JP6541049B2

JP6541049B2 - 筋萎縮性側索硬化症のバイオマーカー

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Publication number: JP6541049B2
Application number: JP2014006096A
Authority: JP
Inventors: 秀直佐々木; 育子高橋; 結香濱; 潤内海
Original assignee: Hokkaido University NUC; LSI Medience Corp
Current assignee: Hokkaido University NUC; LSI Medience Corp
Priority date: 2014-01-16
Filing date: 2014-01-16
Publication date: 2019-07-10
Anticipated expiration: 2034-01-16
Also published as: JP2015133919A

Description

本発明は、筋萎縮性側索硬化症の存在を検出するための検査診断及び同疾患の治療標的として有用なマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、さらにその標的遺伝子とそれらの利用に関する。

認知症を含む神経変性疾患は、一般に進行性であり、脳神経細胞の不可逆的な変性を伴うことから、早期に診断し治療を開始することが重要である。しかし、現時点では有効なバイオマーカーが確立されておらず、血清学的検査による診断法は確立されておらず、また確実な治療法も確立されていない。その結果、疾患は進行し、かつ難治性であるために、日常生活が破壊される状況となり、患者本人の肉体的負担のみならず、家族にも多大の負担を来している。このように、神経変性疾患は患者本人だけでなく、長期にわたり介護者にも多大な負担が及ぶことから、社会全体の活力の大きな損失につながるという実態がある。超高齢化社会が進む我が国では、神経変性疾患対策が国家的な重要課題となってきている。すなわち、（１）高齢化社会における医療福祉行政の基幹的課題であること、（２）認知症による膨大な経済的損失（年間5兆円相当ともいわれる）を軽減すること、（３）医療イノベーションで日本発の革新的治療法の開発を推進し、日本の医薬品輸入赤字（２兆円超）を解消すること、（４）国の5ヵ年計画（2012）で対策が必要な重点疾患（がん、難病・希少疾病、肝炎、感染症、糖尿病、脳心血管疾患、精神神経疾患、小児疾患）に指定されていること、などである。これらの疾患の診断と治療に役立つ新たなバイオマーカーの開発、検査診断薬、治療薬、治療法の開発が緊急の課題となっている。

検査診断法の疾患関連バイオマーカーが特定され、血清学的診断法により簡便に早期の診断及び病態のモニタリングが実施できるようになれば、早期治療が可能となり、多くの患者の不可逆的なダメージを最小限に抑えることが可能となる。早期診断が可能となれば、患者だけでなく介護者のＱＯＬの向上、ひいては超高齢化を迎えた日本社会全体の活力の維持にも大きく貢献することは間違いない。治療法に関しては、病態改善薬のみならず、進行抑制薬も十分に医療上の意義が高いことから、疾患関連バイオマーカーの神経系に対する機能の解析も重要になっている。

神経変性疾患の発症や病態に関わる生体内因子は、遺伝子から細胞まで広く研究されているが、未解明な部分が非常に多く、未だに診断や治療につながる有用なバイオマーカーは見出されていない。難治性神経変性疾患のうちでも、筋萎縮性側索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis：ＡＬＳ）は重篤な神経機能障害と死に至る疾患であり、有用なバイオマーカーの開発は緊急の課題となっている。

近年、生体内因子の重要な因子として、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡと略す）が注目されている。ｍｉＲＮＡは、約２２塩基の蛋白質非翻訳ＲＮＡ（small non-coding RNA）であり、ヒトには約2000種類が存在することが示唆されている。ｍｉＲＮＡは生体内でさまざまな遺伝子の発現抑制を行う分子として注目される。ゲノム上には各ｍｉＲＮＡ遺伝子の領域が存在し、ＲＮＡポリメラーゼIIによって転写され、約数百塩基のｍｉＲＮＡ初期転写産物が形成される。ｍｉＲＮＡ初期転写産物は核内でＤｒｏｓｈａ、細胞質内でＤｉｃｅｒと呼ばれる２種類のＲＮａｓｅ III酵素によってプロセシングされ、成熟ｍｉＲＮＡが形成される。成熟ｍｉＲＮＡは制御タンパク質複合体（RNA-induced silencing complex：ＲＩＳＣ）と協調しつつ、相補的配列をもつ複数のターゲット遺伝子のｍＲＮＡと相互作用し、遺伝子の発現を抑制することが知られている。

ｍｉＲＮＡはヒト疾患に広く関連が示唆されているが、特にがんとｍｉＲＮＡの関係に関して、様々な臓器において正常組織とがん組織で多くのｍｉＲＮＡの発現様式が異なることから、発がん過程へのｍｉＲＮＡ発現異常の関与が強く示唆されている。すなわち、腫瘍抑制的ｍｉＲＮＡの発現低下あるいは発がん促進的ｍｉＲＮＡの発現上昇がヒト発がん過程に関与している可能性が強く示唆されている（非特許文献１）。ｍｉＲＮＡの産業上の利用に関しても、がんの領域での利用が主体であったが、ようやく各種疾患に対する創薬への利用が報告され始めてきた（非特許文献２）。血中に存在するｍｉＲＮＡを疾患関連バイオマーカーとして、検査診断に利用できることも、がん（非特許文献３）や心疾患（非特許文献４）で報告されている。
神経疾患分野においては、血液よりも、中枢神経系の脳脊髄液（cerebrospinal fluid:ＣＳＦ）に存在するｍｉＲＮＡが診断学的な意味があることが報告され、たとえば、多発性硬化症（multiple sclerosis:ＭＳ）では、miR-922、miR-181c、miR-633などがその候補として報告されている（非特許文献５）。また一方で、損傷後の神経の再生にｍｉＲＮＡを利用する方法（特許文献１）や多能性ストローマ細胞のニューロン分化を刺激する方法（特許文献２）が報告されている。

