(G/C→G/G)。(C)反映神經營養因子(NF)剝奪之時程的時間線。(D及E)在長期培養期間，相較於Ctrl-SOD1 +/+ LMC-MN，ALS-SOD1 +/L144F LMC-MN更易受NF剝奪影響。(D)在NF剝奪期間之指定時間點進行免疫染色以揭示LMC-MN(SMI32on、ISL1on及FOXP1on)。(E)藉由在NF剝奪後指定時間點FOXP1on ISL1on數目之定量來測定LMC-MN之存活率且將其針對NF剝奪前(-NF第0天)之存活率歸一化。(平均值±s.d.，n=4個獨立實驗，*P<0.05，雙因素ANOVA)。比例尺為100μm。(F)如藉由qPCR所測定的在NF剝奪後第14天時長期MN培養物中hsa-mir-17~92之表現。資料展示為ALS-SOD1 +/L144F 相對於Ctrl-SOD1 +/+之倍數變化(FC)。(至少四個獨立實驗之平均值±s.d.，*P<0.05，雙尾t檢驗)。(G)西方墨點法指示， 在NF剝奪後第14天，SOD1 +/L144F MN培養物中PTEN、NDFIP1及NEDD4-2之蛋白質水準升高。包括α微管蛋白作為負載對照。定量資料展示為ALS-SOD1 +/L144F 相對於Ctrl-SOD1 +/+之倍數變化(FC)。(平均值±s.d.，n=4個獨立實驗，*P<0.05，雙尾t檢驗)。(H)進行免疫染色以展示在NF剝奪後第14天FOXP1on ISL1on LMC-MN中PTEN之亞細胞定位。紅色虛線描繪MN核之邊界。比例尺為10μm。核與細胞溶質PTEN平均強度比之定量(右圖)揭示SOD1 +/L144F LMC-MN中nPTEN易位增加。(平均值±s.d.，n=4個獨立實驗，*P<0.05，雙尾t檢驗)。
圖6A至E展示SOD1 +/L144F LMC-MN之存活期可藉由hsa-mir-17~92之過度表現而延長。(A)實驗性時間線之示意性說明。在分化第25天，對iPSC~MN培養物進行隔夜慢病毒(LV)感染以過度表現hsa-mir-17~92或作為對照之YFP，隨後在分化第32天剝奪NF後進行存活分析。(B及C)在存活分析終點(-NF第28天)時受感染MN培養物之qPCR分析。(B)慢病毒轉導引起hsa-mir-17~92之異位且持續性的過度表現。(C)壓力SOD1 +/L144F iPSC~MN中上調的PTEN、NDFIP1及NEDD4-2 mRNA水準因hsa-mir-17~92之過度表現而受到抑制。資料展示為各組相對於SOD1 +/L144F LV-YFP之倍數變化(FC)。(平均值±s.d.，n=4個獨立實驗，*P<0.05，單因素ANOVA)。(D及E)hsa-mir-17~92之過度表現在NF剝奪後明顯延長SOD1 +/L144F LMC-MN之存活期。(D)如藉由SMI32及FOXP1免疫染色所揭示的在NF剝奪前後經LV感染之LMC-MN。(E)在NF剝奪之第28天，藉由定量LMC-MN(FOXP1on ISL1on)數目來測定LMC-MN存活率且將其針對NF剝奪前之LMC-MN數目歸一化。(平均值±s.d.，n=4/5個獨立實驗，*P<0.05，**P<0.01，單因素ANOVA)。
圖7A至H展示在MN中mir-17~92之過度表現將延遲疾病發作且延長SOD1 G93A 小鼠之壽命。(A)Ctrl及ALS小鼠之基因型，以及在Olig2 Cre/+驅動蛋白作用下於MN中過度表現mir-17~92之SOD1 G93A 品系中的經拯救ROSA26-loxp-STP-loxp(LSL)-mir-17~92。(B及C)在P100時腰椎半腹角區之切片中ChATon MN之免疫染色及其數目定量揭示SOD1 G93A MN數目之明顯恢復。白色虛線劃出脊髓邊緣。比例尺為50μm。(n=4隻小鼠，平均值±s.d.，*P<0.05，單因素ANOVA)。(D及E)在P100時腰椎脊髓之半腹側ChATon MN中PTEN亞細胞定位之免疫染色及定量。SOD1 G93A MN中nPTEN之積聚因mir-17~92過度表現而減少。最右側圖中展示高倍數放大的突出顯示之PTEN細胞。白色虛線描繪MN核。比例尺為10μm。(平均值±s.d.，n=4隻小鼠，*P<0.05，單因素ANOVA)。(F)展示脊柱後凸表型之小鼠的侖琴射線照片(roentgenogram)。應注意，脊柱後凸在ALS；mir-17~92 MN-OE 小鼠中得以改善。紅色點線描繪後肢形狀；黑色點線描繪小鼠脊椎。(G)用於測試運動效能之旋桿測試。測定自加速之旋桿落下之等待時間且針對P100時之初始效能(為100%)歸一化。ALS；mir-17~92 MN-OE 小鼠呈現自P120開始改良之效能。(平均值±s.d.，Ctrl(n=5)、ALS(n=8)及ALS；mir-17~92 MN-OE (n=6)小鼠，關於藉由雙因素ANOVA比較ALS與ALS；mir-17~92 MN-OE 小鼠，*P<0.05)。(H)卡普蘭-邁耶(Kaplan-Meier)存活曲線反映Ctrl(n=32)、ALS(n=33)及ALS；mir-17~92 MN-OE (n=22)小鼠之存活率。(****關於藉由對數秩(log-rank)Mantel-Cox檢驗比較ALS與ALS；mir-17~92 MN-OE 小鼠，P<0.0001)。
圖8A至E展示藉由在成年期過度表現mir-17~92進行的SOD1 G93A 小鼠基因療法足以保護神經肌肉功能且延長壽命。(A)實驗策略 之概述。時間線顯示用於分析之治療時程及階段。左側之示意圖說明在腰椎鞘內注射(在L6與S1間)表現mir-17~92或作為對照之GFP之初級轉錄物的scAAV9。(B)已進行對照scAAV9-GFP或scAAV9-mir-17~92注射之SOD1 G93A 小鼠之P100腰椎脊髓中的miR-17原位雜交。比例尺為50μm。(C)qPCR分析揭示與注射scAAV9-GFP之SOD1 G93A 小鼠相比，在注射scAAV9-mir-17~92後P100時SOD1 G93A 小鼠整個腰椎脊髓中之mir-17~92表現明顯升高。(平均值±s.d.，n=4，*P<0.05，雙尾t檢驗)。(D)如藉由刺激坐骨神經後GA肌肉中誘發之CMAP所分析的注射scAAV9前後之神經肌肉功能。標繪由指定年齡之各組得到的最大峰間CMAP值之平均值。在注射scAAV9時SOD1 G93A 小鼠中之CMAP幅度已在減小，且隨時間推移逐漸進一步減小，而mir-17~92之過度表現在P120及P140時明顯改善神經肌肉功能。(平均值±s.d.，n=4~7隻/組，關於藉由雙因素ANOVA比較注射scAAV9-mir-17~92之小鼠與注射scAAV9-GFP之小鼠，*P<0.05)。(E)在scAAV9遞送mir-17~92後，SOD1 G93A 小鼠之壽命延長約14%。卡普蘭-邁耶存活曲線反映Ctrl；AAV9-mir-17~92(n=13)、ALS；AAV9-GFP(n=15)及ALS；AAV9-mir-17~92(n=17)小鼠之存活率。(***關於藉由對數秩Mantel-Cox檢驗比較ALS；AAV9-GFP小鼠與ALS；AAV9-mir-17~92小鼠，P<0.0005)。
