CN112292134A - Mir-17~92作为运动神经元(mn)退化疾病的治疗或诊断目标 - Google Patents

Abstract

本发明涉及mir‑17～92作为运动神经元(MN)退化疾病的候选治疗或诊断目标。mir‑17～92在脊髓MN中的表达持续整个成年期且尤其在SOD1G93A小鼠中MN损失开始前减少。因此，mir‑17～92可用作ALS的候选治疗目标。

Description

MIR-17～92作为运动神经元(MN)退化疾病的治疗或诊断目标

技术领域

本发明涉及微RNA(miRNA)，尤其作为运动神经元(MN)退化疾病的候选治疗或诊断目标的mir-17～92的领域。

背景技术

ALS，亦称为路-盖里格氏病(Lou Gehrig's disease)，是一种侵袭上位及下位运动神经元的破坏性成年发病型神经退化性疾病。随之发生进行性且最终致命的肌肉麻痹，通常在疾病发作的2至5年内导致死亡。ALS大多为偶发性的，但有约10％的病例为家族性的。在全世界内，发病率为每年每100,000人中有约2-3例病例。在约75％的ALS患者中，远程肢体神经支配MN，尤其是控制快速肢体动作的快缩易疲劳(fast-twitch fatigable，FF)MN通常为经历退化的第一MN亚型，因此患者最初经历手臂或腿无力或萎缩。其他MN亚型随后受到影响，且在3至5年内，患者遭受完全麻痹且最终因呼吸衰竭而死亡。用于治疗ALS的唯一市售药物(利鲁唑(Riluzole))具有适度作用，可改善肌肉功能，但具有较强副作用且对患者存活期无明显影响。最近，美国食品与药物管理局(US Food&Drug Administration，FDA)批准一种新药物(依达拉奉(Edaravone))，但其功效有待评估。迄今为止，尚无用于此致命疾病的有效治愈方法。

有若干基因的致病性突变已与家族性及偶发性ALS相关联，包括SOD1、TARDBP、FUS/TLS、VAPB、OPTN等。超氧化物歧化酶1(SOD1)基因中的显性突变占家族性ALS(fALS)的15-20％。尽管SOD1在ALS中的确切病理作用仍不清楚，但已确立一系列携带fALS SOD1突变体的转基因小鼠，其重演ALS发展的病理性表型，包括作为疾病发作的第一病征的肢体无力，且提供用于研究ALS机制的有价值模型。在这些fALS-SOD1转基因模型中进行的累积研究表明，多个细胞机制的失调共同地促成ALS发展。研究最深入的一个路径为内质网(ER)压力(Kikuchi H等人(2006)Spinal cord endoplasmic reticulum stress associatedwith a microsomal accumulation of mutant superoxide dismutase-1in an ALSmodel.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica 103(15):6025-6030)，其主要在易损的FF-MN中观察到。亦已将RNA代谢与ALS病理学相关联，因为有许多经识别的疾病相关基因编码RNA结合蛋白，诸如TARDBP、FUS及HNRNPA1。值得关注的是，这些致病基因亦参与miRNA生物发生及代谢。近期的研究进一步揭示，miRNA表达的失调出现在ALS小鼠模型及患者中(Eitan C及Hornstein E(2016)Vulnerability of microRNA biogenesis in FTD-ALS.Brain Res 1647:105-111)。

微RNA(miRNA)为内源性非编码小RNA，其对脊髓中细胞命运决定及神经元存活起关键作用。最新的研究揭示，引起ALS的致病性突变足以抑制Dicer复合物活化，此是由压力颗粒(stress granule，SG)的细胞溶质大分子组装介导，导致miRNA生物发生的整体下调。然而，与ALS有关的miRNA的确切功能及集合尚未完全确定。尽管缺少肌肉特异性miRNAmir-206可加快fALS-SOD1_G93A小鼠模型中MN损失的发生(Williams AH等人(2009)MicroRNA-206delays ALS progression and promotes regeneration of neuromuscularsynapses in mice.Science 326(5959):1549-1554)，但MN特异性miRNA是否亦参与MN存活的细胞自主调节仍不清楚。Dicer活性的条件性损失可阻断小鼠胚胎MN谱系中的miRNA生物发生，导致包括肢体神经支配MN在内的一小组MN的选择性退化(Chen JA及Wichterle H(2012) Apoptosis of limb innervating motor neurons and erosion of motor poolidentity upon lineage specific dicer inactivation.Frontiers in neuroscience6:69)。mir-17～92为富集在MN的miRNA丛集(MN-enriched miRNA cluster)，对于控制胚胎肢体神经支配MN(LMC-MN)存活至关重要(Tung YT等人(2015)Mir-17～92 Governs MotorNeuron Subtype Survival by Mediating Nuclear PTEN.Cell reports 11(8):1305-1318)。此保护作用是由抑制Nedd4-2及Ndfip1对PTEN的单泛素化，随后抑制Nedd4-2及Ndfip1对核PTEN的单泛素化且随后抑制核PTEN易位所介导。

发明内容

本发明出人意料地发现，mir-17～92在脊髓MN中的表达持续整个成年期，且其尤其在SOD1^G93A小鼠中MN损失开始之前减少。此时还伴随SOD1^G93A小鼠的脊髓MN中核PTEN的积聚。重要的是，藉由遗传工程方法或成体scAAV9递送使SOD1^G93A MN中mir-17～92过度表达可明显延迟运动缺陷且延长寿命。这些发现将mir-17～92确定为ALS的候选治疗目标。

本发明提供一种治疗或预防个体的运动神经元退化疾病的方法，其包含向所述个体投与治疗或预防有效量的一或多个编码微RNA-17～92丛集的成员的基因或转基因(transgenes)。

本发明亦提供一种改善患有运动神经元退化疾病的个体的运动缺陷及延长所述个体的寿命的方法，其包含向所述个体投与有效量的一或多个编码微RNA-17～92丛集的成员的基因或转基因。在一个实施例中，所述方法可延迟或预防MN退化的发作或降低发展MN退化的风险。

某些实施例包括将微RNA-17～92丛集的一或多个成员递送至个体的中枢神经系统中。特定言之，将微RNA-17～92丛集的一或多个成员递送至个体的脊髓中。

本发明亦提供一种在活体外筛选保护ALS中的运动神经元亚型的药物的方法，其包含(i)提供带有包含fALS基因及报导体基因的转基因的干细胞株；(ii)将药物与所述细胞株一起培养；(iii)引导所述细胞分化成运动神经元细胞及表达；及(iv)若自所述干细胞株产生运动神经元亚型，则判定所述药物有效地保护ALS中的运动神经元亚型。

本发明进一步提供一种用于诊断个体的ALS中的运动神经元亚型的方法，其包含提供生物样品及侦测微RNA-17～92丛集之一或多个成员或者核PTEN的存在，其中失调的微RNA-17～92成员或核PTEN的存在指示对个体的ALS中的运动神经元亚型的诊断或对ALS中运动神经元亚型的易感性。

本发明进一步提供一种用于诊断个体的ALS中的运动神经元亚型或对ALS中运动神经元亚型的易感性的套组，其包含一或多种用于侦测生物样品中微RNA-17～92丛集的一或多个成员或者核PTEN的存在的试剂。

图式简单说明

图1A至K展示需要mir-17～92来维持成体脊髓MN。(A)说明mir-17～92如何藉由直接靶向Nedd4-2 E3泛素接合酶及其接头Ndfip1，由此抑制正在发育的LMC-MN中促凋亡核PTEN(nPTEN)的积聚来控制PTEN亚细胞定位(Tung等人，2015)。此研究还旨在揭示mir-17～92/nPTEN轴参与ALS中MN退化的可能。(B)在P40时腰椎脊髓的ChAT^on MN中miR-17表达的代表性原位杂交。虚线划分脊髓边缘与灰质的界限。比例尺为50μm。(C)示意性说明成体脊髓中的神经元分布。对背侧非MN区及腹侧MN区中的个别神经元细胞体进行雷射捕获显微切割且进行RNA提取。(D)经天蓝B(Azure B)染料染色的半腹角区的代表性冷冻切片(参见STAR法)。右图中的数字是在显微切割期间由显微切割软件自动分配。比例尺为50μm。LCM表示雷射捕获显微切割。(E及F)关于经雷射显微切割的细胞中的ChAT及mir-17～92丛集个别成员的qPCR分析。捕获背侧MN作为对照。(平均值±s.d.，n＝4只小鼠。在所关注的群组间进行双尾t检验。*P<0.05)。FC：倍数变化。(G及I)关于在P30时mir-17～92^MNΔ小鼠的腰椎半腹角切片中ChAT^on MN的免疫染色及其数目定量揭示MN明显损失。(平均值±s.d.，n≥3只小鼠，*P<0.05，双尾t检验)。(H及J)在P30时腓肠肌(GA)肌肉的NMJ。mir-17～92^MNΔ小鼠呈现NMJ神经支配的明显减弱。α-BTX：α-金环蛇毒，从而侦测烟碱型乙酰胆碱受体(AChR)。(平均值±s.d.，n＝3只小鼠，*P<0.05，双尾t检验)。(K)如在刺激坐骨神经后于GA肌肉中诱发CMAP所揭示，mir-17～92^MNΔ小鼠中神经肌肉功能减退。CMAP的定量是藉由计算最大峰间值测定(平均值±s.d，n＝6只小鼠，*P<0.05，双尾t检验)。