しかしながら、ｍｉＲＮＡは各種疾患に広く関与している可能性が高いにもかかわらず、具体的にＡＬＳへのｍｉＲＮＡの応用技術に関する情報は乏しく、マウスモデルでmiR-206の不足が病態を悪化させるという報告（非特許文献６）などがあるにすぎない。進行性で内因的な因子の関与が大きいと考えられるＡＬＳでは、ｍｉＲＮＡを利用した検査診断あるいは創薬に有用な疾患バイオマーカーの開発が切望されている。

特表2011-515407号公報特表2012-530054号公報

microRNAの制御異常と癌、実験医学 vol.27, No.8, 2009. 臨床・創薬利用が見えてきたmicroRNA、遺伝子医学MOOK23 2012. Allegra A et al., Int J Oncol. 2012;41(6):1897-912. Fichtlscherer S. et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2011;31(11):2383-90. Haghikia A. et al., Neurology. 2012;79(22):2166-2170. Williams AH et al., Science. 2009;326(5959):1549-1554.

上記のとおり、難治性のＡＬＳに対する検査法や治療法は確立しておらず、医療上の大きな課題になっている。疾患に関与すると言われているｍｉＲＮＡ及び／又はその標的遺伝子に関して、ＡＬＳにおけるバイオマーカーとなり得るｍｉＲＮＡ及び／又はその標的遺伝子を見出し、その利用方法を確立すれば、新しい検査診断法、病態モニタリング法、さらには治療薬への応用が可能となる。本発明の目的は、ＡＬＳの検査と治療に対するｍｉＲＮＡ及び／又はその標的遺伝子の利用であり、ＡＬＳのバイオマーカーとなるｍｉＲＮＡ及び／又はその標的遺伝子を臨床検査や病態モニタリング、さらには治療法へ応用することである。

本発明は、以下の発明に関する：
［１］被験者から採取した試料中のｍｉＲＮＡを測定する工程を含み、前記ｍｉＲＮＡが表１又は表２に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つである、筋萎縮性側索硬化症の検出方法。
［２］被験者から採取した試料中の遺伝子産物を測定する工程を含み、前記遺伝子が表３〜表６の記載の遺伝子の少なくとも１つである、筋萎縮性側索硬化症の検出方法。
［３］表１又は表２に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つと、表３〜表６の記載の遺伝子の遺伝子産物の少なくとも１つとを測定する、［１］又は［２］の検出方法。
［４］前記ｍｉＲＮＡが、miR-663b、miR-4649-5p、miR-4299、miR-3187-5pである、［１］又は［３］の検出方法。
［５］筋萎縮性側索硬化症に対する治療を行った対象から試料を採取する工程、並びに、前記試料中のｍｉＲＮＡ、及び／又は、その標的遺伝子の遺伝子産物を測定する工程を含み、前記ｍｉＲＮＡが表１又は表２に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つであり、前記標的遺伝子が表３〜表６の記載の遺伝子の少なくとも１つであるである、前記治療効果の判定方法。
［６］表１〜表６に記載したｍｉＲＮＡ及び／又は標的遺伝子の少なくとも１つの発現を指標とする、筋萎縮性側索硬化症の治療薬をスクリーニングする方法。
［７］表１に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つを抑制するオリゴヌクレオチドを有効成分とする医薬組成物。
［８］表２に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つを補充するオリゴヌクレオチドを有効成分とする医薬組成物。
［９］表３又は表４に記載の標的遺伝子、又はその遺伝子産物の少なくとも１つの全長あるいは一部を有効成分とする医薬組成物。
［１０］表５又は表６に記載の標的遺伝子、又はその遺伝子産物の少なくとも１つの全長あるいは一部を抑制する成分を含む医薬組成物。
［１１］筋萎縮性側索硬化症の治療または予防用である、［７］〜［１０］のいずれかの医薬組成物。

本発明の検出方法によれば、簡便な遺伝子検査方法により、ＡＬＳを検出することができる。好ましくは、ＡＬＳの進行に伴う病態を把握することができる。また、本発明におけるｍｉＲＮＡ及び／又はその標的遺伝子を同疾患の検査診断並び治療に利用することができる。さらに、同疾患の治療薬となる化合物のスクリーニングに利用することができる。

