KR101928427B1 - 마이크로rna-497을 유효성분으로 포함하는 알코올성 간질환의 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 스크리닝 방법 - Google Patents

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Abstract

마이크로RNA-497(miRNA-497) 또는 이의 모방체를 유효성분으로 포함하는 알코올성 간질환의 예방 또는 치료용 조성물 및 이를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

Description

마이크로RNA-497을 유효성분으로 포함하는 알코올성 간질환의 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 스크리닝 방법{Composition comprising microRNA-497 for preventing or treating of alcoholic liver diseases and method of screening thereof}
마이크로RNA-497 (microRNA-497, miRNA-497)을 유효성분으로 포함하는 알코올성 간질환의 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 구체적으로 알코올에 의해 유발된 담즙정체성 간질환 (cholestatic liver diseases)을 포함하는 알코올성 간질환에 효과가 있는 약학 조성물과 이의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
간은 우리 몸에서 가장 큰 장기로서 각종 대사작용, 해독, 분해, 합성 및 분비를 담당하는 매우 중요한 장기로서, 에너지 대사를 관리하는 기능이 있어 음식물에서 흡수된 모든 영양소들이 간에서 에너지를 생산할 수 있는 물질로 대사되어 전신에 공급되거나 저장된다. 또한, 간은 약 2,000여종의 효소, 알부민, 응고인자들의 혈청단백, 답즙산, 인지질 또는 콜레스테롤 등의 지방 등을 합성하고 저장하며 분배하는 기능이 있다. 또한, 간은 약물, 술 또는 독성물질 등을 해독시키면서 간 세포가 손상되기 쉽고 따라서 약물성, 독성 또는 알코올성 간질환 등이 흔히 발생하게 된다.
알코올은 간질환의 주요 원인 중 하나로서, 알코올의 만성적인 과잉섭취에 의한 알코올성 간 질환(alcoholic liver disease: ALD)은 알코올성 지방간, 알코올성 간염 (급성, 만성) 및 알코올성 간경변증으로 분류되며, 간에 약간의 지방이 축적된 것부터 진행된 간경화에 이르기까지 여러 형태로 나타나고, 구체적으로 지방간 (hepatic steatosis), 지방간염 (steatohepatitis), 섬유증, 간경화 (cirrhosis) 및 간세포 암 (hepatocellular carcinoma)을 포함한다.
국내 간경변증의 원인은 음주에 의한 간경변이 2위를 차지하고 있으며 우리나라 간세포암종을 원인별로 살펴보면 음주가 3위를 차지하고 있다.
간에서 분비되는 담즙은 담즙산, 인지질, 빌리루빈, GSH 및 전해질 등의 성분을 가지며, 독성물질 및 지방분해 산물의 배설을 위한 통로일 뿐만 아니라, 장에서 지방의 소화 및 흡수에 관여하여 다양한 생리 기능을 수행하며, 빌리루빈 (Bilirubin)과 같은 내인성 노폐물 및 약물과 여러 가지 독성물질을 배출하고, 장에서 정상적 지방 흡수를 증가시키며, 인체 콜레스테롤 (cholesterol) 대사의 평형유지에 중추적 역할을 담당한다 (Ballatori N et al., Am. J. Physiol, 263, pp. G617-G624, 1992).
담즙산 대사물은 공복상태, 또는 비만, 알코올 식이, 염증질환 및 당뇨병과 같은 다양한 스트레스 환경에서 합성 또는 생성되며, 다양한 대사성질환 조절에 관여하는 것으로 알려져 있다 (Li T et al., Pharmacol Rev, 2014;66:948-983).
담즙정체 또는 담즙울체 (cholestasis)는 담즙의 순환장애로 인한 생화학적, 생리적, 또는 임상적 변화를 의미한다. 담즙정체의 원인으로는 알코올성 간질환, 급성 간염, 담관의 감염 및 반흔이 동반된 일차성 담즙성 간경화증, 바이러스 간염 B 또는 C에 의한 간경화증, 약물, 임신, 담관 내 담석, 담관 좁아짐 (협착), 췌장 염증 (췌장염) 등의 원인이 있다. 담즙 분비의 이상은 간 내 또는 전신에 독성 물질의 축적을 유발하여 간 손상 또는 황달을 일으킬 수 있다.
담즙정체 또는 담즙울체성 간질환을 완전하게 치료하는 방법은 현재 간이식술 외에는 알려져 있지 않다. 약물요법에 의한 치료는 질환의 증상을 감소시키고 합병증을 예방하는 수준에 그친다.
한편, 마이크로알엔에이 (microRNA)는 다양한 생물학적 과정의 중요한 조절자로서, 한 가닥의 21~23개의 작은 미인식 알엔에이 (RNA) 분자로 구성되고, 표적유전자 번역 억제와 엠알엔에이 분해를 통해 포스터-전자조절을 제어하는 것으로 알려져 있다.
microRNA는 주로 표적 mRNA의 3'UTR에 결합하여 mRNA의 분해를 촉진하거나 mRNA의 번역을 저해함에 따라 여러 생물체에서 단백질의 발현을 음성 조절한다. 이러한 miRNA는 세포 사멸, 분화 및 증식과 같은 세포성 기작과 암, 간질환 및 대사성질환과 같은 생리학적 과정에 중요한 조절자로 작용 한다 (Szabo G., et al, 2013;10:542-552).
멜라토닌은 다양한 생리적 기능 및 대사성 항상성을 조절하는 것에 중요한 역할을 한다. 또한, 멜라토닌은 송과체 및 다양한 조직에서 생성되며 생체주기, 수면 또는 항산화 수준에 따라 조절되는 것으로 알려져 있다. 특히, 멜라토닌은 산화적스트레스, 염증, 당뇨, 비만 또는 간질환 같은 대사성질환 조절에 중요한 기능을 하는 것으로 알려져 있다 (Reiter RJ et al., Physiology, 2014;29:325-333).
본 발명자들은 멜라토닌에 의해 발현이 촉진되는 마이크로RNA를 이용하여 알코올 의존성 경로에 의해 유발되는 간질환의 치료를 위한 새로운 치료제 및 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
일 양상은 마이크로RNA-497 (miRNA-497) 또는 miRNA-497의 모방체(mimic)를 유효성분으로 포함하는 알코올성 간질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
다른 양상은 miRNA-497을 이용한 알코올성 간질환의 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
일 양상은 마이크로RNA-497 (microRNA-497, miRNA-497, miR-497) 또는 miRNA-497의 모방체를 유효성분으로 포함하는 알코올성 간질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "마이크로알엔에이 (마이크로RNA, microRNA, miRNA, mir)"는 특정 염기 서열 (또는 서열번호)로 나타내어지는 miRNA 뿐만 아니라 상기 miRNA의 전구체 (pre-miRNA), 초기전사체 (pri-miRNA), 및 이들과 이들과 생물학적 기능이 동등한 miRNA, 예를 들면 동족체 (즉, 호몰로그 또는 오솔로그), 유전자 다형 등의 변이체, 및 유도체를 포함한다. 이러한 전구체, 초기전사체, 동족체, 변이체 또는 유도체는 구체적으로는 miRBase release 20(http://WWW.mirbase.org/)에 의해 동정할 수 있다.
또한, 본 명세서에서 사용하는 miRNA는 mir 유전자의 유전자 산물이어도 좋고, 그러한 유전자 산물은 성숙한 miRNA (예를 들면, 상기한 바와 같은 mRNA의 번역 억제에 관여하는 15~25 염기, 또는 19~25 염기의 비코딩 RNA) 또는 miRNA 전구체 또는 전사체 (예를 들어 pre-miRNA 또는 pri-miRNA)를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "mmu-mir-497 유전자", "mmu-mir-497" 또는 " mir-497"은 상기 서열번호 3에 기재된 mir-497 유전자 (miRBase Accession No. MI0004636)나 그 외 그 외 생물종 호몰로그 또는 오솔로그 등을 포함한다.
