KR102106587B1 - Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA 또는 이의 변이체를 유효성분으로 포함하는 근육질환 또는 악액질의 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA 또는 이의 변이체를 유효성분으로 포함하는 근육질환 또는 악액질의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서는, 나이가 증가함에 따라 Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA들의 발현이 감소하는 것을 발견하였다. 특히, 대부분의 miRNA들을 완전히 분화된 근관에 과발현하였을 때, 근관의 직경이 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 종양으로 유도된 악액질 마우스 모델에서도 Atrogin-1 단백질을 저해함으로써 악액질이 개선되는 것을 확인하였다. 따라서, Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA 또는 이의 변이체는 Atrogin-1 의존적인 근육 질환 및 악액질 치료 및 예방에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA 또는 이의 변이체를 유효성분으로 포함하는 근육질환 또는 악액질의 예방 또는 치료용 약학 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING MUSCULAR DISEASE OR CACHEXIA COMPRISING, AS ACTIVE INGREDIENT, miRNA LOCATED IN Dlk1-Dio3 CLUSTER OR VARIANT THEREOF}

본 발명은 Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA 또는 이의 변이체를 유효성분으로 포함하는 근육질환 또는 악액질의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

골격근의 질량과 기능은 나이가 들면 점차 감소하며, 이는 노인들의 사망률 및 삶의 질 저하에 주요 원인이다. 노화된 골격근은 근육 질량이 줄어들 뿐 아니라, 힘 및 기능면에서 점진적인 감소를 보이는데, 이러한 질병을 '노화성 근육감소증(Sarcopenia)'이라고 한다(허준원 외 4, 2017). 근육 질량은 30대에서 매년 약 1%씩 감소하며, 노화성 근육감소증의 유병률은 60대 노인에서 약 10%이고 80대에 약 50%로 증가한다. 노화에 따른 근육의 감소는 신체 활동의 장애뿐만 아니라 2형 당뇨병, 비만, 이상지질혈증, 고혈압과 같은 여러 질병을 촉발하기 때문에, 건강한 근육을 위한 효과적인 치료제 개발이 시급하다. 그러나, 현재까지 FDA(Food and Drug Administration)의 승인을 받은 노화성 근육감소증에 대한 치료제는 없다. 최근, 세계 보건기구(World Health Organization)는 노화성 근육감소증에 대질병분류체계(ICD-10-CM)에 질병 코드를 부여하였다. 이러한 상황을 미루어볼 때 노화성 근육감소증에 대한 진단 및 치료제의 개발이 가속화될 것으로 예상된다.

근육 질량은 동화작용과 이화작용 사이의 역동적 균형에 의해 결정된다. 인터루킨-1(IL-1), 종양괴사인자(TNF-α) 및 글루코코르티코이드(glucocorticoid)를 비롯한 다양한 자극을 통해 근육 위축이 일어나는 것이 보고된 바 있다. 이러한 근육 위축에는 근육 특이적 E3 리가아제(예: MuRF1 및 Atrogin-1/MAFbx)가 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 이러한 E3 리가아제는 오랫동안 근육을 움직이지 않는 경우, 신경 손상, 당뇨병, 패혈증, 갑상선 기능 항진증, 암에 의한 악액질 등의 여러 질병에서도 현저하게 증가하는 것으로 보고되었다. 노화된 근육에서의 E3 리가아제 조절 메카니즘은 거의 알려진 바가 없는데, 마우스, 래트 및 인간 근육에서 MuRF1 및 Atrogin-1의 유전자 발현 수준 정도만 알려져 있는 수준이다. 그러나 이러한 유전자 발현 연구 결과도 또 다른 연구그룹에서는 상반된 결과가 나오는 등 논란의 여지가 있다.

한편, microRNA(이하, miRNA)는 가장 광범위하게 연구된 비번역 RNA 중 하나로서, 전사 후 수준에서 유전자의 발현을 조절하는 것이 주 역할이다. microRNA는 약 22 뉴클레오타이드로 이뤄진 단일 가닥 분자로서, 종종 폴리시스트론(polycistronic) 클러스터에 배열되어 동일한 타겟 또는 같은 경로를 공동으로 표적화하는 경향을 보인다. Dlk1-Dio3(delta-like 1 homolog-type 3 iodothyronine deiodinase)는 알려진 가장 큰 miRNA 클러스터이다. 근육 노화에서 Dlk1-Dio3 클러스터의 기능이 알려진 것은 거의 없다.

허준원 외 4, 노화성 근감소증과 운동, 운동학 학술지 제19권 제2호. DOI : http://dx.doi.org/10.15758/jkak.2017.19.2.43

이에, 본 발명자들은 Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA가 노화로 인한 근육감소에서 어떠한 공통적인 역할을 하는지 알아보고 이를 토대로 노화성 근육감소증 치료제로서의 사용가능성을 확인하고자 하였다. 그 결과, 본 발명자들은 Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA가 마우스의 골격근 및 근원세포(myoblast)의 노화에 관여함을 확인하였다. 또한, 근육 노화 과정에서 miRNA에 의한 Atrogin-1 발현 조절 기전을 규명하였고, Dlk1-Dio3 클러스터 내 miRNA를 바탕으로 한 유전적 치료방법이 근육 노화뿐만 아니라 암의 악액질에 효과적인 예방 효능이 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 Dlk1-Dio3 클러스터 내 miRNA를 유효성분으로 포함하는 근육노화 또는 악액질의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA 또는 이의 변이체를 유효성분으로 포함하는 근육질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA 또는 이의 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드가 적재된 벡터를 유효성분으로 포함하는 근육질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA 또는 이의 변이체를 유효성분으로 포함하는 악액질의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA 또는 이의 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드가 적재된 벡터를 유효성분으로 포함하는 악액질의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 근육질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 근육질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 악액질의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 악액질을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 근육질환의 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA 또는 이의 변이체의 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 근육질환의 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA 또는 이의 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드가 적재된 벡터의 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 악액질의 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA 또는 이의 변이체의 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 악액질의 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA 또는 이의 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드가 적재된 벡터의 용도를 제공한다.

본 발명에서는 노화에 따라 Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA들의 발현이 감소하는 것을 발견하였다. 또한, 특정 miRNA들을 완전히 분화된 근관에 과발현하였을 때, 근관의 직경이 증가하는 것을 확인하였다. 또한, Dlk1-Dio3 클러스터에 있는 다양한 miRNA들이 Atrogin-1 3'-UTR과 상호 작용하여 근육 특이적 E3 리가아제인 Atrogin-1의 단백질 발현을 억제하는 것을 확인하였다. 또한, 상기 miRNA를 발현하는 아데노바이러스를 노화된 마우스의 근육에 감염시켰을 시, 골격근 위축을 극적으로 개선하였다. 또한, 종양으로 유도된 악액질 마우스 모델에서도 miRNA를 이용해 Atrogin-1 단백질을 저해함으로써 악액질이 개선되는 것을 확인하였다. 따라서, Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA 또는 이의 변이체는 Atrogin-1 의존적인 근육 질환 및 악액질 개선에 유용하게 활용될 수 있다.