血漿中miR-663bとＡＬＳ病態の相関グラフである。死亡ないしは永続的な侵襲的人工呼吸器接続を観察のend pointとした時に、発症からend pointまでの期間と強い負の相関を認めた。血漿中miR-4649-5pとＡＬＳ病態の相関グラフである。死亡ないしは永続的な侵襲的人工呼吸器接続を観察のend pointとした時に、発症からend pointまでの期間と強い負の相関を認めた。血漿中miR-4299とＡＬＳ病態の相関グラフである。発症からend pointまでの全経過時間で補正した罹病期間との間に負の相関を認めた。血漿中miR-3187-5pとＡＬＳ病態の相関グラフである。発症からend pointまでの全経過時間で補正した罹病期間との間に負の相関を認めた。

以下に特に記載すること以外は、本発明の検出方法・治療効果判定方法・治療方法・医薬組成物・治療薬のスクリーニング方法において、適宜、相互に参照することができる。
本発明の検出方法では、ＡＬＳを検出するバイオマーカーとして、表１又は表２に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つ、及び／又は、表３〜表６に記載の標的遺伝子の遺伝子産物（ポリペプチド又はｍＲＮＡ）の少なくとも１つを使用することができる。これらは好ましくはＡＬＳの進行に伴う病態把握用のバイオマーカーに用いることができる。該ｍｉＲＮＡ及び／又はその標的遺伝子の遺伝子産物は、単独の使用も、複数の使用も、いずれも可能である。精度を高めるためには、複数を組み合わせて使用する方が好ましく、また、公知のｍｉＲＮＡ及び／又はその標的遺伝子の遺伝子産物を組み合わせて利用することもできる。

後述の実施例において具体的実験データが示すとおり、血漿において、ＡＬＳ患者では健常者と比較して、表１のｍｉＲＮＡ（すなわち、miR-4258、miR-663b、miR-1469、miR-663、miR-4649-5p）が増大していた。従って、被験者、特にＡＬＳが疑われる患者又はＡＬＳ患者から採取した試料中で、これらのｍｉＲＮＡ（以下、検出用ｍｉＲＮＡと称する）の少なくとも１つの増加を、それ自体公知の方法に従って測定することにより、ＡＬＳの可能性ありと判定することができる。特に、miR-663bとmiR-4649-5pは、ＡＬＳの死亡時期又は侵襲的陽圧換気療法の時期との関連性が高く、ＡＬＳの進行に伴う病態把握用のバイオマーカー（例えば、ＡＬＳの予後の指標や進行程度の予知）とすることができるので好ましい。

また、血漿において、ＡＬＳ患者では健常者と比較して、表２のｍｉＲＮＡ（すなわち、hsa-miR-26b、hsa-miR-4299、hsa-let-7f、hsa-miR-4419a、hsa-miR-3187-5p、hsa-miR-4496、hsa-miR-151-3p）が減少していた。従って、被験者、特にＡＬＳが疑われる患者又はＡＬＳ患者から採取した試料中で、これらの検出用ｍｉＲＮＡの少なくとも１つの減少を、それ自体公知の方法に従って測定することにより、ＡＬＳの可能性ありと判定することができる。特に、miR-4299とmiR-3187-5pは、ＡＬＳの死亡時期又は侵襲的陽圧換気療法の時期との関連性が高く、ＡＬＳの進行に伴う病態把握用のバイオマーカー（例えば、ＡＬＳの重症度の指標）とすることができるので好ましい。

表３と表４は、ＡＬＳ患者血漿中で増大したｍｉＲＮＡが標的としていると予測される遺伝子を、表５と表６はＡＬＳ患者血漿中で減少したｍｉＲＮＡが標的としていると予測される遺伝子を示す。これらは、ＡＬＳの病態に関与する遺伝子群であるので、表１と表２のｍｉＲＮＡに加え、表３〜表６の標的遺伝子の遺伝子産物を併用して測定することにより、より高精度にＡＬＳを検出できる。

また、表１に記載の増大したｍｉＲＮＡを減少させる作用を有するオリゴヌクレオチド類の核酸医薬を投与して過剰なｍｉＲＮＡの作用を抑制することは、ＡＬＳの治療に有用な薬剤を提供することができる。

あるいは、表２に記載の減少したｍｉＲＮＡと同様の作用を有するオリゴヌクレオチド類の核酸医薬を投与して減少したｍｉＲＮＡの作用を補充することは、ＡＬＳの治療に有用な薬剤を提供することができる。

表１及び表２に記載のｍｉＲＮＡの配列は公知のデータベース（miRBase：http://www.mirbase.org/）から入手することができる。それぞれの名称とＩＤを表１及び表２に示した。

本発明の検出方法においてバイオマーカーとしてｍｉＲＮＡ又はその標的遺伝子のｍＲＮＡを使用する場合、それ自体公知の遺伝子検査方法、例えば、核酸プローブを用いるハイブリダイゼーション法や、ＰＣＲプライマーを用いるＰＣＲ法により、測定することができる。測定機器で言えば、マクロアレイ、マイクロビーズ、イメージスキャナー、次世代シークエンサー、質量分析装置などが用いられる。