图2A至J展示症状发生前SOD1^G93A MN中的mir-17～92/nPTEN失调。(A及B)关于腰椎半腹角区的切片中ChAT^on MN的免疫染色及其数目定量揭示自P100开始，SOD1^G93A MN明显损失。白色虚线划分脊髓界限。比例尺为50μm。(n≥4只小鼠，平均值±s.d.，*P<0.05，双因素变异数分析(two-way ANOVA))。(C及D)(C)中展示在不同阶段腰椎脊髓的半腹侧ChAT^onMN中miR-17表达的代表性原位杂交且(D)中展示miR-17的定量。应注意，SOD1^G93A MN中的miR-17表达在P80时开始下降，随后SOD1^G93A中的MN明显减少。比例尺为50μm。(n≥4只小鼠，平均值±s.d.，*P<0.05，双因素ANOVA)。(E)来自对照小鼠及SOD1^G93A小鼠的腹侧角区冷冻切片的雷射捕获的示意性说明(参见STAR法)。仅对具有规则形状的大MN(完整MN)进行显微切割。(F～H)关于在P100时自SOD1^G93A小鼠雷射捕获的MN的qPCR分析。(F)ChAT的表达相当证实仅收集完整MN。(G)在MN损失之前，SOD1^G93A MN展现mir-17～92丛集成员的下调。(H)SOD1^G93A MN中的mir-17～92目标，包括PTEN、Ndfip1及Nedd4-2上调。数据展示为SOD1^G93A MN相对于Ctrl MN的倍数变化(FC)。(平均值±s.d.，n＝4只小鼠，*P<0.05，双尾t检验)。(I及J)(I)中展示在不同阶段，腰椎脊髓的ChAT^on MN中PTEN的免疫染色。最右侧图中以黄色正方形展示高倍数放大的突出显示的PTEN细胞。白色虚线描绘MN核。比例尺为10μm。(J)在P100时，关于ChAT^on MN中的核与细胞溶质PTEN强度比的定量指示在SOD1^G93A MN中核PTEN积聚。(平均值±s.d.，n≥4只小鼠，*P<0.05，双因素ANOVA)。

图3A至G展示SOD1_G93A LMC-MN更易发生退化且展现早期mir-17～92减少。(A)Ctrl及SOD1^G93A ESC分化成具有Hb9::RFP；Foxp1::GFP双报导体的有丝分裂后MN的示意性说明(相关细节参见STAR法)。为加快MN退化，将环匹阿尼酸(cyclopiazonic acid，CPA)引入MN中且藉由流动式细胞测量术测定MN亚型的存活率。评定经媒剂(DMSO)处理的MN作为无压力对照。(B及C)来自Ctrl(蓝)及SOD1^G93A(红)Hb9::RFP；Foxp1::GFP ESC的各MN亚型的存活率在CPA或媒剂处理后每6小时藉由流动式细胞测量术定量。将指定时间点时各MN亚群的百分比针对0小时(亦即，即将处理前)的百分比归一化。相较于经处理的Ctrl LMC-MN，SOD1^G93ALMC-MN在CPA处理后30小时至48小时经历显著细胞损失。相比之下，Ctrl及SOD1^G93A非LMC-MN两者对于CPA处理具有较高抗性。(由n＝3个独立实验得到的平均值±s.d.。详细统计结果展示于表S2及S3中)。(D～G).处理后24小时的FACS纯化的MN亚型。各群体中mir-17～92成员(D及E)及其目标(PTEN、Nedd4-2、Ndfip1)(F及G)的表达是藉由qPCR测定。将miRNA/mRNA水平针对相应Ctrl亚型归一化。深紫色突出显示经CPA处理组，而淡紫色表示仅用媒剂处理的组。(至少3个独立实验的平均值±s.d.，*P<0.05，双尾t检验)。

图4A至E展示SOD1^G93A LMC-MN呈现PTEN的早期核易位，从而导致其对于ALS的易损性。(A)在CPA处理24小时后关于分离的MN中PTEN亚细胞定位的免疫染色。红色虚线描绘MN核的边界。比例尺为10μm。(B)关于GFP^off RFP^on非LMC-MN及GFP^on RFP^on LMC-MN中的核与细胞溶质PTEN平均强度比的定量。(平均值±s.d.，n＝3个独立实验，*P<0.05，双尾t检验)。(C)在胚胎脊髓中卵内(in ovo)电穿孔期间所进行的阶段的示意性说明。(D)针对腰椎脊髓切片的免疫染色展示在GFP-PTEN-NLS^elec脊髓的电穿孔侧处Foxp1^on LMC MN减少，而Lhx3^on非LMC神经元对异位GFP-PTEN的表达具有较大抗性。(E)关于Foxp1^on LMC MN及Lhx3^on非LMC神经元的定量。数据展示为电穿孔侧相对于对侧的细胞数目的倍数变化。(平均值±s.d.，n＝5/6个胚胎，*P<0.05，单因素ANOVA)。

图5A至H展示SOD1^+/L144F人类iPSC源性MN中的hsa-mir-17～92/nPTEN路径的持续性失调。(A)CRISPR-Cas9介导的基因校正的示意性描绘。SOD1^+/L144F突变(G至C突变)周围的基因组序列以红色突出显示。在向导RNA识别序列下加下划线。引入含有经校正G(以蓝色突出显示)的99个核苷酸的单股寡核苷酸作为用于同源定向修复(HDR)的模板。(B)藉由DNA测序确定Ctrl-SOD1^+/+细胞株中的经校正碱基(G/C→G/G)。(C)反映神经营养因子(NF)剥夺的时程的时间线。(D及E)在长期培养期间，相较于Ctrl-SOD1^+/+LMC-MN，ALS-SOD1^+/L144F LMC-MN更易受NF剥夺影响。(D)在NF剥夺期间的指定时间点进行免疫染色以揭示LMC-MN(SMI32^on、ISL1^on及FOXP1^on)。(E)藉由在NF剥夺后指定时间点FOXP1^on ISL1^on数目的定量来测定LMC-MN的存活率且将其针对NF剥夺前(-NF第0天)的存活率归一化。(平均值±s.d.，n＝4个独立实验，*P<0.05，双因素ANOVA)。比例尺为100μm。(F)如藉由qPCR所测定的在NF剥夺后第14天时长期MN培养物中hsa-mir-17～92的表达。数据展示为ALS-SOD1^+/L144F相对于Ctrl-SOD1^+/+的倍数变化(FC)。(至少四个独立实验的平均值±s.d.，*P<0.05，双尾t检验)。(G)西方墨点法指示，在NF剥夺后第14天，SOD1^+/L144F MN培养物中PTEN、NDFIP1及NEDD4-2的蛋白质水平升高。包括α微管蛋白作为负载对照。定量数据展示为ALS-SOD1^+/L144F相对于Ctrl-SOD1^+/+的倍数变化(FC)。(平均值±s.d.，n＝4个独立实验，*P<0.05，双尾t检验)。(H)进行免疫染色以展示在NF剥夺后第14天FOXP1^on ISL1^on LMC-MN中PTEN的亚细胞定位。红色虚线描绘MN核的边界。比例尺为10μm。核与细胞溶质PTEN平均强度比的定量(右图)揭示SOD1^+/L144F LMC-MN中核PTEN易位增加。(平均值±s.d.，n＝4个独立实验，*P<0.05，双尾t检验)。