일 구체예에서 miRNA-497의 모방체는 a) miRNA-497의 성숙한 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; b) miRNA-497의 pre-miRNA(전구체) 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및 c) miRNA-497의 pri-miRNA(초기전사체) 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나일 수 있다.
일 구체예에서 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1(SEQ ID NO: 1)(CAGCAGCACACUGUGGUUUGUA), 서열번호 2(SEQ ID NO: 2) (CAAACCACACUGUGGUGUUAG), 또는 이들의 조합된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
일 구체예에서 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3(SEQ ID NO: 3) (CCUGCCCCCGCCCCAGCAGCACACUGUGGUUUGUACGGCACUGUGGCCACGUCCAAACCACACUGUGGUGUUAGAGCGAGGGUA)의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
일 구체예에서 miRNA-497의 성숙한 서열은 mmu-miR-497-5p (miRBase Accession No. MIMAT0003453)(서열번호 1) 또는 mmu-miR-497-3p (miRBase Accession No. MIMAT0017247)(서열번호 2)에 기재된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 일 구체예에서 miRNA-497의 성숙한 서열은 ThermoFisher Assay ID: AM11293의 서열을 사용할 수 있다.
일 구체예에서 pre-miRNA-497은 mmu-mir-497 (Entrez Gene ID: 751537)(miRBase Accession No. MI0004636)(서열번호 3)에 기재된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 일 구체예에서 pre-mir-497는 ThermoFisher Assay ID: MC11293의 서열을 사용할 수 있다. 일 구체예에서 pre-miRNA (Ambion, Austin, TX, USA) 의 No. MC11293을 센스 (sense)로 사용하고, No. AM11293을 안티센스 (anti-sense)로 사용할 수 있다.
일 구체예에서 pri-miRNA-497은 ThermoFisher Assay ID: Mm03307967의 서열을 사용할 수 있다.
일 구체예에서 상기 폴리뉴클레오티드는 벡터로부터 발현되는 것일 수 있다. 상기 벡터는 d) miRNA-497의 성숙한 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하여 포유동물의 세포 내에서 상기 서열을 발현하는 벡터; e) miRNA-497의 pre-miRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하여 포유동물의 세포 내에서 상기 서열을 발현하는 벡터; 및 f) miRNA-497의 pri-miRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하여 포유동물의 세포 내에서 상기 서열을 발현하는 벡터 중 어느 하나일 수 있다.
상기 벡터는 알코올성 간질환을 예방 또는 치료하고자 하는 부위의 조직 또는 세포에 투여되어 miRNA-497의 성숙한 서열, 이의 pre-miRNA 또는 pri-miRNA를 포함하는 miRNA-497이 안정적으로 발현될 수 있도록 할 수 있다.
일 구체예에서 상기 벡터는 바이러스성 벡터 또는 비바이러스성 벡터일 수 있다. 상기 바이러스성 벡터는 세포에 감염을 일으키는 바이러스 고유의 세포 내 침투 기전을 이용하는 것으로서 miRNA-497을 전달하여 발현할 수 있는 것이라면 제한되지 않는다. 일 구체예에서 상기 바이러스성 벡터는 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노부속바이러스(Adeno-associated Virus: AAV), 레트로바이러스(Retrovirus), 렌티바이러스(Lentivirus)일 수 있다.
상기 비바이러스성 벡터는 miRNA-497을 전달하여 발현할 수 있는 것이라면 제한되지 않는다. 일 구체예에서 상기 비바이러스성 벡터는 지질 전달체 또는 고분자 전달체일 수 있다. 예를 들어, 상기 지질 전달체는 양이온성, 음이온성 또는 중성 지질을 이용한 전달체일 수 있으며, miRNA를 보호하여 혈액 순환시 안정성을 향상시킬 수 있다. 양이온성 지질을 이용할 경우 음전하를 띄는 친수성 miRNA가 지질에 부착될 수 있으며, 세포막과의 입자간의 전자기적 상호작용으로 인해 세포 내로의 흡수를 증진시킬 수 있다. 상기 지질 전달체는 리포좀에 기반한 전달체를 포함한다. 또한, 예를 들어, 상기 고분자 전달체는 PLGA 또는 PEI와 같은 고분자를 이용한 전달체일 수 있으며, PLGA는 생체 친화적이고 안정성과 방출 지속 효과가 있다. PEG로 표면을 변조한 PLGA의 경우 체내에서 긴 시간 동안 안정하게 머무를 수 있다. 또한, PEI는 물에 잘 용해되고 양전하를 띄므로 음전하를 띄는 miRNA를 잘 봉입하여 운반할 수 있다.
상기 벡터는 예방 또는 치료하고자 하는 대상체의 조직 또는 세포에 투여되어, miRNA-497 또는 miRNA-497의 모방체를 발현할 수 있다.
상기 miRNA-497은 멜라토닌에 의해 발현이 조절되어 알코올 섭취성 마우스의 간에서 담즙산 (bile acid)의 합성을 개선 시킬 수 있다. 일 구체예에서 상기 miRNA-497은 멜라토닌에 의해 발현이 촉진되는 것일 수 있다. 일 구체예에서 상기 miRNA-497은 간에서 담즙산에 합성을 억제하는 할 수 있다.
본 발명자들은 miRNA-497이 카나비노이드 수용체 제1형 (cannabinoid receptor type 1: CB1R)-B 세포 전위 유전자 2 (B-cell translocation gene 2: BTG2)-yin yang 1 (YY1) 신호전달 경로, 즉 CB1R-BTG2-YY1 신호전달 경로를 저해하고 이에 따라 알코올에 의해 유도된 담즙산의 합성 또는 생성을 억제한다는 것을 발견하였다. 또한, 멜라토닌은 miRNA-497을 촉진함에 의해 알코올 자극된 Btg2 및 Yy1 mRNA의 유도와 담즙산 생산을 약화시킨다는 것을 발견하였다. 일 구체예에서 상기 miRNA-497은 CB1R-BTG2-YY1 신호전달 경로를 저해하여 담즙산 합성을 감소시킬 수 있다.
상기 카나비노이드 수용체 제1형 (cannabinoid receptor type 1: CB1 수용체, CB1R)은 다양한 대상성 질환에 관련되어 있다. 상기 CB1 수용체는 일부 말초 세포조직 (예, 간, 지방조직, 및 부신)에서도 발현된다. 말초 CB1 수용체 길항제는 비만, 과체중, 비-알콜성 지방간 질병, 제2 형 당뇨병, 신장병, 신장 섬유증, 골다공증, 및 골관절염과 같은 많은 질병의 치료 가능성을 가진 약제이다.
B 세포 전위 유전자 2 (B-cell translocation gene 2: BTG2) 및 yin yang 1 (YY1)은 생물학적 상태의 강력한 조절자 (regulator)이다. 구체적으로 BTG2는 대사 항상성을 조절하고 대사 과정을 유지하는 데 핵심적인 역할을 한다.
Btg2의 과발현은 Yy1 유전자 발현 및 담즙산 생산을 강화시키는 반면에, 알코올 자극에 의해 유발되는 담즙산 합성은 Btg2 유전자 기능제어 (knockdown)시 CB1R-BTG2-YY1 캐스케이드 (cascade) 또는 신호전달 경로를 방해한다.
본 발명에서 miRNA-497 모방체(mimic)의 과발현은 Btg2 및 Yy1 유전자 발현의 감소뿐만 아니라 알코올에 의한 담즙산 생산을 획기적으로 감소시키는 반면에, 이러한 현상은 miRNA-497 저해제(억제제)에 의해 반대로 될 수 있다.
본 발명에서 멜라토닌은 miRNA-497의 발현을 용량의존적으로 증가시킨다. 멜라토닌에 의한 miRNA-497의 상향조절은 CB1R-BTG2-YY1 신호전달 경로를 약화시킴으로써 알코올 유도된 담즙산 합성을 억제한다. 이러한 본 발명의 멜라토닌-miRNA-497 신호전달 네트워크는 알코올 의존성 경로에 의해 유발되는 간질환의 치료를 위한 새로운 치료 타겟을 제공한다.
