KR20110065568A

KR20110065568A - 마이크로ｒｎａ-196의 과발현을 이용한 간염 ｃ 바이러스 감염 치료

Info

Publication number: KR20110065568A
Application number: KR1020117010438A
Authority: KR
Inventors: 허버트 엘. 본코브스키; 웨이홍 호우
Original assignee: 샬롯테-맥클렌버그 하스피털 오쏘러티 두잉 비지니스 에즈 카롤리나스 메디컬 센터
Priority date: 2008-10-08
Filing date: 2009-10-08
Publication date: 2011-06-15
Also published as: JP2012505233A; AU2009302344A2; AR073800A1; CN102257140A; EP2352829A1; CA2739948A1; BRPI0914060A2; WO2010042683A1; MX2011003813A; AU2009302344A1

Abstract

본 발명은 HCV 감염 세포를 miRNA-196 유사체로 형질감염시킴으로써 HCV 감염 세포 및 HCV 감염 포유동물을 치료하는 방법에 관한 것이다. miRNA-196 유사체는 Bach1 단백질 및 HCV 유전자 발현을 현저히 하향 조절시키면서, 또한 HMOX1 유전자 발현을 상향 조절한다. miRNA-196은 Bach1 mRNA의 3'-UTR과 결합하여 Bach1 의 발현을 감소시킨다. 이와 같이, miRNA-196은 간세포 내 HCV 복제 및 HMOX1/Bach1 발현의 조절에 있어서 중요한 역할을 한다. 본 발명은 또한 Bach1 및 HCV 유전자 발현이 하향 조절되면서 HMOX1 발현이 증가되도록 하는 치료적 유효량의 miRNA-196을 포함하는 HCV를 발현하는 세포의 치료용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 miRNA-196 유사체를 HCV 단백질을 발현하는 간세포 내로 형질감염시킬 수 있도록 적용될 수 있다.

Description

마이크로ＲＮＡ-196의 과발현을 이용한 간염 Ｃ 바이러스 감염 치료{TREATING HEPATITIS C VIRUS INFECTION WITH OVER-EXPRESSION OF MICRORNA-196}

정부 지원 연구 또는 개발

본 발명은 NIH/NIDDK에 의한 지원번호 RO1-DK38825 하에 미국 정부 지원으로 행하여졌다. 미국 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 가진다.

본 발명은 일반적으로 간염 C 감염 치료 방법 및 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 Bach1 및/또는 HCV의 조절에 관한 것이다. Bach1 및 HCV NS5A 단백질은 miR-196에 의하여 하향 조절될 수 있으며, 동시에 HMOX1를 상향 조절할 수 있다.

간염 C 바이러스(HCV)는 플라비비리다에(Flaviviridae ) 과에 속하는 작고 (50 nm 크기) 엔빌로프된 단일가닥 RNA 바이러스이다. 간염 A 바이러스, 간염 B 바이러스, 및 간염 C 바이러스는 모두 간 염증을 야기시키므로 유사한 명칭을 가지나, 각각은 유전자 상으로 및 임상적으로 구분되고 상이한 바이러스이다. HCV는 간염 C로 알려진 혈액 매개 (즉, 혈액 대 혈액 접촉에 의하여 확산되는) 감염증을 야기시킨다. 상기 감염은 종종 증상이 없으나, 일단 발생하면 만성 감염이 간의 염증(만성 간염)을 야기시킬 수 있다. 이러한 증상은 간의 반흔 (섬유증) 및 진행성 반흔(간경병증)으로 진행될 수 있다. 일부 경우에, 간경병증은 간부전 또는 간암을 포함하는 기타 간경병증의 합병증으로 진행될 수 있다.

급성 간염 C는 HCV 감염 후 최초 6 개월을 의미한다. 감염된 사람의 60% 내지 70% 정도가 급성기 동안 증상을 나타내지 않는다. 급성기 증상을 경험한 소수의 환자에서는, 일반적으로 온화하고 비특이적이며 간염 C의 특정 진단을 거의 초래하지 않는다. 급성 간염 C 감염의 증상은 식욕 감소, 피곤함, 복통, 황달, 소양감 및 독감과 유사한 증상들을 포함한다. HCV는 대개 감염 후 1 내지 3 주 이내에 혈액 내에서 검출가능하며, 그 바이러스에 대한 항체는 일반적으로 3 내지 12 주 이내에 검출가능하다. HCV 감염된 사람의 대략 15-40%가 알라닌 아미노전이효소(ALT) & 아스파테이트 아미노전이효소(AST) 정규화, 및 혈장 HCV-RNA 제거 (자발적 바이러스 제거)와 같은 간기능검사(LFTs)에서 정규화에 의하여 입증된 바와 같이 급성기 동안 그들의 신체로부터 바이러스를 제거한다. HCV 감염된 환자 중 나머지 60-85%는 만성 간염 C(CHC)를 발병한다.

만성 감염 C는 6 개월 이상 동안 지속되는 HCV 감염으로 정의된다. 만성 간염 C의 자연 경과는 사람마다 상당히 다르다. 거의 모든 HVC 감염된 사람이 간 조직 검사에서 염증의 증거를 가진다. 그러나, 간 반흔(섬유증)의 진전율은 개인에 따라 상당한 변동을 나타낸다. 최근의 데이터는 치료되지 않은 환자 중에 대략 3분의 1이 20년 이내에 간경병증으로 진전됨을 시사한다. 나머지 3분의 1은 30년 이내에 간경병증으로 진전된다. 간 질환에 특이적인 증상은 전형적으로 간 반흔이 상당히 일어날 때까지 나타나지 않는다. 그러나, 간염 C는 전신 질환이며, 환자는 진행성 간 질환의 발병 이전에 무증상으로부터 많은 증상을 나타내는 질환에 이르기까지 광범위한 임상적 징후를 경험할 것이다. 만성 간염 C와 관련된 일반화된 신호 및 증상은 피곤함, 현저한 체중 감소, 독감과 유사한 증상, 근육통, 관절 통증, 간헐적 저열, 소양감, 수면 장애, 복통 (특히 우상 사분면 내), 식욕 변화, 구역질, 설사, 소화 불량, 인지 기능 장애, 우울증, 두통 및 기분의 두드러진 변화를 포함한다.

일단 만성 간염 C가 간경병증으로 진전되면, 감소된 간 기능 또는 문맥고혈압으로 알려진 증상인 간 순환 내에 증가된 압력에 의하여 일반적으로 야기되는 신호 및 증상들이 나타날 수 있다. 간경화의 가능한 신호 및 증상들은 복수 (복부 내 액체 축적), 타박상 및 출혈 경향, 골통, 정맥류 (특히 위 및 식도 내 확대된 정맥), 지방변, 황달, 및 간성뇌증으로 알려진 인지기능 장애 증상을 포함한다.

만성 간염 C는 다른 형태의 간염보다, 갑상선기능항진 또는 갑상선기능저하를 가지는 갑상선염 (갑상선의 염증), 만발성 피부 포르피린증, 저온 글로불린혈증 (소혈관 염증 형태), 사구체신염 (신장의 염증), 특히 막성증식성 사구체신염 (MPGN)과 같은 HVC의 존재와 관련된 간외 징후로 인하여 진단된다. 간염 C는 또한 건조 증후군 (sicca syndrome), 혈소판감소증, 편평태선, 당뇨병, 및 B-세포 림프세포 증식질환과 관련이 있다.

간염 C 바이러스 감염은 전세계적인 건강 문제이며, 이를 위한 백신은 현재 유용하지 않다. 현재 만성 간염 C(CHC)의 표준 치료법은 페그 인터페론(IFN)과 리바비린의 조합이나, 단지 약 50%의 환자만이 이러한 치료에 반응한다. 부가적으로, 이러한 치료는 고비용이고, 연장되며 수많은 바람직하지 않은 부작용을 수반한다. 전세계적으로 1억 5천 내지 2억으로 추정되는 사람들이 간염 C에 감염되어 있다.

따라서, HCV를 표적으로 하고 모든 형태의 간염 C의 치료를 위한 항바이러스 요법 및 절차를 발견하고 개발할 필요가 있다.

발명의 개요

본 발명은 간염 C 바이러스 단백질을 발현하는 인간 간암 세포 내 Bach1 단백질 발현 수준을 감소시켜 HCV 감염 세포 또는 포유동물을 치료하는 방법을 제공함으로써 상기 요구 중 적어도 일부를 충족시킨다. Bach1 단백질 발현 수준 감소는 상기 세포를 miRNA-196 유사체(mimic)로 형질감염시켜 miRNA-196이 Bach1 mRNA의 3'-UTR에 결합하도록 하여 Bach1 발현을 감소시킴으로써 달성될 수 있다. 상기 miRNA는 단지 상기 Bach1 mRNA의 3'-UTR과 효과적으로 결합하기 위한 매칭되는 "시드 영역"을 포함할 것을 필요로 할 뿐이다. 바람직하게, 상기 miRNA는 상향 조절 또는 과발현되어 Bach1 발현 수준 감소를 증가시킨다. 상기 miRNA-196 수준은 miRNA 경로에 들어가 성숙한 miRNA-196으로서 작용하는 합성된 miRNA 유사체에 의하여 상향 조절된다.