图6A至E展示SOD1^+/L144F LMC-MN的存活期可藉由hsa-mir-17～92的过度表达而延长。(A)实验性时间线的示意性说明。在分化第25天，对iPSC～MN培养物进行隔夜慢病毒(LV)感染以过度表达hsa-mir-17～92或作为对照的YFP，随后在分化第32天剥夺NF后进行存活分析。(B及C)在存活分析终点(-NF第28天)时受感染MN培养物的qPCR分析。(B)慢病毒转导引起hsa-mir-17～92的异位且持续性的过度表达。(C)压力SOD1^+/L144F iPSC～MN中上调的PTEN、NDFIP1及NEDD4-2 mRNA水平因hsa-mir-17～92的过度表达而受到抑制。数据展示为各组相对于SOD1^+/L144F LV-YFP的倍数变化(FC)。(平均值±s.d.，n＝4个独立实验，*P<0.05，单因素ANOVA)。(D及E)hsa-mir-17～92的过度表达在NF剥夺后明显延长SOD1^+/L144FLMC-MN的存活期。(D)如藉由SMI32及FOXP1免疫染色所揭示的在NF剥夺前后经LV感染的LMC-MN。(E)在NF剥夺的第28天，藉由定量LMC-MN(FOXP1^on ISL1^on)数目来测定LMC-MN存活率且将其针对NF剥夺前的LMC-MN数目归一化。(平均值±s.d.，n＝4/5个独立实验，*P<0.05，**P<0.01，单因素ANOVA)。

图7A至H展示在MN中mir-17～92的过度表现将延迟疾病发作且延长SOD1^G93A小鼠的寿命。(A)Ctrl及ALS小鼠的基因型，以及在Olig2^Cre/+驱动蛋白作用下于MN中过度表达mir-17～92的SOD1^G93A品系中的经拯救ROSA26-loxp-STP-loxp(LSL)-mir-17～92。(B及C)在P100时腰椎半腹角区的切片中ChAT^on MN的免疫染色及其数目定量揭示SOD1^G93A MN数目的明显恢复。白色虚线划出脊髓边缘。比例尺为50μm。(n＝4只小鼠，平均值±s.d.，*P<0.05，单因素ANOVA)。(D及E)在P100时腰椎脊髓的半腹侧ChAT^on MN中PTEN亚细胞定位的免疫染色及定量。SOD1^G93A MN中核PTEN的积聚因mir-17～92过度表达而减少。最右侧图中展示高倍数放大的突出显示的PTEN细胞。白色虚线描绘MN核。比例尺为10μm。(平均值±s.d.，n＝4只小鼠，*P<0.05，单因素ANOVA)。(F)展示脊柱后凸表型的小鼠的仑琴射线照片(roentgenogram)。应注意，脊柱后凸在ALS；mir-17～92^MN-OE小鼠中得以改善。红色点线描绘后肢形状；黑色点线描绘小鼠脊椎。(G)用于测试运动效能的旋杆测试。测定自加速的旋杆落下的等待时间且针对P100时的初始效能(为100％)归一化。ALS；mir-17～92^MN-OE小鼠呈现自P120开始改良的效能。(平均值±s.d.，Ctrl(n＝5)、ALS(n＝8)及ALS；mir-17～92^MN-OE(n＝6)小鼠，关于藉由双因素ANOVA比较ALS与ALS；mir-17～92^MN-OE小鼠，*P<0.05)。(H)卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)存活曲线反映Ctrl(n＝32)、ALS(n＝33)及ALS；mir-17～92^MN-OE(n＝22)小鼠的存活率。(****关于藉由对数秩(log-rank)Mantel-Cox检验比较ALS与ALS；mir-17～92^MN-OE小鼠，P<0.0001)。

图8A至E展示藉由在成年期过度表达mir-17～92进行的SOD1^G93A小鼠基因疗法足以保护神经肌肉功能且延长寿命。(A)实验策略的概述。时间线显示用于分析的治疗时程及阶段。左侧的示意图说明在腰椎鞘内注射(在L6与S1间)表达mir-17～92或作为对照的GFP的初级转录物的scAAV9。(B)已进行对照scAAV9-GFP或scAAV9-mir-17～92注射的SOD1^G93A小鼠的P100腰椎脊髓中的miR-17原位杂交。比例尺为50μm。(C)qPCR分析揭示与注射scAAV9-GFP的SOD1^G93A小鼠相比，在注射scAAV9-mir-17～92后P100时SOD1^G93A小鼠整个腰椎脊髓中的mir-17～92表达明显升高。(平均值±s.d.，n＝4，*P<0.05，双尾t检验)。(D)如藉由刺激坐骨神经后GA肌肉中诱发的CMAP所分析的注射scAAV9前后的神经肌肉功能。标绘由指定年龄的各组得到的最大峰间CMAP值的平均值。在注射scAAV9时SOD1^G93A小鼠中的CMAP幅度已在减小，且随时间推移逐渐进一步减小，而mir-17～92的过度表达在P120及P140时明显改善神经肌肉功能。(平均值±s.d.，n＝4～7只/组，关于藉由双因素ANOVA比较注射scAAV9-mir-17～92的小鼠与注射scAAV9-GFP的小鼠，*P<0.05)。(E)在scAAV9递送mir-17～92后，SOD1^G93A小鼠的寿命延长约14％。卡普兰-迈耶存活曲线反映Ctrl；AAV9-mir-17～92(n＝13)、ALS；AAV9-GFP(n＝15)及ALS；AAV9-mir-17～92(n＝17)小鼠的存活率。(***关于藉由对数秩Mantel-Cox检验比较ALS；AAV9-GFP小鼠与ALS；AAV9-mir-17～92小鼠，P<0.0005)。

具体实施方式

尽管与本文所述的方法及材料类似或等效的任何方法及材料均可用于实践或测试本文所述的实施例，但本文描述一些优选的方法、组合物、装置及材料。然而，在描述本发明材料及方法之前，应理解，本发明不限于本文中所描述的特定分子、组合物、方法或方案，因为其可根据常规实验及优化而变化。亦应理解，用于本描述中的术语仅出于描述特定型式或实施例的目的，且并不意欲限制本文中所描述的实施例的范围。

除非另外定义，否则本文中所使用的所有技术及科学术语具有与本发明所属领域一般技术者通常所理解相同的含义。

除非上下文另外明确规定，否则如本文及所附申请专利范围中所使用，单数形式“一个(种)(a)”、“一个(种)(an)”及“所述”包括多数个(种)参考物。

如本文中可互换地使用，术语“miR基因产物”、“微RNA”、“miRNA”或“miR”意谓与编码RNA杂交且调节编码RNA的表达的长度在18个与25个核碱基之间的非编码RNA。

如本文所用，术语“投药(administration)”及“投与(administering)”是指将药物、前药或其他药剂或治疗剂提供给个体或者活体内、活体外或离体细胞、组织及器官的行为。

如本文所用，术语“有发展……的风险”意谓个体易于发展病状或疾病。在某些实施例中，有发展病状或疾病的风险的个体展现所述病状或疾病的一或多种症状，但并未展现足够被诊断患有所述病状或疾病的数目的症状。在某些实施例中，有发展病状或疾病的风险的个体展现所述病状或疾病的一或多种症状，但程度比被诊断患有所述病状或疾病所要求的程度要轻。

如本文所用，术语“预防……的发作”意谓预防有发展疾病或病状的风险的个体发展所述病状或疾病。在某些实施例中，有发展疾病或病状的风险的个体接受与已患有所述疾病或病状的个体所接受的治疗类似的治疗。

如本文所用，术语“延迟……的发作”意谓延迟有发展疾病或病状的风险的个体中所述病状或疾病的发展。在某些实施例中，有发展疾病或病状的风险的个体接受与已患有所述疾病或病状的个体所接受的治疗类似的治疗。

在一个态样中，本发明提供一种治疗或预防个体的运动神经元退化疾病的方法，其包含向所述个体投与治疗或预防有效量的一或多个编码微RNA-17～92丛集的成员的基因或转基因。

在另一态样中，本发明提供一种改善患有运动神经元退化疾病的个体的运动缺陷及延长其寿命的方法，其包含向所述个体投与有效量的一或多个编码微RNA-17～92丛集的成员的基因或转基因。

在一些实施例中，本发明的投药包含将微RNA-17～92丛集的一或多个成员递送至个体的中枢神经系统中。在一些实施例中，将微RNA-17～92丛集的一或多个成员递送至个体的脊髓中。

在一些实施例中，运动神经元退化疾病的治疗或预防是经由SOD1_G93A MN中微RNA-17～92丛集的一或多个成员的过度表达实现。在一个实施例中，SOD1_G93A MN中微RNA-17～92丛集的一或多个成员的过度表达伴随PTEN以及E3接合酶Nedd4-2及Ndfip1的表达降低。在一个实施例中，SOD1_G93A MN中mir-17～92的早期选择性下调是在MN退化发作之前发生。因此，mir-17～92/nPTEN在SOD1_G93A脊髓中MN退化即将发作之前呈现MN标签分子的改变。在一个实施例中，选择性mir-17～92/nPTEN失调早期在SOD1_G93A LMC MN出现且可赋予对ALS疾病的MN亚型易损性。

