KR20110082515A

KR20110082515A - 피부 경화증의 치료

Info

Publication number: KR20110082515A
Application number: KR1020117007580A
Authority: KR
Inventors: 스테펜 게이; 올리버 디스틀러; 브리타 마우러
Original assignee: 유니베르시태트 취리히
Priority date: 2008-09-04
Filing date: 2009-09-04
Publication date: 2011-07-19
Also published as: WO2010026213A3; AU2009289239B2; US20110218233A1; US8247389B2; AU2009289239A1; EP2331143B1; WO2010026213A2; EP2331143A2; JP2012502007A

Abstract

본 발명은 피부 경화증을 치료하는 방법을 제공한다. 이 같은 방법은 miR-29, 또는 miR-29의 순환성 농도 및/또는 세포내 농도를 증가시키는 miR-29 상향조절자의 투여에 의해 miR-29를 상향 조절하는 단계를 포함한다. 또한 본 발명은 피부 경화증의 치료를 위한 miR-29의 용도, 및 피부 경화증 치료용 약물의 제조를 위한 miR-29의 용도에 관한 것이다.

Description

피부 경화증의 치료{TREATMENT OF SCLERODERMA}

본 발명은 피부 경화증의 신규한 약리학적 치료에 관한 것이다. 구체적으로는, 본 발명은 피부 경화증을 치료하기 위한 microRNA 군(microRNA family)의 miR-29의 상향조절(upregulation)에 관한 것이다.

본 발명은 피부 경화증(SSc)의 신규한 약리학적 치료에 관한 것이다. 피부 경화증에는 다양한 유형이 존재한다. 전신성 경화증으로도 지칭되는 다중 전신성 섬유증 형태는 피부의 연관 정도에 따라 2가지 하위유형을 포함한다. 즉 제한형 피부 형태는 사지에 영향을 미치는 반면, 분산형 하위유형은 또한 몸체에 영향을 미친다. 전선성 질환 이외에도, 예를 들어 피부의 특정 영역, 종종 관절 및 근육에 영향을 미치지만 내부 장기에는 영향을 미치지 않는 국소피부 경화증(morphea)을 비롯한 질환에는 국소 형태가 존재한다. 전신성 경화증의 주요 특징은 피부 및 내부 장기에서의 만연된 미세혈관 손상 및 진행성 섬유증이다. 일반적으로 가장 명확한 임상적 증상은 피부 경화 및 이와 관련된 상흔이다. 피부가 딱딱해지거나, 홍조를 띠거나, 또는 벗겨질 수 있다. 주로 장기 부전(organ failure)으로 인해 발생하는 합병증을 관리하는데 있어서의 발전에도 불구하고, 현재까지 여전히 치유도 질병 특이적 치료도 존재하지 않는다. 현재 몇몇 이용 가능한 약제가 피부를 부드럽게 하고 염증을 감소시킬 지라도 피부 경화증의 치료를 위한 부가적이고 효과적인 약물에 대한 필요성이 명백히 존재한다.

miR-29는 유전자 발현을 조절하는 것과 연관이 있는 작은 비암호화 micro RNA이다. 동물 miRNA는 약 70개의 뉴클레오티드로 이루어진 전구체로서 전사되어, 다이서 효소(Dicer enzyme)에 의해 순서적으로 가공되어 약 22개의 뉴클레오티드를 갖는 생성물이 된다. 이 경우, 성숙한 서열은 전구체 RNA의 3' 말단에서 유래한다. 생성물은 표적 mRNA의 5' 말단과의 상보성을 통해 조절 작용을 하는 것으로 간주된다. miR-29a, miR-29b1과 miR29b2, 및 miR-29c는 miR-29군에 속한다.

miR-29는 Bcl-2 단백질군의 세포사멸 억제 멤버인 Mcl-1 단백질의 준위를 조절하는 것으로 나타나 있다. 또한 miR-29는 다양한 T-세포 백혈병에서 분열되는 것으로 밝혀져 있는 종양 유전자(oncogene)인 Tcl1 단백질의 준위를 조절하고, 폐암에서 종종 상향조절된 DNMT3A 및 DNMT-3B 둘 모두를 직접 표적화(targeting)하는 는 것으로 나타나 있다. 추가로 miR-208의 부재시에 miR-29 발현은 상향조절되어, 심근성 섬유증을 예방하는 것으로 나타나 있다(WO 2008/074866). 피부 세포 및 피부 경화증에서 miR-29의 역할은 현재까지 연구되어 있지 않다.