HCV 감염된 포유동물은 또한 HCV 비구조 단백질을 발현하는 세포 내 HMOX1 유전자 발현을 상향 조절함으로써 치료될 수 있다. 다양한 구현예에서, HMOX1 유전자 발현의 상향 조절은 상기 세포 내 Bach1 유전자 발현의 하향 조절을 수반한다. 이와 같이, miRNA-196은 HMOX1을 음성적으로 조절하는 Bach1과 결합함으로써 간접적으로 HMOX1를 상향 조절한다. 각각의 조절은 상기 세포를 miRNA-196 유사체로 형질감염시킴으로써 달성될 수 있다. 부가적으로, 간세포와 같은 HCV 감염된 세포는 상기 세포를 miRNA-196 유사체로 형질감염시켜 감염된 세포 내 HCV 발현을 감소시킴으로써 치료될 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 miRNA-196 유사체를 포유동물에 투여하여 HCV 감염 세포를 miRNA-유사체로 형질감염시킬 수 있도록 적용되는 약학적 조성물을 제공한다. 이러한 조성물의 투여는 간세포 내 Bach1의 발현을 번역 억제하고, HMOX1을 상향 조절하고, HCV 복제를 조절한다.

중요한 것은, 본 발명이 Bach1 유전자 발현의 하향 조절, HMOX1 유전자 발현의 상향 조절, 및 HCV 유전자 발현의 하향 조절을 유도하는, Bach1의 3'-UTR 내 기능적 miRNA-196 결합 부위를 입증한다는 것이다. miRNA-196의 이용은 HCV 감염 세포 및 간염 C(예를 들어, 만성 HCV 감염)를 가지는 포유동물, 및 아마도, 증가된 산화 스트레스를 특징으로 하는 기타 질환들을 치료하기 위한 신규한 부가적인 치료법을 제공한다.

감염된 세포 각각, 또는 이와 같이 감염된 세포를 가지는 포유동물을 본 발명의 구현예에 따른 조성물로 처리하여, 치료학적 유효량의 miRNA-196 유사체의 투여에 따라 Bach1 및 HCV NS5A 단백질 발현 수준의 현저한 감소 및 HMOX1 수준 증가를 제공할 수 있다.

본 발명은 일반적 용어로 기재되었으며, 첨부하는 도면을 참조로 하며, 도면들은 반드시 일정한 비율로 도시된 것은 아니다.
도 1a는 miR-196과 표적화된 첫번째 추정 Bach1 3'-UTR 간의 첫번째 시드 영역 매치를 개략적으로 도시한다.
도 1b는 miR-196과 표적화된 추정 Bach1 3'-UTR 간의 두번째 시드 영역 매치를 개략적으로 도시한다.
도 2a는 miRNA-196 유사체로 형질감염과 관련된 하향 조절된 Bach1 단백질 수준을 예시한다.
도 2b는 miRNA-196 억제제로 형질감염과 관련된 상향 조절된 Bach1 단백질 수준을 예시한다.
도 2c는 miRNA-196 유사체 형질감염에 의하여 변경되지 않은 Bach1 mRNA 수준을 도시한다.
도 3a는 miRNA-196 유사체와 관련된 HMOX1 mRNA 수준의 상향 조절을 예시한다.
도 3b는 miRNA-196 유사체로의 형질감염은 Cullin 3 mRNA 수준을 변경시키지 않음을 도시한다.
도 4a는 miRNA-196 유사체로의 형질감염과 관련된 HCV NS5A 단백질 수준의 하향 조절을 예시한다.
도 4b는 miRNA-196 억제제로의 형질감염과 관련된 HCV NS5A 단백질 수준의 상향 조절을 예시한다.
도 4c는 Con 1 (서브타입 1b) 전장 레플리콘 세포 내 miRNA-196 유사체로 형질감염에 의한 HCV NS5A 및 코어 mRNA 수준의 하향 조절을 도시한다.
도 5a는 miRNA-196에 대한 두 개의 Bach1 3'-UTR 시드 매치 부위를 도시한다.
도 5b는 pGL3-Bach1, pGL3-Bach1, pRL-TK (renilla) 및 miR-196 유사체 또는 Lipofectamine 2000에 의한 억제제로의 동시형질감염에 이용되는 반딧불이(firefly) 루시퍼라아제 (f- luc) 리포터 구조물의 개략적 묘사를 예시한다.
도 5c는 miRNA-196 유사체가 pGL3-Bach1 리포터의 f- luc 활성을 억제함을 보인다.
도 5d는 miRNA-196 억제제가 pGL3-Bach1 리포터의 f- luc 활성을 약간 증가시킴을 보인다.
도 6a는 Bach1 3'-UTR의 두 개의 시드 매치 부위 내 네 개의 뉴클레오티드의 교체를 예시한다.
도 6b는 miRNA-196 유사체가 돌연변이 pGL3-Bach1 또는 pGL3-Bach1, pRL-TK (renilla), 및 miR-196 유사체로 동시형질감염된 세포 내에서 pGL3-Bach1-WT의 f-luc 활성을 감소시키나 pGL-Bach1-Mut 리포터의 f- luc 활성을 감소시키지 않음을 예시한다.
도 6c는 miR-155 유사체가 pGL3-Bach1 또는 pGL3-Bach1, pRL-TK (renilla), 및 miR-155 유사체로 동시형질감염된 세포 내에서 pGL3-Bach1-WT 및 pGL-Bach1-Mut 리포터 모두의 f- luc 활성을 감소시킴을 예시한다.
도 7a는 miRNA-196의 시드 매치 부위에 도입된 네 개의 뉴클레오티드 돌연변이를 예시한다.
도 7b는 pGL3-Bach1, pRL-TK 및 증가하는 농도의 유사체 음성 대조군 miR-196 또는 돌연변이 miR-196으로 동시형질감염된 세포의 루시퍼라아제 활성을 도시한다.
도 8a는 돌연변이 miRNA-196 및 돌연변이 Bach1 3'-UTR 사이의 시드 매치의 복구를 예시한다.
도 8b는 돌연변이 리포터 (pGL3-Bach1-Mut), pRL-TK, 및 돌연변이 miRNA-196 또는 야생형 miRNA-196 유사체로 동시형질감염된 세포의 48 시간 동안 측정된 루시퍼라아제 활성을 도시한다.
도 9a는 J6/JFH1 RNA로 형질감염된 Huh-7.5 세포 내에서 miRNA-196 유사체에 의한 HCV J6/JFH1 RNA 수준의 하향 조절을 도시한다.
도 9b는 배양 상청액 내로 분비된 J6/JFH1 간염 C 바이러스로 감염된 Huh-7.5 세포 내를 도시한다.
도 9c는 배양 상청액 내로 분비된 J6/JFH1 간염 C 바이러스로 감염된 Huh-7.5 세포 내에서 miRNA-196 유사체에 의한 HCV J6/JFH1 단백질 수준의 하향 조절을 도시한다.

본 발명은 이하 첨부하는 도면을 참조로 하여 보다 상세하게 기재될 것이며, 도면에는 본 발명의 일부 구현예가 도시되나 모든 구현예가 도시되는 것은 아니다. 과연, 본 발명은 많은 상이한 형태로 구현될 수 있고, 본원 명세서에 기재된 구현예에 제한되는 것으로 해석되지 않아여 하며; 그보다, 이들 구현예는 본원의 개시가 출원가능한 법적 요구조건을 충족시킬 수 있도록 제공되는 것이다.

간염 C 바이러스(HCV)는 간세포 내에서 산화 스트레스를 직접적으로 유도하는 것으로 인정되어 왔다. 또한, 힘(heme) 옥시게나아제 1(HMOX1)은 항산화 및 항염증 활성을 가지는 주요 세포보호 효소인 것으로 인정되어 왔다. 이와 같이, HMOX1의 존재 또는 이용은 HCV에 의하여 유도되는 산화 스트레스를 무효화하거나 완화시키기 위한 수단으로 여겨질 수 있다. 그러나, Bach1, 기본 루신 지퍼 (bZip) 포유동물 전사 억제제는 HMOX1을 음성적으로 조절한다. 따라서, Bach1 수준 감소는 단독으로 또는 증가된 HMOX1 수준과 결합되어 간염 C의 예방 또는 완화를 잠재적으로 유도할 수 있다.

Bach1는 cap'n'collar 타입의 기본 영역 루신 지퍼 인자 패밀리 (CNC-bZip)에 속하는 전사 인자를 인코딩하는 유전자이다. 인코딩된 단백질은 넓은 복합체, 트램 트랙, bric-a-brac/폭스바이러스 및 아연 핑거 (BTB/POZ) 도메인을 포함하며, 이는 CNC-bZip 패밀리 일원에 이례적이다. 이러한 BTB/POZ 도메인은 단백질-단백질 상호 작용 및 호모- 및/또는 헤테로-올리고머의 형성을 촉진시킨다. 이러한 인코딩된 단백질이 MafK와 헤테로다이머를 형성할 때, 이는 Maf 인식 요소(MARE)의 억제제로 작용하며 전사가 억제된다. 보다 구체적으로, Bach1는 HMOX1 유전자 발현을 음성적으로 조절하는 HMOX1의 포유동물 전사 억제제이다. Bach1은 Maf-관련 옹코진 패밀리와 길항 헤테로다이머를 형성한다. 이러한 헤테로다이머는 Maf 인식 요소 (MAREs)에 결합하여 Maf-함유 헤테로다이머에 반응하는 유전자 (예를 들어, HMOX1 및 NQO1) 및 기타 양성 전사 인자의 발현을 억제한다.

miRNAs는 일반적으로 유전자 발현의 중요한 조절자인 것으로 간주되는 비-코딩 RNAs(~22 nt)이다. 본 발명 이전에, microRNAs가 Bach1 또는 HCV를 조절하는지 여부 및 어떻게 조절하는지는 거의 알려지지 않았다. 본 발명은 최초로 miRNA-196이 Bach1 mRNAs의 3'-UTR에 직접적으로 작용하여 상기 단백질의 발현을 번역 억제하고 HMOX1을 상향 조절함을 인식하였다. 부가적으로, miR-196은 또한 HCV NS5A 단백질 발현을 억제한다. 따라서, miRNA-196은 간세포 내 HCV 복제 및 HMOX1/Bach1 발현의 조절에 있어서 아마도 심지어 결정적으로 중요한 역할을 한다. 따라서, HCV 감염 세포 또는 간염을 가지는 포유동물을 miRNA-196 유사체를 투여하여 감염된 세포를 miRNA-196 유사체로 형질감염시킴으로써 치료할 수 있다. 바람직하게, miRNA-196의 과발현 및 감염된 세포 내로 그 형질감염은 간염 C 감염을 예방 또는 완화하기 위한 접근법을 이롭게 제공한다. 일 구현예에서, miRNA-196의 수준은 miRNA 경로에 들어가 성숙 miRNA-196으로서 작용하는 합성된 miRNA 유사체에 의하여 상향 조절된다.