また、本発明の検出方法においてバイオマーカーとしてｍｉＲＮＡの標的遺伝子がコードするポリペプチドを使用する場合、それ自体公知のタンパク質分析方法、例えば、抗体を用いる免疫学的分析方法、電気泳動等の生化学的分析方法や質量分析方法により実施することができ、臨床検査用の自動分析機を使用することもできる。

本発明方法で用いる試料としては、例えば、脳疾患部位、脳脊髄液、血液試料（例えば、末梢血、血漿、血清）、唾液、涙液、鼻汁、尿、リンパ液、その他の体液、好ましくは、脳疾患部位やその周辺部位（脳脊髄液等）を用いることができる。さらには生検で採取された臓器組織、病理組織、細胞、又はそれらからの抽出成分も利用できる。

本発明の検出方法においてバイオマーカーとして用いる表１又は表２に記載のｍｉＲＮＡ、及び／又は表３〜表６に記載の標的遺伝子の遺伝子産物は、ＡＬＳの患者に対して行う各種治療の効果を判定するために使用することもできる。
本発明の治療効果判定方法は、ＡＬＳに対する治療を行った対象から試料を採取する工程、および前記試料中のｍｉＲＮＡ及び／又はその標的遺伝子の遺伝子産物を測定する工程を含む。

本発明の治療効果判定方法において、ＡＬＳ患者に対する治療効果を判定する場合には、表１に記載のＡＬＳ検出用ｍｉＲＮＡをバイオマーカーとして用いる場合、当該治療を行う前のＡＬＳ患者血漿中では、そのｍｉＲＮＡ濃度が健常者よりも高い数値を示す傾向がある。当該ｍｉＲＮＡ濃度が、治療を行うことにより低下した場合、その治療は効果があったと判定することができる。一方、治療を行っても低下しなかった場合には、その治療は効果がなかったと判定することができる。ただし、ｍｉＲＮＡは複数種で個々に標的遺伝子の発現制御を行っていることが推定されるので、個々のｍｉＲＮＡ濃度が協調的に変動せずともよく、臨床症状の状態を勘案して治療効果が判定される。表３又は表４に記載の標的遺伝子の遺伝子産物は、表１のｍｉＲＮＡに連動して変動することが期待できる。よって、表１のｍｉＲＮＡの測定に併用して測定することにより、検査の精度を上げることができる。

また、ＡＬＳ患者に対する治療効果を判定する場合には、表２に記載のＡＬＳ検出用ｍｉＲＮＡをバイオマーカーとして用いる場合、当該治療を行う前のＡＬＳ患者血漿中では、そのｍｉＲＮＡ濃度が健常者よりも低い数値を示す傾向がある。当該ｍｉＲＮＡ濃度が、治療を行うことにより上昇した場合、その治療は効果があったと判定することができる。一方、治療を行っても上昇しなかった場合には、その治療は効果がなかったと判定することができる。ただし、ｍｉＲＮＡは複数種で個々に標的遺伝子の発現制御を行っていることが推定されるので、個々のｍｉＲＮＡ値が協調的に変動せずともよく、臨床症状の状態を勘案して治療効果が判定される。表５又は表６に記載の標的遺伝子の遺伝子産物は、表２のｍｉＲＮＡに連動して変動することが期待できる。よって、表２のｍｉＲＮＡの測定に併用して測定することにより、検査の精度を上げることができる。

本発明の治療方法では、表１に示した、ＡＬＳ患者血漿中で増大しているｍｉＲＮＡを患者体内において抑制することにより、あるいは、表３又は表４に示すその標的遺伝子の遺伝子産物（好ましくはポリペプチド）を患者に補充するか、あるいは、標的遺伝子それ自体を遺伝子治療により患者に投与することにより、ＡＬＳを治療することができる。

また、本発明の治療方法では、表２に示した、ＡＬＳ患者血漿中で減少しているｍｉＲＮＡを患者体内において増大させることにより、あるいは、表５又は表６に示すその標的遺伝子の遺伝子産物（好ましくはポリペプチド）を患者において阻害することにより、ＡＬＳを治療することができる。なお、本明細書において、用語「治療」には、疾患発症後の患者を処置する狭義の「治療」と、疾患発症前の患者を処置する「予防的療法」が含まれる。

生体内のｍｉＲＮＡを抑制する方法としては、それ自体公知の方法に従って実施することができ、例えば、対象ｍｉＲＮＡの全長または一部とハイブリダイズ可能な相補的配列を含むオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）を投与することによって行うことができる。
上記の抑制性オリゴヌクレオチドを患者に投与する方法としては、それ自体公知の方法に従って実施することができ、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、リン脂質膜をもつリポソームに封入する方法、エキソソームを模倣したリポソームに封入する方法、コラーゲンとの複合体として徐放化させる方法、ＲＮＡの糖部分のＯ（酸素）をＳ（硫黄）で置き換えた４’−チオＲＮＡ化による化学修飾体の利用、オリゴヌクレオチドの糖の部分を２’−Ｆ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチルに修飾した化学修飾体の利用、などで生体内において安定的に補充する核酸補充法として実施することができる。同時に、ｍｉＲＮＡは複数分子で標的遺伝子を制御する可能性が高いため、上記の核酸補充法に関しても、複数の核酸カクテルによる補充を好んで用いることができる。これらは、本発明における医薬組成物である。