在一些实施例中，本发明的方法可延迟或预防MN退化的发作或降低发展MN退化的风险。

运动神经元疾病(MND)是选择性影响运动神经元的若干神经退化病症中的任一种，运动神经元是控制身体的随意肌的细胞。在一些实施例中，本发明中所描述的运动神经元退化疾病包括肌肉萎缩性侧索硬化(ALS)及脊髓性肌肉萎缩症(SMA)。在一些实施例中，ALS是家族性ALS或偶发性ALS。

在一些实施例中，微RNA-17～92丛集的成员包括(但不限于)mir-17、mir-17*、mir-18a、mir-19a、mir-19b、mir-20a及mir-92a。在一个实施例中，微RNA-17～92丛集的成员是mir-17。

在一些实施例中，本发明的基因或转基因是并入或囊封于载剂中以用于投与或递送。在一些实施例中，载剂为病毒载体或纳米粒子。在一些实施例中，病毒载体是scAAV9、重组AAV的任何血清型(诸如AAV1、AAV2、AAV9、AAV2/1、AAV2/5、AAV2/8、AAV2/9)或慢病毒。能够驱动微RNA-17～92丛集表达的任何启动子均可用于载体中。在一些实施例中，启动子是H1、CMV、RSV、SV40、人类β-肌动蛋白、人类延长因子1α或细胞巨大病毒早期增强子/鸡β-肌动蛋白。在某一实施例中，本发明的转基因包含CMV启动子及一或多个编码微RNA-17～92丛集的成员的基因。

在一些实施例中，本发明的方法进一步包含投与一或多种靶向SOD1或MMP9的抑制性核酸、编码核PTEN干扰肽的转基因、ER压力抑制剂、压力颗粒阻断剂或miRNA生物发生活化剂。

适用于本发明方法中的抑制性核酸包括反义寡核苷酸、siRNA化合物、诸如siRNA化合物的单股或双股RNA干扰(RNAi)化合物、经修饰的碱基/锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)及与目标SOD1或MMP9的至少一部分杂交的其他寡聚化合物或寡核苷酸模拟物。在一些实施例中，抑制性核酸包括反义RNA、反义DNA、嵌合反义寡核苷酸、包含经修饰键联的反义寡核苷酸、干扰RNA(RNAi)、短干扰RNA(siRNA)、微干扰RNA(miRNA)、小时序RNA(stRNA)、或短发夹RNA(shRNA)、小RNA诱导的基因活化(RNAa)、小活化RNA(miRNA)或其组合。

举例而言，反义寡核苷酸通常设计成藉由结合至DNA或RNA目标且阻止在转录、转译或剪接层面上的表达来阻断所述目标的表达。本发明的反义寡核苷酸是经设计以在严格条件下与SOD1或MMP9杂交的互补核酸序列。

举例而言，本文所描述的方法中所用的抑制性核酸包含一或多个经修饰的键或碱基。经修饰的碱基包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、肽核酸或锁核酸(LNA)分子。优选地，经修饰的核苷酸为锁核酸分子，包括α-L-LNA。LNA包含核糖核酸类似物，其中核糖环经2'-氧与4'-碳间的亚甲基桥“锁定”；亦即，含有至少一个LNA单体的寡核苷酸。

举例而言，与SOD1或MMP9互补的核酸序列可为干扰RNA，包括(但不限于)小干扰RNA(“siRNA”)或小发夹RNA(“shRNA”)。用于构筑干扰RNA的方法是此项技术中所熟知的。

本发明的基因或与所述基因组合的本文所述的试剂可调配为医药组合物或与医药学上可接受的载剂的组合。这些医药组合物或组合可调配成非经肠、体表、经口、鞘内或藉由局部投药方式投与。这些医药组合物或组合可以任何方式调配且可视病状或疾病以及疾病程度、各患者的一般医学状况、所得优选投药方法及类似因素而以多种单位剂型投与。在一个实施例中，所述医药组合物或组合可经鞘内投与。举例而言，在实施例中，所述医药组合物或组合可经由鞘内注射活体内投与。

本发明的医药组合物或组合可根据此项技术中已知用于制造医药的任何方法制备。此类药物可含有甜味剂、调味剂、着色剂及防腐剂。调配物可混有适合制造的医药学上可接受的无毒赋形剂。调配物可包含一或多种稀释剂、乳化剂、防腐剂、缓冲剂、赋形剂等，且可以诸如以下形式提供：液体、粉末、乳液、冻干粉末、喷雾剂、乳膏、洗剂、控制释放调配物、锭剂、丸剂、凝胶、在贴片上、在植入物中等。

在一些实施例中，本文所描述的方法可包括与一或多种靶向SOD1或MMP9的抑制性核酸、编码核PTEN干扰肽的转基因、ER压力抑制剂、压力颗粒阻断剂或miRNA生物发生活化剂共投与。

在另一态样中，本发明提供一种在活体外筛选保护ALS中的运动神经元亚型的药物的方法，其包含(i)提供带有包含fALS基因及报导体基因的转基因的干细胞株；(ii)将药物与所述细胞株一起培养；(iii)引导所述细胞分化成运动神经元细胞及表达；及(iv)若自所述干细胞株中产生运动神经元亚型，则判定所述药物有效地保护ALS中的运动神经元亚型。

在一些实施例中，干细胞株是胚胎干细胞株或iPSC细胞株。在一些实施例中，干细胞株是人类或小鼠干细胞株。

在一些实施例中，fALS基因为含有经扩增的GGGGCC重复序列的C9orf72突变、FUS-R521C、FUS-P525R、FUS-R521H、FUS-Q210H、FUS-R514G、FUS-C1574G、SOD1-G93A、SOD1-A4V、SOD1-D90A、SOD1-D91A、SOD1-H46R、SOD1-A89V、SOD1-I113T、TDP43-A315T、TDP43-Q343R、TDP43-M337V、TDP43-N345K、TDP43-I383V或TDP43-M337V。

在一些实施例中，所述报导体为双报导体。在一些实施例中，所述双报导体为Hb9::RFP及FoxP1::GFP。

在另一态样中，本发明提供一种用于诊断个体的ALS中的运动神经元亚型的方法，其包含提供生物样品及侦测微RNA-17～92丛集的一或多个成员或者核PTEN的存在，其中失调的微RNA-17～92成员或核PTEN的存在指示对个体的ALS中的运动神经元亚型的诊断或对ALS中运动神经元亚型的易感性。

本文亦提供用于诊断个体的ALS中的运动神经元亚型或对ALS中运动神经元亚型的易感性的套组，其包含一或多种用于侦测生物样品中微RNA-17～92丛集的一或多个成员或者PTEN的存在的试剂。在一个特定实施例中，所述套组包含至少一个用于侦测微RNA-17～92丛集的一或多个成员或者PTEN的存在的连续核苷酸序列，所述核苷酸序列实质上为微RNA-17～92丛集的一或多个成员或PTEN或者与其互补。举例而言，核酸可包含至少一个与微RNA-17～92或PTEN(完全、部分)互补的序列。在一个实施例中，所述套组中的一或多种试剂经标记，且因此，这些套组可进一步包含能够侦测所述标记的试剂。所述套组可进一步包含有关使用所述套组的组件侦测ALS中的运动神经元亚型的说明书。

以下实例中进一步描述本发明，这些实例不限制申请专利范围中所描述的本发明的范围。

实例

材料及方法

小鼠

携带突变型人类SOD1_G93A转基因(B6SJL-Tg(SOD1*G93A)1Gur/J的小鼠是购自杰克逊实验室(Jackson Laboratory)。预先产生过度表达运动神经元特异性mir17～92的小鼠Olig2_Cre/+；ROSA26-loxp-STOP-loxp-mir-17～92_f/f(mir-17～92_MN-OE)(20)，且进一步使其与SOD1_G93A/+；ROSA26-loxp-STOP-loxp-mir-17～92_f/f小鼠杂交以获得SOD1_G93A；Olig2_Cre/+；ROSA26-loxp-STOP-loxp-mir-17～92/_ff或f/+(ALS；mir-17～92_MN-OE)拯救小鼠(rescuemice)。对于所有实验，将ALS；mir-17～92_MN-OE小鼠与其SOD1_G93A；Olig2_Cre/+或SOD1_G93A；ROSA26-loxp-STOP-loxp-mir-17～92_f/+或f/f ALS同胎仔畜相比较。