상기한 바와 같이, miRNAs는 일반적으로 유전자 발현의 중요한 조절자인 것으로 간주되는 작은 비-코딩 RNAs(~22 nt)이다. 보다 구체적으로, miRNAs는 약 21-23 뉴클레오티드 길이의 단일 가닥 RNA 분자로, 주로 번역 억제를 통하여 유전자 발현을 조절한다. miRNAs는 DNA로부터 전사되나 단백질로 번역되지 않는 (비-코딩 RNA) 유전자에 의하여 인코딩된다; 대신 이들은 pri - miRNA 로 알려진 1차 전사체로부터 pre - miRNA로 불리우는 짧은 스템-루프 구조 및 최종적으로 기능적 miRNA로 프로세싱된다. 성숙한 miRNA 분자는 하나 이상의 메신저 RNA (mRNA)에 부분적으로 상보적이며, 그들의 주요 기능은 유전자 발현은 하향 조절하는 것이다. miRNAs의 기능은 유전자 조절에 있는 것으로 보인다. 이를 위하여, miRNA는 하나 이상의 메신저 RNAs (mRNAs)의 일부에 상보적이다. 동물 miRNAs는 대개 3' UTR 내 부위에 상보적이다. miRNA의 mRNA에의 어닐링은 단백질 번역을 억제하나, 때로는 mRNA의 절개를 촉진한다. 이러한 경우에, miRNA의 결합을 통한 이중 가닥 RNA의 형성은 RNA 간섭 (RNAi)과 유사한 과정을 통하여 mRNA 전사체의 분해를 유발한다. 그러나, 다른 경우에 있어서는, 상기 miRNA 복합체는 단백질 번역 시스템을 블록킹하거나 또는 그렇지 않으면 mRNA의 분해를 야기하지 않으면서 단백질 번역을 억제하는 것으로 믿어진다. 현재, 표적 유전자가 하향 조절되는 정확한 메커니즘은 명확하지 않은채 남아 있다.

본원의 목적을 위하여, 마이크로RNA 유사체 (예를 들어, miRNA-196 유사체)는 그 안정성을 증가시키고 활성을 향상시키기 위하여 ON-TARGET®으로 화학적으로 변경된 이중 가닥 RNA 올리고뉴클레오티드이다. 상기 마이크로RNA 유사체는 내생 전구체 miRNAs를 모방하여 miRNA 경로에 들어가 성숙한 miRNA로 작용한다.

miRNA-mRNA 이형2중가닥의 말단에 6-8 염기 쌍 "시드 영역" 내 서열 상보성은 miRNA-표적 RNA 상호작용의 특이성을 결정하는 것으로 보인다. miR-196가 동물 내 무수한 발달 프로그램에 결정적인 관련 전사 인자 유전자군인 호메오박스 (HOX) 클러스터에 폭넓고 진화론적으로 보존된 상보성을 가지며 HOX 유전자 발현을 조절하는 것으로 처음으로 인식되었다.

본 발명자들은 miRNA-196가 Bach1 mRNA의 3'-UTR을 표적화함으로써 HCV 게놈을 표적화하며 HMOX1 유전자를 상향 조절하는 것을 제안한다. 따라서, HCV 감염 세포는 상기 감염 세포를 miRNA-196 유사체로 형질감염시킴으로써 치료될 수 있다. 상기 HCV 감염 세포를 형질감염시킴으로써, Bach1 발현 수준을 감소시키는 반면 HMOX1 수준을 증가시킬 수 있다. 이롭게, HMOX1을 음성적으로 조절하는 Bach1의 하향 조절은 HMOX1 발현 증가를 보조한다. 상기 주목한 바와 같이, HMOX1은 항산화 효과를 제공하여 HCV에 의하여 유도되는 산화 스트레스를 완화시킨다. 부가적으로, miRNA-196 상향 조절을 IFN β처리를 이용하여 유도할 수 있다. 이러한 miRNA-196의 유도는 인간 간암세포주 Huh-7 및 1차 쥐 간세포 내에서 볼 수 있다.

miRNAs의 수는 계속해서 증가하고 있으며, 부가적인 mRNAs 및 이들에 의하여 조절되는 후보 유전자가 계속하여 동정되고 있다. 간과 관련하여, miRNA-122가 간세포 내에 발현되는 가장 풍부한 miRNA로 동정되며 콜레스테롤 대사의 몇몇 효소에 대하여 주요 효과를 가진다. miRNA-122는 또한 HCV 발현을 위하여 요구된다. 일반적으로, miRNA-122의 효과는 발현의 상향 조절과 가장 관련 있는 5 영역 내 부위, 및 반면 발현 억제와 가장 관련 있는 3' 비번역 영역 내 부위와 동족 시드 서열 결합 부위의 전후 관계 및 위치에 의존한다. 본 발명의 구현예는 miRNA-196 유사체를 HCV NS5A 단백질 발현의 하향 조절자로서 이용하는 것을 포함한다. 상기 단백질은 HCV의 완전하고 정상적인 발현을 위하여 필수적이다. 이와 같이, 본 발명의 구현예는 감염 세포 또는 간염 C를 가지는 포유동물을 치료적 유효량의 miRNA-196 유사체로 치료하는 방법을 포함한다. 치료적 유효량은 공지의 투여 경로에 의하여 제공될 수 있다. 예를 들어, miRNA-196 유사체를 포함하는 치료제는 본 발명의 다양한 구현예에 따라 국소적, 장 내 또는 비경구 투여 경로에 의하여 적용될 수 있다.

현재, HCV 감염은 감염된 간세포 및 아마도 기타 감염된 세포 내에서도 산화 스트레스를 증가시키는 것으로 인정된다. 이와 같은 증가된 산화 스트레스의 한가지 중요한 매개체는 HCV 코어 단백질이다. 마찬가지로, HMOX1이 수많은 세포 및 조직을 과도한 산화 스트레스의 잠재적인 손상 효과에 대항한 보호를 보조하는 것으로 인정된다. 상기한 바와 같이, HMOX1은 HCV에 의하여 유도되는 산화 스트레스를 무효화하거나 완화시킬 수 있는 항산화 및 항염증 활성을 가지는 주요한 세포보호 효소이다. 보다 구체적으로, HMOX1는 힘(heme) 분해를 촉매하고, 생체 내에서 항산화 및 항염증 활성을 가지는 철 이온, 일산화탄소 및 빌리베르딘을 생성하는 주요 세포보호 효소이다. 이와 같은 HMOX1의 이로운 특성들은 HMOX1이 잠재적인 산화 촉진제로 작용할 수 있는 "자유" 또는 느슨하게 결합된 힘을 감소시키고, 잠재적인 항산화 및 항염증 및 항섬유화 효과를 가지는 일산화탄소, 빌리베르딘 및 빌리루빈의 생산을 증가시키는 능력에 근거한다.

HMOX1 유전자 발현의 조절은 복잡하다. 그러나, 본 발명자들은 HMOX1의 조절을 위한 중요한 부위들 중, HMOX 유전자의 5' 비번역 영역 내에 일련의 확대된 AP-1 부위 (항산화 반응 요소로도 불리움), Maf 단백질 반응 요소[MARE], 및 메탈로포르피린-반응 요소[MPRE]가 있음을 보였다. Bach1은 cap n' collar 패밀리 아연, 루신 지퍼 단백질의 일원이다. 이는 HMOX1 유전자 발현의 억제에 있어서 주요한 역할을 한다. 이는 작은 Maf 단백질과 헤테로다이머를 형성하고 유전자의 전사 활성을 블록킹함으로써 이루어진다. Bach1은 힘(heme)과 결합하면 그 단백질의 구조 변화와 함께 Maft 단백질에 대한 친화도의 현저한 감소 및 그에 따른 저하와 HMOX1 유전자 발현의 활성 증가를 유도하는, 몇몇 일치하는 결합 부위(모두 CP 모티프를 함유)를 포함한다. 주요한 자극 Maf 단백질 중 하나는 Nrf2이다. Nrf2의 상향 조절은 HMOX1 유전자의 발현 증가와 관련이 있다.

상기에 비추어, HMOX1 활성은 HCV 감염에서 증가될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 임상적 연구는 만성 간염 C에서 HMOX1 발현 감소를 확인하여 왔다. 이와 같이, 더 낮은 HMOX1 유전자 발현 수준을 초래하는 유전적 또는 기타 요인들을 가지는 환자는 급성 HCV 노출 후 만성 간염 C 감염에 대한 위험이 증가될 수 있고/있거나 HVC 감염으로 인한 보다 신속하게 진행하는 간 질환 발병 위험성이 더 클 수 있다.