本発明の医薬組成物は、ＡＬＳの治療に用いることができ、有効成分として、表１に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つ（その全長または一部）に対する抑制性オリゴヌクレオチド、表２に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つ（その全長または一部）と同様の作用を有するオリゴヌクレオチド（好ましくはｍｉＲＮＡ）、表３又は表４に示す標的遺伝子の遺伝子産物（好ましくはポリペプチド）、表３又は表４に示す標的遺伝子、表５又は表６に示す標的遺伝子の遺伝子産物（好ましくはポリペプチド）を阻害する物質、及び、表５又は表６に示す標的遺伝子を阻害する物質から選んだ、少なくとも１つを含むことができ、所望により、製薬学的に許容される担体を更に含むことができる。

本発明の検出方法においてバイオマーカーとして用いる表１又は表２に記載のｍｉＲＮＡ、及び表３〜表６に記載の標的遺伝子の遺伝子産物は、ＡＬＳの治療薬をスクリーニングするために使用することができる。
本発明において、ｍｉＲＮＡまたはその標的遺伝子の遺伝子産物を標的とする候補物質（例えば化合物）をスクリーニングする方法は、ｉｎｖｉｔｒｏでは、直接標的分子に結合する候補物質を分光学的な変化や表面プラズモン共鳴で調べる方法（いわゆるハイスループットスクリーニング）や培養細胞に候補物質を暴露させて培養細胞中の標的（ｍｉＲＮＡまたはその標的遺伝子の遺伝子産物）の発現を調べる方法などが適用される。さらにｉｎｖｉｖｏでは、神経変性モデル動物において、ＡＬＳ症状またはＡＬＳ病理像の改善を指標とした方法などが適用される。

例えば、本発明のスクリーニング方法の内、表３〜表６に記載の標的遺伝子でコードされるポリペプチドを利用する態様では、前記の各種ｉｎｖｉｔｒｏアッセイ又はｉｎｖｉｖｏアッセイを用いて実施することができる。本態様では、例えば、当該ポリペプチド又はそれを発現する細胞、組織、若しくは動物個体（特には非ヒト動物）と、候補物質とを接触させる工程、および前記候補物質とポリペプチドとの結合、前記ポリペプチドの発現量変化若しくは活性変化、又は動物固体における症状変化を分析する工程を含む方法により、実施することができる。

また、本発明のスクリーニング方法の内、表１又は表２に記載のｍｉＲＮＡ、又は、表３〜表６に記載の標的遺伝子のｍＲＮＡの発現を指標とする態様では、例えば、候補物質を培養細胞、組織、又は動物個体（特には、非ヒト動物）に投与する工程、前記個体から試料を採取する工程、および前記試料中のｍｉＲＮＡ又はｍＲＮＡを測定する工程を含む方法により、実施することができる。

本発明のスクリーニング方法で評価する候補物質は、特に限定されるものではないが、各種化合物に加え、各種抽出物、例えば、微生物の培養上清、各種生物若しくはその組織由来の天然成分若しくは抽出物を挙げることができる。また、使用する細胞は、組織から分離された培養細胞、樹立された培養細胞株、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、Ｍｕｓｅ細胞などが、非ヒト動物においては、特定遺伝子のノックアウトあるいはノックインの処理を施したモデルマウス、モデルラットなどを挙げることができる。

本発明のスクリーニング方法において、表１に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つを測定する場合、そのｍｉＲＮＡ量を減少させることができる物質をＡＬＳの治療薬の候補として選択することができる。又は表２に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つを測定する場合、そのｍｉＲＮＡ量を増大させることができる物質をＡＬＳの治療薬の候補として選択することができる。
また、表３又は表４に記載の標的遺伝子のポリペプチド又はｍＲＮＡを測定する場合、その遺伝子産物の発現量又は活性を増加させることができる物質をＡＬＳの治療薬の候補として選択することができる。さらに表５又は表６に記載の標的遺伝子のポリペプチド又はｍＲＮＡを測定する場合、その遺伝子産物の発現量又は活性を減少させることができる物質をＡＬＳの治療薬の候補として選択することができる。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

《実施例１：ＡＬＳ患者血漿中における疾患関連ｍｉＲＮＡの同定》
健常成人１０人（男性５人＋女性５人、平均年齢49.3±14.9歳）とＡＬＳ患者１６人（男性９人＋女性７人、平均年齢65.8±8.9歳）の採血は被験者の上腕静脈から２０ｍＬの末梢血を採取し、速やかに４℃、３０００ｒｐｍで１０分間、遠心処理し、上清（血漿）を０．６ｍＬずつポリプロピレンチューブに分注して−８０℃で凍結保存した。凍結保存した試料０．３ｍＬから、ＲＮＡを抽出してｍｉＲＮＡを測定した。