儘管與本文所述之方法及材料類似或等效的任何方法及材料均可用於實踐或測試本文所述之實施例，但本文描述一些較佳的方法、組合物、裝置及材料。然而，在描述本發明材料及方法之前，應理解，本發明不限於本文中所描述之特定分子、組合物、方法或方案，因為其可根 據常規實驗及最佳化而變化。亦應理解，用於本描述中之術語僅出於描述特定型式或實施例之目的，且並不意欲限制本文中所描述之實施例之範圍。
除非另外定義，否則本文中所使用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域一般技術者通常所理解相同之含義。
除非上下文另外明確規定，否則如本文及所附申請專利範圍中所使用，單數形式「一個(種)(a)」、「一個(種)(an)」及「該」包括複數個(種)參考物。
如本文中可互換地使用，術語「miR基因產物」、「微RNA」、「miRNA」或「miR」意謂與編碼RNA雜交且調節編碼RNA之表現的長度在18個與25個核鹼基之間之非編碼RNA。
如本文所用，術語「投藥(administration)」及「投與(administering)」係指將藥物、前藥或其他藥劑或治療劑提供給個體或者活體內、活體外或離體細胞、組織及器官之行為。
如本文所用，術語「有發展……之風險」意謂個體易於發展病狀或疾病。在某些實施例中，有發展病狀或疾病之風險的個體展現該病狀或疾病之一或多種症狀，但並未展現足夠被診斷患有該病狀或疾病之數目的症狀。在某些實施例中，有發展病狀或疾病之風險的個體展現該病狀或疾病之一或多種症狀，但程度比被診斷患有該病狀或疾病所要求之程度要輕。
如本文所用，術語「預防……之發作」意謂預防有發展疾病或病狀之風險的個體發展該病狀或疾病。在某些實施例中，有發展疾病或病狀之風險的個體接受與已患有該疾病或病狀之個體所接受之治療類似 的治療。
如本文所用，術語「延遲……之發作」意謂延遲有發展疾病或病狀之風險的個體中該病狀或疾病之發展。在某些實施例中，有發展疾病或病狀之風險的個體接受與已患有該疾病或病狀之個體所接受之治療類似的治療。
在一個態樣中，本發明提供一種治療或預防個體之運動神經元退化疾病之方法，其包含向該個體投與治療或預防有效量的一或多個編碼mir-17~92叢集之成員之基因或轉殖基因。
在另一態樣中，本發明提供一種改善患有運動神經元退化疾病之個體之運動缺陷及延長其壽命的方法，其包含向該個體投與有效量的一或多個編碼mir-17~92叢集之成員之基因或轉殖基因。
在一些實施例中，本發明之投藥包含將mir-17~92叢集之一或多個成員遞送至個體之中樞神經系統中。在一些實施例中，將mir-17~92叢集之一或多個成員遞送至個體之脊髓中。
在一些實施例中，運動神經元退化疾病之治療或預防係經由SOD1 G93A MN中mir-17~92叢集之一或多個成員之過度表現實現。在一個實施例中，SOD1 G93A MN中mir-17~92叢集之一或多個成員之過度表現伴隨PTEN以及E3接合酶Nedd4-2及Ndfip1之表現降低。在一個實施例中，SOD1 G93A MN中mir-17~92之早期選擇性下調係在MN退化發作之前發生。因此，mir-17~92/nPTEN在SOD1 G93A 脊髓中MN退化即將發作之前呈現MN標籤分子之改變。在一個實施例中，選擇性mir-17~92/nPTEN失調早期在SOD1 G93A LMC MN出現且可賦予對ALS疾病之MN亞型易損性。
在一些實施例中，本發明之方法可延遲或預防MN退化之發作或降低發展MN退化之風險。
運動神經元疾病(MND)係選擇性影響運動神經元之若干神經退化病症中之任一種，運動神經元係控制身體之隨意肌之細胞。在一些實施例中，本發明中所描述之運動神經元退化疾病包括肌肉萎縮性側索硬化(ALS)及脊髓性肌肉萎縮症(SMA)。在一些實施例中，ALS係家族性ALS或偶發性ALS。
在一些實施例中，mir-17~92叢集之成員包括(但不限於)mir-17、mir-17*、mir-18a、mir-19a、mir-19b、mir-20a及mir-92a。在一個實施例中，mir-17~92叢集之成員係mir-17。
在一些實施例中，本發明之基因或轉殖基因係併入或囊封於載劑中以用於投與或遞送。在一些實施例中，載劑係病毒載體或奈米粒子。在一些實施例中，病毒載體係scAAV9、重組AAV之任何血清型(諸如AAV1、AAV2、AAV9、AAV2/1、AAV2/5、AAV2/8、AAV2/9)或慢病毒。能夠驅動mir-17~92叢集表現之任何啟動子均可用於載體中。在一些實施例中，啟動子係H1、CMV、RSV、SV40、人類β-肌動蛋白、人類延長因子1α或細胞巨大病毒早期增強子/雞β-肌動蛋白。在某一實施例中，本發明之轉殖基因包含CMV啟動子及一或多個編碼mir-17~92叢集之成員之基因。
在一些實施例中，本發明之方法進一步包含投與一或多種靶向SOD1或MMP9之抑制性核酸、編碼nPTEN干擾肽之轉殖基因、內質網(Endoplasmic Reticulum，ER)壓力抑制劑、壓力顆粒阻斷劑或miRNA生物發生活化劑。
適用於本發明方法中之抑制性核酸包括反義寡核苷酸、siRNA化合物、諸如siRNA化合物之單股或雙股RNA干擾(RNAi)化合物、經修飾之鹼基/鎖核酸(LNA)、肽核酸(PNA)及與標的SOD1或MMP9之至少一部分雜交的其他寡聚化合物或寡核苷酸模擬物。在一些實施例中，抑制性核酸包括反義RNA、反義DNA、嵌合反義寡核苷酸、包含經修飾鍵聯之反義寡核苷酸、干擾RNA(RNAi)、短干擾RNA(siRNA)、微干擾RNA(miRNA)、小時序RNA(stRNA)、或短髮夾RNA(shRNA)、小RNA誘導之基因活化(RNAa)、小活化RNA(miRNA)或其組合。
舉例而言，反義寡核苷酸通常設計成藉由結合至DNA或RNA標的且阻止在轉錄、轉譯或剪接層面上之表現來阻斷該標的之表現。本發明之反義寡核苷酸係經設計以在嚴格條件下與SOD1或MMP9雜交之互補核酸序列。