더 낮은 수준의 HMOX1 유전자 발현은 만성 간염 C 감염과 관련될 수 있고 Bach1은 HMOX1을 음성적으로 조절한다. 따라서, HCV 감염 세포 또는 간염 C를 가지는 포유동물을 감염된 세포 내에 Bach1 수준을 감소시키는 방식으로 처리하여 HCV의 영향을 이롭게 완화할 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 일 구현예는 세포를 miRNA-196으로 형질감염시켜 miRNA-196이 Bach1 mRNA의 3'-UTR과 결합하도록 하여 Bach1의 발현을 감소시키고 HMOX1을 상향 조절함으로써 만성 간염 C 감염 포유동물을 치료하는 방법을 포함한다. 바람직하게, 상기 miRNA-196은 과발현되어 Bach1에 결합하고 HMOX1을 상향 조절하기 위한 더 많은 miRNA-196을 제공한다.

본 발명에 따른 일 구현예에서, HCV 감염 (예를 들어, 만성 간염 C) 포유동물을 miRNA-196으로 처리한다. 특히, 감염된 세포를 Bach1 발현을 하향 조절하는 miRNA-196 유사체로 형질감염시킨다. 일 특정 구현예에서, HCV 비구조 단백질을 발현하는 감염 세포 내 Bach1 단백질 발현 수준을, 상기 세포를 miRNA-196 유사체로 형질감염시켜 miRNA-196이 Bach1 mRNA의 3'-URT과 결합하도록 하여 Bach1의 발현을 감소시킴으로써 감소시킬 수 있다. 바람직한 방법에서, 상기 Bach1 mRNA의 3'-UTR과 결합하는 miRNA-196는 과발현된다. 일 특정 구현에에서, miRNA-196은 또한 인터페론 베타를 투여함으로써 상향 조절된다. 다른 구현예에서, miRNA-196은 miRNA-196 유사체 단독 또는 인터페론 베타와 조합 투여에 의하여 상향 조절된다.

감염된 세포 각각, 또는 이와 같이 감염된 세포를 가지는 포유동물의 처리는 치료학적 유효량의 miRNA-196 유사체의 투여에 따라 Bach1 단백질 발현 수준의 현저한 감소를 제공할 수 있다. "치료적 유효량"이라 함은 감염된 세포 또는 간염을 가지는 포유동물에 하나 이상의 표적 질환을 치료 및/또는 예방하기에 효율적인 양의 miRNA-196 유사체를 의미한다. 일반적 가이드에 의하여, HCV 감염 치료를 위한 miRNA-196 유사체의 일일 치료량은 일반적으로 0.5 내지 5 μmol/체중 kg, 또는 1.0 내지 4 μmol/체중 kg, 또는 2 내지 3 μmol/체중 kg 범위일 수 있다. 대안적인 구현예에서, miRNA-196 유사체의 치료량은 0.1 내지 1 μmol/체중 kg, 또는 0.25 내지 1 μmol/체중 kg, 또는 0.25 내지 0.75 μmol/체중 kg 범위일 수 있다.

다양한 구현예에서, Bach1 단백질 발현 수준을 약 10% 내지 약 75%, 또는 약 25% 내지 약 65% 감소시킬 수 있다. 다른 구현예에서, 형질감염 24 시간 후 Bach1 단백질 발현 수준은 약 25% 내지 약 75%, 또는 약 50% 내지 약 60% 감소를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 형질감염 48 시간 후 Bach1 단백질 발현 수준은 약 40% 내지 약 80%, 또는 약 60% 내지 약 70% 감소를 포함한다.

상기 논의한 바와 같이, HMOX1 유전자 발현 수준 증가는 HCV에 의하여 유도되는 산화 스트레스를 무효화하거나 완화시키는데 이로울 수 있다. miRNA-196으로 형질감염되면, HCV 비구조 단백질을 발현하는 세포 내 HMOX1 유전자 발현이 이롭게 증가될 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 구현예는 HCV 비구조 단백질을 발현하는 세포 내 HMOX1 유전자 발현을 상향 조절함으로써 HCV 감염 세포 또는 HCV 감염 포유동물을 치료하는 방법을 포함한다. HMOX1 유전자 발현은 감염된 세포를 치료적 유효량의 miRNA-196 유사체로 형질감염시킴으로써 상향 조절된다. 일 구현예에서, HMOX1의 상향 조절은 세포 내 Bach1 유전자 발현의 하향 조절을 수반한다. 바람직한 일 구현예에서, 상기 방법은 miRNA-196을 상향 조절 또는 과발현시켜 간세포를 처리하는 단계를 포함한다. 다양한 구현예에서, HMOX1의 발현은 miRNA-196 유사체로 형질감염되지 않은 세포 내 HMOX1 발현 수준에 비하여 약 2 내지 약 3 배 증가한다.

Bach1 발현 억제 외에도, HCV 비구조 단백질을 발현하는 인간 간세포 내 HCV 비구조 단백질 5a (HCV NS5A) 발현 또한 억제된다. 이와 같이, 본 발명의 구현예는 HCV 감염 세포를 miRNA 유사체로 처리하는 것을 포함한다. 감염된 세포를 miRNA-196 유사체로 형질감염시켜 HCV NS5A 발현을 하향 조절할 수 있다. 바람직하게, miRNA-196은 과발현된다.

본 발명의 특정 구현예는 HCV 감염 세포를 miRNA-196 유사체로 형질감염시켜 HCV 비구조 단백질을 발현하는 세포 내 HCV NS5A 발현을 감소시킴으로써 HCV 감염 세포 또는 HCV 감염 포유동물을 치료하는 것을 포함한다. 즉, 특정 구현예에서, HCV 레플리콘 세포 및 HCV 감염 세포를 miRNA-유사체로 형질감염시켜 상기 세포 내 HCV RNA 발현 및/또는 단백질 발현을 감소시킴으로써 HCV 감염 포유동물을 치료한다. 이와 같은 구현예에서, HCV NS5A 단백질 발현 수준은 10 내지 60%, 또는 20 내지 50% 감소된다. 다른 구현예에서, 형질감염 24 시간 후 HCV NS5A 단백질 발현 수준은 약 45 내지 약 55% 감소를 포함하는 반면, 형질감염 48 시간 후 HCV NS5A 단백질 발현 수준은 약 35 내지 약 45% 감소를 포함한다.

본원 명세서 전체를 통하여 사용되는 용어 "형질감염"은 바이러스 벡터 또는 기타 전달 수단을 이용하여 외부 물질을 진핵 세포 내로 도입하는 것을 의미한다. 동물 세포의 형질감염은 전형적으로 세포 원형질막 내 일시적인 구명 또는 "홀"을 개방하여 물질이 흡수되도록 하는 것을 수반한다. 유전자 물질 (수퍼코일드 플라스미드 DNA 또는 siRNA 구조물과 같은), 또는 심지어 항체와 같은 단백질을 형질감염시킬 수 있다. 전기천공법 외에, 양이온성 지질을 상기 물질과 혼합하여, 세포 원형질막과 융합하고 내부에 카르고를 침적하는 리포솜을 생산함으로써 형질감염을 수행할 수 있다.

한가지 가능한 형질감염 방법은 인산 칼슘을 이용할 수 있다. 인산 이온을 함유하는 HEPES-완충 식염수(HeBS)를 형질감염될 물질을 함유하는 염화칼슘 용액과 혼합한다. 두 가지가 혼합되면, 양으로 대전된 칼슘과 음으로 대전된 인산염의 미세 침전이 형성되어 형질감염될 물질을 그 표면에 결합시킨다. 다음, 침전물의 현탁액을 형질감염될 세포에 첨가한다. 상기 공정은 완전히 이해되지는 않지만, 상기 세포는 침전물 일부와 함께 형질감염될 물질을 흡수한다.

다른 방법은 고도 분기된 유기 화합물(예를 들어, 덴드리머)을 이용하여 유전자 물질(예를 들어, DNA, RNA, 또는 miRNA)과 결합시키고 이를 세포 내로 들어가도록 한다. 다른 방법은 리포솜, 즉, 어떤 점에서는 세포의 구조와 유사하고 세포막과 실제로 융합할 수 있는 작은 막-결합체 내에 형질감염될 유전자 물질의 혼입, 세포 내로 유전자 물질을 배출시키는 것을 포함한다. 진핵세포의 경우, 지질-양이온에 근거한 형질감염이 보다 전형적으로 사용되는데, 이는 세포가 보다 민감성이기 때문이다. .

다른 방법은 DEAE-덱스트란 또는 폴리에틸렌이민과 같은 양이온성 폴리머를 사용한다. 음으로 대전된 유전자 물질은 다양이온(polycation)에 결합하고, 그 복합체는 내표작용(endocytosis)을 통하여 세포에 의하여 흡수된다.

형질감염에 대한 직접적인 접근은 유전자 물질이 불활성 고체 (통상적으로 금) 나노입자와 커플링된 다음 표적 세포의 핵 내로 직접적으로 "샷"되는 유전자 총(gene gun)이다. 유전자 물질은 또한 바이러스를 매개체로 이용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 이러한 경우, 그 기법은 바이러스 형질도입(transduction)으로 불리우며, 세포는 형질도입되는 것으로 말하여진다. 형질감염의 다른 방법은 뉴클레오펙션(nucleofection), 전기천공법(electroporation), 열충격(heat shock), 마그네토펙션(magnetofection) 및 Lipofectamine, Dojindo Hilymax, Fugene, jetPEI, Effectene 또는 DreamFect과 같은 등록상표의 형질감염 시약을 포함한다.