도 1a 내지 도 1f는 젊은 마우스 및 나이든 마우스로부터 분리한 TA 근육 및 근섬유의 miRNA 발현 프로파일을 비교 분석한 것이다.
구체적으로, 도 1a은 연령에 따라 TA 근육(tibialis anterior muscle) 조직에서 차별적으로 발현한 miRNA의 분포를 표시한 차트이다. 왼쪽의 원 차트는 노화 TA 근육에서 56%의 miRNA(61개)가 발현 감소됨을 보여준다. 오른쪽의 원형 차트는 발현 감소된 miRNA의 69%(42개)가 Dlk-Dio3 게놈 영역에 위치하고 있음을 보여준다.
도 1b는 노화에 따라 증가한 miRNA 48개와 감소된 miRNA 61개를 사용하여 발현량(> 1.5배)에 109개의 miRNA를 분류하였다.
도 1c는 노화에 따른 Dlk1-Dio3 게놈 영역에 위치한 42개 miRNA를 발현량에 따라 분류한 것이다. 각 칼럼은 젊은 마우스(6개월) 및 나이든 마우스(24개월)의 TA 근육에서 miRNA 발현 수준을 나타낸 것이다.
도 1d는 젊은 마우스(3개월) 및 나이든 마우스(27개월)에서 분리된 근아세포(myoblast)에서 차별적으로 발현하는 miRNA의 분포를 나타낸 차트이다. 왼쪽의 원 차트는 노화 근아세포에서 60%의 miRNA(71개)가 발현이 감소됨을 보여준다. 오른쪽의 원 차트는 발현 감소된 miRNA의 83%(59개)가 Dlk1-Dio3 게놈 영역에 위치함을 보여준다.
도 1e는 발현이 증가된 miRNA 47개 및 감소된 miRNA 71개를 사용하여 발현량(> 2배)에 118개의 miRNA를 발현량에 따라 분류한 것이다.
도 1f는 노화에 따른 Dlk1-Dio3 게놈 영역에 위치한 59개의 miRNA를 발현량에 따라 분류한 것이다. 각 열은 젊거나 노화된 TA 근육에서 분리한 근아세포에서 miRNA 수준을 나타낸다.
도 2는 노화에 따른 Dlk1-Dio3 클러스터에 존재하는 miRNA의 발현량의 변화를 연령에 따라 나타낸 것이다. 구체적으로, 인간의 연령(25세 내지 80세)과 인간 Dlk1-Dio3 클러스터에 존재하는 18개의 miRNAs 발현량의 상관관계를 나타낸 것이다. miRNA는 인간 대둔근(gluteus maximus muscle)에서 분리하였다. 자료는 Spearman 's correlation test(ρ; 95 % CI; n = 20)를 사용하여 평가하였다.
도 3a는 근육 비대의 표현형을 일으키는 miRNA의 스크리닝 계획을 나타낸 것이다. C2C12 세포의 분화 유도 후 4일째에, Dlk1-Dio3 클러스터 내에 존재하는 miRNA 활성을 확인하기 위해, miRNA mimic을 분화된 근관에 개별적으로 형질감염 시켰다. 형질감염 후 24시간에, 근관 직경을 측정하였다.
도 3b는 miRNA mimic으로 형질감염된 분화된 근육 세포의 이미지를 나타낸 것이다. 근관은 직경 측정을 위해 에오신 Y로 염색하였다. 스케일 바는 50 ㎛이다.
도 3c는 miRNA mimic으로 형질감염 시킨 후 다양한 직경을 갖는 근관의 백분율을 나타낸 것이다. 진한 색일수록 더 큰 직경을 나타낸다. 현미경 영상 소프트웨어(NIS-Elements Basic Research, Nikon)를 사용하여 직경 측정을 위해 네 가지 이미지를 무작위로 선택하였다. 데이터는 평균±SD로 나타내었다.
도 4a는 마우스 Atrogin-1 3'UTR에서 miRNA(인간에서 12개 보존)에 대한 38개의 결합 부위가 예측됨을 나타낸 것이다.
도 4b는 miRNA로 형질감염된 293T 세포에서 Atrogin-1 3'UTR을 갖는 루시퍼라제 리포터의 상대적 활성을 나타낸 것이다(* P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001).
도 4c는 miRNA로 형질감염된 분화된 C2C12 세포에서 면역블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 상기 결과는 GAPDH에 의해 표준화되었다.
도 4d는 도 4c의 Atrogin-1의 상대적 발현량을 정량화한 것이다.
도 4e는 miR-493, miR-376b 및 miR-433 형질감염된 C2C12 근관에서 Atrogin-1의 면역블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. Atrogin-1의 발현 수준을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 정량화하고 그 결과를 GAPDH 발현으로 정규화시켰다.
도 4f는 miRNA로 형질감염된 분화된 인간 골격근 세포(HSMM)의 면역블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 상기 결과는 GAPDH에 의해 표준화되었다.
도 4g는 도 4f의 Atrogin-1의 상대적 발현량을 정량화한 것이다.
도 4h 및 도 4i는 젊은 마우스 또는 늙은 마우스로부터 분리된 TA 근육 내 Atrogin-1의 면역 분석 및 정량한 결과를 나타낸 것이다. 상기 결과는 ACTN1의 평균 발현량에 의해 표준화되었다(*** P <0.001).
도 4j는 표시된 연령의 인간 근육 조직에서의 Atrogin-1의 면역블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 상기 결과는 GAPDH에 의해 표준화되었다.
도 4k는 인간 연령과 Atrogin-1의 발현 사이의 상관 분석 결과를 나타낸 것이다. 상기 결과는 Spearman 's correlation test(ρ; 95 % CI)를 사용하여 평가하였다.
도 4l은 젊은 마우스 또는 나이든 마우스로부터 분리된 TA 근육에서 Atrogin-1의 mRNA의 상대적 발현량을 나타낸 것이다. 상기 결과는 ACTB에 의해 표준화되었다.
도 4m은 25세 내지 80세 사이의 인간 피험자의 근육에서 Atrogin-1 mRNA의 발현량을 나타낸 것이다. 상기 결과는 GAPDH로 정규화되었다. 상기 결과는 Spearman 's correlation test(ρ; 95 % CI; n = 20)를 사용하여 평가하였다.
도 4n은 단계별 분석에 포함된 miRNA를 나타낸 것이다. 이때, *는 인간에 보존된 것이다.
도 5a는 노화된 마우스의 근육 무게와 체중의 비율을 나타낸 것이다.
도 5b는 젊은 마우스 및 나이든 마우스의 근육의 횡단면 이미지를 나타낸 것이다(적색, 라미닌; 블루, DAPI; 스케일 바, 50 ㎛).
도 5c는 단면적(CSA)의 형태학적 분석 결과를 나타낸 것이다. 4개의 다른 이미지가 무작위로 선택되었고 각 CSA는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 분석되었다(* P <0.05).
도 6은 젊은 TA 근육 및 노화된 TA 근육에서 C2C12 근육 비대화 표현형을 강하게 유도하는 상위 5개 miRNA의 발현을 나타낸 것이다. 구체적으로, 젊거나 나이든 TA 근육(n = 5)에서 miR-668, miR-376c, miR-494, miR-541 및 miR-1197의 상대적 발현량을 나타낸 것이다. U6 small nuclear RNA(snRNA) 수준으로 정규화하고 평균 ± SD (* P <0.05)로 나타내었다.
도 7a는 마우스 Atrogin-1의 전장 3'UTR(위) 및 절단된 3'UTR(아래)에서 miR-376c-3p의 결합 추정 부위를 나타낸 것이다. 인간과 마우스 사이의 보존된 부위만 포함한다.
도 7b는 야생형(WT) 또는 돌연변이 3'UTR을 가지는 루시퍼라제 리포터의 활성을 측정하여 miR-376c-3p가 WT Atrogin-1 3'UTR에 또는 결실 돌연변이(Mut) Atrogin-1 3'UTR에 미치는 영향을 확인한 것이다(*** P <0.001).
도 7c는 ASO(비오틴 유무에 관계없음) 및 스트렙타비딘 비즈(streptavidin beads)를 이용한 풀다운 분석 결과를 나타낸 것이다. 상기 정량 분석은 qRT-PCR로 수행하였다(** P <0.01).
도 8은 C2C12 세포에서 스트렙타비딘 비즈를 이용한 Atrogin-1 3'UTR의 풀다운 분석 결과를 나타낸 것이다. 데이터는 3번의 독립적인 실험의 평균 ± SD로 나타내었다.
도 9a 및 도 9b는 miR-376c-3p 또는 억제제(I)-miR-376c-3p로 형질감염된 분화된 일차 근아세포(도 9a) 및 HSMM(도 9b)에서의 Atrogin-1의 면역블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. Atrogin-1의 발현 수준을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 계량화하고 ACTB에 의해 표준화시켰다.
도 9c는 miR-376c-3p 및 억제제(I)-miR-376c-3p 형질감염된 C2C12 세포에서의 Atrogin-1의 면역블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 상기 결과는 ACTB 표현으로 정규화되었다.
도 10a는 miR-376c-3p 또는 대조군(야생형, Ctrl)을 발현하는 분화된 근육 세포의 이미지를 나타낸 것이다(녹색, MyHC; 파란색, DAPI; 스케일 바, 50 ㎛).
도 10b는 miR-376c-3p 또는 대조군(야생형, Ctrl)을 발현하는 분화된 근육 세포의 섬유 직경의 백분율에 대한 정량화 그래프를 나타낸 것이다.
도 10c는 miR-376c-3p 또는 대조군(야생형, Ctrl)을 발현하는 분화된 근육 세포의 섬유 직경의 평균에 대한 정량화 그래프를 나타낸 것이다(** P <0.01).
도 10d는 miR-376c-3p 또는 대조군으로 형질감염된 분화된 HSMM에서 게놈 DNA 함량에 의해 정규화된 단백질 비율을 나타낸 것이다(** P <0.01).
도 10e는 23개월령 마우스의 TA 근육(AdmiRa-376c-3p) 및 대조군 TA 근육(AdmiRa-Ctrl)으로의 아데노 바이러스 주사의 계획을 나타낸 것이다.
도 11a는 AdmiRa-376c-3p 또는 대조군(AdmiRa-Ctrl)에 감염된 C2C12 근관에서 Atrogin-1의 면역블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. C2C12 세포의 근관 분화 후 3일째에, 근육 세포를 AdmiRa-376c-3p 또는 대조군(AdmiRa-Ctrl)에 감염시켰다. 아데노바이러스 감염 24시간 후, 웨스턴 블롯을 통해 Atrogin-1의 발현을 측정하였고 ACTB의 결과로 정규화하였다.
도 11b는 감염 후 7일째에 GFP-표지된 AdmiRa-376c-3p 또는 대조군으로 감염된 23 개월의 TA 근육 조직의 형광 이미지를 나타낸 것이다(눈금 막대, 1mm).
도 12a 내지 도 12c는 바이러스 감염된 근육 횡단면의 이미지(도 12a), 백분율(도 12b) 및 평균(도 12c)에 대한 그래프를 나타낸 것이다(적색, 라미닌; 파란색, DAPI; 스케일 바, 50 ㎛; * P <0.05; ** P <0.01).
도 12d는 23개월된 마우스의 AdmiRa-Ctrl 또는 376c-3p 감염 TA 근육 조직에서 Atrogin-1 및 eIF3f의 면역블롯 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 12e는 ImageJ를 사용하여 도 12d의 면역블롯 분석 결과에서 Atrogin-1 및 eIF3f의 상대적인 발현량을 나타낸 것이다. 상기 결과는 ACTN1의 평균 수준에 의해 정상화되었다. 데이터는 평균 ± SD로 나타내었다(* P <0.05, ** P <0.01).
도 12f는 젊은 마우스 또는 나이든 마우스의 TA 근육 피로도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 12g는 아데노바이러스에 감염된 늙은 마우스 TA 근육의 피로도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 13a는 miR-376c-3p 또는 si-Atrogin-1 트랜스펙션된 C2C12 근관의 이미지를 나타낸 것이다. 100 μM의 덱사메타손(dex)을 24시간 처리하거나 처리하지 않았다(녹색, MyHC; 파란색, DAPI; 스케일 바, 50 ㎛).
도 13b 및 도 13c는 도 13a의 정량화한 근섬유 직경의 백분율(b) 및 평균(c)을 그래프로 나타낸 것이다. 4개의 다른 이미지가 근관 직경 측정을 위해 무작위로 선정되었다(* P <0.05, ** P <0.01).
도 13d는 Atrogin-1의 면역블롯 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 13e는 miR-376c-3p 또는 si-Atrogin-1이 트랜스펙션된 C2C12 근관의 게놈 DNA 함량으로 표준화된 단백질의 상대 비율을 나타낸 것이다(* P <0.05, ** P <0.01).
도 14a는 정상 또는 Atrogin-1 발현 저해된 C2C12 근관의 이미지이다(MyHC, 녹색; DAPI, 파란색; 스케일 바, 50 ㎛).
도 14b 및 도 14c는 정량화한 근관 지름의 백분율(도 14b)과 평균(도 14c)을 그래프로 나타낸 것이다. 4개의 다른 이미지가 근관 직경 측정을 위해 무작위로 선택되었다(* P <0.05).
도 15a는 colon-26(C26) 배양 배지(CM)를 넣거나, 넣지 않은 상태에서 배양된 miR-376c-3p 또는 대조군이 트랜스펙션된 C2C12 근관의 이미지이다(녹색, MyHC; 파란색, DAPI; 스케일 바, 50 ㎛).
도 15b 및 도 15c는 정량화된 섬유 지름의 백분율(도 15b) 및 평균(도 15c)을 나타낸 것이다. 근관 직경 측정을 위해 세 가지 이미지를 무작위로 선택하였다(* P <0.05).
도 15d는 CM 존재 유무에 따른 miR-376c-3p로 형질 감염된 C2C12 근세포에서 Atrogin-1 및 eIF3f의 면역블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. ImageJ를 이용한 Atrogin-1과 eIF3f 단백질의 상대적 발현 양을 측정하였다. GAPDH의 발현으로 정규화하였다.
도 15e는 C26 종양 보유 마우스(n = 6)의 TA 근육 조직으로의 아데노바이러스 주사과정을 도식화한 것이다. 8주된 마우스에 C26 종양 세포를 접종한 후 7일 및 10일에, AdmiRa-376c-3p 또는 AdmiRa-Control(10⁸ CFU/50 ㎕/주사)을 각각 하나의 TA 및 대측근에 주사하였다.
도 16a는 C26 종양 접종 전과 접종 후 14일째의 체중을 측정한 것이다.
도 16b는 종양 접종된 마우스(악액질 유발군) 및 종양이 접종되지 않은 마우스(정상)의 TA 근육 중량 대 경골 길이(Tibia length)의 비율을 나타낸 것이다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 나타내었다(n = 6; * P <0.05, ** P <0.01).
도 17a는 종양 주사 후 14일에 AdmiRa-376c-3p 또는 대조군 바이러스에 감염된 TA 근육 조직의 중량의 백분율을 나타낸 것이다. 경골 길이로 데이터를 정규화하였다(** P <0.01).
도 17b 및 도 17c는 단면적(CSA)의 형태학적 분석 결과를 나타낸 것이다. CSA의 측정을 위해 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 무작위로 6개의 이미지를 선택하여 측정하였다. 데이터는 평균 ± SD로 나타내었다(* P <0.05, ** P <0.01).
도 18은 노화에 따른 Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA에 의한 Atrogin-1 단백질 발현 조절 모델을 나타낸 것이다. Atrogin-1 단백질 발현 수준은 나이든 근육 조직의 Dlk1-Dio3 게놈 영역에서 miRNA의 전체적 발현 저하에 의해 증가하였다. Atrogin-1의 노화에 따른 발현 증가는 eIF3f와 같은 표적 단백질의 분해를 유도하여 노화된 근육에서 근육 위축을 유발할 수 있다. 이러한 일련의 사건이 노화성 근육감소증(sarcopenia) 발병의 중요한 원인기전임을 규명하였다.
도 19a는 인간 연령과 miR-23a-3p의 발현 사이의 상관관계 분석 결과를 나타낸 것이다. 상기 결과는 qRT-PCR을 통해 정량화되었다. 또한, 상기 결과는 Spearman 's correlation test(ρ; 95 % CI)를 사용하여 평가하였다.
도 19b는 노화에 따른 TA 근육에서 miR-23a-5p, miR-23a-3p, miR-19a-3p 및 miR-19b-3p의 상대적 발현을 나타낸 것이다.