舉例而言，本文所描述之方法中所用之抑制性核酸包含一或多個經修飾之鍵或鹼基。經修飾之鹼基包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、肽核酸或鎖核酸(LNA)分子。較佳地，經修飾之核苷酸為鎖核酸分子，包括α-L-LNA。LNA包含核糖核酸類似物，其中核糖環經2'-氧與4'-碳間的亞甲基橋「鎖定」；亦即，含有至少一個LNA單體之寡核苷酸。
舉例而言，與SOD1或MMP9互補之核酸序列可為干擾RNA，包括(但不限於)小干擾RNA(「siRNA」)或小髮夾RNA(「shRNA」)。用於構築干擾RNA之方法係此項技術中所熟知的。
本發明之基因或與該基因組合的本文所述之試劑可調配為醫藥組合物或與醫藥學上可接受之載劑的組合。該等醫藥組合物或組合可調配成非經腸、體表、經口、鞘內或藉由局部投藥方式投與。該等醫藥組 合物或組合可以任何方式調配且可視病狀或疾病以及疾病程度、各患者之一般醫學狀況、所得較佳投藥方法及類似因素而以多種單位劑型投與。在一個實施例中，該醫藥組合物或組合可經鞘內投與。舉例而言，在實施例中，該醫藥組合物或組合可經由鞘內注射活體內投與。
本發明之醫藥組合物或組合可根據此項技術中已知用於製造醫藥之任何方法製備。此類藥物可含有甜味劑、調味劑、著色劑及防腐劑。調配物可混有適合製造的醫藥學上可接受之無毒賦形劑。調配物可包含一或多種稀釋劑、乳化劑、防腐劑、緩衝劑、賦形劑等，且可以諸如以下形式提供：液體、粉末、乳液、凍乾粉末、噴霧劑、乳膏、洗劑、控制釋放調配物、錠劑、丸劑、凝膠、在貼片上、在植入物中等。
在一些實施例中，本文所描述之方法可包括與一或多種靶向SOD1或MMP9之抑制性核酸、編碼nPTEN干擾肽之轉殖基因、ER壓力抑制劑、壓力顆粒阻斷劑或miRNA生物發生活化劑共投與。
在另一態樣中，本發明提供一種在活體外篩選保護ALS中之運動神經元亞型之藥物的方法，其包含(i)提供帶有包含fALS基因及報導體基因之轉殖基因之幹細胞株；(ii)將藥物與該細胞株一起培養；(iii)引導該細胞分化成運動神經元細胞及表現；及(iv)若自該幹細胞株中產生運動神經元亞型，則判定該藥物有效地保護ALS中之運動神經元亞型。
在一些實施例中，幹細胞株係胚胎幹細胞株或iPSC細胞株。在一些實施例中，幹細胞株係人類或小鼠幹細胞株。
在一些實施例中，fALS基因係含有經擴增之GGGGCC重複序列之C9orf72突變、FUS-R521C、FUS-P525R、FUS-R521H、FUS-Q210H、FUS-R514G、FUS-C1574G、SOD1-G93A、SOD1-A4V、 SOD1-D90A、SOD1-D91A、SOD1-H46R、SOD1-A89V、SOD1-I113T、TDP43-A315T、TDP43-Q343R、TDP43-M337V、TDP43-N345K、TDP43-I383V或TDP43-M337V。
在一些實施例中，該報導體為雙報導體。在一些實施例中，該雙報導體為Hb9：：RFP及FoxP1：：GFP。
在另一態樣中，本發明提供一種用於診斷個體之ALS中之運動神經元亞型的方法，其包含提供生物樣品及偵測mir-17~92叢集之一或多個成員或者nPTEN之存在，其中失調之mir-17~92成員或nPTEN之存在指示對個體之ALS中之運動神經元亞型的診斷或對ALS中運動神經元亞型之易感性。
本文亦提供用於診斷個體之ALS中之運動神經元亞型或對ALS中運動神經元亞型之易感性的套組，其包含一或多種用於偵測生物樣品中mir-17~92叢集之一或多個成員或者PTEN之存在的試劑。在一個特定實施例中，該套組包含至少一個用於偵測mir-17~92叢集之一或多個成員或者PTEN之存在的連續核苷酸序列，該核苷酸序列實質上係mir-17~92叢集之一或多個成員或PTEN或者與其互補。舉例而言，核酸可包含至少一個與mir-17~92或PTEN(完全、部分)互補之序列。在一個實施例中，該套組中之一或多種試劑經標記，且因此，該等套組可進一步包含能夠偵測該標記之試劑。該套組可進一步包含有關使用該套組之組件偵測ALS中之運動神經元亞型的說明書。
以下實例中進一步描述本發明，該等實例不限制申請專利範圍中所描述之本發明之範圍。
實例
材料及方法
小鼠
攜帶突變型人類SOD1 G93A 轉殖基因(B6SJL-Tg(SOD1*G93A)1Gur/J之小鼠係購自傑克遜實驗室(Jackson Laboratory)。預先產生過度表現運動神經元特異性mir17~92之小鼠Olig2 Cre/+ ；ROSA26-loxp-STOP-loxp-mir-17~92 f/f (mir-17~92 MN-OE )(20)，且進一步使其與SOD1 G93A /+；ROSA26-loxp-STOP-loxp-mir-17~92 f/f 小鼠雜交以獲得SOD1 G93A ；Olig2 Cre/+ ；ROSA26-loxp-STOP-loxp-mir-17~92/ ff或f/+(ALS；mir-17~92 MN-OE )拯救小鼠(rescue mice)。對於所有實驗，將ALS；mir-17~92 MN-OE 小鼠與其SOD1 G93A ；Olig2 Cre/+或SOD1 G93A ；ROSA26-loxp-STOP-loxp-mir-17~92 f/+或f/f ALS同胎仔畜相比較。
為了產生具有雙轉殖基因(Tg)報導體之小鼠，將脊髓MN報導體Hb9：：RFP構築體經電穿孔放入BALB/c胚胎幹細胞(ESC)中且注射至宿主小鼠中。若干嵌合小鼠出生且進一步使其與C57BL/6J野生型小鼠雜交以獲得種系傳遞之轉殖基因Hb9：：RFP始建系(founder line)。使用具有在起始密碼子處插入約195kb之5' FoxP1序列及GFP之BAC的FoxP1：：GFP ES細胞株(由Jeremy Dasen及Hynek Wichterle惠贈)(44)在C57BL/6背景下得到FoxP1：：GFP小鼠品系。隨後，使FoxP1：：GFP品系與Hb9：：RFP品系配對，得到在C57BL/6背景下具有雙Tg報導子(FoxP1：：GFP；Hb9：：RFP)之小鼠。在E12.5時分析雙Tg FoxP1：：GFP；Hb9：：RFP胚胎以驗證雙報導體之功效。所有活動物均保持在經中央研究院動物實驗管理小組(IACUC Academia Sinica)批准及監督之SPF動物設施中。
組織收集
小鼠在用300μL之20mg/mL阿佛丁(Avertin)(2,2,2-三溴乙醇，Sigma)麻醉下處死且隨後灌注PBS及含4%多聚甲醛(PFA)之PBS。分離整個脊髓，再固定且在蔗糖中低溫保存。將脊髓包埋於FSC 22冷凍切片包埋劑(Leica)中，且切割為10μm恆冷箱切片(cryostat section)，隨後藉由3' DIG標記之LNA miRCURY探針(Exiqon)進行免疫染色或原位雜交。