상기 CB1R-BTG2-YY1 신호전달 경로에 의해 조절되는 담즙산 합성에 관여하는 효소에는 Cyp7a1, Cyp27a1 및 Cyp8b1가 있다.
실제로 간에서 콜레스테롤으로부터 담즙산의 합성은 두 가지 경로인 전형적인 경로와 대안적인 경로가 있고, 콜레스테롤 7α-히드록시라제 (cholesterol 7α-hydroxylase: CYP7A1), 스테롤 27 히드록시라제 (sterol 27 hydroxylase: CYP27A1), 및 스케롤 12α-히드록시라제 (sterol 12α-hydroxylase: CYP8B1)와 같은 속도 결정 효소 (rate-determining enzyme)에 의해 일어난다.
담즙정체성 간질환 (cholestatic liver)은 비만, 당뇨병, 지방간염 및 염증과 같은 간 대사 장애의 조절에 관여하는 담즙산에 의해 유발된다.
일 구체예에 따르면 본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료되는 알코올에 의해 유발된 간질환은 알코올성 지방간, 알코올성 급성 간염, 알코올성 만성 간염, 알코올성 간섬유증, 알코올성 간경변, 알코올성 간암 또는 알코올성 담즙정체성 간질환이고, 보다 바람직하게 알코올성 담즙정체성 간질환일 수 있다.
일 구체예에 따르면 상기 조성물은 비경구, 경구, 경피, 피내, 근육내, 정맥, 피하, 복강내, 지속성 방출, 제어된 방출, 지연된 방출, 좌약, 흡입, 카테터 (catheter), 또는 설하 투여 또는 간 조직으로의 직접 주사를 위해 제제화되는 조성물일 수 있다.
본 발명에 따른 miRNA-497 또는 miRNA-497 모방체는 식품의약안정청 (KFDA)의 통상적인 약학 제제로의 제형화 기준 또는 건강보조식품의 제형 기준에 의거하여 제형화할 수 있다.
miRNA-497 또는 miRNA-497 모방체는 그 자체를 사용하거나 약학적으로 허용이 가능한 산부가염 또는 금속 복합체, 예를 들어 아연, 철 등과 같은 염의 형태로 사용할 수 있다. 좀 더 구체적으로 산부가염은 염화수소, 브롬화수소, 황산염, 인산염, 말레산염, 아세트염, 시트로산염, 벤조산염, 숙신산염, 말린산염, 아스코로브산염, 타르탈산염을 사용할 수 있다. 그리고 miRNA-497, miRNA-497의 모방체 및 이들의 염 형태를 유효성분으로 함유하는 조성물은 통상적인 방법으로, 투여방법, 투여형태 및 치료목적에 따라 상기 유효성분을 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 혼합하여 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다.
상기 담체가 희석제로 사용되는 경우에는 염수, 완충제, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 링거액, 락토즈, 수크로즈, 칼슘 실리케이트, 메틸 셀룰로오즈 및 에탄올로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1종 이상의 담체를 사용한 경구투여와 비경구투여용으로 분말, 과립, 주사액, 시럽, 용액제, 정제, 좌약, 페사리 (pessaries), 연고, 크림 또는 에어로졸 등과 같은 제형으로 제조한다. 다만, 본 발명의 담체가 상기의 담체로 한정되는 것은 아니다. 이때, 비경구 투여는 경구 이외에 직장, 정맥, 복막, 근육, 동맥, 경피, 비강, 흡입 등을 통한 유효성분의 투여를 의미한다.
상기 제형에 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함하여 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 제형화 할 수 있다. 그리고 본 발명의 투여량은 환자의 상태, 투여 경로 및 투여 형태에 따라 조절될 수 있어 한정되지 않으며 증상에 따라 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 자명하게 다양한 범위 내에서 사용할 수 있으나, 통상적으로 본 발명에서는 실험적인 유효량으로 체중 1㎏ 당 0.0001 내지 100㎎을 하루에 연속적 또는 간헐적으로 투여가 가능할 것으로 판단된다.
상기와 같은 miRNA-497의 효과를 바탕으로, miRNA-497의 발현을 증가시킬 수 있는 물질을 탐색하는 방법을 사용하여 새로운 알코올성 간질환 예방 또는 치료제를 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, miRNA-497 유전자를 보유하는 세포에 피검물질을 처리하고 miRNA-497의 발현 양상을 조사한 다음, 피검물질을 처리하지 않은 대조군 세포와 비교하여 miRNA-497의 발현이 상향되는 것을 찾는 방법을 사용할 수 있다.
본 발명자들은 멜라토닌에 의해 miRNA-497의 발현이 증가되며, miRNA-497의 증가된 발현은 알코올에 의한 담즙 생산을 현저하게 감소시킴을 확인하였으며, miRNA-497의 발현을 증가시키는 피검물질을 선별하는 방법은 알코올성 간질환 치료제의 스크리닝 방법으로 유용하게 이용될 수 있다.
구체적으로 상기 본 발명의 다른 양상에 따른 방법은, 시험관 내에서 마이크로RNA-497(miRNA-497)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 세포에 피검물질을 처리하는 단계; 및 피검물질이 처리된 단리된 세포에서 miRNA-497의 발현을 분석하고, 피검물질을 처리하지 않은 단리된 대조군 세포의 miRNA-497의 발현 양상과 비교하는 단계;를 포함하는 알코올성 간질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 miRNA-497는 멜라토닌에 의해 발현이 조절되어 알코올 섭취성 마우스의 간에서 담즙산(bile acid)의 합성을 개선 시킬 수 있다. 일 구체예에서 상기 miRNA-497은 멜라토닌에 의해 발현이 촉진되는 것일 수 있다. 일 구체예에서 상기 miRNA-497은 간에서 담즙산 합성을 억제 할 수 있다. 일 구체예에서 상기 miRNA-497은 CB1R-BTG2-YY1 신호전달 경로를 저해하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "측정"은 확인, 검사, 검출 또는 판정 지원이라는 용어로 치환할 수 있다. 또한, 용어 "분석"은 평가라는 용어로 치환될 수 있고, 검사 결과 또는 측정 결과에 의거하여 진단 또는 평가를 지원하는 것을 포함하는 의미에서 사용된다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 용어 "피검물질"은 피검 화합물 또는 피검 조성물이라는 용어로 치환될 수 있고, 저분자 화합물, 항체, 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA (short hairpin RNA), 핵산, 단백질, 펩티드, 기타 추출물 및 천연물로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 활성 또는 발현량을 측정하는 단계는 유전자의 전사 활성 수준을 측정하거나 발현된 단백질량을 측정할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 유전자의 발현 정도는 역전사 중합효소 연쇄반응 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR), 효소면역분석법 (ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블롯 (Western Blotting) 및 유세포 분석법 (FACS)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것을 포함할 수 있다.
일 구체예에 따르면 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 스크리닝될 수 있는 알코올에 의해 유발된 간질환에 대한 치료제는 알코올성 지방간, 알코올성 급성 간염, 알코올성 만성 간염, 알코올성 간섬유증, 알코올성 간경변, 알코올성 간암 또는 알코올성 담즙정체성 간질환이고, 보다 바람직하게 알코올성 담즙정체성 간질환일 수 있다.
통계학적 분석 방법
GraphPad Prism 3-5.0 소프트웨어를 사용하여 데이터 및 통계 분석을 수행하였다. 그룹 간의 차이에 대한 통계적 유의성은 Student's t test를 사용하여 결정하였고, 다중 비교는 처치 및 실험을 요인으로 하여 one-way ANOVA을 사용하여 분석하였다. 모든 데이터는 평균±S.E.M.으로 표현되었고, P < 0.05에서 통계학적으로 유의함으로 간주되었다.
