KR101414383B1 - Ｄｌｋ-1 유전자 발현억제용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Dlk-1의 발현을 억제하는 마이크로 RNA인 miR-143을 포함하는 Dlk-1 유전자 발현억제용 조성물, 상기 miR-143을 포함하여 암세포에서 과발현되는 Dlk-1의 발현을 억제하는 암 예방 또는 치료용 조성물 및 미분화세포에서 과발현되어 미분화세포의 분화를 억제하는 Dlk-1의 발현을 억제하는 마이크로 RNA인 miR-143을 포함하는 분화촉진용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 miR-143을 포함하는 조성물은 Dlk-1 유전자(pref-1)의 발현수준을 감소시켜서, pref-1의 발현에 의하여 유지되는 전분화세포의 분화를 촉진시킬 뿐만 아니라, pref-1의 발현에 의하여 유발되는 암세포의 진행을 억제할 수 있으므로, 줄기세포를 이용한 세포치료제 또는 항암치료제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

Ｄｌｋ-1 유전자 발현억제용 조성물{Composition for inhibiting expression of Dlk-1 gene}

본 발명은 Dlk-1 유전자 발현억제용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 Dlk-1의 발현을 억제하는 마이크로 RNA인 miR-143을 포함하는 Dlk-1 유전자 발현억제용 조성물, 상기 miR-143을 포함하여 암세포에서 과발현되는 Dlk-1의 발현을 억제하는 암 예방 또는 치료용 조성물 및 미분화세포에서 과발현되어 미분화세포의 분화를 억제하는 Dlk-1의 발현을 억제하는 마이크로 RNA인 miR-143을 포함하는 분화촉진용 조성물에 관한 것이다.

폐암은 상피세포로부터 유래하는 폐의 암종으로서, 주로 소세포 폐암 및 비-소세포 폐암으로 구분된다. 비-소세포 폐암(NSCLC)은 때로는 수술로 치료되는 반면에 소세포 폐암(SCLC)은 통상적으로 화학요법 및 방사선에 대해서 더 잘 반응한다.

비수술적인 방법에 의해 치료될 수 있는 소세포 폐암을 치료하기 위하여, 이의 발병원인을 규명하려는 연구가 활발히 진행되고 있으며, 최근에는 폐암의 발병기작에 관여하는 것으로 알려진 Dlk-1에 대하여 관심이 집중되고 있다.

인간의 Dlk-1(delta-like 1 homolog, hDlk-1)은, 전체 길이 383아미노산 잔기를 갖고, 세포 외 영역에 6개의 EGF 유사 모티브를 갖으며, 1회 막 관통형의 1형 막 단백질로 알려져 있는데, 상기 세포 외 영역은 Notch/Delta/Serrate 패밀리와 상동성을 나타낸다고 알려져 있고, Pref-1, pG2, SCP-1 및 ZOG라고 호칭되기도 한다. 상기 hDlk-1를 코딩하는 유전자는 GRP(gastrin releasing peptide) 응답성의 폐 소세포 암 유래 세포주에서 발현되는 분자 또는 전(前) 지방세포의 분화를 억제하는 인자로서 클로닝되었다. 상기 유전자로부터 발현된 hDlk-1은 세포막으로 이동한 다음, 단백질 분해효소에 의하여 세포 외 영역이 절단되고, 절단된 단백질 단편이 혈액으로 분비되는데, 상기 혈액으로 분비된 단백질 단편은 약 225 내지 262개의 아미노산으로 구성된 당단백질인 FA-1(Fetal antigen-1)으로 알려져 있다.