본 발명은 일 측면으로, Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA 또는 이의 변이체를 유효성분으로 포함하는 근육질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에서, Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA는 miRNA-668(서열번호 1), miRNA-376c(서열번호 2), miRNA-494(서열번호 4), miRNA-541(서열번호 5), miRNA-377(서열번호 10), miRNA-1197(서열번호 6), miRNA-495(서열번호 7), miRNA-300(서열번호 14), miRNA-409(서열번호 16), miRNA-544a(서열번호 18), miRNA-379(서열번호 19), miRNA-431(서열번호 23), miRNA-543(서열번호 30) 및 miRNA-337(서열번호 36)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

본 명세서에서 사용한 용어, "Dlk1-Dio3 클러스터"는 "delta-like 1 homolog-type 3 iodothyronine deiodinase"의 약자로서, 가장 큰 miRNA 클러스터로 알려져 있다.

본 명세서에서 사용한 용어, "miRNA"는, DNA로부터 전사되지만, 단백질로 번역되지 않는 유전자에 의해 코딩된 약 21 내지 24개의 뉴클레오티드의 비코딩 RNA 이다. 이들은 pri-miRNA로서 공지된 1차 전사체로부터 pre-miRNA로 명명되는 짧은 줄기-루프 구조 및 최종적으로 작용성 miRNA로 프로세싱된다. 성숙화 동안 각각의 pre-miRNA는, 하나는 pri-miRNA를 코딩하는 유전자의 5' arm으로부터 기원하는 것이고, 나머지 다른 하나는 pri-miRNA를 코딩하는 유전자의 3' arm으로부터 기원하는 것으로서, 높은 상보성을 가진 2개의 독특한 단편을 제공한다. 성숙한 miRNA 분자는 하나 이상의 메신저 RNA(mRNA)에 부분적으로 상보적이고, 그의 주요 기능은 유전자 발현을 하향조절하는 것이다.

miRNA의 국제 명명법에 따라 하기와 같이 소정의 포맷을 가진 독특한 명칭을 배정받는다.

성숙한 miRNA의 경우 "sss-miR-X-Y"의 포맷으로 명명되는데, 여기서, "sss"는 miRNA의 종을 나타내는 3문자 코드이고, 예를 들어 인간을 상징하는 "hsa"일 수 있다. miR에서 대문자 "R"은 성숙한 miRNA을 지칭하는 것을 나타낸다. X는 특정 종에서 miRNA의 서열로 배정된 고유한 임의 번호이다. 수개의 고도로 상동성인 miRNA가 공지되어 있다면, 문자가 그 뒤에 이어질 수 있다. 예를 들어, "376a" 및 "376b"는 고도로 상동성인 miRNA를 지칭한다. Y는 pre-miRNA의 절단에 의해 수득된 것인 성숙한 miRNA가 pri-miRNA를 코딩하는 유전자의 5' arm(이때, Y는 "-5p"이다) 또는 그의 3' arm(이때, Y는 "-3p"이다)에 상응하는지를 여부를 나타낸다.

본 발명에서 언급된 Dlk1-Dio3 영역에 위치한 miRNA 중, "hsa-miR-376c-3p"를 예로 들어보면, "hsa"는 인간 miRNA에 관한 것임을 의미하고, "miR"은 성숙한 miRNA를 지칭하고, "376"은 이러한 특정 miRNA에 배정된 임의 번호를 지칭하고, "3p"는 성숙한 miRNA가 pri-miRNA를 코딩하는 유전자의 3' arm으로부터 수득되었다는 것을 의미한다.

한편, 본 발명에서 Dlk1-Dio3 영역에 위치한 miRNA는, -3p 및/또는 -5p에 해당되는 miRNA일 수 있다. 일 구체예로, 본 발명에서 miRNA-376c는 miR-376c-3p 또는 miRNA376c-5p일 수 있다.

본 명세서에서 사용한 용어, "miRNA 변이체"는 본 발명에 따른 Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA(서열번호 1, 2, 4, 5, 6, 7, 10, 14, 16, 18, 19, 23, 30 또는 36)와 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 98%의 상동성이 유지되는 염기서열을 가지는 miRNA일 수 있다. 본 발명에서, miRNA 변이체는 miRNA 단편일 수 있다.

본 명세서에서 사용한 용어, "miRNA 단편"은 miRNA 참조서열(reference sequence)과 비교할 때, 결실되거나 참조서열과 상응하는 위치와 동일한 서열의 분절을 포함하는 것일 수 있다. 상기 "참조서열"이란, 서열 비교의 근거로서 사용되도록 지정된 서열을 의미한다. 본 발명에서, miRNA 참조서열은 서열번호 1, 2, 4, 5, 6, 7, 10, 14, 16, 18, 19, 23, 30 또는 36의 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

본 명세서에서 사용한 용어, "miRNA 유사체(mimic)"는 miRNA 작용을 모방하는 폴리뉴클레오티드이다.

상기 Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA는 Atrogin-1/MAFbx 단백질의 발현량을 감소시킬 수 있다. 또한, 상기 Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA는 Atrogin-1/MAFbx 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 3-말단 비번역 영역(3'-untranslated region, 3'-UTR)과 직접적으로 상호작용하여 근육분해효소인 Atrogin-1/MAFbx의 발현을 억제할 수 있다.

본 명세서에서 사용한 용어, "Atrogin-1"은 MuRF1과 함께 대표적인 근육 특이적인 E3 리가아제이다. 다른 근육 질환과 달리, Atrogin-1의 근육 노화에 대한 역할은 상대적으로 알려지지 않았다. 본 발명의 일 실시예에서, 나이든 마우스의 근육 조직에서 Atrogin-1 단백질의 수준이 유의하게 증가한 반면, 유전자 발현 수준에는 변화가 없었다. 이는 miRNA가 전사 후 방식으로 Atrogin-1 발현을 조절한다는 것을 의미한다(도 18 참조). 현재까지의 연구에 따르면, miR-19a, miR-19b 및 miR-23a가 Atrogin-1을 타겟팅하여 근육 비대를 유발한다고 알려져 있으나, 본 발명에서는 젊은 근육 조직과 노화된 근육 조직에서는 차별적으로 발현되지 않았다(도 19a 및 도 19b 참조). 이를 통해, 노화에 따라 발현이 낮아지는 Dlk-1-Dio3 클러스터 miRNA가 Atrogin-1 매개형 노화성 근육감소증에 중요한 내재적 요인이 될 수 있음을 알 수 있었다.

본 명세서에서 사용한 용어, "근육질환"은 근력약화로 인해 발생할 수 있는 모든 질환을 의미하며, 예를 들어 근육감소증, 근위축증(muscular atrophy), 근육 퇴행 위축(muscle dystrophy) 또는 심위축증일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 "근육감소증"은 노화성 근육감소증일 수 있다.

상기 "근력 약화"는 한 개 또는 그 이상의 근육의 힘이 감소된 상태를 의미한다. 상기 근력 약화는 어느 한 근육이나, 몸의 한쪽, 상지나 하지 등에 국한될 수도 있고, 전신에 걸쳐 나타날 수도 있다. 또한 근피로나 근육통을 포함하는 주관적인 근력 약화 증상은 의학적 검진을 통해 객관적인 방법으로 정량화될 수 있다. 근력 약화의 원인으로는 근손상, 근육 세포의 분화 감소 등으로 인한 근육량 감소, 근육 노화 등을 들 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다.

노화성 근육감소증은 팔, 다리 등을 구성하는 골격근이 크게 줄어드는 근육질환으로서, 노화 때문에 근육세포가 줄어든 데다 활동이 부족해 발생한다. 영어로는 sarcopenia인데, 근육이란 뜻의 "sarco"와 부족, 감소를 의미하는 "penia"가 합쳐진 말이다. 2017년 초, 세계보건기구(WHO)는 정상보다 근육량이 적은 것을 정식 질환으로 인정하여, 노화성 근육감소증에 질병분류 코드를 부여했다.

근위축증은 근육이 위축되는 질환으로서, 팔, 다리의 근육이 거의 좌우 대칭적으로 점점 위축되어 가는 것으로 여러 형태가 있다. 가장 많은 것은 근위축성 측삭경화증과 척수성진행성 근위축증이다. 상기 질병 모두 척수에 있는 운동신경섬유 및 세포의 진행성 변성에 의한 것이지만 원인은 불명확하다. 구체적으로, 근위축성 측상경화증은 '루게릭병'이라고도 부르며, 척수신경이나 간뇌의 운동세포가 서서히 파괴되어 이 세포의 지배를 받는 근육이 위축되어 힘을 쓰지 못하게 되는 병이다. 척수성진행성 근위축증은 추체로의 변성이 없고, 척수 전각세포의 변성이 만성으로 진행한다.

근육 퇴행 위축이란, 점진적인 근위축과 근쇠약이 나타나는 질환으로서, 병리학적으로 근육섬유의 괴사를 특징으로 하는 퇴행성 근육병증을 의미한다. 근세포막의 손상으로 근육섬유의 괴사와 퇴행과정을 거쳐 근력저하 및 위축이 발생하게 된다. 근육 퇴행 위축은 근육 약화의 범위와 분포, 발병 연령, 진행 속도, 증상의 중증도, 가족력에 따라 하위 질병으로 나누어질 수 있으며, 상기 근육 퇴행 위축의 비제한적 예로서, 뒤시엔느 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy), 베커 근이영양증(Becker muscular dystrophy), 사지골반 근이영양증(Limb-girdle muscular dystrophy), 에머리-드라이푸스 근이영양증(Emery-Dreifuss muscular dystrophy), 안면 견갑상환 근이영양증(Facioscapulohumeral muscular dystrophy), 근긴장성 근이영양증(Myotonic muscular dystrophy), 안구 인두 근이영양증(Oculopharyngeal muscular dystrophy), 말단 근육 근이영양증, 선천성 근이영양증(Congential muscular dystrophy)을 들 수 있다.

심위축증은 심장이 외부적이거나 내부적인 요인에 의해서 위축되어 가는 것으로서, 기아, 소모성질환, 노쇠했을 때 심근섬유가 마르고 가늘어져 지방조직의 감소를 유발하는 심장의 갈색위축 증세를 일으킬 수 있다.

본 발명은 다른 측면으로, Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA 또는 이의 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드가 적재된 벡터를 유효성분으로 포함하는 근육질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 이때, 상기 Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA는 상술한 바와 같다.

상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 바이러스 및 이의 유사체들을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 바이러스는 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노 부속 바이러스(Adeno-associated virus), 허피스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus), 렌티바이러스(Lentivirus), 레트로바이러스(Retrovirus) 및 폭스바이러스(Poxvirus)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 바이러스는 아데노바이러스 또는 아데노 부속 바이러스일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA 또는 이의 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드가 적재된 벡터는 당업계에 공지된 클로닝 방법으로 제조될 수 있으며, 그 방법에 특별히 제한되는 것은 아니다.