일 양상에 따른 마이크로RNA-497 또는 miRNA-497의 모방체를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 알코올에 의해 유발된 간질환의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
다른 양상에 따른 피검물질이 처리된 단리된 세포에서 miRNA-497의 발현을 분석 및 대조군과 발현양상을 비교하는 단계를 포함하는 방법은 알코올성 간질환 치료제의 스크리닝에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 일 구체예에 따른 알코올은 Btg2, Yy1, 및 담즙산 합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 발현 증가 양상을 나타낸다 (1군당 n = 7, *P < 0.05, **P < 0.01 대(vs.) 비처리 대조군).
도 1(A)는 에탄올 투여에 따른 Cb1r , Cyp7a1 , Cyp27a1 , 및 Cyp8b1 mRNA 수준과 함께 Btg2 및 Yy1의 수준을 나타낸다. 도 1(B) 및 (C)는 에탄올 투여에 따른 간 및 혈청에서 담즙산 (BA) 수준을 나타낸다. 도 1(D)는 2-AG 투여에 따른 Btg2 , Yy1 및 담즙산 합성 효소를 암호화하는 유전자의 발현을 나타낸다. 도 1(E) 및 (F)는 2-AG 투여에 따른 간 및 혈청에서 담즙산 (BA) 수준을 나타낸다.
도 2는 일 구체예에 따른 알코올 의존성 담즙산 합성은 CB1R-BTG2 경로에 의해 매개되는 양상을 나타낸다 (1군당 n = 7, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 대(vs.) 비처리 대조군 또는 EtOH 급여 마우스).
도 2(A)는 에탄올에 의해 유도된 Cb1r , Btg2 , Yy1 , 및 담즙산 합성 효소의 mRNA의 수준에 대한 AM251의 영향을 나타낸다. 도 2(B)는 AM251에 의한 담즙산의 수준을 나타낸다. 도 2(C)는 Ad-Btg2 투여에 의한 Yy1 , Cyp7a1 , Cyp27a1 및 Cyp8b의 수준을 나타낸다. 도 2(D)는 Ad- Btg2 투여에 의한 간에서 담즙산의 수준을 나타낸다. 도 2(E)는 내인성 Btg2의 유전자 기능제어 (knockdown)시 에탄올에 의해 유도된 Btg2 , Yy1 , 및 담즙산 합성 유전자 발현의 변화를 나타낸다. 도 2(F)는 Btg2 유전자 기능제어/침묵 (silencing)에 의한 담즙산의 수준의 변화를 나타낸다.
도 3은 일 구체예에 따른 알코올 의한 담즙산 대사/합성은 Yy1에 의해 매개되는 양상을 나타낸다.
도 3(A)는 Yy1 유전자 기능제어 (sh Yy1)시 에탄올에 유도된 Yy1 및 담즙산 합성 유전자의 발현의 변화를 나타낸다. 도 3(B)는 sh Yy1에 의한 간에서 담즙산의 수준의 변화를 나타낸다 (1군당 n = 7, *P < 0.05, **P < 0.01 대(vs.) 비처리 대조군 또는 EtOH 급여 마우스). 도 3(C)는 sh Yy1에 의한 Cyp7a1 프로모터 활성의 변화를 나타낸다. 도 3(D)는 에탄올 반응성 요소가 Cyp7a1 유전자 프로모터의 -1500 내지 -1200 사이에 위치함을 나타낸다. 도 3(E)는 mCyp7a1-Luc (mt)에 의한 Cyp7a1의 프로모터 활성의 변화를 나타낸다. 모든 데이터는 대조군 (± SEM)에 대한 배(fold) 활성을 나타낸다. 도 3(F)는 YY1에 의해 알코올 자극된 담즙산 합성이 매개됨을 나타낸다(*P < 0.05 대(vs.) 비처리 대조군 또는 EtOH 급여 마우스).
도 4는 일 구체예에 따른 멜라토닌에 의한 알코올 급여 마우스의 간에서 BTG2 유전자 발현과 담즙산 합성의 양상을 나타낸다.
도 4(A)는 멜라토닌에 의한 Btg2 , Yy1 , 및 담즙산 합성에 관여하는 유전자의 발현의 변화를 나타낸다. 도 4(B)는 에탄올 및/또는 멜라토닌을 처리한 마우스에서 BTG2, YY1, 및 CYP7A1 단백질에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸다. 도 4(C)는 에탄올 및/또는 멜라토닌을 처리한 마우스 간에서 담즙산의 농도를 나타낸다 (1군당 n = 7, *P < 0.05, **P < 0.01 대(vs.) 비처리 대조군 또는 EtOH 급여 마우스).
도 5는 일 구체예에 따른 멜라토닌에 의한 Btg2 , Yy1 , 및 Cyp7a1 mRNA 수준의 감소는 miR-497 의존적인 양상을 나타낸다.
도 5(A)는 멜라토닌에 의한 miR-497, miR-374, 및 miR-3195의 발현을 나타낸다(1군당 n = 7, *P < 0.05, 대(vs.) 비처리 대조군). 도 5(B)는 Pre-miR-497 또는 Pre-miR-Con로 형질감염시킨 PMH에서 miR-497의 수준을 나타낸다. 도 5(C)는 Pre-miR-497 또는 Pre-miR-Con로 형질감염시킨 PMH에서 Btg2 , Yy1 , 및 Cyp7a1의 mRNA 발현 수준을 나타낸다. 도 5(D)는 Anti-miR-497 또는 Anti-miR-Con로 형질감염시킨 PMH에서 miR-497의 수준을 나타낸다. 도 5(E)는 Anti-miR-497 또는 Anti-miR-Con로 형질감염시킨 PMH에 멜라토닌을 처리했을 때, miR-497와, Btg2 , Yy1 , 및 Cyp7a1의 mRNA 발현 수준을 나타낸다(*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 대(vs.) 비처리 또는 멜라토닌 처리 세포).
도 6은 일 구체예에 따른 알코올 유발 담즙산 합성은 멜라토닌-miR-497 축 (신호전달 네트워크)에 의해 매개되는 양상을 나타낸다 (*P < 0.05, 대(vs.) 비처리 대조군 또는 EtOH 처리 세포, 및 EtOH 및 멜라토닌 처리 세포).
도 6(A)는 멜라토닌, pre-miR-Con 또는 pre-miR-497을 처리했을 때 알코올 유발성 Btg2 , Yy1 , 및 Cyp7a1 mRNA의 수치의 변화를 나타낸다. 도 6(B)는 멜라토닌, pre-miR-Con 또는 pre-miR-497을 처리했을 때 알코올 유발성 담즙산 수치의 변화를 나타낸다. 도 6(C)는 멜라토닌, anti-miR-Con 또는 anti-miR-497을 처리했을 때 알코올 유발성 Btg2 , Yy1 , 및 Cyp7a1 mRNA의 수치의 변화를 나타낸다. 도 6(D)는 멜라토닌, anti-miR-Con 또는 anti-miR-497을 처리했을 때 알코올 유발성 담즙산 수치의 변화를 나타낸다.
도 7은 일 구체예에 따른 상술한 알코올 유도성 담즙산 합성에 대한 멜라토닌과 miR-497의 역할을 나타내는 모델이다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1-1. 알코올은 Btg2 , Yy1 , 및 담즙산 합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 발현 증가
수컷 C57BL/6 야생형 (WT) 마우스 (Samtako, Osan, 한국) (n=7)에 5% 알코올 (에탄올, 총 칼로리의 36%)을 함유하는 리버-디칼리 (Lieber-DeCarli) 알코올 식이 기준 방법 (Research Diets, New Brunswick, NJ, USA)으로 4주 동안 경구 투여군과 리버-디칼리 알코올 식이 투여군에 실험종료 전 2주간 멜라토닌 (melatonin, 10 mg/kg) 경구 투여군으로 구분하였다. 또한, 야생형 마우스에 말토오스 덱스트린을 함유하는 액체를 4주 동안 경구 투여 (oral gavage)군을 대조군으로 하였고(n=7), 야생형 대조군에 실험종료 전 2주간 멜라토닌 (10 mg/kg) 처리군 등 4가지 군으로 분리하였다. 알코올 동물 실험 급여 (challenge) 기간이 끝나면, 마우스를 CO2를 이용하여 안락사 시키고 간 조직과 혈액 샘플을 채취하였다. 모든 동물 연구 및 프로토콜은 국립 보건원(NIH)의 가이드라인 및 방침에 따라 라온바이오 (RaonBio)의 동물 관리 기관에 의해 승인되었으며 (용인, 한국, KPCP-140029), 이와 같은 방법은 달리 기술되지 않는 한 이하 다른 실시예에서도 동일하다.