상기 hDlk-1 유전자 및 그 유전자 산물은, 미(未) 분화되고 증식능이 높은 태아 세포에서 높은 수준으로 발현되고, 특히, 태아 간장, 태아 신장, 태아 골격근, 태아 뇌 등에서 높은 수준으로 발현되지만, 출생 후에는 대부분의 조직에서 발현이 확인되지 않게 되어, 정상적인 성체 조직에 있어서는 부신, 태반, 하수체, 미분화된 간세포 (幹細胞) 및 전구 세포에서 그의 발현이 국한된다고 알려져 있다(WO 2005/052156). 특히, 성체 간장에 있어서의 미분화되고 다분화능을 갖는 간 난원형 세포, 뼈/연골/지방 세포의 간세포인 중간엽 간세포에서 hDlk-1이 발현된다고 알려져 있는데, 상기 hDlk-1은 상기 다분화능을 가지는 세포에서 미분화능을 유지하는데 중요한 역할을 수행하는 것으로 예상되고 있다.

이러한 hDlk-1 유전자 및 그 유전자 산물은, 여러 암이나 종양에서도 높은 수준으로 발현되는 것으로 알려져 있는데, 상술한 소세포 폐암 뿐만 아니라, 신경내분비 종양, 신경아세포종, 신경교종, 1 형 신경섬유종증, 간장암, 신장암, 난소암, 급성 골수성 백혈병 등이 발병한 환자의 조직에서 상기 hDlk-1이 높은 수준으로 발현됨이 알려져 있다(WO 02/081625; 일본 공개특허공보 제2001-269174호). 또한, 적백혈병 세포주(erythroleukemia)인 K562 세포에 hDlk-1 유전자를 도입하면 세포 증식이 항진되고, 글리아 아종세포에 hDlk-1 유전자를 도입하면 세포 증식능을 획득하는 것이 보고되어 있어, hDlk-1이 발암기작에 관여할 것으로 예상되고 있으므로, 이를 암치료의 표적으로 사용하려는 연구가 활발히 진행되었다. 예를 들어, 한국특허공개 제2009-88893호에는 상기 hDlk-1에 특이적으로 결합할 수 있는 항hDlk-1 항체 및 상기 항체를 포함하는 암 치료용 약학 조성물이 개시되어 있다. 그러나, 상기 항체는 hDlk-1이 발현되어 세포막에 위치한 후에 작용하는 것이기 때문에, 암의 진전을 저해할 수는 있으나, 암을 근본적으로 치료하기에는 부족하다는 단점이 있었다.

한편, 작은 RNA(small RNA, sRNA)는 생체 내에서 유전자 발현을 조절하는 역할을 하는 17 내지 25 뉴클레오티드 정도 길이의 리보핵산을 의미한다. sRNA는 그 생성되는 방식에 따라 크게 마이크로 RNA(microRNA, miRNA)와 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA)로 분류된다. miRNA는 부분적으로 이중나선을 이루는 헤어핀 RNA(hairpin RNA)로부터 생성되며, siRNA는 긴 이중가닥 RNA(double strand RNA, dsRNA)로부터 유래한다. 일반적으로 생체 내의 여러 조절과정에서 중요한 역할을 하는 sRNA는 miRNA이며, 실험 기술적으로 특정 유전자의 발현을 조절하는데 사용되는 sRNA는 siRNA로 분류된다.

상기 miRNA는 19-25 nt 길이의 단일 가닥 RNA(single strand RNA, ssRNA) 분자로서 내재적(endogenous) 헤어핀-구조 전사체(hairpin-shaped transcript)에 의해 생성된다. miRNA는 표적 mRNA의 3' 비번역 영역(UTRs)에 상보적으로 결합하여 전사 후 유전자 억압자(post-transcriptional gene suppressor)로서 작용하며, 번역 억제와 mRNA 불안정화를 유도함으로써 표적 유전자를 억제한다. miRNA는 발전(development), 분화, 증식, 세포사멸 및 신진대사(metabolism)과 같은 다양한 과정에서 중요한 역할을 한다. 이러한 과정들은 가끔 종양형성 동안 교란되며, 많은 miRNA들이 인간 암에서 낮게 유지되는 것으로 볼 때, miRNA는 종양형성에서 역할을 하는 것으로 보인다.

miRNA와 암 사이의 강한 연관이 최근 증명되어 암 생물학 분야에서 새로운 연구 분야로 떠오르고 있으며, miRNA의 발현은 발달과 세포분화 과정 중에 극적으로 변화하고, miRNA 기능에 대한 조절 네트워크에 대한 이전 분석을 통해 상기 분자들이 어떻게 생성되며 조절되는지 이해할 수 있었다.