본 발명의 요약

본 발명은 치료학적 유효량의 miR-29 또는 miR-29 상향조절자(upregulator)를 치료가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 피부 경화증 중 섬유증을 치료하는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 피부 경화증의 치료를 위한 miR-29 또는 miR-29 상향조절자의 용도, 피부 경화증 치료용 약물의 제조를 위한 miR-29 또는 miR-29 상향조절자의 용도, 및 피부 경화증의 치료에 효과적인 화합물을 스크린닝하는 방법에 관한 것이다.

도 1:
A: SSc 섬유아세포에서의 miR-29군의 기준선 발현: miR-29a에 있어서 발현이 가장 강력하다(델타 CT법에서 낮은 수치는 높은 발현을 의미한다).
B: miR-29군 멤버의 기준선 발현 준위는 정상의 피부 섬유아세포(각각에서 n=6)에 비해 SSc 피부 섬유아세포에서는 강력하게 하향조절(downregulating)된다.
도 2:
A: SSc 환자로부터의 파라핀 포매 피부 단면에서의 miR-29a의 기준선 발현이 건강한 대조군에 비해 하향조절된다. 상피세포층 및 진피층 사이에서는 발현의 차이가 존재하지 않는다.
B: SSc 환자의 새로운 피부 생검에서 miR-29a의 기준선 발현은 건강한 대조군에 비해 하향조절된다.
도 3:
A: SSc 피부 섬유아세포에서의 miR-29a의 발현 증가는 형질감염(transfection) 72 시간 이후에 mRNA 및 단백질 준위에 대해 콜라겐 I 및 III의 하향조절을 초래한다.
B: SSc 피부 섬유아세포에서의 miR-29b 및 miR-29c의 발현 증가는 형질감염 72 시간 이후에 mRNA 준위에 대해 콜라겐 I 및 III의 하향조절을 초래한다.
도 4:
Col3A1-3' UTR을 표적화하는 루시퍼라제 리포터 유전자(luficerase reporter gene) 분석: pGL3 대조군/3'UTR_Col3A1_5'to3'과 프리-miR29a의 공-형질감염은 개똥벌레 루시퍼라제 활성의 감소를 초래한다.

본 발명은 피부 경화증을 치료하는 방법을 제공한다. 피부 경화증은 국소피부 경화증을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다중 전신성 형태 및 국소 형태로 이루어져 있다. 본 발명의 치료는 치료학적 유효량의 miR-29 또는 miR-29 상향조절자를 치료가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 이 같은 치료는 miR-29의 순환성 농도 및/또는 세포내 농도의 평가를 포함한다.

miR-29는 성숙한 miR-29a, miR-29b1, miR-29b2 및 miR-29c뿐만 아니라, 성숙한 miRNA의 생물활성을 유지하고 있는 이들의 상동성 서열, 전구체, 단편 또는 변이체를 포함한다. 상술한 서열을 암호화하는 DNA와 같은 기타 핵산이 또한 포함된다. 일반적으로 상동성은 2개 이상의 핵산 사이의 서열 유사성으로부터 추론된다. 서열 사이의 정확한 유사성 비율은 유사성을 확립하는데 있어서 유용한 것으로, 조직에서 핵산에 따라 변하지만, 유사성을 확립하기 위해 25% 정도의 낮은 서열 유사성이 통상적으로 이용된다. 또한, 보다 높은 준위의 서열 유사성, 예를 들어 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 서열 유사성은 유사성의 확립에 사용될 수 있다. 서열 유사성 비율을 결정하는 방법(예를 들어, 디폴트 매개변수(default parameter)를 이용한 BLASTN)이 일반적으로 이용 가능하다.

miR-29군의 RNA 서열은 하기와 같다:

성숙한 miR-29a: UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA

성숙한 miR-29b1: UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU

성숙한 miR-29b2: UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU

성숙한 miR-29c: UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA

본 발명에 따른 바람직한 miR-29는 miR-29a뿐만 아니라, 성숙한 miR-29a의 생물활성을 유지하고 있는 이의 상동성 서열, 전구체 단편 또는 변이체이다.

miR-29 상향조절자는 혈액 또는 세포에서 miR-29의 발현 및/또는 활성을 증가시키며, miR-29를 발현시키는 벡터를 포함하지만 이에 한정되지 않는 화합물이다. 발현 벡터의 예로는 아데노바이러스 또는 레트로바이러스 발현 벡터와 같은 바이러스성 발현 벡터가 있다.

miR-29 또는 miR-29 상향조절자의 투여는 피부 및 내부 장기로의 전달에 적합한, 당해 기술분야의 숙련자에게 공지된 임의의 방법일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 특정 양태에서, miR-29 또는 miR-29 상향조절자는 정맥내 주사 또는 동맥내 주사를 통해 투여될 수 있다. 몇몇 양태에서, 투여는 miR-29 또는 miR-29 상향조절자의 구강투여, 경피 투여, 복막내 투여, 피하 투여, 서방형 투여, 조절 방출형 투여, 지연 방출형 투여, 좌약형 투여 또는 설하선 투여를 포함한다.

활성 성분의 투여량은 개체의 종류, 이의 나이, 체중 및 개개의 상태, 개개의 약물 동력학적 자료, 및 투여 방식에 의존한다. 약 70㎏의 체중을 갖는 개인의 경우, miR-29 또는 miR-29 상향조절자의 일일 투여량은 0.01㎎/㎏ 체중 내지 1000㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 0.1㎎/㎏ 체중 내지 100㎎/㎏ 체중, 더욱 바람직하게는 1㎎/㎏ 체중 내지 25㎎/㎏ 체중의 범위이며, 이는 1일 1회 또는 수회 나누어 투여될 수 있다. miR-29 또는 miR-29 상향조절자는 단독으로 사용되거나, 기타 약제와 함께 사용될 수 있다.

또한 본 발명은 피부 경화증의 치료를 위한 miR-29 또는 miR-29 상향조절자의 용도, 특히 miR-29 또는 miR-29 상향조절자를 포함하는 약학 조성물의 용도에 관한 것이다.

또한 본 발명은 피부 경화증 치료용 약물의 제조를 위한 miR-29 또는 miR-29 상향조절자의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 의약은, 예를 들어 통상적인 혼합, 과립화, 코팅, 분산 또는 동결 건조 공정을 통해 그 자체로서 공지된 방법으로 제조되는 약학 조성물이다. 본 발명의 특정 양태에서, miR-29 또는 miR-29 상향조절자는 지질 비히클과 결합되어 있다. 대안적으로는, 당업자는 단순히 miR-29 또는 miR-29 상향조절자 자체를 제공할 수 있으며, 여기서 상기 miR-29 또는 miR-29 상향조절자는 선택적으로 리포솜(liposome) 또는 나노입자와 같은 전달 비히클 내에 포함된다. 본 발명의 특정 양태에서, miR-29 또는 miR-29 상향조절자는 연고로 제조된다.

추가로, 본 발명은 i) 후보 화합물을 섬유아세포를 접촉시키는 단계, ii) miR-29의 활성 또는 발현을 평가하는 단계, 및 iii) 후보 화합물의 부재시의 miR-29 활성 또는 발현에 비해 miR-29의 활성 또는 발현을 선택적으로 증가시키는 후보 화합물을 선택하는 단계를 포함하는, 피부 경화증의 치료에 효과적인 화합물을 스크린닝하는 방법에 관한 것이다. miR-29 활성 또는 발현의 평가는 miR-29의 발현 준위를 평가하는 단계를 포함할 수 있다. 당해 기술분야의 숙련자라면 RNA 발현 준위를 평가하는 다양한 방법, 예를 들어 노던 블랏팅(northern blotting) 또는 RT-PCR에 대해 잘 알고 있을 것이다, 추가로 본 발명은 이들 스크린닝 방법에 의해 선택된 화합물에 관한 것이다.