(1) RNA 분리 및 정량적 실시간 PCR (quantitative real-time PCR : qPCR ) 분석
총 RNA를 다양한 조건의 마우스 일차 간세포(primary hepatocyte) 또는 간 조직으로부터 TRIzol 시약(Invitrogen)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 추출하였고, qPCR 분석을 수행하였다. 상보적인 DNA는 Maxima® First Strand cDNA Synthesis kit (Fermentas, Vilnius, Lithuania)를 사용하여 합성하였다. 유전자 발현 수준은 Power SYBR® Green PCR Master Mix kit (Applied Biosystems, Warrington, UK) 및 StepOneTM 실시간 PCR 시스템 (Applied Biosystems)을 사용하여 측정하였다. 모든 전사물의 발현은 리보솜 L32 발현으로 표준화되었다. RNA 분리 및 qPCR 분석 방법은 달리 기술되지 않는 한 이하 다른 실시예에서도 동일하게 수행되었다.
도 1(A)에 나타난 바와 같이, 알코올 투여 대조군과 비교하여 Cb1r , Cyp7a1 , Cyp27a1, 및 Cyp8b1 mRNA의 상승과 함께 Btg2 및 Yy1의 유전자 발현을 유의하게 향상시켰다.
(2) 담즙산 농도 측정
총 담즙산 수준(total bile acid level)을 Total Bile Acid Assay Kit (Cell Biolabs, Inc., San Diego, CA, USA)를 사용하여 세포 용해물(cell lysate)로부터 분석하였다. 간 및 혈청에서의 담즙산의 농도를 제조자의 프로토콜에 따라 담즙산 L3K 어세이 키트(Bile Acid L3K Assay Kit)(Diagnostic Chemicals Limited, Oxford, CT, USA)를 사용하여 측정하였다. 담즙산 농도 측정 방법은 달리 기술되지 않는 한 이하 다른 실시예에서도 동일하게 수행되었다.
도 1(B) 및 (C)에 나타나 바와 같이, 알코올 섭취는 대조군과 비교하여 간 및 혈청에서 각각 담즙산(BA)의 수준을 유의하게 증가시켰다.
알코올 섭취는 간에서 Btg2 및 Yy1 유전자의 발현을 증가시키고, 이어서 담즙산 합성을 촉진하였다.
실시예 1-2. 2-AG는 Btg2 , Yy1 , 및 담즙산 합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 발현 증가
수컷 C57BL/6 야생형 (WT) 마우스 (Samtako, Osan, 한국) (n=7)에 2-아라키도닐 글리세롤 (2-arachidonoyl glycerol : 2-AG, 5 mg/kg)을 7일 동안 복강주사 투여군과 제외군 등으로 분리하였다.
(1) RNA 분리 및 정량적 실시간 PCR (quantitative real-time PCR : qPCR ) 분석
TRIzol 시약(Invitrogen)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 RNA를 추출하였고, Power SYBR® Green PCR Master Mix kit (Applied Biosystems, Warrington, UK) 및 StepOneTM 실시간 PCR 시스템 (Applied Biosystems)을 사용하여 유전자 발현을 측정하였다. 도 1(D)에 나타난 바와 같이, 2-AG에 대한 노출은 Btg2, Yy1 및 담즙산 합성 효소를 암호화하는 유전자를 유의하게 증가시켰다.
(2) 담즙산 농도 측정
총 담즙산 수준(total bile acid level)을 Total Bile Acid Assay Kit (Cell Biolabs, Inc., San Diego, CA, USA)를 사용하여 분석하였다. 또한, 간 및 혈청에서의 담즙산의 농도를 제조자의 프로토콜에 따라 담즙산 L3K 어세이 키트(Bile Acid L3K Assay Kit)(Diagnostic Chemicals Limited, Oxford, CT, USA)를 사용하여 측정하였다. 도 1(E) 및 (F)에 나타난 바와 같이, 2-AG 처리는 또한 대조군과 비교하여 간 및 혈청에서 각각 담즙산(BA)의 수준을 유의하게 증가시켰다.
2-AG 섭취는 간에서 Btg2 및 Yy1 유전자의 발현을 증가시키고, 이어서 담즙산 합성을 촉진하였다.
실시예 2: 알코올 의존성 담즙산의 합성은 CB1R - BTG2 경로에 의해 매개
(1) 수컷 C57BL/6 야생형 (WT) 마우스 (Samtako, Osan, 한국) (n=7)에 에탄올 (6 g/kg)을 7일 동안 경구 투여로 급여하였다. 다른 군의 수컷 C57BL/6 WT 마우스 (n=7)에 에탄올 (6 g/kg) 투여와 Cb1r의 선택적 길항제인 AM251 (5 mg/kg)을 동일한 방법으로 7일 동안 급여하였다. 에탄올 급여와 AM251 투여 마우스에서 담즙산의 합성에 대한 선택적 Cb1r 길항제인 AM251의 생리적 효과를 측정하였다.
도 2(A)에 나타난 바와 같이, 알코올 유도 Cb1r , Btg2 , Yy1, 및 담즙산 합성 효소의 증가가 AM251에 의해 유의하게 약화되었다.
또한, 도 2(B)에 나타난 바와 같이, 알코올만을 급여한 마우스와 비교시, AM251 노출된 마우스 간 담즙산의 수치가 유의하게 감소하였다. 이로부터 알코올 유도된 담즙산 합성의 조절에서 Cb1r가 중요한 역할을 제시한다.
(2) 알코올성 간 질환에 대한 Btg2의 영향을 확인하기 위해서 Btg2을 과발현시키는 아데노바이러스 전달 시스템(Adenovirus delivery system: Ad-Btg2) (1×109 [pfu]의 단위 투여량)을 이용하였다. 전장 (full-length) Btg2 및 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein: GFP)을 발현하는 아데노바이러스를 제조하였다. Btg2를 코딩하는 cDNA를 pAdTrack-CMV 셔틀 벡터에 삽입하고 AdEasy 시스템으로 재조합 아데노바이러스 플라스미드를 생성하였다. 생성된 재조합 바이러스를 HEK293 세포에서 증폭시키고 제조자의 지시에 따라 Adeno-X Maxi Purification Kit (Clontech Laboratories, Inc., Mountain Views, CA, USA)을 사용하여서 정제하였다. 정제된 재조합 바이러스 (Ad- Btg2)를 수컷 C57BL/6 WT 마우스(Samtako, Osan, 한국)에 7일 동안 꼬리 정맥주사 투여 후 Btg2 유전자를 과발현하였다. qPCR 분석을 통해 마우스의 간에서 Ad-Btg2의 성공적인 전달을 측정하였고, 키트를 사용하여 담즙산 농도를 측정하였다.
도 2(C)에 나타난 바와 같이, 마우스 간에서 Ad- Btg2 투여에 의해 Btg2 , Yy1, Cyp7a1 , Cyp27a1 및 Cyp8b의 발현이 유의하게 증가하였다.
또한, 도 2(D)에 나타난 바와 같이 Ad-Btg2 투여군은 대조군에 비해 담즙산 합성 효소의 발현에 상응하는 간의 담즙산 수치가 유의하게 상승하였다.