为了产生具有双转基因(Tg)报导体的小鼠，将脊髓MN报导体Hb9::RFP构筑体经电穿孔放入BALB/c胚胎干细胞(ESC)中且注射至宿主小鼠中。若干嵌合小鼠出生且进一步使其与C57BL/6J野生型小鼠杂交以获得种系传递的转基因Hb9::RFP始建系(founder line)。使用具有在起始密码子处插入约195kb的5′FoxP1序列及GFP的BAC的FoxP1::GFP ES细胞株(由Jeremy Dasen及Hynek Wichterle惠赠)(44)在C57BL/6背景下得到FoxP1::GFP小鼠品系。随后，使FoxP1::GFP品系与Hb9::RFP品系配对，得到在C57BL/6背景下具有双Tg报导子(FoxP1::GFP；Hb9::RFP)的小鼠。在E12.5时分析双Tg FoxP1::GFP；Hb9::RFP胚胎以验证双报导体的功效。所有活动物均保持在经中央研究院动物实验管理小组(IACUC AcademiaSinica)批准及监督的SPF动物设施中。

组织收集

小鼠在用300μL的20mg/mL阿佛丁(Avertin)(2,2,2-三溴乙醇，Sigma)麻醉下处死且随后灌注PBS及含4％多聚甲醛(PFA)的PBS。分离整个脊髓，再固定且在蔗糖中低温保存。将脊髓包埋于FSC 22冷冻切片包埋剂(Leica)中，且切割为10μm恒冷箱切片(cryostatsection)，随后藉由3'DIG标记的LNA miRCURY探针(Exiqon)进行免疫染色或原位杂交。关于步骤及分析的详细说明提供于SI材料及方法中。

雷射捕获显微切割

小鼠在用阿佛丁麻醉下处死且随后灌注DEPC-PBS。取出脊髓且在7分钟内切割成若干段，随后包埋于FSC 22冷冻切片包埋剂(Leica)中。在-20℃下，将冷冻块低温切割成20μm厚的切片且储存在-80℃下直至雷射捕获程序。

对于MN的染色，各切片用不含RNA酶的70％乙醇洗涤60秒，在含1％天蓝B(MPBiomedicals)的洗涤溶液中染色180秒，随后再洗涤20秒，且随后完全风干。MN是鉴别为存在于L5腰椎脊髓的腹侧区中的较深染色的大细胞体，而背侧非MN是鉴别为位于背侧脊髓中的经天蓝B染色的细胞体。自各小鼠显微切割(PALM MicroBeam，ZEISS，20X物镜)约400～500个MN或背侧非MN且收集至单个管中。自每一品系的3～4只小鼠收集MN及背侧非MN。

脊髓运动神经元计数

在各指定阶段，在10μm脊髓切片的一侧对L5腹角中具有DAPI的ChAT_on MN计数。不包括展示不规则核形状的MN。直方图展示来自每只相同年龄及基因型的小鼠(n≥3只小鼠)的至少3个切片中的平均MN计数。

AAV9病毒制备及注射

AAV9-mir-17～92质粒的构筑描述于SI方法中。AAV9-mir-17～92及AAV9-GFP是由中央研究院的AAV核心设施(AAV Core Facility)封装。对于鞘内注射，在P60时小鼠藉由异氟醚麻醉。经由在小鼠背部以手术方式切开约1.5cm窗口，暴露出腰椎脊髓。使用27G针将20μL的AAV9-GFP或AAV9-mir-17～92(5×10⁹vg/μL)以4μL/min的速率注射至在L6与S1段间的沟中。小鼠尾部轻击指示成功注射。

实例1mir17～92/PTEN在成体脊髓MN中表达及维持MN存活的mir-17～92要求

在先前研究(Tung，Y.T.，Lu，Y.L.，Peng，K.C.，Yen，Y.P.，Chang，M.，Li，J.，Jung，H.，Thams，S.，Huang，Y.P.，Hung，J.H.等人(2015).Mir-17～92 Governs Motor NeuronSubtype Survival by Mediating Nuclear PTEN.Cell reports 11，1305-1318)中发现，mir-17～92miRNA丛集的表达在正在发育的LMC-MN中富集，且所述丛集从而在LMC-MN到达神经支配肌肉并自其得到神经营养支持前促进LMC-MN存活。在机械作用上，mir-17～92靶向PTEN及其相关E3泛素接合酶复合物，亦即Nedd4-2及Ndfip1。因此，PTEN单泛素化较少且大部分保留在细胞质中以防止LMC-MN在正在发育的脊髓中经历天然存在的细胞凋亡(图1A)。

鉴于许多脊髓发作ALS患者是自四肢无力开始，且活动性去神经在ALS患者的四肢中比在其胸椎椎旁肌中发生得更显著，故LMC-MN看来比在ALS中的其他MN类型更容易发生退化(Kanning，K.C.，Kaplan，A.及Henderson，C.E.(2010).Motor neuron diversity indevelopment and disease.Annual review of neuroscience 33，409-440)。此情形促使吾人检查mir-17～92/核PTEN(nPTEN)是否能经由其在成体MN亚型中的不同表达造成ALS中MN亚型的不同易损性(图1A)。

先使用miR-17作为丛集中的代表性miRNA且胆碱乙酰转移酶(ChAT)作为MN标记物，在产后第40天(P40)藉由在经切片的成体腰椎脊髓中进行原位杂交(ISH)以及免疫染色，检查mir-17～92的表达在成体脊髓MN中是否仍保持富集(图1B)。尽管在整个脊髓中的神经元中可侦测到miR-17的表达，但其表达在腹侧脊髓中更显著(图1B及S1A)。定量验证了相较于位于腹侧脊髓处的闰绍细胞(Renshaw cell，RC)，脊髓MN中的miR-17表达量较高。

为了证实mir-17～92丛集的每一成员在MN中富集，对腹侧MN及来自背侧脊髓的非MN的细胞体进行雷射显微切割(图1C及图1D)并进行定量RT-PCR(qPCR)。使用ChAT以确保捕获了真正的MN(图1E)。与来自背侧脊髓的非MN相比，在成年小鼠脊髓的MN中mir-17～92的表达量更高(图1F)，证实mir-17～92的表达富集且自发育的胚胎持续至成体脊髓MN。

随后，检查mir-17～92的目标(亦即，PTEN)在成体脊髓中的表达。值得关注地是，PTEN在腹侧ChAT^on MN中大量表达且主要位于细胞溶质中，而PTEN在背侧细胞及Calbindin^on RC中的表达几乎无法侦测。这些结果指示，在成体脊髓中，PTEN优先在脊髓MN中表达且展现差别性细胞溶质定位，由此可能反映mir-17～92表达的富集。

吾人先前的研究指示，MN中mir-17～92缺失(Olig2^Cre/+；mir-17～92^floxed＝mir-17～92^MNΔ)导致在胚胎阶段E12.5～13.5时LMC-MN的特定损失(Tung，Y.T.，Lu，Y.L.，Peng，K.C.，Yen，Y.P.，Chang，M.，Li，J.，Jung，H.，Thams，S.，Huang，Y.P.，Hung，J.H.等人(2015).Mir-17～92 Governs Motor Neuron Subtype Survival by Mediating NuclearPTEN.Cell reports 11，1305-1318)。因此，约70％的mir-17～92^MNΔ胚胎可能因严重运动缺陷而在新生儿时死亡(N＝69，表S1)。剩余存活的mir-17～92^MNΔ小鼠允许吾人评定在出生后的后续阶段的MN表型。在这些突变小鼠(N＝17)中，有约85％展现较小体型及较轻体重。几乎所有的mir-17～92^MNΔ小鼠均展示某些“ALS”病变标志，包括1)在P30时mir-17～92^MNΔ小鼠脊髓中的ChAT^on MN数目明显减少(图1G且在1I中定量)。2).值得注意的是，在P30未在对照小鼠的腓肠肌(GA)肌肉中侦测到去神经，而mir-17～92^MNΔ小鼠呈现运动终板的急剧去神经(图1H且在图1J中定量)。3).mir-17～92^MNΔ小鼠的复合肌肉动作电位(CMAP)相对于对照值减少约35％(图1K)。综合而言，吾人的分析指示mir-17～92/PTEN在成体脊髓MN中高水平表达，且MN中mir-17～92的下调足以引起MN损失。