본원에 참조로 통합되는 미국 특허 제 5,942,634 호는 양이온성 양친매성 물질을 사용하여 생물학적 활성 (치료) 분자의 세포 내로 이송을 촉진시키는 것을 기재한다. 미국특허 제 5,942,634 호는 또한 하나 이상의 양이온성 양친매성 물질의 분산액을 치료 분자과 접촉시킴으로써 치료 분자를 포함하는 치료 조성물을 제조하는 방법을 교시한다. 세포 내로 전달될 수 있는 상기 치료 분자는 DNA, RNA, 및 폴리펩타이드를 포함한다. 이와 같은 조성물을 이용하여 유전자 치료법, 및 안티센스 폴리뉴클레오티드 또는 생물학적 활성 폴리펩티드의 세포로 전달을 제공할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 간염 C, 바람직하게 만성 간염 C를 가지는 세포 또는 포유동물의 치료를 위한 약학 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 조성물은 Bach1 및/또는 HCV NS5A가 하향 조절되고 HMOX1 발현이 증가하도록 치료적 유효량의 miRNA-196 유사체를 포함하여야 한다. 본 발명에 따른 구현예는 miRNA-196 유사체를 HCV를 발현하는 간세포 내로 형질감염시킬 수 있도록 적용된다. 본 발명의 조성물은 이에 제한되지 않으나 유전자 물질을 표적 세포 내로 형질감염시키기 위한 상기한 수단들 중 임의의 것을 포함 또는 이용할 수 있다.

다양한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 장관 투여 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 구현예에 따른 조성물은 정제, 캡슐 또는 경구 투여용 액상 제제 형태로 제공될 수 있다. 그러나, 가장 바람직하게, 상기 조성물은 정맥 주사용 액상 제제로서 제공된다.

다른 구현예에서, 상기 조성물은 주가 또는 주입을 위한 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 다양한 조성물은 정맥 내 (정맥 내로), 동맥 내 (동맥 내로), 근육 내 (근육 내로), 피하 (피부 밑에), 경피 (피부 자체 내로), 척추 강 내 (척추 관 내로), 또는 복강 내 (복막 내로 주입 또는 조사) 투여될 수 있다.

감염된 세포 각각, 또는 이와 같이 감염된 세포를 가지는 포유동물을 본 발명의 구현예에 따른 조성물로 처리하여, 치료적 유효량의 miRNA-196 유사체의 투여에 따라 Bach1 및 HCV NS5A 단백질 발현 수준의 현저한 감소 및 HMOX1 수준 증가를 제공할 수 있다. "치료적 유효량"이라 함은 감염된 세포 또는 간염을 가지는 포유동물에 하나 이상의 표적 질환을 치료 및/또는 예방하기에 효율적인 양의 miRNA-196 유사체를 의미한다. 일반적 가이드에 의하여, HCV 감염 치료를 위한 miRNA-196 유사체의 일일 치료량은 일반적으로 0.5 내지 5 μmol/체중 kg, 또는 1.0 내지 4 μmol/체중 kg, 또는 2 내지 3 μmol/체중 kg 범위일 수 있다. 대안적인 구현예에서, miRNA-196 유사체의 치료량은 0.1 내지 1 μmol/체중 kg, 또는 0.25 내지 1 μmol/체중 kg, 또는 0.25 내지 0.75 μmol/체중 kg 범위일 수 있다.

실시예

I. 재료 및 실험

A. 시약 및 항체

BCA 단백질 분석 시약을 Pierce Biotechnology (Rockford, IL)로부터 수득하였다. 둘벡코 변형 이글 배지 (DMEM) 및 소태아혈청(FBS)을 HyClone (Logan, UT)로부터 수득하였다. Dual-Glo® 루시퍼라아제 분석 시스템을 Promega (Madison, WI)로부터 수득하였다. TRIzol을 Invitrogen (Carlsbad, CA)으로부터 구입하고, geneticin (G-418)을 Gibco (Grand Island, NY)로부터 구입하였다. 프라이머를 Integrated DNA Technologies (Coralville, IA)에 의하여 합성하였다. 4-15% 구배 SDS-PAGE 겔 및 ImmunBlot PVDF 막을 Bio-Rad (Hercules, CA)로부터 구입하였다. 마우스 안티-HCV NS5A 및 마우스 안티-HCV NS3 모노클론 항체를 Virogen (Watertown, MA)로부터 구입하였다. 염소 안티-인간 Bach1 및 GAPDH 폴리클론 항체를 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)로부터 수득하였다. ECL-Plus를 Amersham (Piscataway, NJ)으로부터 수득하였다.

B. 세포 배양

9-13 세포를 University of Heidelberg, Heidelberg, Germany로부터 공급받았다. 상기 9-13 세포주, 인간 간암 Huh-7 세포군은 복제 HCV 비구조 영역에 있으며, HCV 비구조 단백질 NS3를 NS5B로 안정하게 발현시킨다. 상기 세포를 10% (v/v) FBS, 100 u/mL 페니실린, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신, 및 500 ㎍/mL G-418로 보충된 DMEM 내에 유지시킨다. 상기 Con1 (서브타입 1b) 전장 레플리콘 Huh-7.5 세포 (Con1 세포)는 Rockefeller University (New York, NY)로부터 수득하였다. 상기 Con1 세포주는 상기 전장 HCV 유전자형 1b 레폴리콘을 함유하는 Huh-7.5 세포군으로, 폴리펩티드의 아미노산 2204에서 세린의 이소루신 치환이 매우 적응가능하다. 상기 Con1 세포는 10% (v/v) FBS 및 0.1mM 비필수 아미노산, 100 유닛/mL 페니실린, 100 ㎍/스트렙토마이신, 및 선택 항체 750 ㎍/mL G418로 보충된 DMFM 내에 유지되었다. 상기 세포를 37℃에서 95% 실내공기 및 5% CO₂의 가습된 분위기 내에 유지시켰다.

C. 마이크로 RNAs 및 구조물

has-miRNA-196에 대한 miRIDIAN 마이크로 RNA 유사체, has-miRNA-16, 맞춤형 돌연변이 has-miRNA-196, 및 miRNA 유사체 음성 대조군 (MMNC)을 Dharmacon (Lafayette, CO)로부터 수득하였다. 마이크로 RNA 유사체는 그 안정성을 증가시키고 활성을 향상시키기 위하여 ON-TARGET®으로 화학적으로 변형된 이중 가닥 RNA 올리고뉴클레오티드이다. 상기 마이크로 RNA 유사체는 내생 전구체 miRNAs를 모방하여 miRNA 경로에 들어가 성숙한 miRNA 종으로서 작용한다. 부가적으로, 이하의 miRNA 억제제, has-miR-196 및 miRNA 억제제 음성 대조군 (MINC)를 또한 Dharmacon으로부터 수득하였다. miRIDIAN 마이크로 RNA 헤어핀 억제제는 천연 miRNAs 활성을 억제하도록 고안된 가장 새로운 합성 올리고뉴클레오티드 억제제이다. pRL-TK 벡터를 Promega로부터 수득하였다. 상기 pRL-TK 수용체 벡터는 Renilla 루시퍼라아제를 인코딩하는 cDNA (Rluc)를 내부 대조 리포터로 함유한다. 1837 bp 단편의 Bach1 3'-UTR을 함유하는 pGL3-Bach1 루시퍼라아제 리포터 구조물을 University of Florida, Gainesville, FL로부터 공급받았다. 돌연변이 pGL3-Bach1을 GENEWIZ, Inc. (South Plainfield, NJ)에 의하여 발생시켰다. 구조물을 제한 효소 절단 및 시퀀싱에 의하여 확인하였다.

D. 형질감염 및 루시퍼라아제 활성 분석

Lipofectamine 2000(Invitrogen)을 사용하여 제조업자 프로토콜에 따라 형질감염을 수행하였다. 간략하게, 9-13 세포를 pGL3-Bach1 또는 돌연변이 pGL3-Bach, pRL-TK, 및 시험 miRNAs로 동시-형질감염시켰다. 형질감염 48 시간 후, 세포를 수확하고 용균시켰다. 루시퍼라아제 리포터 활성을 Dual-Glo® 루시퍼라아제 분석 시스템을 이용하여 측정하였다. 반딧불이 루시퍼라아제 활성을 Renilla 루시퍼라아제 활성 및 BCA 단백질 분석 키트를 이용하여 결정된 총 단백질에 대하여 정규화하였다. 비교의 편의를 위하여, pGL3-Bach1 및 pRL-TK 형질감염을 가지는 세포에 대한 값을 1로 설정하였다.

E. 시험관 내 전사, 형질감염 및 감염

감염성 J6로부터의 코어-NS2 영역 (유전자형 2a) 및 감염성 JFH1로부터의 NS3-NS5B 영역 (유전자형 2a)을 가지는 전장 키메라 게놈인 HCV 감염성 클론 pJ6/JFH1을 M. Rice (the Rockefeller University, New York, NY)로부터 공급받았다. J6/JFH1-기제 세포 배양액-발생 HCV (HCVcc)의 생산은 이전에 보고되었다. 간략하게, pJ6/JFH1 플라스미드를 XbaI로 선형화하고, 에탄올 침전, 프로티나아제 K로 절단, 및 페놀-클로로포름 추출에 의하여 정제하였다. 선형화된 플라스미드를 MEGAscript T7 키트 (Ambion, Austin, TX)를 이용하는 시험관 내 전사를 위한 주형으로서 사용하였다. HCV RNA 감염을 위하여, Huh-7.5 세포를 24-웰 플레이트 내에서 형질감염 1일 전에 플레이팅하고 70-80% 콘플루언스로 형질감염시켰다. 세포를 2 ㎍/웰의 HCV RNA 및 4 uL/웰 리포펙타민 2000을 이용하여 48 시간 동안 RNA/리포펙타민 비율 1:2로 형질감염시켰다. 미접촉 (naive) Huh-7.5 세포를 감염시키기 위하여, HCV RNA로 48 시간 동안 형질감염된 세포로부터의 세포 배양 상청액을 수집하고 0.2 ㎛ 필터를 통하여 여과하고, 미접촉 Huh-7.5 세포 배양액에 첨가하였다.