マイクロアレイは３Ｄ−Ｇｅｎｅチップ（東レ（株））を用い、メーカー指定のｍｉＲＮＡ抽出液並びにハイブリダイゼーション試薬セットとＨｙ５シングルカラーラベル（miRCURY LNA microRNA Hy5 Power labeling kit）によって試料中のｍｉＲＮＡを標識し、Human miRNA Oligo chip（データベースmiRBase Release17.0から選定したヒト約１８００種のｍｉＲＮＡプローブを搭載）上のプローブでハイブリダーゼーションを行い、３Ｄ−Ｇｅｎｅスキャナーで結合したｍｉＲＮＡの蛍光を計測し、シグナル値を標準化（global normalization）して用いた。健常人対照群に対する患者群（＝ＡＬＳ患者／健常人）のシグナル強度の変化を変動率（Fold change）として求め、変動率（Log₂）のｍｉＲＮＡに対して両側不等分散ｔ検定を行い、ｐ＜０．１のｍｉＲＮＡを同定した。その結果、５種類のｍｉＲＮＡがＡＬＳ患者血漿中で有意に増大していることを見出した（表７）。また、７種類のｍｉＲＮＡがＡＬＳ患者血漿中で有意に減少していることを見出した（表８）。

これら５種類のｍｉＲＮＡについて、年齢、性別、罹患期間、初期症状（延髄、腕、脚）、ＡＬＳ−ＦＲＳ−Ｒ（ALS Functional Rating Scale：ALS機能評価尺度改訂版）、ＡＬＳ−ＦＲＳ−Ｒにおける球麻痺に関する評価、機能的評価、ＭＭＳＥ（Mini Mental State Examination：小規模認知機能検査）、ＦＡＢ（Frontal Assessment Battery：前頭葉機能検査）、機能的評価（Barthel Index）、死亡時期又は侵襲的陽圧換気療法（人工呼吸器装着）の時期までの期間（Time from onset to end point：エンドポイント期間）を指標として、多変量解析（二変数分散解析で危険率５％の棄却楕円）を行った。

その結果、表９に示したように、増大していた５種類のｍｉＲＮＡのうち、miRNA-663bとmiR-4649-5pが、死亡ないしは永続的な侵襲的人工呼吸器接続を観察のend pointとした時に、発症からend pointまでの期間と強い負の相関を認めた。これは、疾患初期であっても結果的に疾患の進行が速い例では高いことを示し、また、他の全ての評価項目に影響を受けなかった。すなわち、miRNA-663bとmiR-4649-5pはＡＬＳにおいて、それらが増大しているほど病勢が強く、早期に（より短期間で）疾患が進行することを示すバイオマーカーとなり得ると考えられた。miRNA-663bとmiR-4649-5pの血中濃度が高い場合、標的遺伝子の機能が抑制されると考えられることから、これらの標的遺伝子の機能不全がＡＬＳの疾患増悪に関与していると考えられる。

ＡＬＳでは、疾患の進行のスピードは症例によって異なり、例えば、発症から１年程度で死亡してしまう例から４−５年ほど人工呼吸器も使用せず生存する例まで様々である。前者の場合、患者本人は自分の疾患の理解や、どのような人工的なデバイスを用いて生存するか、あるいは死亡するかを理解したり、意思決定する余裕もない。疾患の進行が速い症例では、途中でその進行が緩くなることも殆ど無い。したがって、疾患の進行タイプを予知できうるバイオマーカーがあれば、発症早期の診断で、患者は今後どの程度のスピードで病態が悪化し、意思決定のための時間をどれだけ確保できるか等を推定できることが可能となる。従来の公知の方法では、疾患の進行のスピードを予測することはほとんど不可能であるあるため、本発明の臨床上の意義は極めて高く、実地医療における予後管理上の利点も大きい。

一方、表１０に示したように、減少していた７種類のｍｉＲＮＡのうち、miRNA-4299とmiR-3187-5pが、発症からend pointまでの全経過時間で補正した罹病期間との間に負の相関を認めた。年齢と関与を見せず、end pointまでの全経過時間で補正した罹病期間の間に強い負の相関を認め、miRNA-4299とmiR-3187-5pは、採血時点での疾患の進行の程度（重症度）を示すバイオマーカーとなり得ると考えられた。miRNA-4299とmiR-3187-5pの血中濃度が低い場合、標的遺伝子の機能が増幅されると考えられるが、これはＡＬＳが進行した病態の遺伝子発現状況と考えられる。

また、表９に示したように、miR-4649-5pは、発症からend pointまでの全経過時間で補正した罹病期間との間に負の相関を認めたことから、早期に疾患が進行することを予知できるバイオマーカーであるだけでなく、採血時点での疾患の進行の程度を検出できるバイオマーカーであると考えられた。

以上のとおり、miRNA-663bとmiR-4649-5pは血漿中健常濃度に比べて２倍以上に増大している場合、また、miRNA-4299とmiR-3187-5pは血漿中健常濃度に比べて１／２以下に減少している場合は、これらは、ＡＬＳの進行に伴う病態把握用のバイオマーカーになり得ると考えられる。