한편, 본 발명에 따른 Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA 또는 이의 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드가 적재된 벡터를 유효성분으로 포함하는 근육질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 구체적으로, 환자에게 1x10⁵ 내지 1x10¹⁸ 의 바이러스 입자(virus particle), 감염능을 가지는 바이러스 단위(TCID₅₀) 또는 플라크 형성 단위(pfu)를 투여하는 것일 수 있고, 바람직하게는 1x10⁵, 2x10⁵, 5x10⁵, 1x10⁶, 2x10⁶, 5x10⁶, 1x10⁷, 2x10⁷, 5x10⁷, 1x10⁸, 2x10⁸, 5x10⁸, 1x10⁹, 2x10⁹, 5x10⁹, 1x10¹⁰, 5x10¹⁰, 1x10¹¹, 5x10¹¹, 1x10¹², 1x10¹³, 1x10¹⁴, 1x10¹⁵, 1x10¹⁶, 1x10¹⁷ 또는 그 이상의 바이러스 입자, 감염능을 가지는 바이러스 단위 또는 플라크 형성 단위를 투여하는 것으로써, 상기 사이에 다양한 수치 및 범위를 포함할 수 있다. 또한, 바이러스 투여량은 0.1 ㎖, 1 ㎖, 2 ㎖, 3 ㎖, 4 ㎖, 5 ㎖, 6 ㎖, 7 ㎖, 8 ㎖, 9 ㎖, 10 ㎖ 또는 그 이상, 이 사이의 모든 값과 범위를 포함할 수 있다.

본 발명은 또 다른 측면으로, Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA 또는 이의 변이체를 유효성분으로 포함하는 악액질의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 본 발명에서, Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA와 이의 변이체는 상술한 바와 같다.

본 명세서에서 사용한 용어, "악액질(cachexia)"은 암, 결핵, 혈우병 등의 말기에서 볼 수 잇는 고도의 전신쇠약증세로, 전신의 각종 장기 장애에 의해 생기는 일종의 중독상태로 간주된다. 증상으로는, 근 쇠약, 급격한 수척, 빈혈, 무기력, 피부 황색화가 일어난다. 악액질의 원인질환은 악성 종양, 바세도병, 하수체기능저하증 등이 있다. 마크로파지가 생산하는 종양괴사인자(tumor necrosis factor, TNF) 등의 생물활성물질도 악액질을 증강시키는 요인으로 밝혀졌다.

본 발명에 따른 Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA 또는 이의 변이체를 유효성분으로 포함하는 근육질환 또는 악액질의 예방 또는 치료용 약학 조성물에서 그 유효성분이 활성을 나타낼 수 있는 한, 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함될 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량% 내지 20.0 중량% 범위 내에서 결정될 수 있다. 이때, "유효량"이란 근육질환 또는 악액질의 치료 효과를 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 근육질환 또는 악액질의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 환자에게 전달하기에 적절한 비-독성 물질이면 어떠한 담체라도 가능하다. 증류수, 알코올, 지방, 왁스 및 비활성 고체가 담체로 포함될 수 있다. 약물학적으로 허용되는 애쥬번트(완충제, 분산제) 또한 약학 조성물에 포함될 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 약학 조성물은 유효성분 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 "약학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.

본 발명에 따른 근육질환 또는 악액질의 예방 또는 치료용 약학 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌 글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 근육질환 또는 악액질의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.01 ug/kg 내지 10 g/kg 범위, 구체적으로는 0.01 mg/kg 내지 1 g/kg 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.

또한, 본 발명은 Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA 또는 이의 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드가 적재된 벡터를 유효성분으로 포함하는 악액질의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 이때, 상기 Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA는 상술한 바와 같다.

상술한 바와 같이, 상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 바이러스 및 이의 유사체들을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 바이러스는 아데노바이러스, 아데노 부속 바이러스, 허피스 심플렉스 바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스 및 폭스바이러스로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 바이러스는 아데노바이러스일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA 또는 이의 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드가 적재된 벡터는 당업계에 공지된 클로닝 방법으로 제조될 수 있으며, 그 방법에 특별히 제한되는 것은 아니다.

한편, 본 발명에 따른 Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA 또는 이의 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드가 적재된 벡터를 유효성분으로 포함하는 악액질의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 구체적으로, 환자에게 1x10⁵ 내지 1x10¹⁸ 의 바이러스 입자(virus particle), 감염능을 가지는 바이러스 단위(TCID₅₀) 또는 플라크 형성 단위(pfu)를 투여하는 것일 수 있고, 바람직하게는 1x10⁵, 2x10⁵, 5x10⁵, 1x10⁶, 2x10⁶, 5x10⁶, 1x10⁷, 2x10⁷, 5x10⁷, 1x10⁸, 2x10⁸, 5x10⁸, 1x10⁹, 2x10⁹, 5x10⁹, 1x10¹⁰, 5x10¹⁰, 1x10¹¹, 5x10¹¹, 1x10¹², 1x10¹³, 1x10¹⁴, 1x10¹⁵, 1x10¹⁶, 1x10¹⁷ 또는 그 이상의 바이러스 입자, 감염능을 가지는 바이러스 단위 또는 플라크 형성 단위를 투여하는 것으로써, 상기 사이에 다양한 수치 및 범위를 포함할 수 있다. 또한, 바이러스 투여량은 0.1 ㎖, 1 ㎖, 2 ㎖, 3 ㎖, 4 ㎖, 5 ㎖, 6 ㎖, 7 ㎖, 8 ㎖, 9 ㎖, 10 ㎖ 또는 그 이상, 이 사이의 모든 값과 범위를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 근육질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 근육질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 악액질의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 악액질을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

상기 개체는 포유동물, 구체적으로 인간일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 투여는 정맥내, 근육내, 피내, 피하, 복강내, 비내, 폐내, 직장내, 소동맥내, 심실내, 병변내, 척추강내, 국소 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 경로를 통해 수행되는 것일 수 있다. 투여 방법은 투여되는 약물의 종류에 따라 달라질 수 있다.

또한, 본 발명은 근육질환의 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA 또는 이의 변이체의 용도를 제공하고, 근육질환의 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA 또는 이의 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드가 적재된 벡터의 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 악액질의 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA 또는 이의 변이체의 용도를 제공하고, 악액질의 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA 또는 이의 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드가 적재된 벡터의 용도를 제공한다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 샘플 준비

서울대학교 분당 병원(SNUBH)에서 인공고관절 치환술(THRA)을 받은 환자에서 얻은 인간 골격근(gluteus maximus muscle)을 즉시 액체 질소로 옮겨 -70℃에서 보관하였다. SNUBH의 임상 기관 검토위원회(B-1710-050-009)가 본 실험을 승인하였다. 서면동의서는 참가자 또는 법적 보호자로부터 얻었으며, 총 20개의 환자 샘플(25세, 27세, 32세, 33세(2명), 41세, 46세(2명), 50세(2명), 51세, 55세, 66세, 67세, 70세, 71세, 75세, 79세(2명) 및 80세)을 이용하여 miRNA 또는 Atrogin-1 단백질의 발현을 평가하였다.

모두 20개의 시료가 miRNA 발현 분석에 사용되었지만 제한된 양의 가용성 때문에 8개만 면역블롯에 사용 가능하였다. RNA와 단백질은 30 ㎍ 이하의 인간시료에서 분리 및 정제하였다. miRNA 발현을 분석하기 위해, TRIzol(Invitrogen)을 사용하여 RNA를 추가로 정제하였다. 면역블롯 분석을 위해 근육 조직을 T 10 Basic Ultra-Turrax 분산기(IKA, China)를 사용하여 균질화한 후 PRO-PREP(iNtRON Biotech)를 사용하여 용해시켰다.

실시예 2. 동물 모델

실험동물자원센터(한국생명공학연구원, KRIBB)에서 젊은 C57BL/6 마우스(3개월) 나이든 C57BL/6 마우스(24개월)를 구입했다. BALB/c(6주령) 마우스들은 Damul Science(대전, 한국)에서 구입하였다. 본 연구의 모든 마우스는 Damul Science(대전, 한국)에서 구입한 사료를 이용하여 표준 실험식이요법(3.1 kcal/g)을 유지하였다. 근육 조직에서 miRNA mimic을 과발현시키기 위해, 아데노바이러스(Adenovirus), AdmiRa-376c-3p 또는 대조군(Applied Biological Materials Inc, 캐나다) 50 ㎕(10⁸ CFU)을 각각 젊은 마우스 및 늙은 마우스의 TA 근육 또는 반대편 근육에 주입했다.

29G(0.33 mm) 인슐린 주사기를 이용하여 매주 1회 주사하였다. 주사한지 4주 후, 아데노바이러스 주사된 마우스로부터 근육 조직을 분리하여 분석에 사용하였다. 악액질 마우스 모델을 만들기 위해, 인슐린 주사기를 사용하여 BABL/c 마우스에 C26 세포(50 ㎕ PBS 중 5×10⁵ 세포)를 피하 주사했다. 종양 접종한지 7일 및 10일 후에, 50 ㎕(10⁸ CFU)를 종양 보유 마우스의 TA 근육 또는 반대편 근육에 근육 내 주사하였다.

Colon 26 세포(CLS Cell Lines Service)를 amphotericin B-penicillin-streptomycin과 10 % FBS가 함유 된 RPMI1640 (Gibco)에서 배양하였다. 마우스와 바이러스 실험은 KRIBB의 동물 관리 및 사용위원회 (Animal Care and Use Committee)의 승인을 받은 프로토콜에 따라 수행되었다.

실시예 3. 세포 배양

일차 근아세포(primary myoblasts)는 상기 실시예 2의 마우스 뒷다리 근육에서 분리하였다. 근육 조직을 가위로 가늘게 썬 다음, 디스파아제(dispase) II(2.4 U/mL, Roche), 콜라게나제(collagenase) D(1 %, Roche) 및 2.5 μM의 CaCl₂를 포함하는 해리 완충액에 넣어 37℃에서 20분간 배양하였다. 슬러리를 혈청 피펫을 사용하여 분쇄하고, 파편을 제거하기 위해 70 ㎛ 나일론 메쉬(BD Biosciences)에 통과시켰다.

세포를 수집하고 암포테리신 B-페니실린-스트렙토마이신 및 5 ng/mL의 bFGF를 함유하는 20% FBS가 포함된 Ham's F-10(Gibco)에서 배양시켰다. 섬유아세포를 제거하기 위해, 세포를 1시간 동안 비코팅 판에 도말하고, 부동 세포를 콜라겐 코팅 배양접시로 옮겼다. 일차 근섬유의 분화는 항생제와 5% 말혈청이 포함된 DMEM(Gibco) 분화 배지에서 세포를 배양함으로써 분화를 유도하였다. C2C12 세포(ATCC)를 암포테리신 B-페니실린-스트렙토마이신 및 10% FBS를 함유하는 DMEM(Gibco)에서 배양하였다. 분화 배지로 변화시킴으로써 세포 도말 후 24시간 혹은 48시간에 분화가 개시되었다.

덱사메타손(dexamethasone)에 의한 위축을 위해, C2C12 세포를 초기에 4일간 분화시킨 후 100 μM의 덱사메타손(Sigma-Aldrich)을 상기 배지에 첨가하였다. 인간 골격근(Lonza)은 17세 공여자로부터 얻었으며, 겐타마이신-암포테리신B, 인간 표피 성장 인자(hEGF), 덱사메타손, L-글루타민 및 10% FBS가 포함된 골격근 기저 배지 2(Lonza)에서 배양하였다.

24시간 내지 48시간 후 분화가 시작되었고, gentamicin-amphotericin B와 2% 말혈청이 포함된 DMEM/F12(Gibco)에서 배양하였다. Colon 26(C26) 조건 배지의 경우 colon 26 세포주는 10% FBS가 포함된 DMEM(Gibco)으로 구성된 배지에서 배양하였다. 72시간 후, 상등액을 수집하고 0.22 미크론 필터를 통해 여과하였다. C26 조건 배지 50% 및 분화 배지(2% 말혈청 DMEM) 50%가 되도록 구성하였다.