하기 실시예는 본 발명의 범주를 한정하기 위함이 아니라, 본 발명을 예시하기 위해 제공된다. 특히 이들 데이터에 따르면, miR-29는 건강한 대조군에 비해 피부 경화증 환자의 피부 샘플에서 하향조절된다는 것을 증명하고 있으며, 따라서 miR-29의 하향조절은 피부 경화증의 치료에 유용하다는 것을 보여준다.

실시예 1: 정상 피부 섬유아세포에 대한 배양된 SSc 섬유아세포에서 miR-29군의 기준선 발현

SSc 환자 및 건강한 기증자로부터의 피부 생검 시료를 펀치 생검(punch biopsy)에 의해 수득하였다. 모든 환자는 르로이(LeRoy) 등에 의해 제안된 바와 같은 기준을 충족시켰다. 본 명세서에서 내에 개시되어 있는 모든 시험관내 실험에 있어서, 부산물 배양물(outgrowth culture)로부터의 피부 섬유아세포를 T75 플라스크에서 배양하였다. 피부 섬유아세포를 DMEM/10% FCS에서 방치하고, 분석을 위해 통과분획(passage) 3번 내지 8번을 이용하였다.

miRVana 키트(앰비온/어플라이드 바이오시스템즈(Ambion/Applied Biosystems)사의 제품)를 이용하여 RNA를 단리한 이후에 Taqman계 RT-PCR을 이용하여 건강한 대조군에 대한 miR-29의 발현 준위를 SSc 환자에서 분석하였다. 앰비온/어플라이드 바이오시스템즈사의 특정 단일 Taqman MicroRNA 분석장비를 이용하였다. 표적 서열은 하기와 같다: hsa-miR-29a: UAGCACCAUCUGAAAUCGGUU(assay ID: 000412, part no.: 4373065), hsa-miR-29b: UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU(assay ID: 000413, part no.: 4373288), hsa-miR-29c: UAGCACCAUUUGAAAUCGGU(assay ID: 000415, part no.: 4373289), RNU6B (내생성 대조군): CGCAAGGAUGACACGCAAAUUCGUGAAGCGUUCCAUAUUUUU(assay ID: 001093, part no.: 4373381).

낮은 수치는 높은 발현을 의미하는 델타 CT법으로 측정된 바와 같이, miR-29군의 모든 멤버는 SSc 섬유아세포에서 발현되는 것으로 밝혀졌으며, miR-29군 내에서 miR-29b(델타 CT=27.1±0.3) 또는 miR-29c(CT=22.8±0.1)에 비해 miR-29a가 가장 높은 발현율(델타 CT=17.4±0.2)을 나타냈다(도 1(A) 참조). 배양된 섬유아세포에서 miR-29의 기준선 준위는 건강한 대조군에 비해 일관성 있게 하향조절된다(mir-29a: p=0.012, miR-29b: p=0.046, 및 miR-29c: p=0.028)(도 1(B) 참조).

본 명세서에 포함된 모든 데이터는 평균치의 평균 ± 표준 오차로서 제공된다. 0.05 미만의 p-값은 통계학적으로 유의한 것으로 간주된다.

실시예 2: 건강한 대조군에 대한 SSc 환자의 a) 파라핀 단면 및 b) 피부 생검에서의 miR-29a의 기준선 발현

건강한 대조군과 비교하여 SSc 환자의 시험관내 샘플에서 miR-29a의 기준선 발현을 조사하였다. 조직 층의 균질화 이후에 miRVana 키트(앰비온/어플라이드 바이오시스템즈사의 제품)를 이용하여 RNA를 단리하고, Taqman-계 RT-PCR에 이용하였다. 앰비온/어플라이드 바이오시스템즈사의 상술한 miR-29a 및 RNU6B용 특정 단일 Taqman MicroRNA 분석장비를 이용하였다.