(3) 또한, 알코올성 간 질환에 대한 Btg2의 영향을 확인하기 위한 다른 방법으로 Btg2 유전자 기능제어 (knock-down) 시킨 렌티바이러스 (Lentivirus) 전달 시스템 (1×109 [TU]의 단위 투여량)을 이용하였다. 구체적으로 렌티바이러스 매개된 녹다운 Btg2 (lentiviral-mediated knockdown of Btg2) (sh Btg2)을 이용하여 알코올 매개 담즙산 합성에서 Btg2의 역할을 조사하였다. 이를 위해서 Btg2 표적화된 짧은 헤어핀 RNA (short hairpin RNA: shRNA)인 sh Btg2 전달 시스템이 제조된 SMARTvector mouse lentiviral Btg2 렌티바이러스 구매 (Dharmacon, Lafayette, CO, USA) 하여 사용하였다.
정제된 재조합 바이러스 (sh Btg2)를 수컷 C57BL/6 야생형 (WT) 마우스 (Samtako, Osan, 한국)에 꼬리 정맥주사를 통해 Btg2 유전자 기능제어 (knockdown) 시키고, 그 후 7일 동안 알코올 (6 g/kg 체중, n=7)에 노출시켰다. sh Btg2로 감염되었을 때, 간에서 Btg2의 발현이 성공적으로 감소되었다. qPCR 분석을 통해 마우스의 간에서 유전자의 발현을 측정하였고, 키트를 사용하여 담즙산 농도를 측정하였다.
도 2(E)에 나타난 바와 같이, 알코올에 유도된 Btg2 , Yy1 , 및 담즙산 합성 유전자 발현이 내인성 Btg2 유전자 기능제어 (knockdown)에 의해 유의하게 약화되었다.
또한, 도 2(F)에 나타난 바와 같이, 알코올 급여 마우스 간 담즙산 수치의 증가가 Btg2 유전자 기능제어/침묵 (silencing)에 의해 유의하게 감소되었다.
이로부터 알코올에 의해 유도된 담즙산 합성의 조절에서 Btg2가 중요한 역할을 함을 알 수 있다.
실시예 3: 알코올에 의한 담즙산 합성 증가는 Yy1에 의해 매개
(1) 알코올성 간질환에 대한 Yy1의 영향을 확인하기 위해서 Yy1 유전자 기능제어 (knockdown)시킨 렌티바이러스 (Lentivirus) 전달 시스템(1×109 [TU]의 단위 투여량)을 이용하였다. 구체적으로 렌티바이러스 매개된 녹다운 Yy1 (lentiviral-mediated knockdown of Yy1) (sh Yy1)을 이용하여 알코올 매개된 담즙산 합성에서 Yy1의 역할을 조사하였다. 이를 위해서 Yy1 표적화된 짧은 헤어핀 RNA (short hairpin RNA: shRNA)인 sh Yy1 전달 시스템이 제조된 SMARTvector mouse lentiviral Yy1 렌티바이러스 구매 (Dharmacon, Lafayette, CO, USA) 하여 사용하였다.
정제된 재조합 바이러스 (sh Yy1)를 수컷 C57BL/6 WT 마우스 (Samtako, Osan, 한국)에 꼬리 정맥주사를 통해 Yy1 유전자 기능제어 (knockdown) 시키고, 그 후 7일 동안 알코올 (6 g/kg 체중, n=7)에 노출시켰다. sh Yy1로 감염되었을 때, 간에서 Yy1의 발현이 성공적으로 감소되었다. qPCR 분석을 통해 마우스의 간에서 유전자의 발현을 측정하였고, 키트를 사용하여 담즙산 농도를 측정하였다.
도 3(A)에 나타난 바와 같이, 알코올 노출은 Yy1 및 담즙산 합성 유전자의 발현을 유의하게 증가시켰으며, 반면에 Yy1을 억제하면 이러한 효과가 감소하였다.
또한, 도 3(B)에 나타난 바와 같이, 알코올 급여에 급격하게 상승한 담즙산 수치는 내인성 Yy1 유전자 기능제어 (knockdown)에 의해 대조군과 비교하여 유의하게 감소하였다.
(2) 알코올 및/또는 Btg2가 간세포에서 Yy1을 통해 Cyp7a1의 전사활성을 촉진하는지를 확인하기 위하여 Yy1의 소간섭 RNA(small interfering RNA)를 제조하였다. QuikChange II Site-Directed Mutagenesis kit (Stratagene, La Jolla, CA, USA)를 사용 Cyp7a1 유전자 프로모터를 활용 점 돌연변이 (point mutant) 대한 프라이머 (정방향 5'-CCAACTGGGTCTTCTATCCT-3' 및 역방향 5'-AGGATAGAAGACCCAGTTGG-3') 와 Yy1에 대한 소간섭 RNA (small interfering RNA: siRNA) 올리고뉴클레오티드 발현 벡터를 구매 (Bioneer Research, 서울, 한국)하여 사용하였다. 제조자의 프로토콜에 따라 형질감염 시약 올리고펙타민 (Oligofectamine) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 AML-12 세포에 각각 si Yy1 및 si Scramble (Scram)로 형질감염시켰다.
AML-12 세포를 10% 소태아 혈청(fetal bovine serum: FBS), 인슐린-트랜스페린-셀레뉼(insulin-transferrin-selenium: ITS)(Gibco-BRL)), 덱사메타손(dexamethasone) 40 ng/ml (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 및 항생제로 보충한 DMEM/F-12 배지 (Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA)에서, 37°C에서 5% CO2를 함유하는 가습 대기 조건에서 배양하였다. AML-12 세포에 24 시간 동안 Cyp7a1 프로모터 (pGL3-basic vector 클로닝, 전남대학교 최흥식 교수실험실에 제공)와 Btg2를 공동 형질감염 (co-transfection)시키고, 이후 알코올 (50 mM)로 12 시간 동안 처리 하였다. 제조자의 지시에 따라 리포펙타민 2000 시약 (Lipofectamine 2000)(Invitrogen)을 사용하여 일시적인 형질감염 분석(transient transfection assay)을 수행하였다.
도 3(C)에 나타난 바와 같이, Cyp7a1 프로모터 활성은 알코올 및 Btg2 자극에 의해 유의하게 증가되었지만, 반면에 이러한 현상은 Yy1 유전자 기능제어/침묵 (silencing)에 의해 급격하게 감소되었다.
(3) Cyp7a1 프로모터에서 알코올 반응성 영역을 결정하기 위해 Cyp7a1 유전자 프로모터의 일련의 결실 구조물 (serial deletion construct, pGL3-basic vector 클로닝, 전남대학교 최흥식 교수실험실)을 제공 받았다. 제조자의 프로토콜에 따라 리포펙타민 2000 시약 (Lipofectamine 2000) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 AML-12 세포에 mCyp7a1 리포터 벡터 (reporter vector)의 야생형 (wild type) 및 결실형 (deletion form)을 24시간 동안 형질감염시키고, 알코올 (50 mM)로 12 시간 동안 처리 하였다. 제조자의 지시에 따라 을 사용하여 일시적인 형질감염 분석(transient transfection assay)을 수행하였다.
도 3(D)에 나타난 바와 같이, Cyp7a1의 전사 활성은 알코올에 반응하여 -1500bp까지 연속적으로 유지되었고 -1200bp 구조물에서 완전히 소실되었다. 이로부터 알코올 반응성 요소가 Cyp7a1 유전자 프로모터의 -1500 내지 -1200 사이에 위치함을 알 수 있다. 전사 인자 결합을 이용한 이 영역의 in silico 분석은 YY1 결합 부위(YY1-binding site)의 존재를 나타내었다.
(4) Cyp7a1 유전자 프로모터에서 YY1 결합 영역의 기능적 중요성을 조사하기 위해서 Yy1과 발현유무의 차이를 나타내는 Cyp7a1 유전자 프로모터의 야생형 및 YY1 결합 영역 mCyp7a1-Luc의 점 돌연변이 (point mutant) 형태를 QuikChange II Site-Directed Mutagenesis kit (Stratagene, La Jolla, CA, USA)를 사용하여 제작하였다. AML-12 세포를 야생형 또는 돌연변이 형태의 Cyp7a1 리포터 유전자 및 Yy1으로 24 시간 동안 공동 형질감염 (co-transfection)시키고 알코올 (50 mM)을 12 시간 동안 처리 하였다. 루시페라제(Luciferase) 활성을 β-갈락토시다아제(β-galactosidase)의 활성으로 정규화하여 형질감염 효율을 보정 하였다.