실시예 4. 형질감염 및 루시퍼라제 ( luciferase ) 분석

mimics 및 miRNAs의 억제제는 mirVana(Invitrogen) 또는 AccuTarget™(Bioneer)(하기 표 1 및 표 2 참조)에서 구입하였다. siRNA 정보는 하기 표 3에 추가하였다. miRNA 및 siRNA(각각 50 nM 내지 100 nM)의 모방 및 억제제는 RNAiMAX(Invitrogen)를 사용하여 일차 근아세포, C2C12 또는 인간 골격근 근육아세포로 형질감염시켰다.

miRNA	Assay ID	Cat. NO
Negative control	-	AM17121
376c-3p	002450	MC12548

miRNA	Sequence	Sequence NO.	Accession NO.
493	ctggcctccagggctttgtacatggtaggctttcattcattcgtttgcacattcggtgaaggtctactgtgtgccaggccctgtgccag	21	MI0003132
337	gtagtcagtagttggggggtgggaacggcttcatacaggagttgatgcacagttatccagctcctatatgatgcctttcttcatccccttcaa	36	MI0000806
665	tctcctcgaggggtctctgcctctacccaggactctttcatgaccaggaggctgaggcccctcacaggcggc	26	MI0005563
431	tcctgcttgtcctgcgaggtgtcttgcaggccgtcatgcaggccacactgacggtaacgttgcaggtcgtcttgcagggcttctcgcaag acgacatcctcatcaccaacgacg	23	MI0001721
433	ccggggagaagtacggtgagcctgtcattattcagagaggctagatcctctgtgttgagaaggatcatgatgggctcctcggtgttctccagg	38	MI0001723
432	tgactcctccaggtcttggagtaggtcattgggtggatcctctatttccttacgtgggccactggatggctcctccatgtcttggagtagatca	20	MI0003133
370	agacagagaagccaggtcacgtctctgcagttacacagctcacgagtgcctgctggggtggaacctggtctgtct	28	MI0000778
379	agagatggtagactatggaacgtaggcgttatgatttctgacctatgtaacatggtccactaactct	19	MI0000787
299	aagaaatggtttaccgtcccacatacattttgaatatgtatgtgggatggtaaaccgcttctt	15	MI0000744
380	aagatggttgaccatagaacatgcgctatctctgtgtcgtatgtaatatggtccacatctt	13	MI0000788
1197	acttcctggtatttgaagatgcggttgaccatggtgtgtacgctttatttgtgacgtaggacacatggtctacttcttctcaatatca	6	MI0006656
323a	ttggtacttggagagaggtggtccgtggcgcgttcgctttatttatggcgcacattacacggtcgacctctttgcagtatctaatc	29	MI0000807
758	gcctggatacatgagatggttgaccagagagcacacgctttatttgtgccgtttgtgacctggtccactaaccctcagtatctaatgc	12	MI0003757
329	ggtacctgaagagaggttttctgggtttctgtttctttaatgaggacgaaacacacctggttaacctcttttccagtatc	11	MI0001725
494	gatactcgaaggagaggttgtccgtgttgtcttctctttatttatgatgaaacatacacgggaaacctcttttttagtatc	4	MI0003134
1193	gtagctgaggggatggtagaccggtgacgtgcacttcatttacgatgtaggtcacccgtttgactatccaccagcgcc	35	MI0014205
543	tacttaatgagaagttgcccgtgtttttttcgctttatttgtgacgaaacattcgcggtgcacttctttttcagtatc	30	MI0005565
495	tggtacctgaaaagaagttgcccatgttattttcgctttatatgtgacgaaacaaacatggtgcacttctttttcggtatca	7	MI0003135
376c	aaaaggtggatattccttctatgtttatgttatttatggttaaacatagaggaaattccacgtttt	2	MI0000776
654	gggtaagtggaaagatggtgggccgcagaacatgtgctgagttcgtgccatatgtctgctgaccatcacctttagaagccc	27	MI0003676
376b	cagtccttctttggtatttaaaacgtggatattccttctatgtttacgtgattcctggttaatcatagaggaaaatccatgttttcagtatcaaatgctg	25	MI0002466
376a	taaaaggtagattctccttctatgagtacattatttatgattaatcatagaggaaaatccacgttttc	3	MI0000784
300	tgctacttgaagagaggtaatccttcacgcatttgctttacttgcaatgattatacaagggcagactctctctggggagcaaa	14	MI0005525
381	tacttaaagcgaggttgccctttgtatattcggtttattgacatggaatatacaagggcaagctctctgtgagta	33	MI0000789
487b	ttggtacttggagagtggttatccctgtcctgttcgttttgctcatgtcgaatcgtacagggtcatccactttttcagtatcaa	24	MI0003530
539	atacttgaggagaaattatccttggtgtgttcgctttatttatgatgaatcatacaaggacaatttctttttgagtat	32	MI0003514
544a	attttcatcacctagggatcttgttaaaaagcagattctgattcagggaccaagattctgcatttttagcaagttctcaagtgatgctaat	18	MI0003515
382	tacttgaagagaagttgttcgtggtggattcgctttacttatgacgaatcattcacggacaacacttttttcagta	8	MI0000790
134	cagggtgtgtgactggttgaccagaggggcatgcactgtgttcaccctgtgggccacctagtcaccaaccctc	17	MI0000474
668	ggtaagtgcgcctcgggtgagcatgcacttaatgtgggtgtatgtcactcggctcggcccactacc	1	MI0003761
485	acttggagagaggctggccgtgatgaattcgattcatcaaagcgagtcatacacggctctcctctcttttagt	40	MI0002469
154	gtggtacttgaagataggttatccgtgttgccttcgctttatttgtgacgaatcatacacggttgacctatttttcagtaccaa	34	MI0000480
496	cccaagtcaggtactcgaatggaggttgtccatggtgtgttcattttatttatgatgagtattacatggccaatctcctttcggtactcaattcttcttggg	31	MI0003136
377	ttgagcagaggttgcccttggtgaattcgctttatttatgttgaatcacacaaaggcaacttttgtttg	10	MI0000785
541	acgtcagggaaaggattctgctgtcggtcccactccaaagttcacagaatgggtggtgggcacagaatctggactctgcttgtg	5	MI0005539
409	tggtactcggggagaggttacccgagcaactttgcatctggacgacgaatgttgctcggtgaaccccttttcggtatca	16	MI0001735
412	ctggggtacggggatggatggtcgaccagttggaaagtaattgtttctaatgtacttcacctggtccactagccgtccgtatccgctgcag	9	MI0002464
369	ttgaagggagatcgaccgtgttatattcgctttattgacttcgaataata catggttgatcttttctcag	37	MI0000777
410	ggtacctgagaagaggttgtctgtgatgagttcgcttttattaatgacgaatataacacagatggcctgttttcagtacc	41	MI0002465
127	tgtgatcactgtctccagcctgctgaagctcagagggctctgattcagaa agatcatcggatccgtctgagcttggctggtcggaagtctcatcatc	43	MI0000472
136	tgagccctcggaggactccatttgttttgatgatggattcttatgctccatcatcgtctcaaatgagtcttcagagggttct	22	MI0000475
411	tggtacttggagagatagtagaccgtatagcgtacgctttatctgtgacgtatgtaacacggtccactaaccctcagtatcaaatccatccccgag	42	MI0003675

Target gene	Cat. NO	Sequence	Sequence NO.
Negative control	SN-1002	-	-
Atrogin-1	1357210	agagagucgg caagucugu (sense)	66
		acagacuugc cgacucucu (antisense)	67
	1357211	gauagaugug uucgucuua (sense)	62
		uaagacgaac acaucuauc (antisense)	63
	1357212	gugaucuaag augggaagg (sense)	64
		ccuucccauc uuagaucac (antisense)	65

루시퍼라제 분석을 위해, Atrogin-1 mRNA의 인간과 마우스 사이의 miR-376c-3p의 보존된 결합 부위만을 포함하는 전장 5598nt 3'UTR 또는 2840nt 3'UTR 단편을 pmirGLO(Promega)에 클로닝하였다. 벡터 luc2(luciferase gene) 코딩서열은 다중 클로닝 사이트에 존재하고, 벡터 hRluc-neo 코딩 서열은 내부 대조군으로 존재하였다. miR-376c-3p 결합 부분(위치 3781-3787)의 결실을 갖는 Atrogin-1 3'UTR 돌연변이체 또한 루시퍼라제 검정을 위해 pmirGLO 벡터에 클로닝하였다.

293T 세포를 Lipofectamine 2000(Invitrogen)을 사용하여 50 nM의 miRNA mimic과 루시퍼라제 플라스미드(200 ng)로 형질감염시켰다. 형질도입한지 48시간 후에, 세포용해액을 Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega) 및 Victor X3(Perkin Elmer)을 사용하여 분석에 사용하였다.

실시예 5. 정량적 RT- PCR 및 miRNA 발현 분석

RNA 분리 및 cDNA 합성은 표준 프로토콜에 따라 수행하였다. 정량적 RT-PCR은 cDNA, 프라이머 및 SYBR Master Mix(Applied Biosystems)가 들어있는 20 ㎕의 총 반응 부피에서 StepOnePlus^TM(Applied Biosystems)을 이용하여 분석하였다. 프라이머 서열을 하기 표 4에 기재하였다.

Species	Primer	Sequence	Sequence NO.
Mouse	Atrogin-1 forward	ACAAGGGAAGTACGAAGGAGCG	서열번호 44
	Atrogin-1 reverse	GGCAGTCGAGAAGTCCAGTC	서열번호 45
	β-actin forward	GGCTGTATTCCCCTCCAT	서열번호 46
	β-actin reverse	CCAGTTGGTAACAATGCCATG	서열번호 47
Human	Atrogin-1 forward	CCATCCGTCTAGTCCGCTC	서열번호 48
	Atrogin-1 reverse	TGAGGTCGCTCACGAAACTG	서열번호 49
	GAPDH forward	TGTTGCCATCAATGACCC	서열번호 50
	GAPDH reverse	CCCACGACGTACTCAGCG	서열번호 51

각 반응에서 데이터는 ACTB 또는 GAPDH mRNA 발현량을 이용해 정규화하였다. 성숙한 마이크로 RNA 발현 분석을 위해 TaqMan MicroRNA 분석을 제조업체의 프로토콜(Applied Biosystems)에 따라 수행하였다. RT-qPCR 반응은 TaqMan Universal PCR Master Mix II(Uracil-N 글리코실라제(glycosylase)가 없음) 및 TaqMan Small RNA Assay mix가 포함된 96-웰 플레이트에서 진행하였다. 사용한 RNA 특이적 프라이머 및 small RNA 특이적 TaqMan MGB 프로브의 시퀀스를 표 5에 기재하였다. U6 snRNA는 정규화를 위해 사용하였다.

miRNA	Assay ID	Cat. NO
U6 snRNA	001973	4427975
127-5p	002229
127-3p	000452
134-5p	001186
337-3p	002157
369-3p	000557
376c-3p	002122 002450
377-3p	000566
379-5p	001138
381-3p	000571
409-5p	002331
411-3p	002238
431-3p	002312
431-5p	001979
485-5p	001036
494-3p	002365
495-3p	001663
541-5p	002200
668-3p	001992 002562
1193-5p	242169_mat
1197-3p	002810

실시예 6. 안티센스 올리고뉴클레오타이드 ( ASO ) 풀다운(pull-down) 분석

miRNA-mRNA 상호 작용 분석을 위해, 하이브리다이제이션 기반 전략을 이용하여 마이크로 RNA와 관련된 표적 mRNA를 정제하였다. C2C12 세포를 Atrogin-1 3'UTR에서 야생형 또는 결실 돌연변이 miR-376c-3p 결합 부위를 함유하는 루시퍼라제 리포터로 형질감염시켰다. 세포용해물(1 mg)을 4℃에서 3시간 동안 배양한 뒤, 내재성(endogenous)의 Atrogin-1-3'UTR 또는 Luciferase 2 mRNA에 특이적으로 혼성화 되도록 고안된 2 ㎍의 바이오틴이 첨가된 ASO(표 6 참조)와 함께 배양하였다.