a) 상피세포층 및 진피층 사이에서는 발현의 가능한 차이를 평가하기 위해, 상피세포 및 진피를 절개한 이후에 RecoverAll Total Nucleic Acid 단리 키트(앰비온/어플라이드 바이오시스템즈사의 제품)를 이용하여 파라핀 포매 조직 단면으로부터 단리된 최초 RNA를 분석하였다. 또한 조직에서 miR-29a의 매우 강력한 발현(델타 CT=18)이 발견되었으며, 이는 SSc 환자의 상피세포 및 진피 둘 모두에서 정상 대조군에 비해 유의하게 하향조절된 것이었다(p=0.012)(도 2(A) 참조).

b) 샘플의 파라핀 처리로 인해 잠재적인 오류에 대한 영향을 배제하기 위해 SSc 환자로부터의 새로운 피부 생검에서 miR-29a의 발현을 부가적으로 조사하였으며, 이후에 건강한 대조군은 2년 미만 동안 -20℃에서 RNA에 저장되었다. 게다가 miR-29a는 건강한 대조군에 비해 SSc에서 유의하게 하향조절되었다(p=0.042)(도 2(B) 참조).

실시예 3: mRNA 에 대해 콜라겐 I 및 III 의 발현 및 단백질 준위를 하향조절하는 SSc 섬유아세포에서의 miR -29의 발현 증가

피부 섬유아세포에서 콜라겐 발현에 대한 miR-29의 효과를 평가하기 위해, 그리고 무엇보다 miR-29군 멤버가 SSc에서 콜라겐 발현을 변경할 수 있다는 것을 증명하기 위해, 리포펙타민 2000 시약(인비트로젠(Invitrogen))을 이용하여 miR-29a의 과발현이 콜라겐 유전자의 하향조절을 유도하는 지를 검토함으로써 6-웰 플레이트에서 SSc 피부 섬유아세포를 100nM(최종 농도)의 pre-miR-29a, pre-miR-29b, 및 pre-miR-29c 또는 스크램블링(scrambling)된 대조군으로 형질감염시켰다. 앰비온/어플라이드 바이오시스템즈사의 하기 전구체 분자 및 음성 대조군이 사용되었다: pre-miR-29a(제품 ID: PM12499, 성숙한 miRNA 서열: UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA), pre-miR-29b-2(제품 ID: PM10103, 성숙한 miRNA 서열: UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU), pre-miR-29c(제품 ID: PM10518, 성숙한 miRNA 서열: UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA), pre-miR miRNA 전구체 분자-음성 대조준 #1(부품 번호: 17110). Sybr Green 프라이머를 이용한 Taqman계 RT-PCR을 이용하여 mRNA 준위에서 콜라겐 I 및 III의 발현을 분석하였다. 프라이머 서열은 하기와 같다: 프로콜라겐 1A1 전방향: 5'-TCAAGAGAAGGCTCACGATGG-3', 후방향: 5'-TCACGGTCACGAACCACATT-3'; 프로콜라겐 3A1 전방향: 5'-GGCATGCCACAGGGATTCT-3', 후방향: 5'-GCAGCCCCATAATTTGGTTTT-3'. 표준 프로토콜에 따라 웨스턴 블럿(Western Blot)을 이용하여 단백질 준위에서 콜라겐 1A1 및 3A1에 대한 miR-29a의 과발현 효과를 조사하였다. 산타 크루즈 바이오테크놀로지스(Santa Cruz Biotechnologie)사로부터 일차 항원(콜라겐 I(H-70): sc-28655, 로트 번호: B2406; 콜라겐 III(H-300): sc-28888, 로트 번호: K2205)을 구입하였다.

반정량적 농도 분석법(semiquantitative densitometry)으로 분석했을 때 SSc 피부 섬유아세포에서 miR-29a의 발현 증가는 단백질 준위(p=0.027)뿐만 아니라 mRNA 준위(각각의 경우 p=0.043)에서 콜라겐 I 및 III 발현에서 상당한 하향조절을 유도하였다. 또한 SSc 섬유아세포에서 miR-29b 및 miR-29c의 과발현은 mRNA 준위에서 콜라겐 I 및 III의 하향조절을 초래하였다(도 3 참조).

요약하면, 이들 기능 실험에 따르면, miR-29군은 SSc에서 주요 발병 경로를 음성적으로 조절한다는 강력한 증거를 제공하였다.