F. 웨스턴 블롯

웨스턴 블롯을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간략하게, 총 단백질 (30-50 ㎍)을 SDS-PAGE 겔 상에서 분리하였다. ImmunBlot PVDF 막 상으로 전기영동에 의하여 이동시킨 후, 막을 1 시간 동안 5% 탈지 분유 및 0.1% Tween-20을 함유하는 PBS 내에서 블록킹한 다음, 1차 항체와 함께 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 1차 항체의 희석은 다음과 같았다: 안티-Bach1 항체에 대하여 1:1000, 및 안티-HCV NS5A 및 안티-GAPDH 항체에 대하여 1:2000. 다음, 상기 막을 1 시간 동안 겨자무 (horseradish) 과산화효소-컨쥬게이트된 2차 항체 (희석 1:10,000)와 함께 인큐베이션하였다. 최종적으로, 상기 결합된 항체를 ECL-Plus 화학발광 시스템을 이용하여 제조업자 프로토콜에 따라 가시화하였다. Kodak 1DV3.6 컴퓨터에 근거한 영상화 시스템 (Rochester, NY)을 이용하여 웨스턴 블롯 후 얻어지는 각각의 특이적 밴드의 상대 광학 밀도를 측정하였다.

G. 정량적 RT - PCR

시험 세포로부터 총 RNA를 추출하고 cDNA를 이전에 기재된 바와 같이 합성하였다. 프라이머를 다음과 같이 사용하였다: Bach-1-특이적 센스 프라이머 5'-GGACACTCCTTG CCAAATGCAG-3' (22 bp), 안티-센스 프라이머 5'-TGACCTGGTTCTGGGCTCTCAC-3' (22 bp); HMOX1-특이적 센스 프라이머 5'- cgggccagcaacaaagtg-3' (18 bp), 안티-센스 프라이머 5'-agtgtaaggacccatcggagaa-3' (22 bp); Cul3-특이적 센스 프라이머 5'-GTGCTCACGACAGGATA-3' (17 bp), 안티-센스 프라이머 5'-GTTTGGCTAAGTAGAACCTTC-3' (21 bp); GAPDH-특이적 센스 프라이머 5'-TTGTTGCCATCAATGACCC-3' (19 bp), 안티-센스 프라이머 5'-CTTCCCGTTCTCAGCCTTG-3' (19 bp). 실시간 정량적 RT-PCR을 CFX96TM Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad) 및 iQ^TM SYBR Green Supermix Real-Time PCR 키트 (Bio-Rad)를 이용하여 수행하였다. 표본을 주형없이 역전사효소없이 음성 대조군으로서 포함시켰으며, 이는 예측한 바와 같이 무시해도 될 정도의 신호를 생산하였다 (Ct 값 > 35). 배수(fold) 변화 값을 동일 표본 내에서 GAPDH 양에 대한 정규화 후 비교 Ct 분석에 의하여 계산하였다. 최초 실험은 몇 회의 처리 및 세포 조작은 GAPDH 유전자 발현에 영향을 미치지 않았음을 보였다.

H. 통계학적 분석

초기 분석은 결과가 정규 분포되어 있음을 보였다. 따라서, 매개변수적 통계학적 절차를 이용하였다. Student's t-test (두 상황의 비교를 위함) 또는 분산 분석법 (2 이상 중에서 비교를 위함)를 이용하여 표본 간의 차이를 분석하였다. P <0.05 값은 통계학적으로 유의한 것으로 간주되었다. 실험을 적어도 3회 반복하여 유사한 결과를 얻었다. 모든 실험은 각각의 처리군에 대하여 적어도 3중 표본을 포함하였다. 단일 실험으로부터의 대표적인 결과를 제시한다. SAS Institute (Cary, NC)로부터의 JMP 4.0.4 소프트웨어를 이용하여 통계학적 분석을 수행하였다.

II . 결과

A. 인실리코 ( in silico ) 분석은 miR -196 및 Bach1 mRNA 의 3'- UTR 의 두 시드 영역 매치를 예측한다.

생물정보학적 접근을 이용하여 잠재적인 miRNA 표적을 동정하였다. TargetScan 4.0 데이터 베이스의 온라인 검색은 적어도 두 개의 추정적인 miRNA-196 시드 매치 부위가 Bach1 mRNA의 3'-UTR 내에 있음을 입증하였다. 도 1a 및 1b에 도시하는 바와 같이, 예측된 결합 부위 (2280-2286 nt) 중 하나는 인간, 마우스, 래트, 닭 및 개 내에 매우 보전되는 반면, 다른 추정 부위(2161-2166 nt)는 종에 걸쳐 저조하게 보존되었다. Nrf2 및 HMOX1 유전자 내에 어떠한 예측된 miRNA-196 결합 부위도 발견되지 않으며, Bach1 유전자의 코딩 영역 내에 어떠한 추정적인 miRNA-196 결합 부위도 발견되지 않았다 (데이터 도시하지 않음).

B. miRNA -196은 HCV 비구조 단백질을 발현하는 9-13 세포 내에서 전사 억제제 Bach1 를 하향 조절하고 HMOX1 을 상향 조절한다.

추정상의 miR-196 결합 부위가 기능적임을 실험적으로 입증하기 위하여, 상기 9-13 세포를 miRNA-196 특이적 유사체 또는 억제제로 형질감염시켰다. Bach1 단백질 및 mRNA 수준을 웨스턴 블롯 및 qRT-PCR 각각에 의하여 평가하였다. miRNA-196 유사체로 형질감염된 9-13 세포는 Bach1 단백질 발현 수준에 있어서 miRNA 유사체 음성 대조군(MMNC)과 비교하여 형질감염 24 시간 후 약 55% 및 형질감염 48 시간 후 약 64%의 현저한 감소를 보였다. 모의 형질감염과 비교하여 miRNA 유사체 음성 대조군으로 형질감염된 세포 내에서 Bach1 단백질 수준에 대한 어떠한 효과도 관측되지 않았다 (도 2a). miRNA-196 특이적 억제제에 의한 miRNA-196의 하향 조절은 miRNA 억제제 음성 대조군과 비교하여 Bach1 단백질 수준을 현저히 증가시켰다 (도 2b). 그러나, 9-13 세포 내에서 Bach1 mRNA 수준에 대한 miRNA-196의 어떠한 유의한 효과도 관측되지 않았다. Bach1 mRNA 수준은 miRNA-196 유사체 형질감염으로 변경되지 않았다 (도 2c). 이러한 결과는 miRNA-196의 Bach1에 대한 조절이 인간 간암 9-13 세포 내에서 번역 수준으로 일어날 수 있음을 입증하는 것이다.

Bach1는 HMOX1 유전자의 확립된 전사 억제제이므로, 본 발명자들은 다음으로 miRNA-196에 의한 Bach1 단백질의 하향 조절이 HMOX1 유전자 발현을 증가시킬 수 있는지 여부를 결정하였다. 따라서, 9-13 세포를 miRNA-196 유사체 또는 miRNA 유사체 음성 대조군으로 48 시간 동안 형질감염시켰다. 48 시간 후, HMOX1 및 Cullin 3 (Cul3, 비특이적 유전자 대조군) mRNA를 qRT-PCR에 의하여 정량하였다. miRNA-196 유사체는 도 3a에 도시하는 바와 같이 동량의 miRNA 유사체 음성 대조군과 비교하여 HMOX1 mRNA 수준을 2.4 배 현저히 상향 조절하였다. Cul 3 mRNA 수준은 도 3b에 도시하는 바와 같이 상향조절되지 않았다.

C. miRNA -196은 HCV 비구조 단백질을 발현하는 9-13 세포 내에서 HCV 비구조 NS5A 단백질 발현을 억제한다.

본 발명 이전에, HCV 비구조 단백질을 발현하는 인간 간암 세포 내에서 miRNA-196이 HCV 비구조 NS5A 단백질 수준을 변경시키는지는 알려지지 않았다. HCV 비구조 단백질을 발현하는 인간 간암 세포 내에서 miRNA-196이 HCV 비구조 NS5A 단백질 수준을 변경시키는지 여부를 결정하기 위하여, 9-13 세포를 miRNA-196 유사체 또는 억제제로 형질감염시켰다. 형질감염 24 시간 및 48 시간 후, 웨스턴 블롯을 수행하여 NS5A 및 GAPDH 단백질 수준을 분석하였다. 50 nM miRNA-196 유사체는 도 4a에 도시하는 바와 같이 동량의 miRNA 유사체 음성 대조군과 비교하여 NS5A 단백질 발현 수준에 있어서 형질감염 24 시간 후 약 52% 48 시간 후 약 37%의 현저한 감소를 초래하였다. 이와 대조적으로, miRNA-196 특이적 억제제에 의한 miRNA-196의 하향 조절은 도 4b에 도시되는 바와 같이 NS5A 단백질 수준을 2.2 배로 현저히 증가시켰다. miRNA-196이 HCV 복제를 억제할 수 있는 여부를 평가하기 위하여, Con1 전장 HCV 레플리콘 Huh-7.5 세포를 음성 대조군 또는 miRNA-196 유사체로 48 시간 동안 형질감염시켰다. 도 4c에 도시되는 바와 같이, miRNA-196은 miRNA 유사체 음성 대조군 (MMNC)과 비교하여 바이러스 RNA 수준에 있어서 현저한 감소를 초래하였다.