雷射捕獲顯微切割
小鼠在用阿佛丁麻醉下處死且隨後灌注DEPC-PBS。取出脊髓且在7分鐘內切割成若干段，隨後包埋於FSC 22冷凍切片包埋劑(Leica)中。在-20℃下，將冷凍塊低溫切割成20μm厚之切片且儲存在-80℃下直至雷射捕獲程序。
對於MN之染色，各切片用不含RNA酶之70%乙醇洗滌60秒，在含1%天藍B(MP Biomedicals)之洗滌溶液中染色180秒，隨後再洗滌20秒，且隨後完全風乾。MN係鑑別為存在於L5腰椎脊髓之腹側區中的較深染色之大細胞體，而背側非MN係鑑別為位於背側脊髓中的經天藍B染色之細胞體。自各小鼠顯微切割(PALM MicroBeam，ZEISS，20X物鏡)約400~500個MN或背側非MN且收集至單個管中。自每一品系之3~4隻小鼠收集MN及背側非MN。
脊髓運動神經元計數
在各指定階段，在10μm脊髓切片之一側對L5腹角中具有DAPI之ChATon MN計數。不包括展示不規則核形狀之MN。直方圖展示來自每隻相同年齡及基因型之小鼠(n
Figure 108111841-A0305-02-0020-7
3隻小鼠)之至少3個切片中的平均 MN計數。
AAV9病毒製備及注射
AAV9-mir-17~92及AAV9-GFP係由中央研究院之AAV核心設施(AAV Core Facility)封裝。對於鞘內注射，在P60時小鼠藉由異氟醚麻醉。經由在小鼠背部以手術方式切開約1.5cm窗口，暴露出腰椎脊髓。使用27G針將20μL之AAV9-GFP或AAV9-mir-17~92(5×109vg/μL)以4μL/min之速率注射至在L6與S1段間的溝中。小鼠尾部輕擊指示成功注射。
實例1 mir17~92/PTEN在成體脊髓MN中表現及維持MN存活之mir-17~92要求
在先前研究(Tung，Y.T.，Lu，Y.L.，Peng，K.C.，Yen，Y.P.，Chang，M.，Li，J.，Jung，H.，Thams，S.，Huang，Y.P.，Hung，J.H.等人(2015).Mir-17~92 Governs Motor Neuron Subtype Survival by Mediating Nuclear PTEN.Cell reports 11，1305-1318)中發現，mir-17~92 miRNA叢集之表現在正在發育之LMC-MN中富集，且該叢集用以在LMC-MN到達神經支配肌肉並自其得到神經營養支持前促進LMC-MN存活。在作用機轉上，mir-17~92靶向PTEN及其相關E3泛素接合酶複合物，亦即Nedd4-2及Ndfip1。因此，PTEN單泛素化較少且大部分保留在細胞質中以防止LMC-MN在正在發育之脊髓中經歷自然細胞凋亡(圖1A)。
鑒於許多脊髓發作ALS患者係自四肢無力開始，且活動性去神經(active denervation)在ALS患者之四肢中比在其胸椎椎旁肌中發生得更顯著，故LMC-MN看來比在ALS中之其他MN類型更容易發生退化 (Kanning，K.C.，Kaplan，A.及Henderson，C.E.(2010).Motor neuron diversity in development and disease.Annual review of neuroscience 33，409-440)。此情形促使吾人檢查mir-17~92/nPTEN是否能經由其在成體MN亞型中之不同表現造成ALS中MN亞型的不同易損性(圖1A)。
先使用miR-17作為叢集中之代表性miRNA且膽鹼乙醯轉移酶(ChAT)作為MN標記物，在產後第40天(P40)藉由在經切片之成體腰椎脊髓中進行原位雜交(ISH)以及免疫染色，檢查mir-17~92之表現在成體脊髓MN中是否仍保持富集(圖1B)。儘管在整個脊髓中之神經元中可偵測到miR-17之表現，但其表現在腹側脊髓中更顯著(圖1B)。定量驗證了相較於位於腹側脊髓處之閏紹細胞(Renshaw cell，RC)，脊髓MN中之miR-17表現量較高。
為了證實mir-17~92叢集之每一成員在MN中富集，對腹側MN及來自背側脊髓之非MN的細胞體進行雷射顯微切割(圖1C及圖1D)並進行定量RT-PCR(qPCR)。使用ChAT以確保捕獲了真正之MN(圖1E)。與來自背側脊髓之非MN相比，在成年小鼠脊髓之MN中mir-17~92之表現量更高(圖1F)，證實mir-17~92之表現富集且自發育之胚胎持續至成體脊髓MN。
隨後，檢查mir-17~92之標的(亦即，PTEN)在成體脊髓中之表現。值得關注地是，PTEN在腹側ChATon MN中大量表現且主要位於細胞溶質中，而PTEN在背側細胞及Calbindinon RC中之表現幾乎無法偵測。此等結果指示，在成體脊髓中，PTEN優先在脊髓MN中表現且展現差別性細胞溶質定位，由此可能反映mir-17~92表現之富集。
吾人先前之研究指示，MN中mir-17~92缺失(Olig2 Cre/+； mir-17~92 floxed =mir-17~92 MN△ )導致在胚胎階段E12.5~13.5時LMC-MN之特定損失(Tung，Y.T.，Lu，Y.L.，Peng，K.C.，Yen，Y.P.，Chang，M.，Li，J.，Jung，H.，Thams，S.，Huang，Y.P.，Hung，J.H.等人(2015).Mir-17~92 Governs Motor Neuron Subtype Survival by Mediating Nuclear PTEN.Cell reports 11，1305-1318)。因此，約70%之mir-17~92 MN△ 胚胎可能因嚴重運動缺陷而在新生兒時死亡(N=69)。剩餘存活之mir-17~92 MN△ 小鼠允許吾人評定在出生後之後續階段的MN表型。在此等突變小鼠(N=17)中，有約85%展現較小體型及較輕體重。幾乎所有的mir-17~92 MN△ 小鼠均展示某些「ALS」病變標誌，包括1)在P30時mir-17~92 MN△ 小鼠脊髓中之ChATon MN數目明顯減少(圖1G且在1I中定量)。2).值得注意的是，在P30未在對照小鼠之腓腸肌(GA)肌肉中偵測到去神經，而mir-17~92 MN△ 小鼠呈現運動終板之急劇去神經(圖1H且在圖1J中定量)。3).mir-17~92 MN△ 小鼠之複合肌肉動作電位(CMAP)相對於對照值減少約35%(圖1K)。綜合而言，吾人之分析指示mir-17~92/PTEN在成體脊髓MN中高水準表現，且MN中mir-17~92之下調足以引起MN損失。
實例2 SOD1 G93A 小鼠之MN中mir-17~92/nPTEN軸之早期症狀發生前失調