이에, 본 발명자들은 상기 소세포 폐암을 비롯한 각종 암의 발생을 예방할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구노력한 결과, miRNA의 일종인 miR-143을 이용하여 hDlk-1 유전자의 발현을 억제할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 하나의 목적은 miR-143을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 miR-143을 유효성분으로 포함하는 Dlk-1 유전자 발현억제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 miR-143을 유효성분으로 포함하는 분화촉진용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 miR-143 핵산분자를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 "miR-143 핵산분자("miR-143")"란, 척추동물에서 잘 보존되고, 심장의 형태형성에 관여하는 마이크로 RNA의 일종인 miR-143을 구성하는 단일가닥 또는 이중가닥 형태의 핵산분자를 의미하는데, 사람에서는 5번 염색체의 33번위치의 miR-145와 가까운 위치에 존재하고, 혈청반응 인자인 myocardin 및 nkx2-5의 직접적인 전사표적이며, 그의 발현은 심장의 박동을 통해 후생적으로 조절된다. 본 발명의 목적상 상기 miR-143는 암조직 및 미분화세포에서 과발현되는 Dlk-1 유전자의 발현을 억제하는 억제제로서 사용된다. 상기 miR-143 핵산분자는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 인간을 포함한 동물, 예를 들어 원숭이(monkeys), 돼지(pigs), 말(horses), 소(cows), 양(sheeps), 개(dogs), 고양이(cats), 생쥐(mice), 토끼(rabbits) 등으로부터 유래된 것일 수 있다.

본 발명의 miR-143은 18 내지 100nt(nucleotide) 길이를 가질 수 있으며, 바람직하게는 성숙 miR-143으로서 19 내지 25nt 길이, 더욱 바람직하게는 21, 22 또는 23nt 길이를 가질 수 있으며, 가장 바람직하게는 21nt 길이를 가지는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 RNA가 될 수 있다. 또한, 본 발명의 miR-143은 50 내지 100nt, 바람직하게는 65-95nt 길이를 갖는 전구체 miR-143으로서 제공될 수도 있다.

miR-143: 5'-UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC-3'(서열번호 1)

본 발명에서 사용되는 miR-143은 이를 구성하는 핵산 분자의 작용성 등가물, 예를 들어, miR-143의 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, miR-143과 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함하는 개념이다.

본 발명의 miR-143은 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재할 수 있다. 성숙 miR-143은 주로 단일 가닥으로 존재하지만, 전구체 miR-143은 주로 이중가닥 부분을 형성할 수 있는 적어도 부분적으로 자가-상보적인(예를 들어 스템- 및 루프-구조)이다. 또한, 본 발명의 핵산 분자는 RNA, DNA, PNA(peptide nucleic acids) 또는 LNA(locked nucleic acid) 같은 형태로 구성될 수 있다.

본 발명의 상기 핵산 분자는 표준 분자 생물학 기술, 예를 들어 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법을 이용하여 분리 또는 제조하거나, 시판되는 것을 사용할 수 있다.

또한, 상기 조성물은 miR-143 자체 뿐만 아니라, 세포 내에서 miR-143의 발현율을 증가시킬 수 있는 여타의 물질, 예를 들어 화합물, 천연물, 신규 단백질 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 "예방"이란 조성물의 투여로 암 형성을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 상기 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 미분화된 전지방구세포에서 Dlk-1 유전자인 pref-1이 과발현되지만, 상기 전지방구세포가 분화되면서, pref-1의 발현수준이 감소하고 반면에 miR-143의 수준이 증가하고, 외부에서 miR-143의 유사체를 도입할 경우 pref-1의 발현수준이 더욱 저하됨을 확인하였다(도 1). 또한, 상기 pref-1과 miR-143이 직접적으로 반응하는지를 확인한 결과, miR-143이 pref-1의 3' UTR에 직접적으로 작용함을 확인할 수 있었다(도 2). 뿐만 아니라, miR-143의 억제제를 처리할 경우에는 분화되는 세포에서도 pref-1의 발현수준이 다소 증가하고, miR-143이 과발현되었을 때 pref-1의 하류인 erk1/2의 인산화정도가 감소됨을 확인하였다(도 3).