실시예 4: Col3A1의 3' UTR을 표적화하기 위한 루시퍼라제 리포터 분석

miR-29군의 멤버, 특히 miR-29a가 피부 섬유아세포에서 콜라겐 유전자의 발현의 직접적인 조절자임을 증명하고, 유전자 조절에 대한 효과가 추가의 매개자(mediator)를 표적화함으로써 매개되지 않음을 증명하기 위해, 본 발명자들은 miR-29군의 멤버 각각에 대해 2개의 결합 부위를 갖고 있는 Col3A1의 3' UTR을 표적화하기 위한 루시퍼라제 리포터 분석을 수행하였다: COL3A1 3' UTR의 242 내지 249 번째 위치에서의 보존된 결합 부위, 및 682 내지 689 번째 위치에서의 빈약하게 보존된 결합 부위(TargetScan 데이터베이스에서 제공되는 정보, 발매번호: 4.2 버전; http://www.targetscan.org/). 실험에서 루시퍼라제의 정지 코돈의 바로 하류에 존재하는 XbaI 부위를 이용함으로써 PCR에 의해 973개 염기쌍의 Col3A1 3' UTR 절편을 인간 게놈 DNA로부터 증폭하고, 원숭이 바이러스 40 프로모터(프로메가(Promega))를 갖는 pGL3-대조군 벡터에 삽입하였다. 본 발명자들은 miR-29의 예상되는 결합 자손(match seed)를 갖고 있는 특정 단편을 생성하기 위해 특정 프라이머를 제작하였다. 프라이머 서열은 하기와 같다: Col3A1-3'UTR 전방향: 5'-ACGCAAGGCTGTGAGACTAC-3', Col3A1-3' UTR 후방향: 5'-CATTGAGCATTATCTCTACTCTG-3', Col3A1 Xba1 전방향: 5'-GTAATTCTAGAACCAAACTCTATCTGAAATCCC-3'. 제조자의 지침서에 따라 리포벡타민 2000 시약(인비트로젠)을 이용함으로써 SSc 또는 정상 피부 섬유아세포를 6-웰 플레이트에서 0.375ug의 개똥벌레 루시퍼라제 리포트 벡터, 및 레닐라(Renilla) 루시퍼라제 pRL-SV40 벡터(프로메가)를 포함하는 0.2ug의 대조군 벡터와 함께 공-형질감염하였다. 각각의 웰에 대해 100nM pre-miR29a, 29b, 29c 또는 스크램블링된 대조군(앰비온/어플라이드 바이오시스템즈)을 사용하였다. 이중 루시퍼라제 분석법(프로메가)을 이용하여 형질감염 24시간 후에 개똥벌레 및 레닐라 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 실험은 2회 수행하였다.

상기 결과에 따르면, pre-miR29a와의 공-형질감염은 개똥벌레 루시퍼라제 활성을 약 50%정도 감소시켰으며, 그 결과 임의의 기타 중재 분자의 부재하에서도 직접적인 조절 효과의 증거가 나타난다는 것을 보여준다.

Claims

피부 경화증의 치료를 위한 miR-29 또는 miR-29 상향조절자(upregulator)의 용도.
제 1 항에 있어서, 상기 miR-29 상향조절자는 miR-29를 발현시키는 발현벡터인 것을 특징으로 하는 용도.
피부 경화증 치료용 약물의 제조를 위한 miR-29 또는 miR-29 상향조절자의 용도.
피부 경화증을 치료하는 방법에 있어서,
치료학적 유효량의 miR-29 또는 miR-29 상향조절자를 치료가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 피부 경화증 치료 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 miR-29 상향조절자는 miR-29를 발현시키는 발현벡터인 것을 특징으로 하는 피부 경화증 치료 방법.
피부 경화증의 치료에 효과적인 화합물을 스크린닝(screening)하는 방법에 있어서,
후보 화합물을 섬유아세포와 접촉시키는 단계;
miR-29의 활성 또는 발현을 평가하는 단계; 및
상기 후보 화합물의 부재시의 miR-29 활성 또는 발현에 비해 miR-29의 활성 또는 발현을 선택적으로 증가시키는 후보 화합물을 선택하는 단계를 포함하는 화합물의 스크린닝 방법.