D. miR -196은 HCV JFH1 -계 세포 배양 세스템 내에서 HCV 발현을 억제한다.

Huh-7.5 세포를 Lipofectamine 2000에 의하여 2 ㎍/웰의 HCV J6/JFH1 RNA로 형질감염시켰다. 48 시간 후, 세포를 miRNA-196 유사체 또는 miRNA 유사체 음성 대조군 (MMNC)으로 형질감염시켰다. HCV 감염을 위하여, 비접촉 Huh-7.5를 앞서 기재된 바와 같이 J6/JFH1-형질감염된 세포로부터 수확된 1 mL의 세포 배양 상청액으로 배양하였다. 상기 상청액에 48 시간 노출시킨 후, 세포를 miRNA-196 유사체 또는 miRNA 유사체 음성 대조군 (MMNC)으로 48 시간 동안 형질감염시켰다. 세포를 수확하고 총 RNA 및 단백질을 추출하였다. HCV RNA를 qRT-PCR에 의하여 정량하고, HCV NS3 및 GAPDK 단백질 수준을 웨스턴 블롯에 의하여 측정하였다.

miRNA-196에 대한 완전한 매치가 HCV JFH1 게놈 내 HCV NS5A 유전자의 코딩 영역 내에서 발견되었다. HCV J6/JFH1 세포 배양 시스템 내에서 miRNA-196의 HCV 발현에 대한 하향 조절 효과가 관측되었다. 50 nM의 miRNA-196은 J6/JFH1 형질감염된 Huh-7.5 세포 내에서 거의 70%의 HCV J6/JFH1 RNA의 현저한 감소 (도 9a), J6/JFH1 감염된 Huh-7.5 세포 내에서 ~50% (도 9b), 및 J6/JFH1 감염된 Huh-7.5 세포 내에서 HCV NS3 단백질의 ~60% 감소 (도 9c)를 초래하였다. 이러한 결과는 JFH1 세포 배양 시스템 내의 앞선 관측과 일치하는 것이다.

E. miRNA -196은 HCV 비구조 단백질을 발현하는 9-13 세포 내에서 Bach1 mRNA 의 3'- UTR 과 직접 상호작용한다.

miRNA-196이 도 5a에 도시되는 바와 같이 miR-196을 위한 두 개의 예측된 시드 매치 부위를 함유하는 Bach1 mRNA의 3'-UTR을 표적화하는지를 추가로 밝혔다. 덜 직접적이고 특이적인 조절을 가하기 보다는, 반딧불이 루시퍼라아제 (f- luc) 오픈 리딩 프레임의 Bach1 3'-UTR 다운스트림을 가지는 pGL3-Bach1이라 불리우는 리포터 구조물 (도 5b)을 이용하였다. 9-13 세포를 pGL3-Bach1 (f- luc), pRL-TK (renilla, 형질감염 효율에 대하여 정규화하기 위하여), 및 miRNA-음성 대조군, miRNA-196 유사체 또는 억제제 또는 miRNA-196 (Bach1 mRNA의 3'-UTR 내에 어떠한 예측된 결합 부위도 가지지 않는 "음성" miR)로 동시-형질감염시켰다. 형질감염 48 시간 후, 루시퍼라아제 리포터 활성을 분석하였다. miRNA-196 유사체 형질감염은 약 53%로 리포터 활성을 현저히 감소시킨 반면, miRNA 유사체 음성 대조군 및 miRNA-196 유사체는 리포터 루시퍼라아제 활성에 어떠한 영향도 미치지 않았다. 부가적으로, miRNA-196 억제제로 형질감염된 세포 내에서 리포터 활성의 유의한 변화가 관측되지 않았다. 도 5c에 도시되는 바와 같이, miRNA-196 유사체는 pGL3-Bach1 리포터의 f- luc 활성을 억제하는 반면, miRNA-196 억제제는 pGL3-Bach1 리포터의 f- luc 활성을 약간 증가시켰다 (도 5d).

다음, 9-13 세포를 pGL3-Bach1-Mut라 불리우는 네 개의 뉴클레오티드 돌연변이 Bach1 3'-UTR을 함유하는 Luc 리포터 구조물 (도 6a), 및 pRL-TK, 및 miRNA-196 유사체 또는 miRNA-155 유사체 (pGL3-Bach1-WT 및 pGL3-Bach1-Mut 내에 예측된 miR-155 결합 부위의 어떠한 변화도 없는 "음성 " miR)로 동시-형질감염시켰다. 형질감염 48 시간 후, 루시퍼라아제 리포터 활성을 Promega로부터의 Dual Luciferase Assay System을 이용하여 측정하고, 반딧불이 루시퍼라아제 활성을 renilla 루시퍼라아제 활성 및 총 단백질에 대하여 정규화하였다. 도 6b에 도시되는 바와 같이, miRNA-196 유사체는 pGL3-Bach1-WT의 f- luc 활성을 감소시켰으나 pGL-Bach1-Mut 리포터의 활성을 감소시키지 않았다. miRNA-196 유사체 형질감염은 투여량 의존적 방식으로 루시퍼라아제 활성을 현저히 감소시킨 반면, miRNA-196은 miRNA-196에 대한 돌연변이 결합 부위를 함유하는 리포터 구조물로 형질감염된 세포 내에 리포터 활성을 변화시키지 않았다. miRNA-155는 도 6c에 도시되는 바와 같이 pGL3-Bach1-WT 및 pGL3-Bach1-Mut 모두 내에서 리포터 활성을 현저히 감소시켰다. 이러한 결과는miRNA-196이 Bach1유전자 발현을 직접적으로 조절하며, miRNA-196이 Bach1 mRNA의 3'-UTR을 통하여 Bach1의 하향 조절을 중재함을 입증하는 것이다.

miRNA-196과 Bach1-3' UTR 간의 직접적인 상호작용을 추가로 결정하기 위하여, 도 7a에 도시되는 바와 같이 네 개의 돌연변이를 도입하여 Bach1 mRNA의 3'-UTR에 대한 시드 매치 부위를 제거한 돌연변이 miRNA 196을 생산하였다. 세포를 pGL3-Bach1-WT, 및 pRL-TK, 및 증가하는 농도의 miRNA 유사체 음성 대조군, miRNA-196 유사체 또는 돌연변이 miRNA-196 유사체로 동시-형질감염시키고, 루시퍼라아제 리포터 활성을 분석하였다. 도 7b에 도시하는 바와 같이, miRNA-196은 투여량 의존적 방식으로 루시퍼라아제 활성의 현저한 감소를 초래하였으며, 이는 앞선 관측과 일치하는 반면, miRNA 음성 대조군 및 돌연변이 miR-196은 루시퍼라아제 활성에 영향을 미치지 않았으며, 이는 miR-196과 Bach1 mRNA의 3'-UTR 간의 직접적인 상호작용을 추가로 나타내는 것이다.

돌연변이 pGL3-Bach1 (pGL3-Bach1-Mut)과 상보적인 염기를 함유하는 돌연변이 miRNA-196 (miR-196-Mut)은 도 8a에 도시되는 바와 같이 그들의 시드 영역 내에서 다시 완전히 매칭하므로 돌연변이 리포터 (Bach1-3'-UTR-Mut)에 대한 효과를 회복할 것이다. 돌연변이 miRNA-196 유사체는 돌연변이 miRNA-196에 "피트"하도록 돌연변이된 돌연변이 pGL3-Bach1로 형질감염된 세포 내에 루시퍼라아제 활성을 현저히 억제시켰다 한편, .miRNA-196 야생형의 돌연변이 리포터 (pGL3-Bach1-Mut) 루시퍼라아제 활성에 대한 어떠한 유의한 효과도 관측되지 않았다. 따라서, 도 8b에 예시하는 바와 같이 miRNA-196과 Bach1 mRNA의 3'-UTR 간의 직접적인 상호 작용을 추가로 입증하는 것이다.

상기 실험은 miRNA-196 유사체의 형질감염이 Bach1 및 HCV 비구조 NS5A 단백질 수준을 현저히 하향 조절하고, HMOX1 유전자 발현을 상향 조절함을 예시한다. 이와 같이, miRNA-196은 간세포 내에서 HCV 복제 및 HMOX1/Bach1 발현의 조절에 있어 중요한, 아마도 심지어 결정적인 역할을 할 수 있다. 따라서, miR-196의 상향 조절은 만성 간염 C 및 아마도 기타 간질환의 치료를 위한 추가적인 신규한 치료법을 제공할 수 있을 것이다.

본원 명세서에 기재된 본 발명의 많은 변형 및 기타 구현예들이 전술한 기재 및 관련 도면에 제시되는 교시의 이점을 가지고 당업자에게 떠오를 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명은 본원에 개시된 특정 구현예에 제한되지 않으며 변형 및 기타 구현예가 첨부되는 청구항의 범위 내에서 포함되는 것으로 이해되어야 할 것이다. 본원 명세서에 특정 용어가 사용되었으나, 이들은 일반적이고 기술적인 의미로 사용된 것일 뿐 제한을 목적으로 하는 것이 아니다.