도 3(E)에 나타난 바와 같이, Cyp7a1의 프로모터 활성은 알코올 노출 또는 Yy1 과발현에 의해 유의하게 증가되었지만, 돌연변이 Cyp7a1 프로모터 활성은 증가되지 않았다.
(5) Cyp7a1 유전자 프로모터에서 YY1 단백질의 동원 (recruitment)을 더 확인하기 위해서 알코올 급여 마우스 (6 g/kg)의 간에서 anti-YY1 항체를 사용하여 In vivo 염색질 면역침강 (chromatin immunoprecipitation: ChIP) 분석을 수행하였다. WT 마우스에 7일 동안 알코올을 경구 투여하였다. 입력(input)은 정제된 DNA의 10%를 나타낸다. 가용성 염색질(chromatin)을 anti-YY1 항체를 사용하여 면역침전시켰다. 정제 후 DNA 추출물을 Cyp7a1 유전자 프로모터의 근위(proximal) (-1300/-1100 bp) 및 원위(distal) (-2000/-1800 bp) 영역에 대한 2쌍의 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 정량화하였다.
PCR에 사용된 특정 프라이머는 다음과 같다:
근위, 정방향 5′-TCTCTCCACTCTATATGAAG-3′ 및 역방향 5′-GCATTGGAAAGACATTTCCA-3′
원위, 정방향 5′-TGATGTTAATGATTATAGTC-3′ 및 역방향 5′-CAGCCCATCAACTAATTCTT-3′.
도 3(F)에 나타난 바와 같이, 근위(proximal: Pro) 영역의 내인성 YY1은 알코올 노출에 의해 유의하게 상승하였다. 그러나 이러한 현상은 Cyp7a1 유전자 프로모터의 비특이적 원위(distal: Dis) 영역에서는 제거되었다. 이로부터 YY1이 알코올 자극된 담즙산 합성을 매개하는 것을 알 수 있다.
실시예 4: 멜라토닌에 의한 알코올 급여 마우스 간에서 BTG2 유전자 발현과 담즙산 합성의 감소
(1) 멜라토닌이 알코올에 의한 Btg2 , Yy1, 및 담즙산 합성 유전자의 조절에 관여하는지 확인하기 위하여, 알코올 급여 마우스에서 멜라토닌의 생리학적 역할을 평가하였다. 만성 알코올 간 질환 모델에서 8주령의 수컷 C57BL/6 야생형(WT) 마우스 (Samtako, Osan, 한국)를 3군으로 나누었다: 1) 말토오스 덱스트린을 함유하는 대조군 액체를 4주 동안 경구 위관 영양법(oral gavage)으로 투여한 군(n=7); 2) 5% 알코올(에탄올)(총 칼로리의 36%)을 함유하는 리버-디칼리 (Lieber-DeCarli) 알코올 식이 방법(Research Diets, New Brunswick, NJ, USA)를 4주 동안 경구 위관 영양법으로 투여한 군(n=7); 3) 4주 동안 리버-디칼리 액체를 투여하고 마지막 2주 동안에는 오전 9시에 멜라토닌 10 mg/kg을 경구 위관 영양법으로 함께 투여한 군(n=7).
qPCR 분석을 통해 마우스 간에서 유전자 발현을 측정하였고, 키트를 사용하여 담즙산 농도를 측정하였다. 도 4(A)에 나타난 바와 같이, 알코올에 의해 증가된 Btg2, Yy1, 및 담즙산 합성에 관여하는 유전자의 발현이 멜라토닌 처리에 의해 급격히 감소되었다.
(2) 단백질을 간 조직으로부터 추출하고 웨스턴 블롯(Western blot)을 사용하여 측정하였다. 마우스로부터 간 조직 추출물을 수확하고 표지된 항체로 웨스턴 블롯하여 분석하였다. 구체적으로 막(membrane)을 BTG2, YY1, CYP7A1, 및 β-actin(SantaCruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)에 대한 항체로 탐침(probe)한 다음, ECL 웨스턴 블롯 검출 키트(ECL Western blot detection kit (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ, USA)를 사용하여 측정하였다.
도 4(B)에 나타난 바와 같이, 알코올만을 급여한 마우스와 비교하여 멜라토닌을 처리한 마우스에서는 BTG2, YY1, 및 CYP7A1 단백질의 수준이 현저하게 완화됨을 알 수 있다.
(3) 또한, 알코올 유도된 담즙산 대사가 멜라토닌에 의해 영향을 받는다는 것을 확인하기 위하여 멜라토닌을 알코올 급여 마우스에 투여한 결과, 도 4(C)에서와 같이 멜라토닌의 처리는 대조군과 비교하여 알코올 매개된 담즙산 생산의 자극을 현저하게 감소시켰다. 이로부터 알코올 매개된 담즙산 합성이 멜라토닌에 의해 약화됨을 알 수 있다.
실시예 5: 멜라토닌에 의한 Btg2 , Yy1 , 및 Cyp7a1 mRNA의 감소는 miR -497에 의존적임
8주령의 수컷 C57BL/6 WT (야생형) 마우스 (Samtako, Osan, 한국)을 2군으로 나누었다: 1) 말토오스 덱스트린을 함유하는 대조군 액체를 4주 동안 경구 위관 영양법 (oral gavage)으로 투여한 군 (n=7); 2) 4주 동안 대조군 액체를 급여하고 마지막 2주 동안에는 오전 9시에 멜라토닌 10 mg/kg을 보충한 알코올을 경구 위관 영양법으로 함께 급여한 군 (n=7)으로 분리하였다.
도 5(A)에 나타난 바와 같이, 멜라토닌에 의해 miR-497의 발현이 유의하게 증가한 반면에, miR-374 및 miR-3195 의 발현에는 유의적인 변화가 없었다.
또한, 상기 일차 마우스 간세포 (primary mouse hepatocyte: PMH)에 각각 microRNA-497 모방체 (mimic) (Pre-miR-497, MC11293) 또는 miRNA 모방체 음의 대조군 (mimic negative control, Pre-miR-Con, AM17110)을 Ambion (Austin, TX, USA)으로부터 구입하여 형질감염시키고, qPCR을 사용하여 분석하였다. 구체적으로 총 RNA를 다양한 조건의 마우스 일차 간세포(primary hepatocyte) 또는 간 조직으로부터 TRIzol 시약(Invitrogen)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 추출하였고, qPCR 분석을 수행하였다. 상보적인 DNA는 Maxima® First Strand cDNA Synthesis kit (Fermentas, Vilnius, Lithuania)를 사용하여 합성하였다. 유전자 발현 수준은 Power SYBR® Green PCR Master Mix kit (Applied Biosystems, Warrington, UK) 및 StepOneTM 실시간 PCR 시스템 (Applied Biosystems)을 사용하여 측정하였다. miRNA 분석을 위해 제조자의 지침에 따라 총 RNA를 miRNeasy isolation kit (Qiagen)를 사용하여 분리하였다. miRNA의 발현은 제조자의 지침에 따라 qPCR 분석을 사용하여 측정하였다. 모든 miRNA의 발현이 U6 소형 핵 RNA(small nuclear RNA) 발현을 통해 정상화되었다.
도 5(B)에 나타난 바와 같이, qPCR 분석 결과 Pre-miR-497을 형질감염 시킨 일차 간세포에서 miR-497가 현저하게 과발현되었다.
또한, 도 5(C)에 나타난 바와 같이, miR-497의 과발현은 대조군과 비교하여 Btg2, Yy1 , 및 Cyp7a1의 mRNA 발현을 현저하게 감소시켰다.