实例2 SOD1^G93A小鼠的MN中mir-17～92/nPTEN轴的早期症状发生前失调

为测试mir-17～92/nPTEN路径的失调与ALS的MN退化有关的假设，吾人将SOD1^G93A小鼠模型用作范例。在整个成年期中，在P80前SOD1^G93A腰椎脊髓中的ChAT^on MN的数目保持不受影响，且在P100时略有减少(图2A，在图2B中定量)。即使在P80时Ctrl与SOD1^G93A小鼠之间的MN数目相当，吾人亦已观测到SOD1^G93A MN中的miR-17表达明显下调(图2C，在图2D中定量)。在Ctrl与SOD1^G93A小鼠两者间的指定年龄期间，由于miR-17表达在背侧Tuj1^on中间神经元(dIN，对ALS有抗性)与calbindin^on RC(在症状发生前ALS阶段中保持完整)两者中保持较低且相当的水平，下调趋势看来在MN中更为突出(Wootz，H.，Fitzsimons-Kantamneni，E.，Larhammar，M.，Rotterman，T.M.，Enjin，A.，Patra，K.，Andre，E.，Van Zundert，B.，Kullander，K.及Alvarez，F.J.(2013).Alterations in the motor neuron-renshaw cellcircuit in the Sod1(G93A)mouse model.J Comp Neurol 521，1449-1469)。

为了精确定量在退化前完整SOD1^G93A侧部MN中miR-17以及mir-17～92丛集的其他成员的表达，吾人使用雷射显微切割自P100的Ctrl及SOD1^G93A小鼠收集侧腹脊髓中基于MN的大小及形状看具有健康形态的MN(关于细节参见STAR法)(图2E)，且藉由qPCR比较mRNA/miRNA的表达。虽然在经显微切割的对照与SOD1^G93A MN的间ChAT的表达不变(图2F)，但mir-17～92的若干成员在SOD1^G93A MN中的表达已呈现明显下降(图2G)。这些资料反映出mir-17～92的表达在SOD1^G93A MN中的MN死亡开始前下调。

此外，除了mir-17～92在相同组经显微切割的MN中的下调外，吾人还观察到，与对照相比时，在P100时所捕获的SOD1^G93A MN中其目标PTEN、Nedd4-2及Ndfip1的表达伴随增加(图2H)。由于Nedd4-2/Ndfip1促进PTEN单泛素化以推动其核输入(Tung等人，2015)，接下来分析在P40、P80及P100时来自对照及SOD1^G93A小鼠的MN中的亚细胞PTEN定位。在P100的SOD1^G93A MN中，PTEN的强度在全细胞(PTEN^总)中以及在核(PTEN^核)中明显增加(图2I)。另外，吾人亦观察到SOD1^G93A MN中PTEN^{核/细胞溶质}的比率显著升高(图2J)，表明升高的PTEN倾向于积聚在MN核中。在mir-17～92减少时(P80)直到明显核PTEN积聚(P100)的延迟可能反映PTEN转录后调节及转译后修饰组合所需的时间。相比于ChAT^on腹侧MN，PTEN在对照、SOD1^G93ACalbindin^on RC及Tuj1^on dIN中的表达在所有年龄皆保持几乎无法侦测(数据未展示)。总体而言，资料展示mir-17～92/nPTEN路径的破坏是SOD1^G93A脊髓中MN损失开始前脊髓MN中的标志事件。

实例3 SOD1^G93A LMC-MN中mir-17～92的选择性失调

为了进一步检查mir-17～92失调是否促成肢体神经支配MN对ALS的易损性，在此情境下，吾人确立一种新颖的双重转基因小鼠品系，其中肢体神经支配LMC-MN标记有GFP(Foxp1::GFP)且普通运动神经元标记有RFP(Hb9::RFP)。为验证报导体的保真度，吾人检查双重荧光报导体沿脊髓的延喙尾轴的表达模式。如所预期，在LMC-MN中侦测到Foxp1::GFP信号，而在LMC-MN及非LMC-MN两者中侦测到Hb9::RFP信号。因此，LMC-MN及非LMC-MN可藉由活体内转基因报导体的组合来区分，其中GFP^on/RFP^on代表LMC-MN且GFP^off/RFP^on代表非LMC-MN。然而，Foxp1::GFP在LMN-MN中的特异性表达变少且在一些脊髓IN中表达。此外，Hb9::RFP亦局限于成体MN的子集(资料未展示)。因此，吾人采用替代性胚胎干细胞(ESC)分化方法，利用以下事实：1)高保真度转基因报导体可用于描绘MN亚型；2)充分确立了用于得到具有真正延喙尾脊髓属性的MN亚型的条件(Davis-Dusenbery，B.N.，Williams，L.A.，Klim，J.R.及Eggan，K.(2014).How to make spinal motor neurons.Development 141，491-501Davis-Dusenbery等人，2014)；3)可用双报导体系统以FACS收集有丝分裂后MN亚型；及4)充分确定了用于在活体外使MN成熟及加速MN退化的条件(Thams，S.，Lowry，E.R.，Larraufie，M.H.，Spiller，K.J.，Li，H.，Williams，D.J.，Hoang，P.，Jiang，E.，Williams，L.A.，Sandoe，J.等人(2018).A Stem Cell-Based Screening Platform IdentifiesCompounds that Desensitize Motor Neurons to Endoplasmic ReticulumStress.Molecular therapy:the journal of the American Society of GeneTherapy)。

在此情况下，吾人进一步得到Foxp1::GFP；Hb9::RFP胚胎干细胞(ESC)株，且随后使用确定的方案使其分化成脊髓MN，由此产生颈/臂Hoxa5^on MN(由约15％LMC-MN及约85％非LMC-MN构成)。关于ESC源性MN的免疫染色揭示，Hb9::RFP细胞与通用MN标记物Isl1/2及Hb9共表达，而Foxp1::GFP细胞根据LMC-MN属性呈现为Foxp1^on/Lhx3^off。此结果藉由针对FACS纯化的GFP^on/RFP^on细胞的qPCR分析进一步验证，其展现Raldh2及Foxp1的高表达，但展现Lhx3的低表达。综上所述，吾人的双报导体系统提供一个在充分确定的分化系统中研究LMC-MN相对于非LMC-MN表型的理想平台。

随后，吾人使Foxp1::GFP；Hb9::RFP品系与Ctrl及SOD1^G93A小鼠杂交，以得到Ctrl及SOD1^G93A双报导体ESC细胞株，随后使其发育(harnessed)成MN亚型(图3A)。在分化时不存在压力条件的情况下，Ctrl及SOD1^G93A细胞株两者可分化成类似的LMC-MN及非LMC-MN，且无优先细胞损失。在基础条件下，Ctrl与SOD1^G93A细胞株间mir-17～92成员的表达量亦类似。为了加快活体外ALS疾病进展，吾人将环匹阿尼酸(CPA)施加至Ctrl及SOD1^G93A ESC源性MN。在应用此处使用的相同ESC分化方法的近期研究中(Thams，S.，Lowry，E.R.，Larraufie，M.H.，Spiller，K.J.，Li，H.，Williams，D.J.，Hoang，P.，Jiang，E.，Williams，L.A.，Sandoe，J.等人(2018).A Stem Cell-Based Screening Platform Identifies Compounds thatDesensitize Motor Neurons to Endoplasmic Reticulum Stress.Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy)，展示CPA对MN展现优先毒性且对IN仅有轻度作用的内质网压力子。在CPA压力下，吾人发现在Ctrl及SOD1^G93A MN两者中非LMC-MN群体对ER压力子更具抗性。相反地，相比于Ctrl LMC-MN，在CPA处理24～48小时后SOD1^G93A LMC-MN展现急剧细胞损失(图3B及3C)。值得注意地是，当仅用媒剂(DMSO)处理时，Ctrl与SOD1^G93A ESC源性MN间未显示不同的退化(图3B及3C)。因此，使用吾人新确立的ALS双报导体系统，可在CPA处理下捕获到MN亚型间不同程度的退化。

为了阐明MN亚型对CPA压力的敏感性差异，吾人研究CPA处理后24小时(亦即，在LMC-MN损失之前的时间点)时在吾人的ESC源性MN系统中mir-17～92及其目标(PTEN、Ndfip1及Nedd4-2)的表达。在SOD1^G93A LMC-MN中，吾人观测到mir-17～92成员下调的趋势，但在Ctrl与SOD1^G93A非LMC-MN间未观测到明显差异(图3D及3E)。同时，在SOD1^G93A LMC-MN中mir-17～92目标(PTEN、Ndfip1及Nedd4-2)的表达亦特异性上调(图3F及3G)。综上所述，SOD1^G93A LMC-MN更易于在压力下发生退化，且选择性呈现mir-17～92下调。