《実施例２：増大したＡＬＳ関連ｍｉＲＮＡの標的遺伝子予測》
疾患に関連するｍｉＲＮＡが見いだされた場合には、このｍｉＲＮＡが標的とする遺伝子を特定することが必要である。ｍｉＲＮＡと標的遺伝子の関係は、１種のｍｉＲＮＡには複数の標的遺伝子があり、他方、１種のタンパク質遺伝子は複数のｍｉＲＮＡから調節を受けるという関係があるとされる。したがって、タンパク質遺伝子とｍｉＲＮＡの相互関係はそれらが掛け合わさったものとなり、約２０００種のｍｉＲＮＡと１種のｍｉＲＮＡあたり数百種以上に上る予測遺伝子数から、その組み合わせ数は膨大なものになる。現在のところ、ｍｉＲＮＡと標的遺伝子の予測はバイオインフォマティクス・ツールを用いて行うことが一般的であるが、特定のタンパク質遺伝子とｍｉＲＮＡの主たる組み合わせを特定することは難しく、その手法は確立されていない。本発明では、バイオインフォマティクス・ツールによるｍｉＲＮＡと標的遺伝子の予測と遺伝子オントロジー解析を組み合わせて、ｍｉＲＮＡと標的遺伝子の組み合わせを絞り込み、さらに絞り込まれた遺伝子群の中から疾患の特徴的病態を考慮したアノテーション解析から、疾患関連標的遺伝子を特定することに成功した。

まず、増大が見出された５種のｍｉＲＮＡについて、ｍｉＲｍａｐ（Nucleic Acids Research 2012;40(22):11673-83）ウェッブツールで予測し、予測確率上位５０遺伝子を同定した。これらのｍｉＲＮＡは協働して標的遺伝子に作用していることが考えられるので、５種の増大したｍｉＲＮＡの標的遺伝子の共通遺伝子を抽出した。その結果が表１１で、最も共通して５種のｍｉＲＮＡのうち３種の標的になっているのが、AFAP1（actin filament associated protein 1）であった。AFAP1は、AFAP110/120のヘテロダイマーとなって筋線維であるアクチンフィラメントの再構成に関与する（Neurosci Lett. 2008 24; 444(2):132-136）ので、ｍｉＲＮＡによるAFAP1の抑制は筋萎縮と関連する可能性が高い。他の因子は５種のｍｉＲＮＡのうち２種に共通する標的になっていた。表１１において、ＡＬＳ関連性が報告されているのはZNF512Bで、最近、ＡＬＳの予後判定因子になることが報告されたが（J Neurol Sci. 2013 15; 324(1-2):163-6）、これ以外の因子は本発明によって明らかにされた。FOXK1、PGPEP1、NAT8Lも筋萎縮に関与する可能性があるので、その変動の検査は診断や病態モニタリングに利用でき、一方、これら遺伝子は創薬標的となるので、これら遺伝子を調節する作用を有する化合物は治療薬として利用することができる。

次に、特にＡＬＳ病態との関連性で有意差が見いだされたmiR-663bとmiR-4649-5pの標的となる各５０種の遺伝子群の中から、神経系に関連する遺伝子もＡＬＳに関与することが考えられるので、これらを抽出した。遺伝子選定には、遺伝子アノテーションツールであるＤＡＶＩＤ（Nat Protoc. 2009;4(1):44-57）にてオントロジー解析を行い、Gene Ontology（biological process）で神経系のイベントに関与する遺伝子群を抽出した（表１２）。これらの遺伝子群が直接ＡＬＳ関連バイオマーカーとする報告は現在のところ見いだされておらず、本発明で明らかにされた。特にDCLK1はモータータンパク質であるkinesinに関係することが興味深い。すなわち、シナプス小胞の輸送に関与するKIF3（kinesin-3 motor protein）が機能を発揮するためにはDCLK1が必要であるという報告がある（Mol Cell. 2012; 47(5): 707-721）。ＡＬＳとの関連性については、KIF3の構成タンパク質のKIF3Bの発現がＡＬＳの増悪因子のひとつであるSOD1変異体によって低下すること（Human Molecular Genetics, 2002;11(17): 2061-2075）、患者群によってはKIF3を構成するKIFAP3の発現が低下すると孤発性ＡＬＳの生存率が高まる可能性があること（Proc Natl Acad Sci USA. 2009;106(22):9004-9009）などが報告されている。これらの報告から、DCLK1の発現増強を促進する化合物は、KIF3の正常化によってＡＬＳの治療薬になる可能性が示唆される。

《実施例３：減少したＡＬＳ関連ｍｉＲＮＡの標的遺伝子予測》
実施例２と同様に、減少が見出された７種のｍｉＲＮＡについて、ｍｉＲｍａｐウェッブツールで予測し、予測確率上位５０遺伝子を同定した。これらのｍｉＲＮＡは協働して標的遺伝子に作用していることが考えられるので、７種の増大したｍｉＲＮＡの標的遺伝子の共通遺伝子を抽出した。その結果が表１３で、共通性はいずれも７種のｍｉＲＮＡのうちの２種にあった。DCX（doublecortin）は、増大するｍｉＲＮＡの標的遺伝子としても同定され、減少するｍｉＲＮＡからも制御されていることが示され、興味深い。