為測試mir-17~92/nPTEN路徑之失調與ALS之MN退化有關的假設，吾人將SOD1 G93A 小鼠模型用作範例。在整個成年期中，在P80前SOD1 G93A 腰椎脊髓中之ChATon MN之數目保持不受影響，且在P100時略有減少(圖2A，在圖2B中定量)。即使在P80時Ctrl與SOD1 G93A 小鼠之間之MN數目相當，吾人亦已觀測到SOD1 G93A MN中之miR-17表現明顯下調(圖2C，在圖2D中定量)。在Ctrl與SOD1 G93A 小鼠兩者間之指定年齡期間，由於miR-17表現在背側Tuj1on中間神經元(dIN，對ALS有抗性)與 calbindinon RC(在症狀發生前ALS階段中保持完整)兩者中保持較低且相當之水準，下調趨勢看來在MN中更為突出(Wootz，H.，Fitzsimons-Kantamneni，E.，Larhammar，M.，Rotterman，T.M.，Enjin，A.，Patra，K.，Andre，E.，Van Zundert，B.，Kullander，K.及Alvarez，F.J.(2013).Alterations in the motor neuron-renshaw cell circuit in the Sod1(G93A)mouse model.J Comp Neurol 521，1449-1469)。
為了精確定量在退化前完整SOD1 G93A 側部MN中miR-17以及mir-17~92叢集之其他成員的表現，吾人使用雷射顯微切割自P100之Ctrl及SOD1 G93A 小鼠收集側腹脊髓中基於MN之大小及形狀看具有健康形態之MN(圖2E)，且藉由qPCR比較mRNA/miRNA之表現。雖然在經顯微切割之對照與SOD1 G93A MN之間ChAT之表現不變(圖2F)，但mir-17~92之若干成員在SOD1 G93A MN中之表現已呈現明顯下降(圖2G)。此等資料反映出mir-17~92之表現在SOD1 G93A MN中之MN死亡開始前下調。
此外，除了mir-17~92在相同組經顯微切割之MN中之下調外，吾人還觀察到，與對照相比時，在P100時所捕獲之SOD1 G93A MN中其標的PTEN、Nedd4-2及Ndfip1的表現伴隨增加(圖2H)。由於Nedd4-2/Ndifp1促進PTEN單泛素化以推動其核輸入(Tung等人，2015)，接下來分析在P40、P80及P100時來自對照及SOD1 G93A 小鼠之MN中的亞細胞PTEN定位。在P100之SOD1 G93A MN中，PTEN之強度在全細胞(PTEN總)中以及在核(PTEN核)中明顯增加(圖2I)。另外，吾人亦觀察到SOD1 G93A MN中PTEN核/細胞溶質之比率顯著升高(圖2J)，表明升高之PTEN傾向於積聚在MN核中。在mir-17~92減少時(P80)直到明顯nPTEN積聚(P100)之延遲可能反映PTEN轉錄後調節及轉譯後修飾組合所需之時間。相比於ChATon 腹側MN，PTEN在對照、SOD1 G93A Calbindinon RC及Tuj1on dIN中之表現在所有年齡皆保持幾乎無法偵測(資料未展示)。總體而言，資料展示mir-17~92/nPTEN路徑之破壞係SOD1 G93A 脊髓中MN損失開始前脊髓MN中之標誌事件。
實例3 SOD1 G93A LMC-MN中mir-17~92之選擇性失調
為了進一步檢查mir-17~92失調是否促成支配肢體之MN對ALS之易損性，在此情境下，吾人確立一種新穎的雙重轉殖基因小鼠品系，其中支配肢體之LMC-MN標記有GFP(Foxp1：：GFP)且普通運動神經元標記有RFP(Hb9：：RFP)。為驗證報導體之保真度，吾人檢查雙重螢光報導體沿脊髓之延喙尾軸之表現模式。如所預期，在LMC-MN中偵測到Foxp1：：GFP信號，而在LMC-MN及非LMC-MN兩者中偵測到Hb9：：RFP信號。因此，LMC-MN及非LMC-MN可藉由活體內轉殖基因報導體之組合來區分，其中GFPon/RFPon代表LMC-MN且GFPoff/RFPon代表非LMC-MN。然而，Foxp1：：GFP在LMN-MN中之特異性表現變少且在一些脊髓IN中表現。此外，Hb9：：RFP亦侷限於成體MN之子集(資料未展示)。因此，吾人採用替代性胚胎幹細胞(ESC)分化方法，利用以下事實：1)高保真度轉殖基因報導體可用於描繪MN亞型；2)充分確立了用於得到具有真正延喙尾脊髓屬性之MN亞型的條件(Davis-Dusenbery，B.N.，Williams，L.A.，Klim，J.R.及Eggan，K.(2014).How to make spinal motor neurons.Development 141，491-501 Davis-Dusenbery等人，2014)；3)可用雙報導體系統以FACS收集有絲分裂後MN亞型；及4)充分確定了用於在活體外使MN成熟及加速MN退化之條件(Thams，S.，Lowry，E.R.，Larraufie，M.H.，Spiller，K.J.，Li，H.，Williams， D.J.，Hoang，P.，Jiang，E.，Williams，L.A.，Sandoe，J.等人(2018).A Stem Cell-Based Screening Platform Identifies Compounds that Desensitize Motor Neurons to Endoplasmic Reticulum Stress.Molecular therapy：the journal of the American Society of Gene Therapy)。
在此情況下，吾人進一步得到Foxp1：：GFP；Hb9：：RFP胚胎幹細胞(ESC)株，且隨後使用確定之方案使其分化成脊髓MN，由此產生頸/臂Hoxa5on MN(由約15% LMC-MN及約85%非LMC-MN構成)。關於ESC源性MN之免疫染色揭示，Hb9：：RFP細胞與通用MN標記物Isl1/2及Hb9共表現，而Foxp1：：GFP細胞根據LMC-MN屬性呈現為Foxp1on/Lhx3off。此結果藉由針對FACS純化之GFPon/RFPon細胞之qPCR分析進一步驗證，其展現Raldh2及Foxp1之高表現，但展現Lhx3之低表現。綜上所述，吾人之雙報導體系統提供一個在充分確定之分化系統中研究LMC-MN相對於非LMC-MN表型之理想平台。