이로부터 일차 간세포(PMH)에서 멜라토닌이 miR-497의 발현을 촉진함으로써, Btg2, Yy1 , 및 Cyp7a1 발현을 억제함을 알 수 있다.
또한, 멜라토닌 매개 Cyp7a1 발현 감소에 miR-497가 중요한 역할을 하는 것을 확인하기 위하여 PMH에 miR-497 억제제 (Anti-miR-497, AM11293), 및 miR-497 억제제 음의 대조군 (miR-497 inhibitor negative control)(Anti-miR-Con, AM17010)을 Ambion (Austin, TX, USA)으로부터 구입하여 형질감염시키고, qPCR을 사용하여 분석하였다.
도 5(D)에 나타난 바와 같이, 일차 간세포(PMH)에서 anti-miR-497에 의해 miR-497가 현저하게 억제되었다.
또한, Anti-miR-497 또는 Anti-miR-Con로 형질감염시킨 일차 간세포 (PMH)에 멜라토닌 (500 μM)을 12시간 동안 처리하였다. 도 5(E)에 나타난 바와 같이, 멜라토닌은 대조군에 비해 miR-497 발현을 유의하게 증가시키고, Btg2 , Yy1 , 및 Cyp7a1 유전자 발현을 완전히 억제하였다. 또한, 이러한 현상은 anti-miR-497에 의해 역전되었다.
이로부터 멜라토닌은 miR-497 의존 경로를 통해 담즙산 합성에 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있다.
실시예 6: 알코올 유발성 담즙산 생산은 멜라토닌- miR - 497 축 (신호전달 네트워크)에 의해 매개
멜라토닌-miR-497 축 (melatonin-miR-497 axis)이 알코올 유발성 담즙산의 생산 조절에 관여 하는지를 알아보기 위하여 알코올과 멜라토닌 모두에 노출된 일차 간세포 (PMH)에서 miR-497의 역할을 평가하였다. PMH에 각각 pre-miR-Con (AM17110) 및 pre-miR-497 (MC11293)을 형질감염시켰다. 24시간 동안 형질감염 시킨 세포에 알코올 50 mM 및/또는 멜라토닌 500 μM을 12시간 동안 처리하였다. 간세포로부터 총 RNA를 추출하여서 qPCR 분석을 수행하였다. 유전자 발현 수준은 Power SYBR® Green PCR Master Mix kit (Applied Biosystems, Warrington, UK) 및 StepOneTM 실시간 PCR 시스템 (Applied Biosystems)을 사용하여 측정하였다.
도 6(A)에 나타난 바와 같이, 알코올에 의해 Btg2 , Yy1 , 및 Cyp7a1 mRNA의 수치가 증가되었으나 이와 같은 효과는 멜라토닌 또는 miR-497에 의해 현저하게 감소되었다.
또한, 담즙산 생산을 측정하기 위해서 간 세포를 수집하였다. 도 6(B)에 나타난 바와 같이, 멜라토닌과 miR-497에 의한 담즙산 생산의 감소 효과는 탁월하였다.
마찬가지 방법으로 PMH에 anti-miR-Con (AM17010) 및 anti-miR-497 (AM11293)을 형질감염시키고, 24시간 동안 형질감염 시킨 일차 간세포에 알코올 50 mM 및/또는 멜라토닌 500 μM을 12시간 동안 처리하였다. 간세포로부터 총 RNA를 추출하여서 qPCR 분석을 수행하였고, 담즙산 생산을 측정하였다.
도 6(C)에 나타난 바와 같이, 이러한 알코올에 의해 증가된 Btg2 , Yy1 , 및 Cyp7a1 mRNA 수준의 멜라토닌 억제 효과는 anti-miR-497 (항-miR-497)에서 완전히 파괴되었다. 또한, 도 6(D)에 나타난 바와 같이, 알코올에 의해 증가된 총 담즙산 수준의 멜라토닌 감소 효과도 anti-miR-497로 miR-497을 억제함으로써 현저하게 무효화되었다.
이로부터 멜라토닌-miR-497 신호 전달 네트워크가 알코올 의존 경로를 경감시킴으로써 간 대사 장애를 개선한다는 것을 알 수 있다. 또한, 일차 간세포에서 알코올 유발성 담즙산의 생산이 멜라토닌-miR-497 축에 의해 매개됨을 알 수 있다.
도 7은 상술한 알코올 유도성 담즙산 합성에 대한 멜라토닌과 miR-497의 역할을 나타내는 모델이다. 알코올성 간 질환의 주요한 요인이 되는 알코올은 CB1R-BTG2-YY1 신호전달 네트워크를 촉진시킴으로써 CYP7A1 유전자의 발현을 높이고 결과적으로 담즙산 합성을 증가시킨다. 또한, 멜라토닌은 miR-497의 발현을 증진시킴으로써 알코올로 자극되는 담즙산 합성을 상당히 개선시킬 수 있다.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation of Kyungpook National University <120> Composition comprising microRNA-497 for preventing or treating of alcoholic liver diseases and screening method of screening thereof <130> PN117016 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mature sequence mmu-miR-497a-5p <400> 1 cagcagcaca cugugguuug ua 22 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mature sequence mmu-miR-497a-3p <400> 2 caaaccacac ugugguguua g 21 <210> 3 <211> 84 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Stem-loop sequence mmu-mir-497a <400> 3 ccugcccccg ccccagcagc acacuguggu uuguacggca cuguggccac guccaaacca 60 cacuguggug uuagagcgag ggua 84

Claims (19)

  1. 마이크로RNA-497(microRNA-497, miRNA-497) 또는
    a) miRNA-497의 성숙한 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
    b) miRNA-497의 pre-miRNA(전구체) 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및
    c) miRNA-497의 pri-miRNA(초기전사체) 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 알코올성 담즙정체성 간질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 삭제
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1, 서열번호 2, 또는 이들의 조합된 서열을 포함하는 것인 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3의 서열을 포함하는 것인 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 바이러스성 벡터 또는 비바이러스성 벡터에 의해 전달되는 것인 조성물.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 바이러스성 벡터는 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노부속바이러스(Adeno-associated Virus: AAV), 레트로바이러스(Retrovirus), 또는 렌티바이러스(Lentivirus)인 조성물.
  7. 청구항 5에 있어서, 상기 비바이러스성 벡터는 지질 전달체 또는 고분자 전달체인 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 miRNA-497은 멜라토닌에 의해 발현이 촉진되는 것인 조성물.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 miRNA-497은 담즙산의 합성을 억제하는 것인 조성물.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 miRNA-497은 CB1R-BTG2-YY1 신호전달 경로를 저해하는 것인 조성물.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 비경구, 경구, 경피, 피내, 근육내, 정맥, 피하, 복강내, 지속성 방출, 제어된 방출, 지연된 방출, 좌약, 흡입, 카테터(catheter), 또는 설하 투여 또는 간 조직으로의 직접 주사를 위해 제제화되는 조성물.
  14. 시험관 내에서 마이크로RNA-497(microRNA-497, miRNA-497)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 세포에 피검물질을 처리하는 단계; 및
    피검물질이 처리된 단리된 세포에서 miRNA-497의 발현을 분석하고, 피검물질을 처리하지 않은 단리된 대조군 세포의 miRNA-497의 발현 양상과 비교하는 단계;를 포함하는 알코올성 담즙정체성 간질환 치료제의 스크리닝 방법.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 miRNA-497은 멜라토닌에 의해 발현이 촉진되는 것인 알코올성 담즙정체성 간질환 치료제의 스크리닝 방법.
  16. 청구항 14에 있어서, 상기 miRNA-497은 담즙산의 합성을 억제하는 것인 알코올성 담즙정체성 간질환 치료제의 스크리닝 방법.
  17. 청구항 14에 있어서, 상기 miRNA-497은 CB1R-BTG2-YY1 신호전달 경로를 저해하는 것인 알코올성 담즙정체성 간질환 치료제의 스크리닝 방법.
  18. 삭제
  19. 삭제
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ONCOLOGY LETTERS 11: 1081-1088, 2016

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