次に、特にＡＬＳ病態との関連性で有意差が見いだされたmiR-4299とmiR-3187-5pの標的となる各５０種の遺伝子群の中で神経系に関連する遺伝子もＡＬＳに関与することが考えられることから、これらを抽出した。遺伝子選定には、遺伝子アノテーションツールであるＤＡＶＩＤにてオントロジー解析を行い、Gene Ontology（biological process）で神経系のイベントに関与する遺伝子群を抽出した（表１４）。これらの遺伝子群が直接ＡＬＳ関連バイオマーカーとする報告は現在のところ見いだされておらず、本発明で明らかにされた。

本発明は、ＡＬＳの検査診断並びに治療に利用することができる。さらに、同疾患の治療薬となる化合物のスクリーニングに利用することができる。

Claims

ｍｉＲ−４２５８、ｍｉＲ−６６３ｂ、ｍｉＲ−１４６９、ｍｉＲ−６６３、及びｍｉＲ−４６４９−５ｐからなる群から選んだｍｉＲＮＡの少なくとも１つについて、被験者由来の血漿試料中のｍｉＲＮＡの発現量と健常者由来の血漿試料中のｍｉＲＮＡの発現量とを測定する工程、及び、前記工程で測定した、被験者由来の血漿試料中のｍｉＲＮＡ発現量と健常者由来の血漿試料中のｍｉＲＮＡ発現量とを比較する工程を含み、前記ｍｉＲＮＡの発現量が健常者由来の血漿試料と比較して被験者由来の血漿試料で増大していた場合に、当該被験者が筋萎縮性側索硬化症であるとする、筋萎縮性側索硬化症の検出を補助する方法。
ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２９９、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１８７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９６、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−３ｐからなる群から選んだｍｉＲＮＡの少なくとも１つについて、被験者由来の血漿試料中のｍｉＲＮＡの発現量と健常者由来の血漿試料中のｍｉＲＮＡの発現量とを測定する工程、及び、前記工程で測定した、被験者由来の血漿試料中のｍｉＲＮＡ発現量と健常者由来の血漿試料中のｍｉＲＮＡ発現量とを比較する工程を含み、前記ｍｉＲＮＡの発現量が健常者由来の血漿試料と比較して被験者由来の血漿試料で減少していた場合に、当該被験者が筋萎縮性側索硬化症であるとする、筋萎縮性側索硬化症の検出を補助する方法。
前記ｍｉＲＮＡが、miR-663b、miR-4649-5p、miR-4299、及びmiR-3187-5pからなる群から選んだ少なくとも１つである、請求項１又は２に記載の検出を補助する方法。
ｍｉＲ−４２５８、ｍｉＲ−６６３ｂ、ｍｉＲ−１４６９、ｍｉＲ−６６３、及びｍｉＲ−４６４９−５ｐからなる群から選んだｍｉＲＮＡの少なくとも１つについて、筋萎縮性側索硬化症に対する治療を行った患者由来の血漿試料中のｍｉＲＮＡの発現量と、前記治療を行う前の前記患者由来の血漿試料中のｍｉＲＮＡの発現量とを測定する工程、及び、前記工程で測定した、治療後の患者由来の血漿試料中のｍｉＲＮＡ発現量と治療前の患者由来の血漿試料中のｍｉＲＮＡ発現量とを比較する工程を含み、前記ｍｉＲＮＡの発現量が治療前の患者由来の血漿試料と比較して治療後の患者由来の血漿試料で低下した場合に、その治療は効果があったと判定する、前記治療効果の判定を補助する方法。
ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２９９、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１８７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９６、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−３ｐからなる群から選んだｍｉＲＮＡの少なくとも１つについて、筋萎縮性側索硬化症に対する治療を行った患者由来の血漿試料中のｍｉＲＮＡの発現量と、前記治療を行う前の前記患者由来の血漿試料中のｍｉＲＮＡの発現量とを測定する工程、及び、前記工程で測定した、治療後の患者由来の血漿試料中のｍｉＲＮＡ発現量と治療前の患者由来の血漿試料中のｍｉＲＮＡ発現量とを比較する工程を含み、前記ｍｉＲＮＡの発現量が治療前の患者由来の血漿試料と比較して治療後の患者由来の血漿試料で上昇した場合に、その治療は効果があったと判定する、前記治療効果の判定を補助する方法。
ｍｉＲ−４２５８、ｍｉＲ−６６３ｂ、ｍｉＲ−１４６９、ｍｉＲ−６６３、及びｍｉＲ−４６４９−５ｐからなる群から選んだｍｉＲＮＡの少なくとも１つについて、血漿試料中のｍｉＲＮＡの発現低下を指標とする、筋萎縮性側索硬化症の治療薬の候補をスクリーニングする方法。
ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２９９、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１８７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９６、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−３ｐからなる群から選んだｍｉＲＮＡの少なくとも１つについて、血漿試料中のｍｉＲＮＡの発現上昇を指標とする、筋萎縮性側索硬化症の治療薬の候補をスクリーニングする方法。