隨後，吾人使Foxp1：：GFP；Hb9：：RFP品系與Ctrl及SOD1 G93A 小鼠雜交，以得到Ctrl及SOD1 G93A 雙報導體ESC細胞株，隨後使其發育(harnessed)成MN亞型(圖3A)。在分化時不存在壓力條件之情況下，Ctrl及SOD1 G93A 細胞株兩者可分化成類似之LMC-MN及非LMC-MN，且無優先細胞損失。在基礎條件下，Ctrl與SOD1 G93A 細胞株間mir-17~92成員之表現量亦類似。為了加快活體外ALS疾病進展，吾人將環匹阿尼酸(CPA)施加至Ctrl及SOD1 G93A ESC源性MN。在應用此處使用之相同ESC分化方法的近期研究中(Thams，S.，Lowry，E.R.，Larraufie，M.H.，Spiller，K.J.，Li，H.，Williams，D.J.，Hoang，P.，Jiang，E.，Williams，L.A.，Sandoe，J.等人(2018).A Stem Cell-Based Screening Platform Identifies Compounds that Desensitize Motor Neurons to Endoplasmic Reticulum Stress.Molecular therapy：the journal of the American Society of Gene Therapy)，展示CPA對MN展現優先毒性且對IN僅有輕度作用之內質網壓力子。在CPA壓力下，吾人發現在Ctrl及SOD1 G93A MN兩者中非LMC-MN群體對ER壓力子更具抗性。相反地，相比於Ctrl LMC-MN，在CPA處理24~48小時後SOD1 G93A LMC-MN展現急劇細胞損失(圖3B及3C)。值得注意地是，當僅用媒劑(DMSO)處理時，Ctrl與SOD1 G93A ESC源性MN間未顯示不同的退化(圖3B及3C)。因此，使用吾人新確立之ALS雙報導體系統，可在CPA處理下捕獲到MN亞型間不同程度之退化。
為了闡明MN亞型對CPA壓力的敏感性差異，吾人研究CPA處理後24小時(亦即，在LMC-MN損失之前的時間點)時在吾人之ESC源性MN系統中mir-17~92及其標的(PTEN、Ndfip1及Nedd4-2)之表現。在SOD1 G93A LMC-MN中，吾人觀測到mir-17~92成員下調之趨勢，但在Ctrl與SOD1 G93A 非LMC-MN間未觀測到明顯差異(圖3D及3E)。同時，在SOD1 G93A LMC-MN中mir-17~92標的(PTEN、Ndfip1及Nedd4-2)之表現亦特異性上調(圖3F及3G)。綜上所述，SOD1 G93A LMC-MN更易於在壓力下發生退化，且選擇性呈現mir-17~92下調。
實例4 SOD1 G93A LMC-MN更易於發生mir-17~92/nPTEN失調
隨後，吾人研究在CPA處理後24小時自Ctrl及SOD1 G93A 小鼠兩者中得到的LMC-MN及非LMC-MN中PTEN亞細胞定位之變化。PTEN主要分佈於Ctrl組中非LMC-MN及LMC-MN之細胞溶質中(圖4A)，類似於關於成體脊髓MN之觀測結果(圖2I)。根據吾人之模型，吾人觀測到相 比於Ctrl LMC-MN，在壓力子處理後SOD1 G93A LMC-MN中之PTEN核/細胞溶質比率明顯增加，而Ctrl及SOD1 G93A 非LMC-MN之PTEN核/細胞溶質比率不存在差異(圖4A；在圖4B中定量)。
為了進一步細查MN亞型是否對nPTEN之細胞毒性起不同反應，吾人採用卵內系統，藉由將PTEN與核定位或核輸出信號(NLS及NES)之融合物電穿孔放入正在發育之雞胚胎中進行(圖4C)。與PTEN-WT及PTEN-NES之微小作用相比，PTEN-NLS之異位過度表現則導致Foxp1on LMC-MN之明顯損失。值得關注地是，Lhx3on非LMC-MN對PTEN表現更具抗性。此結果指示nPTEN優先造成LMC-MN死亡(圖4D，在圖4E中定量)。
總之，此等發現表明選擇性mir-17~92/nPTEN失調在SOD1 G93A LMC-MN早期出現且賦予對ALS之MN亞型易損性。
實例5 人類ALS SOD1 +/L144F iPSC源性MN中hsa-mir-17~92/nPTEN失調之重演
為了進一步探究在人類MN情形下mir-17~92之作用是否相關，吾人使帶有MN報導體Hb9：：GFP(HuES3 HB9：：GFP)之人類ESC細胞株在限定條件下分化為MN(Maury，Y.，Come，J.，Piskorowski，R.A.，Salah-Mohellibi，N.，Chevaleyre，V.，Peschanski，M.，Martinat，C.及Nedelec，S.(2014).Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes.Nature biotechnology)，由此重演自OLIG2on祖細胞MN(第9天)在第14天發育為HB9on/ISL1on新生MN之發育時間次序。在第16天，藉由FACS收集Hb9：：GFPon MN且藉由FOXP1及 RALDH2之表現鑑定LMC-MN標記物之富集。與吾人在小鼠MN中之發現類似(圖1F)，在FACS純化之HB9：：GFPon人類MN中hsa-mir-17~92表現量更高。
接下來，自攜帶SOD1 +/L144F 突變之ALS患者獲得人類誘導性多能幹細胞(iPSC)(Boulting，G.L.，Kiskinis，E.，Croft，G.F.，Amoroso，M.W.，Oakley，D.H.，Wainger，B.J.，Williams，D.J.，Kahler，D.J.，Yamaki，M.，Davidow，L.等人(2011).A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells.Nature biotechnology 29，279-286)，且進一步產生由CRISPR-Cas9系統介導的同基因對照SOD1 +/+細胞株以校正突變之DNA序列(圖5A及5B)。該兩個iPSC細胞株在吾人之培養條件下展現不可區分之多能標誌與正常核型，且該兩個細胞株之間之SOD1表現量相當。兩個iPSC細胞株均可遵循發育時間次序成功分化為SMI32on ISL1on MN，且具有約80%效率。接著，在補充有神經營養因子(NF)之培養基中再培養分離之MN兩週，直至呈現較為成熟之標記物CHAT。大部分(約75%)的ISL1on MN在第16天獲得FOXP1on LMC-MN屬性且其後，提供一個在ALS情況下研究人類LMC-MN之理想系統。