Primer	Sequence	Sequence NO.
mmu-miR-376c	AACATAGAGGAAATTTCACGT	서열번호 52
U6	TGGCCCCTGCGCAAGGATG	서열번호 53
Atrogin-1 forward	CAGCTTCGTGAGCGACCTC	서열번호 54
Atrogin-1 reverse	GGCAGTCGAGAAGTCCAGTC	서열번호 55
GAPDH forward	GGGAAATTCAACGGCACAGT	서열번호 56
GAPDH reverse	AGATGGTGATGGGCTTCCC	서열번호 57
Luciferase 2 forward	CACCTTCGTGACTTCCCATT	서열번호 58
Luciferase 2 reverse	TGACTGAATCGGACACAAGC	서열번호 59
5'biotinylated ASO for endogenous Atrogin-1	ATGTGGCACTCACAGCAGAG	서열번호 60
5'biotinylated ASO for reporter mRNA	AGACGGGCAAGAAAGAGGAT	서열번호 61

스트렙타비딘-아가로오즈 비즈(beads)(Novagene)를 결합 혼합물에 첨가한 후 4℃에서 2시간 동안 추가 배양하였다. 비즈를 1 ml의 NT2 완충액(50 mM 트리스-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl₂ 및 0.05 % NP-40)으로 3회 세척한 후, 복합체를 20 유닛의 RNase-free DNase(15분, 37℃) 및 0.1% SDS/0.5 mg/mL 프로테이나아제 K(55℃에서 15분)로 각각 DNA와 단백질을 제거하였다. 산성 페놀 추출 및 qScript 마이크로 RNA cDNA 합성 키트(Quanta Biosciences)를 사용하여 miRNA로부터 cDNA 합성하거나, Maxima Reverse Transcriptase를 사용하는 랜덤 헥사머(random hexamer)로 RNA를 합성함으로써 ASO 풀다운 물질로부터 RNA를 분리하였다. cDNA는 Bio-Rad iCycler를 사용하여 SYBR(Kapa Biosystems)으로 qPCR 분석을 통해 발현을 평가하였다. ASO 풀다운 결과의 정규화를 위해 각 샘플에서 U6 snRNA 또는 GAPDH mRNA의 상대적인 수준을 정량화하였다.

실시예 7. 면역블롯 분석

근육 조직 및 분리된 근육 세포를 프로테아제 및 포스파타아제 억제제를 함유하는 용해 완충액(50 mM Tris-Cl, pH7.4, 150 mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl₂)에서 균질화하였다. 용해물을 4℃에서 15,000 ×g에서 20분간 원심 분리하고, 생성된 상등액을 SDS-PAGE에 이어 면역블롯 분석을 하였다. 면역블로팅에 사용된 항체는 ACTB(β-actin, Abcam), ACTN1(Santa Cruz Biotechnology), AKT(Santa Cruz Biotechnology), mTOR(Cell Signaling Technology), S6K(Cell Signaling Technology), 4EBP(Cell Signaling Technology), FOXO3a(Cell Signaling Technology), MuRF1(Santa Cruz Biotechnology), Atrogin-1(Thermo scientific, ECM) 및 eIF3f(Novus)이다. GAPDH는 직접 개발한 항체를 사용하였다. ACTB, ACTN1 또는 GAPDH는 정규화를 위해 사용하였다.

실시예 8. 형태측정세포학 분석

면역 염색을 위해 분화된 C2C12 근관세포를 4% 파라포름알데하이드로 고정시키고 0.3% Triton X-100과 함께 배양하여 투과성을 향상시켰다. 고정된 샘플을 3% FBS 함유 PBS로 블로킹하고 항-MyHC(Santa Cruz Biotechnology)로 처리한 다음 PBS로 세척하고 AlexaFluor 488(Invitrogen) 2차 항체로 반응시켰다. 에오신(Eosin) 염색을 위해, 분화된 C2C12 근관세포(myotube)를 -20℃에서 15분 동안 차가운 메탄올에 고정시키고 15분 동안 에오신 Y(Thermo scientific)로 염색하였다.

샘플을 증류수로 3회 세척하고 Nikon Eclipse Ti-U 현미경을 사용하여 이미지를 분석하였다. 근관세포의 직경을 분석하기 위해, 4개의 이미지를 무작위로 선정하였다. 선택된 이미지의 근관세포의 직경은 현미경 이미징 소프트웨어(NIS-Elements Basic Research, Nikon)를 사용하여 계산하였다. 특정 게놈 DNA 키트(NANOHELIX)를 사용하여 게놈 DNA를 분리하고, BCA 단백질 분석 시약(피어스)으로 세포 용해물의 단백질 농도를 분석하여 단백질:게놈 DNA 비율을 측정하였다.

면역조직화학적 분석을 위해, 마우스 TA 근육 조직을 4% 파라포름알데하이드에 고정시키고 15 내지 30% 수크로즈로 침투시켰다. 10 ㎛ 두께의 냉동 마우스근육섹션을 저온 유지장치(Leica)를 사용하여 만들었고, 표준 프로토콜에 따라 DAPI 및 항체로 염색하였다. 샘플을 0.05% Tween-20을 함유한 PBS 중의 3% FBS로 블로킹시키고, 항-라미닌(Sigma-Aldrich)으로 처리하였으며, PBS로 세척하고, AlexaFluor 546(Invitrogen) 2차 항체로 반응시켰다. 단면적을 측정하기 위해 6개의 이미지를 무작위로 선택하였다. 이미지의 단면적은 NIH ImageJ 소프트웨어를 사용하여 계산하였다.

실시예 9. 통계분석

정량적 데이터는 달리 명시되지 않는 한 평균±표준편차로 표기하였다. 평균 차이는 Student's unpaired t test를 사용하여 평가하였고, P <0.05는 통계적으로 유의하다고 분석하였다.

실험예 1. 나이에 따른 근육 내 Dlk1 - Dio3 클러스터에 위치한 miRNA의 발현

인간 골격 근육 조직에서 나이에 따른 Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA의 발현 양상을 조사하였다. 인간 Dlk1-Dio3 유전자 좌(gene locus)는 99개의 성숙 miRNA(54 개의 pre-miRNA)를 포함하며, 87개는 인간 게놈과 마우스 게놈 사이에서 보존되어 있다. 25세에서 80세의 연령대의 인간 참가자로부터 골격근 조직 샘플(n = 20)을 얻어 Dlk1-Dio3 내에 존재하는 miRNA 중 무작위로 선별한 18개의 pre-miRNA 발현을 qRT-PCR로 분석하였다. 그 결과를 도 1a 내지 도 1d, 및 도 2에 나타내었다.

도 1a 내지 도 1d, 및 도 2에 나타난 바와 같이, 10개의 pre-miRNAs는 나이에 따라 발현이 유의한 감소를 보였고(P <0.05), 나머지 8개의 pre-miRNAs도 연령에 따라 감소하는 경향을 보였다. 마우스 및 사람 근육에서 Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA의 나이에 따른 발현 감소 패턴의 일치는 근육 노화에서 이들 분자의 중요한 역할을 암시한다.

실험예 2. Dlk1 - Dio3 클러스터에 위치한 miRNA가 근관세포의 직경에 끼치는 영향 확인

Dlk1-Dio3 유전자 좌에 존재하는 miRNA 중, 마우스와 인간 사이에 서열이 보존된 miRNA가 노화 근육의 주요 표현형 중 하나인 근육위축에 관여하는지를 조사하기 위해, miRNA 유사체(mimic)를 근관세포로 완전히 분화된 C2C12 세포에 과발현하여 근관세포 직경에 미치는 영향을 평가하였다. 상기 실험과정을 도 3a에 나타내었고, 상기 실험결과를 도 3b 및 도 3c에 나타내었다.

도 3b 및 도 3c에 나타난 바와 같이, 테스트한 42개의 pre-miRNA 중 36개가 대조군에 비해 현저히 큰 직경을 유도하였다. 이를 통해, Dlk1-Dio3 클러스터에 존재하는 miRNA가 노화에 따른 골격근 위축에 기여할 가능성을 확인할 수 있었고, miRNA의 투여를 통해 골격근의 크기를 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다.

실험예 3. Atrogin -1 단백질의 발현을 조절하는 Dlk1 - Dio3 클러스터에 위치한 miRNA

mimic-형질감염된 근관세포에서 관찰된 항-위축성의 표현형을 매개하는 miRNA의 표적을 확인하기 위해, TargetScan 알고리즘(www.targetscan.org)을 사용하였다. 그 결과를 도 4a 내지 도 4n에 나타내었다.

23개의 pre-miRNAs에서 비롯된 38개의 성숙 miRNA가 근육 특이적 E3 리가아제를 코딩하는 Atrogin-1의 3'UTR을 표적하는 것으로 예측되었다(도 4a, 표 7). 이때, 하기 표 7에서 *는 인간 Atrogin-1 3'UTR 내 보존 위치를 의미한다.

pre- miRNA (23)	mature miRNA (27)	Number of binding sites(38)	Position(bp)
127	127-5p	3	3218-3224 3622-3628* 3977-3983
300	300-3p	1	5480-5486
337	337-3p	1	1013-1019*
369	369-3p	2	3638-3644* 5305-5312
370	370-3p	2	464-470
376b	376b-3p	1	518-524
	376b-5p	1	480-486
376c	376c-3p	2	275-281 3781-3787*
	376c-5p	1	480-486
377	377-3p	1	3721-3728*
379	379-5p	1	539-545*
381	381-3p	1	5512-5518
409	409-5p	1	4511-4517
431	431-5p	1	253-259*
433	433-3p	1	787-793
493	493-5p	1	1301-1307*
494	494-3p	2	601-607 1129-1135
495	495-3p	2	455-461* 5427-5433
541	541-5p	1	5231-5237
543	543-3p	1	1412-1418
544	544-3p	3	206-212 1386-1392 2943-2949
	544-5p	3	341-347 1489-1495 1714-1720
654	654-3p	1	3274-3280
668	668-3p	1	2183-2190*
1193	1193-3p	1	1428-1434
	1193-5p	1	539-545*
1197	1197-3p	1	5026-5032*

루시퍼레이즈 리포터 분석을 사용하여 이러한 miRNA가 Atrogin-1 3'UTR을 실제로 표적하는지 확인하였는데, 23개의 pre-miRNA 중 14개가 절반 이하로 리포터 활성을 현저히 감소시켰으며(도 4b), 이는 Dlk1-Dio3 클러스터 내 최소 14개의 pre-miRNA가 Atrogin-1 3'UTR에 직접적으로 결합할 수 있음을 보여주었다. 상기 pre-miRNAs로 형질감염된 C2C12 근육세포에서 AKT, mTOR, S6K, 4EBP, FOXO3a 및 MuRF1과 같은 근육 항상성에 관여하는 주요 단백질의 변화는 없었지만, Atrogin-1 단백질의 발현은 특이적으로 낮아져 있었다(도 4c 및 도 4d).