实例4 SOD1_G93A LMC-MN更易于发生mir-17～92/nPTEN失调

随后，吾人研究在CPA处理后24小时自Ctrl及SOD1^G93A小鼠两者中得到的LMC-MN及非LMC-MN中PTEN亚细胞定位的变化。PTEN主要分布于Ctrl组中非LMC-MN及LMC-MN的细胞溶质中(图4A)，类似于关于成体脊髓MN的观测结果(图2I)。根据吾人的模型，吾人观测到相比于Ctrl LMC-MN，在压力子处理后SOD1^G93A LMC-MN中的PTEN^{核/细胞溶质}比率明显增加，而Ctrl及SOD1^G93A非LMC-MN的PTEN^{核/细胞溶质}比率不存在差异(图4A；在图4B中定量)。

为了进一步细查MN亚型是否对核PTEN的细胞毒性起不同反应，吾人采用卵内系统，藉由将PTEN与核定位或核输出信号(NLS及NES)的融合物电穿孔放入正在发育的鸡胚胎中进行(图4C)。与PTEN-WT及PTEN-NES的微小作用相比，PTEN-NLS的异位过度表达则导致Foxp1^on LMC-MN的明显损失。值得关注地是，Lhx3^on非LMC-MN对PTEN表达更具抗性。此结果指示nPTEN优先造成LMC-MN死亡(图4D，在图4E中定量)。

总之，这些发现表明选择性mir-17～92/nPTEN失调在SOD1^G93A LMC-MN早期出现且赋予对ALS的MN亚型易损性。

实例5人类ALS SOD1^+/L144F iPSC源性MN中hsa-mir-17～92/nPTEN失调的重演

为了进一步探究在人类MN情形下mir-17～92的作用是否相关，吾人使带有MN报导体Hb9::GFP(HuES3 HB9::GFP)的人类ESC细胞株在限定条件下分化为MN(Maury，Y.，Come，J.，Piskorowski，R.A.，Salah-Mohellibi，N.，Chevaleyre，V.，Peschanski，M.，Martinat，C.及Nedelec，S.(2014).Combinatorial analysis of developmental cues efficientlyconverts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes.Naturebiotechnology)，由此重演自OLIG2^on祖细胞MN(第9天)在第14天发育为HB9^on/ISL1^on新生MN的发育时间次序。在第16天，藉由FACS收集Hb9::GFP^on MN且藉由FOXP1及RALDH2的表达鉴定LMC-MN标记物的富集。与吾人在小鼠MN中的发现类似(图1F)，在FACS纯化的HB9::GFP^on人类MN中hsa-mir-17～92表达量更高。

接下来，自携带SOD1^+/L144F突变的ALS患者获得人类诱导性多能干细胞(iPSC)(Boulting，G.L.，Kiskinis，E.，Croft，G.F.，Amoroso，M.W.，Oakley，D.H.，Wainger，B.J.，Williams，D.J.，Kahler，D.J.，Yamaki，M.，Davidow，L.等人(2011).A functionallycharacterized test set of human induced pluripotent stem cells.Naturebiotechnology 29，279-286)，且进一步产生由CRISPR-Cas9系统介导的同基因对照SOD1^+/+细胞株以校正突变的DNA序列(图5A及5B)。所述两个iPSC细胞株在吾人的培养条件下展现不可区分的多能标志与正常核型，且所述两个细胞株之间的SOD1表达量相当。两个iPSC细胞株均可遵循发育时间次序成功分化为SMI32^on ISL1^on MN，且具有约80％效率。接着，在补充有神经营养因子(NF)的培养基中再培养分离的MN两周，直至呈现较为成熟的标记物CHAT。大部分(约75％)的ISL1^on MN在第16天获得FOXP1^on LMC-MN属性且其后，提供一个在ALS情况下研究人类LMC-MN的理想系统。

为了加快ALS进展，吾人在MN成熟后(自第32～60天)剥夺培养基中的NF(Shi，Y.，Lin，S.，Staats，K.A.，Li，Y.，Chang，W.H.，Hung，S.T.，Hendricks，E.，Linares，G.R.，Wang，Y.，Son，E.Y.等人(2018).Haploinsufficiency leads to neurodegeneration inC9ORF72 ALS/FTD human induced motor neurons.Nature medicine 24，313-325)，导致自ALS-SOD1^+/L144F iPSC得到的FOXP1^on ISL1^on LMC-MN更显著减少(图5C～图5E)。随后，吾人检查在NF剥夺之前及14天之后的hsa-mir-17～92/nPTEN水平，此是在ALS-MN严重损失前的阶段，使人联想到活体内MN减少的开始。在NF剥夺之前，在Ctrl-SOD1^+/+及ALS-SOD1^+/L144FMN培养物中观测到不可区分的hsa-mir-17～92、PTEN及NDFIP1蛋白质表达水平，以及核与细胞溶质PTEN比率。然而，在NF剥夺后14天时，hsa-17～92的表达急剧减少(图5F)，同时PTEN、NEDD4-2及NDFIP1蛋白质水平升高，且ALS-SOD1^+/L144F MN培养物中的PTEN^{核/细胞溶质}比率升高(图5G及5H)。值得注意的是，在此阶段，吾人未观测到Ctrl-SOD1^+/+与ALS-SOD1^+/L144F细胞株之间细胞损失的明显差异(图5E)。此发现证实了在小鼠SOD1^G93A模型中的观测结果：具有核PTEN积聚的hsa-mir-17～92的下调是在SOD1-ALS类型中LMC-MN损失前展现。

实例6在人类SOD1^+/L144F iPSC源性MN中靶向hsa-mir-17～92以用于治疗性应用

为研究mir-17～92是否能充当停止ALS中MN退化的目标，随后吾人测试操纵mir-17～92的表达是否能修复人类ALS-iPSC源性MN中的MN退化。吾人在NF剥夺前利用慢病毒(LV)将hsa-mir-17～92或作为对照的YFP递送至iPSC～MN中(图6A)。在整个存活分析中，分别藉由免疫染色及qPCR确认ALS-SOD1^+/L144F MN中YFP及hsa-mir-17～92的持续过度表达(图6B)。正如所料，异位hsa-mir-17～92表达引起ALS-SOD1^+/L144F MN中PTEN、NEDD4-2及NDFIP1的抑制(图6C)，且对ALS-SOD1^+/L144F LMC-MN群具有显著拯救作用(图6D且在图6E中定量)。综上所述，这些资料证实，在MN情形中hsa-mir-17～92的过度表达可减轻ALS-SOD1^+/L144F中的MN退化，由此提供hsa-mir-17～92可作为ALS治疗的理想治疗目标的原理验证证据。

实例7藉由在MN中过度表达mir-17～92改善SOD1^G93A小鼠的ALS症状

为研究mir-17～92是否能在活体内拯救ALS中的MN退化，吾人随后测试操纵mir-17～92的表达是否能改善SOD1^G93A小鼠的ALS症状。吾人先前已产生条件型mir-17～92^MN-OE(Olig2^Cre/+；ROSA-26-LSL-mir-17～92^f/f)小鼠，且这些小鼠健康并展现正常寿命(Tung，Y.T.，Lu，Y.L.，Peng，K.C.，Yen，Y.P.，Chang，M.，Li，J.，Jung，H.，Thams，S.，Huang，Y.P.，Hung，J.H.等人(2015).Mir-17～92Governs Motor Neuron Subtype Survival byMediating Nuclear PTEN.Cell reports 11，1305-1318)。此处，吾人在单纯C57BL/6背景下进一步使mir-17～92^MN-OE小鼠与SOD1^G93A品系杂交(图7A)。ＣhAT^on MN中mir-17～9的表达复原是藉由[SOD1^G93A；mir-17～92^MN-OE]小鼠腰椎脊髓切片的原位杂交以及免疫染色证实。与在P100时SOD1^G93A同胞中miR-17的几乎无法侦测的表达量相比，[SOD1^G93A；mir-17～92^{MN -OE}]小鼠保持较高的miR-17表达量。因此，SOD1^G93A小鼠中的MN数目减少在P100时于[SOD1^G93A；mir-17～92^MN-OE]小鼠中明显停止(图7B，在图7C中定量)。在分子层面上，SOD1^G93AMN中PTEN^{核/细胞溶质}比率升高在mir-17～92过度表达后降低(图7D，在图7E中定量)。

为进一步检查mir-17～92过度表达是否改善ALS症状及运动功能，吾人进行一系列生理分析(Kanning，K.C.，Kaplan，A.及Henderson，C.E.(2010).Motor neurondiversity in development and disease.Annual review of neuroscience 33，409-440)。在P140，[SOD1^G93A；mir-17～92^MN-OE]小鼠体重增加且展现后肢抱握症状缓解。SOD1^G93A小鼠中由肌肉无力引起的脊柱后凸表型亦因mir-17～92过度表达而得到改善(由仑琴射线照相检验)(图7F)。行为上，[SOD1^G93A；mir-17～92^MN-OE]小鼠在旋杆测试中表现更好(图7G)。引人注目的是，在C57BL/6群落中SOD1^G93A小鼠的中值存活期为约160天，但在mir-17～92过度表达时增加至约182天，呈现约14％的寿命延长(图7H)。