為了加快ALS進展，吾人在MN成熟後(自第32~60天)剝奪培養基中之NF(Shi，Y.，Lin，S.，Staats，K.A.，Li，Y.，Chang，W.H.，Hung，S.T.，Hendricks，E.，Linares，G.R.，Wang，Y.，Son，E.Y.等人(2018).Haploinsufficiency leads to neurodegeneration in C9ORF72 ALS/FTD human induced motor neurons.Nature medicine 24，313-325)，導致自ALS-SOD1 +/L144F iPSC得到的FOXP1on ISL1on LMC-MN更顯著減少(圖5C~圖5E)。隨後，吾人檢查在NF剝奪之前及14天之後的hsa-mir-17~92/nPTEN水準，此係在ALS-MN嚴重損失前的階段，使人聯想到活體內MN減少之開始。在NF剝奪之前，在Ctrl-SOD1 +/+及ALS-SOD1 +/L144F MN培養物中觀測到不可區分的hsa-mir-17~92、PTEN及NDFIP1蛋白質表現水準，以及核與細胞溶質PTEN比率。然而，在NF剝奪後14天時，hsa-17~92之表現急劇減少(圖5F)，同時PTEN、NEDD4-2及NDFIP1蛋白質水準升高，且ALS-SOD1 +/L144F MN培養物中之PTEN核/細胞溶質比率升高(圖5G及5H)。值得注意的是，在此階段，吾人未觀測到Ctrl-SOD1 +/+與ALS-SOD1 +/L144F 細胞株之間細胞損失之明顯差異(圖5E)。此發現證實了在小鼠SOD1 G93A 模型中之觀測結果：具有nPTEN積聚之hsa-mir-17~92的下調係在SOD1-ALS類型中LMC-MN損失前展現。
實例6 在人類SOD1 +/L144F iPSC源性MN中靶向hsa-mir-17~92以用於治療性應用
為研究mir-17~92是否能充當停止ALS中MN退化之標的，隨後吾人測試操縱mir-17~92之表現是否能修復人類ALS-iPSC源性MN中之MN退化。吾人在NF剝奪前利用慢病毒(LV)將hsa-mir-17~92或作為對照之YFP遞送至iPSC~MN中(圖6A)。在整個存活分析中，分別藉由免疫染色及qPCR確認ALS-SOD1 +/L144F MN中YEP及hsa-mir-17~92之持續過度表現(圖6B)。正如所料，異位hsa-mir-17~92表現引起ALS-SOD1 +/L144F MN中PTEN、NEDD4-2及NDFIP1之抑制(圖6C)，且對ALS-SOD1 +/L144F LMC-MN群具有顯著拯救作用(圖6D且在圖6E中定量)。綜上所述，此等資料證實，在MN情形中hsa-mir-17~92之過度表現可減輕ALS- SOD1 +/L144F 中之MN退化，由此提供hsa-mir-17~92可作為ALS治療之理想治療標的的原理驗證證據。
實例7 藉由在MN中過度表現mir-17~92改善SOD1 G93A 小鼠之ALS症狀
為研究mir-17~92是否能在活體內拯救ALS中之MN退化，吾人隨後測試操縱mir-17~92之表現是否能改善SOD1 G93A 小鼠之ALS症狀。吾人先前已產生條件型mir-17~92 MN-OE (Olig2 Cre/+ ；ROSA-26-LSL-mir-17~92 f/f )小鼠，且此等小鼠健康並展現正常壽命(Tung，Y.T.，Lu，Y.L.，Peng，K.C.，Yen，Y.P.，Chang，M.，Li，J.，Jung，H.，Thams，S.，Huang，Y.P.，Hung，J.H.等人(2015).Mir-17~92 Governs Motor Neuron Subtype Survival by Mediating Nuclear PTEN.Cell reports 11，1305-1318)。此處，吾人在單純C57BL/6背景下進一步使mir-17~92 MN-OE 小鼠與SOD1 G93A 品系雜交(圖7A)。ChATon MN中mir-17~9之表現復原係藉由[SOD1 G93A ；mir-17~92 MN-OE ]小鼠腰椎脊髓切片之原位雜交以及免疫染色證實。與在P100時SOD1 G93A 同胞中miR-17之幾乎無法偵測的表現量相比，[SOD1 G93A ；mir-17~92 MN-OE ]小鼠保持較高的miR-17表現量。因此，SOD1 G93A 小鼠中之MN數目減少在P100時於[SOD1 G93A ；mir-17~92 MN-OE ]小鼠中明顯停止(圖7B，在圖7C中定量)。在分子層面上，SOD1 G93A MN中PTEN核/細胞溶質比率升高在mir-17~92過度表現後降低(圖7D，在圖7E中定量)。
為進一步檢查mir-17~92過度表現是否改善ALS症狀及運動功能，吾人進行一系列生理分析(Kanning，K.C.，Kaplan，A.及Henderson，C.E.(2010).Motor neuron diversity in development and disease.Annual review of neuroscience 33，409-440)。在P140， [SOD1 G93A ；mir-17~92 MN-OE ]小鼠體重增加且展現後肢抱握症狀緩解。SOD1 G93A 小鼠中由肌肉無力引起的脊柱後凸表型亦因mir-17~92過度表現而得到改善(由侖琴射線照相檢驗)(圖7F)。行為上，[SOD1 G93A ；mir-17~92 MN-OE ]小鼠在旋桿測試中表現更好(圖7G)。引人注目的是，在C57BL/6群落中SOD1 G93A 小鼠之中值存活期為約160天，但在mir-17~92過度表現時增加至約182天，呈現約14%之壽命延長(圖7H)。
實例8 AAV9-mir17~92之成年投藥延長SOD1 G93A 小鼠存活期
在SOD1 G93A 小鼠中過度表現mir-17~92的有希望之結果促使吾人測試mir-17~92作為成年小鼠中之治療措施之潛力。吾人利用自身互補型腺相關載體血清型9(scAAV9)，藉由在P60時經鞘內注射以在整個脊髓中過度表現mir-17~92(Foust，K.D.，Salazar，D.L.，Likhite，S.，Ferraiuolo，L.，Ditsworth，D.，Ilieva，H.，Meyer，K.，Schmelzer，L.，Braun，L.，Cleveland，D.W.等人(2013).Therapeutic AAV9-mediated suppression of mutant SOD1 slows disease progression and extends survival in models of inherited ALS.Molecular therapy：the journal of the American Society of Gene Therapy 21，2148-2159)，其繞過mir-17~92之潛在功能以促進胚胎MN祖細胞之異位增殖(圖8A)。為測試病毒感染效率，吾人首先將scAAV9-GFP注射給Ctrl小鼠，且在注射後40天，在脊髓MN中以及在一些背細胞中觀測到較強且持久之GFP表現。隨後，將scAAV9-mir-17~92與scAAV9-GFP並行注射至Ctrl及SOD1 G93A 小鼠中。吾人藉由miR-17之原位雜交以及腰椎脊髓中mir-17~92成員之qPCR定量來驗證脊髓中外源mir-17~92之穩固誘導(圖8B及8C)。