6개의 miRNA(miR-381, 654, 127, 1193, 369 및 370)는 대조군과 비교하여 33 내지 50%만큼 리포터 활성을 낮췄고, 3개의 miRNA(miR-433, 376b 및 493)는 Atrogin-1 발현에 아무런 영향을 주지 않았다(도 4e). 인간 골격근 세포(HSMM)에서도 보존된 miRNA가 Atrogin-1 발현 억제를 야기했지만 다른 주요 단백질에는 영향을 미치지 않았다(도 4f 및 도 4g). 또한, Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA가 노화된 근육 조직에서 현저히 발현이 낮아져 있다는 사실에서 유추할 수 있는데, Atrogin-1 단백질 발현은 마우스와 인간 모두에서 젊은 근육 조직과 비교하여 나이에 따라 증가하는 것을 알 수 있었다(도 4h 내지 도 4k).

그러나, Atrogin-1 유전자의 발현은 차이가 없었는데, 이는 Atrogin-1 단백질의 나이에 따른 발현 증가는 클러스터 내의 miRNA에 의한 전사 후 조절에 기인함을 의미한다(도 4l 및 도 4m). 이러한 결과는 Dlk1-Dio3 클러스터에 있는 miRNAs의 특정 그룹(도 4n)이 Atrogin-1 단백질 발현을 제어한다는 것을 보여 주며, 노화에 따른 Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA의 발현 감소가 Atrogin-1의 발현을 증가시킴으로써 근육감소증을 유발시킬 수 있음을 보여준다.

실험예 4. miR -376c-3p의 근육 내 과발현이 노화성 근육감소증에 미치는 영향 확인

생후 24개월된 노화 마우스의 근육 조직은 3개월된 젊은 마우스의 근육 조직과 비교했을 때, 근육량이 현저히 감소하고 단면적이 작은 표현형을 보였다(도 5a 내지 도 5c). Dlk1-Dio3 클러스터 내 miRNA의 치료 가능성을 in vivo에서 조사하기 위해 근관의 직경을 크게 유도한 가장 효과적인 miRNA 중 하나를 선택하였다. 근관 직경을 크게 증가시킨 상위 5개 miRNA(도 3c) 중에서, miR-376c-3p가 노화된 TA 근육에서 가장 확실하게 발현이 저해되어 있었기 때문에 이 miRNA를 최종 선택하였다(도 6). miR-376c-3p와 Atrogin-1 3'UTR 사이의 특정 상호 작용을 더 조사하기 위해, 루시퍼라제 Atrogin-1 3'UTR 구조 및 miR-376c-3p mimic을 이용하여 리포터 분석을 수행하였다. miR-376c-3p mimic(miR-376c-3p)은 루시퍼라제 활성을 감소시켰는데, 이러한 활성 감소는 3'UTR상의 miR-376c-3p 결합 부위를 제거하였을 때 사라졌다(도 7a 및 도 7b).

Bi-ASO(biotinylated Atrogin-1 antisense oligomers)를 사용하여 수행한 풀다운 실험을 통해 내재적인 miR-376c-3p와 Atrogin-1 3'UTR 사이의 직접적 결합을 증명했다(도 7c 및 도 8).

구체적으로, C2C12 세포에 Atrogin-1 3'UTR에서 야생형(WT) 또는 결실 돌연변이(Mut) miR-376c-3p 결합 부위를 포함하는 루시퍼라제 리포터로 형질감염 시켰다. 형질감염 후 48시간에, 루시페라제 2 mRNA 농축을 검출하기 위해 스트렙타비딘 비즈 및 RT-qPCR 분석으로 ASO(비오틴의 존재 또는 부재하인 경우 분석에 이용)를 사용하여 루시퍼라제 2 mRNA를 추출하였다.

miR-376c-3p 형질감염은 일차 근아세포, C2C12 및 HSMM에서 모두 Atrogin-1 발현을 감소시켰고, 반대로 억제제 (I)-miR-376c-3p는 Atrogin-1 발현을 증가시켰다(도 9a 내지 도 9c). miR-376c-3p로 형질감염된 근관의 섬유 두께 역시 감소되었고(도 10a 내지 도 10c), 세포 내 총 단백질 함량은 miR-376c-3p 형질감염된 HSMM에서 유의하게 증가했다(도 10d).

마지막으로, miR-376c-3p가 노화 마우스의 근육감소를 개선하는지 확인하기 위해, 23개월된 마우스의 TA 근육에 miR-376c-3p(AdmiRa-376c-3p) 또는 대조군 아데노 바이러스(AdmiRa-Ctrl)를 1개월간 투여하고 면역조직화학 분석을 통해 횡단면을 조사하였다(도 10e, 도 11a 및 도 11b). 이때, 각 실험군의 마우스로서 6마리를 사용하였다. miR-376c-3p를 과발현하는 TA 근육은 대조군에 비해 현저하게 큰 근육섬유를 나타내었다(도 12a 내지 도 12c). AdmiRa-376c-3p에 감염된 근육에서 Atrogin-1 E3 리가아제의 표적으로 알려진 eIF3f의 발현 수준은 감소된 Atrogin-1 발현과 달리 증가하였다(도 12d 및 도 12e). 또한, 근육피로도를 개선하는 결과를 얻었는데, 이를 통해 노화 근육의 기능까지 개선할 가능성을 보여주었다(도 12f 및 도 12g). 이러한 결과는 miR-376c-3p가 근육 노화를 퇴치하기 위한 효과적인 타겟이 될 수 있음을 보여준다.

실험예 5. 글루코코르티코이드 및 악액질에 의한 근육 위축에서 miR -376c-3p의 효과 확인

Atrogin-1은 노화뿐만 아니라 글루코코르티코이드 또는 암이 발생한 생체내 근육에서 위축을 일으킨다. 따라서, miR-376c-3p가 글루코코르티코이드에 의한 근육 위축을 개선시킬 수 있는지 확인하였다. 그 결과를 도 13a 내지 도 13e, 및 도 14a 내지 도 14c에 나타내었다.

도 13a 내지 도 13e, 및 도 14a 내지 도 14c에 나타난 바와 같이, miR-376c-3p는 덱사메타손으로 유도된 근관의 근육 위축을 예방하여 덱사메타손에 의한 근육 위축이 야기된 경우에도 덱사메타손을 처리하지 않은 대조군과 비슷한 직경을 보여주었고(도 13a 내지 도 13c), 덱사메타손 처리에 의해 증가한 Atrogin-1 발현 역시 miR-376c-3p에 의해 대조군 수준으로 감소되었다(도 13d). 또한, miR-376c-3p는 덱사메타손 처리에 의해 감소된 근육내 단백질량도 정상으로 되돌렸다(도 13e). siRNA를 이용한 Atrogin-1의 넉다운 실험을 통해, 덱사메타손으로 처리된 근관에서 Atrogin-1 단백질 발현 억제를 통해 근육의 형태학적인 악화를 방지하는 것을 확인하였다(도 13a 내지 도 13e, 및 도 14a 내지 도 14c).

또한, miR-376c-3p가 종양으로 유도된 근육위축을 개선하는지 여부를 조사하였다. Atrogin-1은 급성 근육 위축의 중요한 마커인데 악액질이 발생하면 과발현함이 보고된 바 있다. 대장암 세포주 C26를 배양했던 배지를 C2C12 근관에 처리한 결과, 근관이 현저하게 얇아지는 것을 확인할 수 있는데, miR-376c-3p 형질 감염을 통해 C26 배양 배지의 근관의 근 위축 유도가 대조군의 근관과 비슷한 정도로 회복시키는 것을 확인하였다(도 15a 내지 도 15c). 이러한 조건에서 Atrogin-1 발현은 낮아졌고 반대로 이의 타겟으로 알려진 eIF3f의 발현은 증가하여 miR-376c-3p가 in vitro에서 근육 위축을 완화시킬 수 있음을 확인하였다(도 15d).