SEQUENCE LISTING <110> THE CHARLOTTE-MECKLENBERG HOSPITAL AUTHORITY (d/b/a CAROLINAS MEDICAL CENTER) BONKOVSKY, HERBERT L. HOU, WEIHONG <120> TREATING HEPATITIS C VIRUS INFECTION WITH OVEREXPRESSION OF microRNA-196 <130> 038151/380278 <150> 61/103,609 <151> 2008-10-08 <160> 29 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bach1 3'UTR (2280-2286 bp) <400> 1 aauacaagua acuacacuac cuc 23 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-196 <400> 2 gguuguuguc cuuugaugga u 21 <210> 3 <211> 34 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 3 agcauguaau acaaguaacu acacuaccuc auau 34 <210> 4 <211> 38 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 4 agcauguaau acaaguaacu acacuaccuc auacacac 38 <210> 5 <211> 38 <212> RNA <213> Rattus rattus <400> 5 agcauguaau acaagugacu acacuaccuc auccguac 38 <210> 6 <211> 34 <212> RNA <213> Gallus gallus <400> 6 agcauguaau acaaguaacu acacuaccuc auac 34 <210> 7 <211> 32 <212> RNA <213> Canis familaris <400> 7 agcaccuaau acaagugacu acacuaccuc ac 32 <210> 8 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bach1 3'UTR (2161-2166) <400> 8 gguuuaaauu ucucucuacc uau 23 <210> 9 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-196 <400> 9 gguuguuguc cuuugaugga u 21 <210> 10 <211> 37 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 10 aaagcacuug guuuaaauuu cucucuaccu auaaaca 37 <210> 11 <211> 33 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 11 aagacacuug guuuaaauuu cucucuauga aca 33 <210> 12 <211> 37 <212> RNA <213> Rattus rattus <400> 12 uagacacuug guuuaaauuu cucucuauuc augaaca 37 <210> 13 <211> 37 <212> RNA <213> Gallus gallus <400> 13 aagacacuug guuuaaauuu cucucuacau auaaaca 37 <210> 14 <211> 37 <212> RNA <213> Canis familaris <400> 14 aagaaacuuc uuggcaauuu uuucuucuua cuaggua 37 <210> 15 <211> 1836 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BACH-1 3'UTR (nt 658-2495) <400> 15 ucuagaaagu cuggcuacau gaauagauuu aagugucacu uucccucccu gccccccgcu 60 ucagucucua ccauaucugg ucccaucaug gacuuccuau uuccuggcau uuuugucccu 120 uuggaagaag aaauaggacu cagaauacag uggcaucagu gauuacacug gcagcauuac 180 ucaggcuccc uagaaucugg agagcuuacc aacauguaaa gcuguucauu uuuccaccgu 240 gggucaccaa ugccagaaaa ccagacauca cggggaaaga auguugcuua cuuuuuacca 300 ggagugcagu ucauuuuuuu cacccuguuu uugaagucgu auuauucacu uguaaaaaug 360 auuguaacag auaaaaaaug uaucugcagc aacucugcag guuugugaaa uaggaugaaa 420 cucaaucuuu uucuauugug gguuugcauu ugaaaagcag guugaauccu ugcucucuuc 480 uccaaauuug gugugguaua aagacacaca aaucauuuua acuuggacau uuaaagauca 540 gucuuagugu uuguucaguc cuguuacaaa auagauaacu gagcaccuau cgcauaacau 600 uuugcggugg cuuuuagcca ugcugggguu agauguguuu gagagucaaa ugaaagcuau 660 ggaucuucuc agcaauuaaa aaaaaugcau auauucacau ucacagaaac auuggcagaa 720 cccaguuuua augguacaga ggaguaguuu auaguguuga uuucaccaaa aucagagggc 780 ugaaagagac acuucuauag acugcauccu gagccuagug cagggcuugu cuagcuaaug 840 ugggcagcca ccacccacug uguaugaaca agucugaagc aaguuggccu ugcccuugag 900 aguauauggg gaccagucuu caugucuugg aguaauuugu caaauguuac ccuuuuugau 960 caggguguag ggggaggaua uugcuaguau auuuucagug guuuguaugu ucucucuguc 1020 acugacuuau uuguaagaga aaauuaguug gacuuguuua uuuucuagua gcuuuuauaa 1080 guacacucaa gaauuuguca gggagaauaa uucugauagu gcaucccaua cugcaaaaga 1140 auuugugugu gugugugugu gugugugugu guguguguau guguauguau acauauauau 1200 cucuccauau agguauuucu uugauacuug uaauuuuaaa uuucagcuuc acgauauaaa 1260 auaauauaag aacuucuggu uuacaaaaug uaaaaucuua agccaaugga acccuugauu 1320 uccuaccuca guguacaccc aacuaugguu guaucaguuu guguaugugc aaaugucaaa 1380 uaaucuuuug cuuuaauugc uacuguacuu gcuuugaaag auuaccuacu auuuuaugau 1440 aaaauguagu ugucuccaga gcuuaaauau aauuuguaaa gcacuugguu uaaauuucuc 1500 ucuaccuaua aacaguuuag cauuaagggu uucuauuaau gacacagaau uauuggccaa 1560 guguaauuuc uuaaaauuua gcauuacuuu aaauagccag cauguaauac aaguaacuac 1620 acuaccucau aucuacauga uuuucaaguu guaaugcaga uggacagaua aaaaagauuu 1680 uacguuuguc uuuuggccau aagugggaaa guuuucugua uauugcauag cauuacacau 1740 uuaugccuau uuuaacauua acuucuaaag aaguuuuuuc uaagaaaaug uuucaaggca 1800 auauuuuuuu ugaggcugcc gaagacaaau gacagg 1836 <210> 16 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Four replacement nucleotides in the two seed match sites of BACH-1 3'UTR <400> 16 caag 4 <210> 17 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' mutant miR-196 <400> 17 gguuguuguc cuuugaguuc u 21 <210> 18 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' miR-196 <400> 18 gguuguuguc cuuugaugga u 21 <210> 19 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' mutant Bach1 3'UTR (2280-2286) <400> 19 aauacaagua acuacacuca agc 23 <210> 20 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' mutant miR-196 <400> 20 gguuguuguc cuuugaguuc u 21 <210> 21 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' mutant Bach1 3'UTR (2161-2166) <400> 21 gguuuaaauu ucucucucaa gau 23 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bach-1-specific sense primer <400> 22 ggacactcct tgccaaatgc ag 22 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bach-1-specific anti-sense primer <400> 23 tgacctggtt ctgggctctc ac 22 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMOX1-specific sense primer <400> 24 cgggccagca acaaagtg 18 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMOX1-specific anti-sense primer <400> 25 agtgtaagga cccatcggag aa 22 <210> 26 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cul3-specific sense primer <400> 26 gtgctcacga caggata 17 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cul3-specific anti-sense primer <400> 27 gtttggctaa gtagaacctt c 21 <210> 28 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH-specific sense primer <400> 28 ttgttgccat caatgaccc 19 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH-specific anti sense primer <400> 29 cttcccgttc tcagccttg 19

Claims

HCV를 발현하는 감염 세포 내 Bach1 단백질 발현 수준을 감소시키는 단계를 포함하는, HCV 감염된 포유동물의 치료 방법.
제1항에 있어서,
HCV 비구조 단백질을 발현하는 세포 내 Bach1 단백질 발현 수준을 감소시키는 단계는 상기 세포를 miRNA-196 유사체(mimic)로 형질감염시켜 miRNA-196이 Bach1 mRNA의 3'-UTR과 결합하도록 하여 Bach1 발현을 감소시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서,
miRNA-196 또는 miRNA-196 유사체를 상향 조절 또는 과발현시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제2항에 있어서,
인터페론 베타를 투여함으로써 miRNA-196을 상향 조절하는 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서,
상기 Bach1 단백질의 발현 수준이 약 10% 내지 약 75% 감소하는 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서,
형질감염 24 시간 후 상기 Bach1 단백질의 발현 수준이 약 50% 내지 약 60% 감소를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서,
형질감염 48 시간 후 상기 Bach1 단백질의 발현 수준이 약 60% 내지 약 70% 감소를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
HCV 감염 세포 내 HMOX1 유전자 발현을 상향 조절하는 단계를 포함하는, HCV 감염된 포유동물의 치료 방법.
제8항에 있어서,
상기 세포 내 Bach1 유전자 발현을 하향 조절하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제9항에 있어서,
상기 세포를 miRNA-196 유사체로 형질감염시킴으로써 Bach1 유전자 발현을 하향 조절하는 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서,
miRNA-196을 상향 조절 또는 과발현시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제8항에 있어서,
상기 세포는 간세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서,
상기 HMOX1 발현은 miRNA-196 유사체로 형질감염되지 않은 세포 내 HMOX1 발현 수준에 비하여 약 2 내지 약 3 배 증가하는 것을 특징으로 하는 방법.
HCV 레플리콘 세포 및 HCV 감염 세포를 miRNA-유사체로 형질감염시킴으로써 상기 세포 내 HCV RNA 발현 및 단백질 발현을 감소시키는 단계를 포함하는, HCV 감염된 포유동물의 치료 방법.
제14항에 있어서,
miRNA-196을 상향 조절 또는 과발현시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제15항에 있어서,
HCV NS5A 단백질 발현 수준이 10 내지 60% 감소하는 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서,
형질감염 24 시간 후 HCV NS5A 단백질 발현 수준이 약 45 내지 약 55% 감소를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서,
형질감염 48 시간 후 HCV NS5A 단백질 발현 수준이 약 35 내지 약 45% 감소를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
HMOX1 발현이 증가하면서 Bach1 및 HCV NS5A 발현 수준이 하향 조절되도록 하는 치료적 유효량의 miRNA-196 유사체를 포함하는, HCV 비구조 단백질을 발현하는 세포 및 간염 C를 가지는 포유동물의 치료용 조성물로서,
상기 조성물은 miRNA-196 유사체의 HCV 단백질을 발현하는 간세포 내로 형질감염을 가능케 하도록 적용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제19항에 있어서,
상기 miRNA-196 유사체가 HCV 단백질을 발현하는 세포 내로 방출될 수 있도록 상기 miRNA-196 유사체는 리포솜 내에 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제20항에 있어서,
상기 조성물은 양이온성 지질을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제19항에 있어서,
상기 miRNA-196 유사체가 HCV 단백질을 발현하는 세포 내로 방출될 수 있도록 양이온성 양친매성 물질을 추가로 포함하는 조성물.