实例8 AAV9-mir17～92的成年投药延长SOD1^G93A小鼠存活期

在SOD1^G93A小鼠中过度表达mir-17～92的有希望的结果促使吾人测试mir-17～92作为成年小鼠中的治疗措施的潜力。吾人利用自身互补型腺相关载体血清型9(scAAV9)，藉由在P60时经鞘内注射以在整个脊髓中过度表达mir-17～92(Foust，K.D.，Salazar，D.L.，Likhite，S.，Ferraiuolo，L.，Ditsworth，D.，Ilieva，H.，Meyer，K.，Schmelzer，L.，Braun，L.，Cleveland，D.W.等人(2013).Therapeutic AAV9-mediated suppression of mutantSOD1 slows disease progression and extends survival in models of inheritedALS.Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy 21，2148-2159)，其绕过mir-17～92的潜在功能以促进胚胎MN祖细胞的异位增殖(图8A)。为测试病毒感染效率，吾人首先将scAAV9-GFP注射给Ctrl小鼠，且在注射后40天，在脊髓MN中以及在一些背细胞中观测到较强且持久的GFP表达。随后，将scAAV9-mir-17～92与scAAV9-GFP并行注射至Ctrl及SOD1^G93A小鼠中。吾人藉由miR-17的原位杂交以及腰椎脊髓中mir-17～92成员的qPCR定量来验证脊髓中外源mir-17～92的稳固诱导(图8B及8C)。

为了在更接近临床的环境中评估小鼠，吾人藉由量测CMAP来分析MN及腓肠肌(GA)肌肉连接性。吾人在以下若干时间点进行CMAP：自P60(在即将AAV处理前)至P140。在P60时，SOD1^G93A小鼠刚开始呈现MN去神经且展现略微受损的CMAP幅度。在P120及P140时，CMAP反应在AAV9-mir-17～92处理后明显改善，但尚未改善达到Ctrl小鼠的水平(图8D)。不同于SOD1反义寡核苷酸(ASO)处理促进MN神经再支配的方式(McCampbell，A.，Cole，T.，Wegener，A.J.，Tomassy，G.S.，Setnicka，A.，Farley，B.J.，Schoch，K.M.，Hoye，M.L.，Shabsovich，M.，Sun，L.等人(2018).Antisense oligonucleotides extend survival and reversedecrement in muscle response in ALS models.J Clin Invest 128，3558-3567)，吾人的数据表明，mir-17～92的过度表达明显延长MN存活期而非促进MN神经再支配。最终，且最重要的是，mir-17～92的成年递送亦使SOD1^G93A小鼠的寿命自161天的中值延长至184天(图8E)。

综合而言，吾人的结果证实，mir-17～92是经由调节成体MN中的PTEN亚细胞易位来维持MN存活的一个必不可少的固有调节因子。在ALS情形中，藉由遗传方法或在成体中递送scAAV9以在MN中过度表达mir-17～92将延迟MN退化的发作、增强运动功能且延长ALS小鼠模型的寿命。这些发现设想mir-17～92为ALS患者MN退化的预后标记物及有希望的候选治疗目标。

Claims (26)

1.一种治疗或预防个体的运动神经元退化疾病或改善患有运动神经元退化疾病的个体的运动缺陷及延长所述个体的寿命的方法，其包含将治疗或预防有效量的一或多个编码微RNA-17～92丛集的成员的基因或转基因或者微RNA-17～92丛集的一或多个成员投予至个体。

2.如权利要求1的方法，其中所述投与包含将微RNA-17～92丛集的一或多个成员递送至所述个体的中枢神经系统中。

3.如权利要求1的方法，其中所述投与包含将微RNA-17～92丛集的一或多个成员递送至所述个体的脊髓中。

4.如权利要求1的方法，其中所述运动神经元退化疾病的治疗或预防是经由所述微RNA-17～92丛集的一或多个成员在SOD1_G93A MN中的过度表达实现。

5.如权利要求4的方法，其中所述微RNA-17～92丛集的一或多个成员在SOD1_G93A MN中的过度表达引起核PTEN水平的伴随降低。

6.如权利要求1的方法，其中SOD1_G93A MN中mir-17～92的早期选择性下调是在MN退化发作之前发生。

7.如权利要求6的方法，其中选择性mir-17～92/nPTEN失调早期在SOD1_G93ALMC MN中出现且可赋予对ALS疾病的MN亚型易损性。

8.如权利要求1的方法，其延迟或预防MN退化发作或降低发展MN退化的风险。

9.如权利要求1的方法，其中所述MN退化为肌肉萎缩性侧索硬化(ALS)或脊髓性肌肉萎缩症(SMA)。

10.如权利要求9的方法，其中所述ALS为家族性ALS或偶发性ALS。

11.如权利要求1的方法，其中所述微RNA-17～92丛集的成员为mir-17、mir-17*、mir-18a、mir-19a、mir-19b、mir-20a或mir-92a。

12.如权利要求1的方法，其中将所述基因或转基因并入或囊封于载剂中以用于投与或递送。

13.如权利要求12的方法，其中所述载剂为病毒载体或纳米粒子。

14.如权利要求13的方法，其中所述病毒载体为scAAV9、重组AAV的任何血清型(诸如AAV1、AAV2、AAV9、AAV2/1、AAV2/5、AAV2/8、AAV2/9)或慢病毒。

15.如权利要求1的方法，其中所述转基因包含H1启动子、CMV启动子、RSV启动子、SV40启动子、人类β-肌动蛋白启动子、人类延长因子-1α启动子或细胞巨大病毒早期增强子/鸡β-肌动蛋白启动子及一或多个编码微RNA-17～92丛集的成员的基因。

16.如权利要求1的方法，其进一步包含投与一或多种靶向SOD1或MMP9的抑制性核酸、编码核PTEN干扰肽的转基因、ER压力抑制剂、压力颗粒阻断剂或miRNA生物发生活化剂。

17.如权利要求16的方法，其中所述抑制性核酸为反义寡核苷酸、siRNA化合物、诸如siRNA化合物的单股或双股RNA干扰(RNAi)化合物、经修饰的碱基/锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)或与所述目标SOD1或MMP9的至少一部分杂交的其他寡聚化合物或寡核苷酸模拟物。

18.如权利要求1的方法，其中所述投与为鞘内注射。

19.一种在活体外筛选保护ALS中的运动神经元亚型的药物的方法，其包含:

(i)提供带有包含fALS基因及报导体基因的转基因的干细胞株；

(ii)将药物与所述细胞株一起培养；

(iii)引导所述细胞分化成运动神经元细胞及表达；及

(iv)若自所述干细胞株产生运动神经元亚型，则判定所述药物有效地保护ALS中的运动神经元亚型。

20.如权利要求19的方法，其中所述干细胞株为胚胎干细胞株或iPSC细胞株。

21.如权利要求19的方法，其中所述干细胞株为人类干细胞或小鼠干细胞。

22.如权利要求19的方法，其中所述fALS基因为含有经扩增的GGGGCC重复序列的C9orf72突变、FUS-R521C、FUS-P525R、FUS-R521H、FUS-Q210H、FUS-R514G、FUS-C1574G、SOD1-G93A、SOD1-A4V、SOD1-D90A、SOD1-D91A、SOD1-H46R、SOD1-A89V、SOD1-I113T、TDP43-A315T、TDP43-Q343R、TDP43-M337V、TDP43-N345K、TDP43-I383V或TDP43-M337V。

23.如权利要求19的方法，其中所述报导体为双报导体。

24.如权利要求23的方法，其中所述双报导体为Hb9::RFP及FoxP1::GFP。

25.一种用于诊断个体的ALS中的运动神经元亚型的方法，其包含提供生物样品及侦测微RNA-17～92丛集的一或多个成员或者PTEN的存在，其中失调的微RNA-17～92成员或核PTEN的存在指示对所述个体的ALS中的运动神经元亚型的诊断或对ALS中运动神经元亚型的易感性。

26.一种用于诊断个体的ALS中的运动神经元亚型或对ALS中的运动神经元亚型的易感性的套组，其包含一或多种用于侦测生物样品中微RNA-17～92丛集的一或多个成员或者核PTEN的存在的试剂。

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