또한, C26 종양으로 유도된 악액질 마우스 모델에서 miR-376c-3p의 치료 가능성을 확인하기 위해, C26 종양을 마우스에 접종 후 7일과 10일째에 AdmiRa-Control 또는 AdmiRa-376c-3p를 TA 근육에 주입하고 근육의 상태를 관찰하였다(도 15e). 종양 보유 마우스의 체중은 비 종양 마우스의 체중보다 약간 낮지만 근육량은 유의하게 낮아져 있는 것을 확인하였다(도 16a 및 도 16b). AdmiRa-376c-3p에 감염된 TA 근육은 13%의 감소를 보였으나 AdmiRa-Control에 감염된 반대쪽 TA 근육은 21% 감소가 관찰되었다(도 17a). AdmiRa-376c-3p에 감염된 TA 근육의 단면적은 8.5% 증가를 동반했다(도 17b 및 도 17c). 상기 실험 결과는 miR-376c-3p의 과발현이 종양으로 유도된 악액질에서 보이는 근육 위축을 효과적으로 억제할 수 있음을 보여준다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING MUSCULAR DISEASE OR CACHEXIA COMPRISING, AS ACTIVE INGREDIENT, miRNA LOCATED IN Dlk1-Dio3 CLUSTER OR VARIANT THEREOF <130> FPD/201806-0063 <150> KR 10-2018-0002557 <151> 2018-01-09 <160> 67 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 66 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-668 <400> 1 ggtaagtgcg cctcgggtga gcatgcactt aatgtgggtg tatgtcactc ggctcggccc 60 actacc 66 <210> 2 <211> 66 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-376c <400> 2 aaaaggtgga tattccttct atgtttatgt tatttatggt taaacataga ggaaattcca 60 cgtttt 66 <210> 3 <211> 68 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-376a <400> 3 taaaaggtag attctccttc tatgagtaca ttatttatga ttaatcatag aggaaaatcc 60 acgttttc 68 <210> 4 <211> 81 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-494 <400> 4 gatactcgaa ggagaggttg tccgtgttgt cttctcttta tttatgatga aacatacacg 60 ggaaacctct tttttagtat c 81 <210> 5 <211> 84 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-541 <400> 5 acgtcaggga aaggattctg ctgtcggtcc cactccaaag ttcacagaat gggtggtggg 60 cacagaatct ggactctgct tgtg 84 <210> 6 <211> 88 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-1197 <400> 6 acttcctggt atttgaagat gcggttgacc atggtgtgta cgctttattt gtgacgtagg 60 acacatggtc tacttcttct caatatca 88 <210> 7 <211> 82 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-495 <400> 7 tggtacctga aaagaagttg cccatgttat tttcgcttta tatgtgacga aacaaacatg 60 gtgcacttct ttttcggtat ca 82 <210> 8 <211> 76 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-382 <400> 8 tacttgaaga gaagttgttc gtggtggatt cgctttactt atgacgaatc attcacggac 60 aacacttttt tcagta 76 <210> 9 <211> 91 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-412 <400> 9 ctggggtacg gggatggatg gtcgaccagt tggaaagtaa ttgtttctaa tgtacttcac 60 ctggtccact agccgtccgt atccgctgca g 91 <210> 10 <211> 69 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-377 <400> 10 ttgagcagag gttgcccttg gtgaattcgc tttatttatg ttgaatcaca caaaggcaac 60 ttttgtttg 69 <210> 11 <211> 80 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-329 <400> 11 ggtacctgaa gagaggtttt ctgggtttct gtttctttaa tgaggacgaa acacacctgg 60 ttaacctctt ttccagtatc 80 <210> 12 <211> 88 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-758 <400> 12 gcctggatac atgagatggt tgaccagaga gcacacgctt tatttgtgcc gtttgtgacc 60 tggtccacta accctcagta tctaatgc 88 <210> 13 <211> 61 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-380 <400> 13 aagatggttg accatagaac atgcgctatc tctgtgtcgt atgtaatatg gtccacatct 60 t 61 <210> 14 <211> 83 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-300 <400> 14 tgctacttga agagaggtaa tccttcacgc atttgcttta cttgcaatga ttatacaagg 60 gcagactctc tctggggagc aaa 83 <210> 15 <211> 63 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-299 <400> 15 aagaaatggt ttaccgtccc acatacattt tgaatatgta tgtgggatgg taaaccgctt 60 ctt 63 <210> 16 <211> 79 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-409 <400> 16 tggtactcgg ggagaggtta cccgagcaac tttgcatctg gacgacgaat gttgctcggt 60 gaaccccttt tcggtatca 79 <210> 17 <211> 73 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-134 <400> 17 cagggtgtgt gactggttga ccagaggggc atgcactgtg ttcaccctgt gggccaccta 60 gtcaccaacc ctc 73 <210> 18 <211> 91 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-544a <400> 18 attttcatca cctagggatc ttgttaaaaa gcagattctg attcagggac caagattctg 60 catttttagc aagttctcaa gtgatgctaa t 91 <210> 19 <211> 67 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-379 <400> 19 agagatggta gactatggaa cgtaggcgtt atgatttctg acctatgtaa catggtccac 60 taactct 67 <210> 20 <211> 94 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-432 <400> 20 tgactcctcc aggtcttgga gtaggtcatt gggtggatcc tctatttcct tacgtgggcc 60 actggatggc tcctccatgt cttggagtag atca 94 <210> 21 <211> 89 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-493 <400> 21 ctggcctcca gggctttgta catggtaggc tttcattcat tcgtttgcac attcggtgaa 60 ggtctactgt gtgccaggcc ctgtgccag 89 <210> 22 <211> 82 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-136 <400> 22 tgagccctcg gaggactcca tttgttttga tgatggattc ttatgctcca tcatcgtctc 60 aaatgagtct tcagagggtt ct 82 <210> 23 <211> 114 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-431 <400> 23 tcctgcttgt cctgcgaggt gtcttgcagg ccgtcatgca ggccacactg acggtaacgt 60 tgcaggtcgt cttgcagggc ttctcgcaag acgacatcct catcaccaac gacg 114 <210> 24 <211> 84 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-487b <400> 24 ttggtacttg gagagtggtt atccctgtcc tgttcgtttt gctcatgtcg aatcgtacag 60 ggtcatccac tttttcagta tcaa 84 <210> 25 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-376b <400> 25 cagtccttct ttggtattta aaacgtggat attccttcta tgtttacgtg attcctggtt 60 aatcatagag gaaaatccat gttttcagta tcaaatgctg 100 <210> 26 <211> 72 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-665 <400> 26 tctcctcgag gggtctctgc ctctacccag gactctttca tgaccaggag gctgaggccc 60 ctcacaggcg gc 72 <210> 27 <211> 81 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-654 <400> 27 gggtaagtgg aaagatggtg ggccgcagaa catgtgctga gttcgtgcca tatgtctgct 60 gaccatcacc tttagaagcc c 81 <210> 28 <211> 75 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-370 <400> 28 agacagagaa gccaggtcac gtctctgcag ttacacagct cacgagtgcc tgctggggtg 60 gaacctggtc tgtct 75 <210> 29 <211> 86 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-323a <400> 29 ttggtacttg gagagaggtg gtccgtggcg cgttcgcttt atttatggcg cacattacac 60 ggtcgacctc tttgcagtat ctaatc 86 <210> 30 <211> 78 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-543 <400> 30 tacttaatga gaagttgccc gtgttttttt cgctttattt gtgacgaaac attcgcggtg 60 cacttctttt tcagtatc 78 <210> 31 <211> 102 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-496 <400> 31 cccaagtcag gtactcgaat ggaggttgtc catggtgtgt tcattttatt tatgatgagt 60 attacatggc caatctcctt tcggtactca attcttcttg gg 102 <210> 32 <211> 78 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-539 <400> 32 atacttgagg agaaattatc cttggtgtgt tcgctttatt tatgatgaat catacaagga 60 caatttcttt ttgagtat 78 <210> 33 <211> 75 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-381 <400> 33 tacttaaagc gaggttgccc tttgtatatt cggtttattg acatggaata tacaagggca 60 agctctctgt gagta 75 <210> 34 <211> 84 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-154 <400> 34 gtggtacttg aagataggtt atccgtgttg ccttcgcttt atttgtgacg aatcatacac 60 ggttgaccta tttttcagta ccaa 84 <210> 35 <211> 78 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-1193 <400> 35 gtagctgagg ggatggtaga ccggtgacgt gcacttcatt tacgatgtag gtcacccgtt 60 tgactatcca ccagcgcc 78 <210> 36 <211> 93 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-337 <400> 36 gtagtcagta gttggggggt gggaacggct tcatacagga gttgatgcac agttatccag 60 ctcctatatg atgcctttct tcatcccctt caa 93 <210> 37 <211> 70 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-369 <400> 37 ttgaagggag atcgaccgtg ttatattcgc tttattgact tcgaataata catggttgat 60 cttttctcag 70 <210> 38 <211> 93 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-433 <400> 38 ccggggagaa gtacggtgag cctgtcatta ttcagagagg ctagatcctc tgtgttgaga 60 aggatcatga tgggctcctc ggtgttctcc agg 93 <210> 39 <211> 94 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-434 <400> 39 tcgactctgg gtttgaacca aagctcgact catggtttga accattactt aattcgtggt 60 ttgaaccatc actcgactcc tggttcgaac catc 94 <210> 40 <211> 73 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-485 <400> 40 acttggagag aggctggccg tgatgaattc gattcatcaa agcgagtcat acacggctct 60 cctctctttt agt 73 <210> 41 <211> 80 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-410 <400> 41 ggtacctgag aagaggttgt ctgtgatgag ttcgctttta ttaatgacga atataacaca 60 gatggcctgt tttcagtacc 80 <210> 42 <211> 96 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-411 <400> 42 tggtacttgg agagatagta gaccgtatag cgtacgcttt atctgtgacg tatgtaacac 60 ggtccactaa ccctcagtat caaatccatc cccgag 96 <210> 43 <211> 97 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-127 <400> 43 tgtgatcact gtctccagcc tgctgaagct cagagggctc tgattcagaa agatcatcgg 60 atccgtctga gcttggctgg tcggaagtct catcatc 97 <210> 44 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse atrogin-1 forward primer <400> 44 acaagggaag tacgaaggag cg 22 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse atrogin-1 reverse primer <400> 45 ggcagtcgag aagtccagtc 20 <210> 46 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse beta-actin forward primer <400> 46 ggctgtattc ccctccat 18 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse beta-actin reverse primer <400> 47 ccagttggta acaatgccat g 21 <210> 48 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human atrogin-1 forward primer <400> 48 ccatccgtct agtccgctc 19 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human atrogin-1 reverse primer <400> 49 tgaggtcgct cacgaaactg 20 <210> 50 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human GAPDH forward primer <400> 50 tgttgccatc aatgaccc 18 <210> 51 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human GAPDH reverse primer <400> 51 cccacgacgt actcagcg 18 <210> 52 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mmu-miR-376c primer <400> 52 aacatagagg aaatttcacg t 21 <210> 53 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> U6 primer <400> 53 tggcccctgc gcaaggatg 19 <210> 54 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> atrogin-1 forward primer <400> 54 cagcttcgtg agcgacctc 19 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> atrogin-1 reverse primer <400> 55 ggcagtcgag aagtccagtc 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 56 gggaaattca acggcacagt 20 <210> 57 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 57 agatggtgat gggcttccc 19 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Luciferase 2 forward primer <400> 58 caccttcgtg acttcccatt 20 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Luciferase 2 reverse primer <400> 59 tgactgaatc ggacacaagc 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'biotinylated ASO for endogenous Atrogin-1 primer <400> 60 atgtggcact cacagcagag 20 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'biotinylated ASO for reporter mRNA primer <400> 61 agacgggcaa gaaagaggat 20 <210> 62 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Atrogin-1 Cat. No. 1357211 sense sequence <400> 62 gauagaugug uucgucuua 19 <210> 63 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Atrogin-1 Cat. No. 1357211 antisense sequence <400> 63 uaagacgaac acaucuauc 19 <210> 64 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Atrogin-1 Cat. No. 1357212 sense sequence <400> 64 gugaucuaag augggaagg 19 <210> 65 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Atrogin-1 Cat. No. 1357212 antisense sequence <400> 65 ccuucccauc uuagaucac 19 <210> 66 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Atrogin-1 Cat. No. 1357210 sense sequence <400> 66 agagagucgg caagucugu 19 <210> 67 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Atrogin-1 Cat. No. 1357210 antisense sequence <400> 67 acagacuugc cgacucucu 19

Claims (21)

1. Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA 또는 이의 변이체를 유효성분으로 포함하는 근육질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물로서, 상기 miRNA는 miRNA-668, miRNA-376c, miRNA-494, miRNA-541, miRNA-377, miRNA-1197, miRNA-495 및 miRNA-409로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나이고, 상기 근육질환은 근육감소증, 근위축증, 근육 퇴행 위축(muscle dystrophy) 및 심위축증으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인 근육질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서,
   상기 miRNA는 Atrogin-1/MAFbx 단백질의 발현량을 감소시키는 것인, 약학 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 miRNA는 Atrogin-1/MAFbx 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 3-말단 비번역 영역(3'-untranslated region, 3'-UTR)과 직접적으로 상호작용하여 Atrogin-1/MAFbx의 발현을 억제하는 것인, 약학 조성물.
5. 삭제
6. Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA 또는 이의 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드가 적재된 벡터를 유효성분으로 포함하는 근육질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물로서, 상기 miRNA는 miRNA-668, miRNA-376c, miRNA-494, miRNA-541, miRNA-377, miRNA-1197, miRNA-495 및 miRNA-409로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나이고, 상기 근육질환은 근육감소증, 근위축증, 근육 퇴행 위축(muscle dystrophy) 및 심위축증으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인 근육질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
7. 삭제
8. 제6항에 있어서,
   상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 바이러스 및 이의 유사체들로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 약학 조성물.
9. 제8항에 있어서,
   상기 바이러스는 아데노바이러스 또는 아데노 부속 바이러스인 것인, 약학 조성물.
10. Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA 또는 이의 변이체를 유효성분으로 포함하는 악액질의 예방 또는 치료용 약학 조성물로서, 상기 miRNA는 miRNA-668, miRNA-376c, miRNA-494, miRNA-541, miRNA-377, miRNA-1197, miRNA-495 및 miRNA-409로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 악액질의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
11. 삭제
12. Dlk1-Dio3 클러스터에 위치한 miRNA 또는 이의 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드가 적재된 벡터를 유효성분으로 포함하는 악액질의 예방 또는 치료용 약학 조성물로서, 상기 miRNA는 miRNA-668, miRNA-376c, miRNA-494, miRNA-541, miRNA-377, miRNA-1197, miRNA-495 및 miRNA-409로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 악액질의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
13. 삭제
14. 제12항에 있어서,
    상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 바이러스 및 이의 유사체들로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 약학 조성물.
15. 제14항에 있어서,
    상기 바이러스는 아데노바이러스 또는 아데노 부속 바이러스인 것인, 약학 조성물.
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제
19. 삭제
20. 삭제
21. 삭제

Images