為了在更接近臨床之環境中評估小鼠，吾人藉由量測 CMAP來分析MN及腓腸肌(GA)肌肉連接性。吾人在以下若干時間點進行CMAP：自P60(在即將AAV處理前)至P140。在P60時，SOD1 G93A 小鼠剛開始呈現MN去神經且展現略微受損之CMAP幅度。在P120及P140時，CMAP反應在AAV9-mir-17~92處理後明顯改善，但尚未改善達到Ctrl小鼠之水準(圖8D)。不同於SOD1反義寡核苷酸(ASO)處理促進MN神經再支配的方式(McCampbell，A.，Cole，T.，Wegener，A.J.，Tomassy，G.S.，Setnicka，A.，Farley，B.J.，Schoch，K.M.，Hoye，M.L.，Shabsovich，M.，Sun，L.等人(2018).Antisense oligonucleotides extend survival and reverse decrement in muscle response in ALS models.J Clin Invest 128，3558-3567)，吾人之資料表明，mir-17~92之過度表現明顯延長MN存活期而非促進MN神經再支配。最終，且最重要的是，mir-17~92之成年遞送亦使SOD1 G93A 小鼠之壽命自161天之中值延長至184天(圖8E)。
綜合而言，吾人之結果證實，mir-17~92係經由調節成體MN中之PTEN亞細胞易位來維持MN存活的一個必不可少的固有調節因子。在ALS情形中，藉由遺傳方法或在成體中遞送scAAV9以在MN中過度表現mir-17~92將延遲MN退化之發作、增強運動功能且延長ALS小鼠模型之壽命。此等發現設想mir-17~92係ALS患者MN退化之預後標記物及有希望的候選治療標的。

Claims (21)

  1. 一種一或多個編碼微RNA-17~92(mir-17~92)叢集之成員之基因或轉殖基因或mir-17~92叢集之一或多個成員之用途，其用於製備治療或預防個體之運動神經元(Motor Neuron，MN)退化疾病或改善患有運動神經元退化疾病之個體之運動缺陷及延長該個體之壽命的藥劑，其中該運動神經元退化疾病係肌肉萎縮性側索硬化(ALS)。
  2. 如請求項1之用途，其中該治療或預防包含將mir-17~92叢集之一或多個成員遞送至該個體之中樞神經系統中。
  3. 如請求項1之用途，其中該治療或預防包含將mir-17~92叢集之一或多個成員遞送至該個體之脊髓中。
  4. 如請求項1之用途，其中該治療或預防係經由該mir-17~92叢集之一或多個成員在MN中之過度表現實現。
  5. 如請求項4之用途，其中該mir-17~92叢集之一或多個成員在MN中之過度表現引起核磷酸酯酶與張力蛋白同源物(nuclear phosphatase and tensin homolog，nPTEN)水準之伴隨降低。
  6. 如請求項4之用途，其中該個體之MN中發生mir-17~92之早期選擇性下調，該下調之發生係在MN退化發作之前。
  7. 如請求項6之用途，其中該mir-17~92之早期選擇性下調在支配肢體之MN(limb-innervating MN，LMC MN)中出現且可賦予對ALS疾病之MN亞型易損性。
  8. 如請求項1之用途，該藥劑延遲或預防MN退化發作或降低發展MN退化之風險。
  9. 如請求項1之用途，其中該ALS係家族性ALS(fALS)或偶發性ALS。
  10. 如請求項1之用途，其中該mir-17~92叢集之成員係mir-17、mir-17*、mir-18a、mir-19a、mir-19b、mir-20a或mir-92a。
  11. 如請求項1之用途，其中該基因或轉殖基因係併入或囊封於載劑中以用於投與或遞送。
  12. 如請求項11之用途，其中該載劑係病毒載體或奈米粒子。
  13. 如請求項12之用途，其中該病毒載體係自身互補型腺相關載體血清型9(Self-Complementary Adeno-Associated Vector serotype 9，scAAV9)、重組腺相關載體(Adeno-Associated Vector，AAV)之任何血清型或慢病毒。
  14. 如請求項13之用途，其中該AAV係AAV1、AAV2、AAV9、AAV2/1、AAV2/5、AAV2/8或AAV2/9。
  15. 如請求項1之用途，其中該轉殖基因包含H1啟動子、CMV啟動子、RSV啟動子、SV40啟動子、人類β-肌動蛋白啟動子、人類延長因子-1α啟動子或細胞巨大病毒早期增強子/雞β-肌動蛋白啟動子及一或多個編碼mir-17~92叢集之成員之基因。
  16. 如請求項1之用途，其中該治療或預防進一步包含投與一或多種靶向SOD1或MMP9之抑制性核酸、編碼nPTEN干擾肽之轉殖基因、內質網(Endoplasmic Reticulum，ER)壓力抑制劑、壓力顆粒阻斷劑或miRNA生物發生活化劑。
  17. 如請求項16之用途，其中該抑制性核酸係反義寡核苷酸、siRNA化合物、單股或雙股RNA干擾(RNAi)化合物、經修飾之鹼基/鎖核酸(LNA)、肽核酸(PNA)或與該標的SOD1或MMP9之至少一部分雜交的其他寡聚化合物或寡核苷酸模擬物。
  18. 如請求項17之用途，其中該抑制性核酸係siRNA。
  19. 如請求項1之用途，其中該藥劑係以鞘內注射投與。
  20. 一種用於診斷個體之ALS中之運動神經元亞型的方法，其包含提供 生物樣品及偵測mir-17~92叢集之一或多個成員之下調或由下調之mir-17~92所介導之nPTEN之存在，其中下調之mir-17~92成員或由下調之mir-17~92所介導之nPTEN之存在指示該個體對ALS中運動神經元亞型之易感性。
  21. 一種用於診斷個體之ALS中之運動神經元亞型或對ALS中之運動神經元亞型之易感性的套組，其包含一或多種用於偵測生物樣品中mir-17~92叢集之一或多個成員之下調或由下調之mir-17~92所介導之nPTEN之存在的試劑。
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