이처럼, miR-143은 Dlk-1 유전자인 pref-1의 발현을 억제하는데, 상기 pref-1은 미분화세포 뿐만 아니라 소세포 폐암, 신경내분비 종양, 신경아세포종, 신경교종, 1 형 신경섬유종증, 간장암, 신장암, 난소암, 급성 골수성 백혈병 등의 암세포에서도 과발현됨이 알려져 있고, 상기 암세포에서 항-Dlk-1 항체를 이용하여 단백질 수준에서 Dlk-1의 활성을 억제할 경우, 암세포의 증식이 억제되어 항암활성을 나타낼 수 있음이 공지되어 있으므로, 상기 miR-143을 이용하여 암세포에서 pref-1의 발현을 억제할 경우, 암의 발생을 억제하여 예방효과를 나타내거나 또는 발생된 암의 증식을 억제하여 암을 치료하는 효과를 나타낼 것으로 예측되었다. 또한, 상기 miR-143를 포함하는 조성물 역시 동일한 효과를 나타낼 것으로 예상되었다.

상술한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 miR-143을 유효성분으로 포함하는 조성물은 다양한 암에서 과발현되는 것으로 알려진 Dlk-1의 발현을 억제할 수 있으므로, 상기 Dlk-1가 과발현되는 것으로 알려진 암의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 이때, 보다 효과적인 항암활성을 나타내기 위하여, 종래에 알려진 항암제제와 함께 사용될 수도 있다.

상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 희석제, 부형제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 다른 양태로서, 본 발명은 상기 miR-143 핵산분자를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"이란, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 발명은 miR-143 핵산분자를 유효성분으로 포함하는 Dlk-1 유전자 발현 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 "Dlk-1 유전자"란, 전체 길이 383아미노산 잔기를 갖고, 세포 외 영역에 6개의 EGF 유사 모티브를 갖는, 1회 막 관통형의 1형 막 단백질을 코딩하는 유전자를 의미하는데, 경우에 따라서는 pref-1, pG2, SCP-1 및 ZOG라고 호칭되기도 한다. 공지된 바와 같이, 상기 Dlk-1 유전자는 미분화된 세포에서 발현되어 미분화된 세포의 분화를 억제할 뿐만 아니라, 다양한 암세포에서 발현되어 암의 증식을 촉진하는 효과를 나타낸다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 발명은 miR-143 핵산분자를 유효성분으로 포함하는 분화 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 "분화 촉진용 조성물"이란, 미분화된 세포의 분화를 유발시키거나 또는 촉진시키기 위한 조성물을 의미한다. 본 발명의 목적상 Dlk-1 유전자가 과발현되는 미분화세포는 분화가 억제되므로, 상기 miR-143를 포함하는 조성물을 이용하여 Dlk-1 유전자의 발현을 억제시킴으로써, Dlk-1 유전자 발현에 의하여 억제된 세포의 분화를 유발시키거나 또는 촉진시키는데 사용될 수 있다.

본 발명의 miR-143을 포함하는 조성물은 Dlk-1 유전자(pref-1)의 발현수준을 감소시켜서, pref-1의 발현에 의하여 유지되는 전분화세포의 분화를 촉진시킬 뿐만 아니라, pref-1의 발현에 의하여 유발되는 암세포의 진행을 억제할 수 있으므로, 줄기세포를 이용한 세포치료제 또는 항암치료제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 pref-1과 miR-143의 발현 및 miR-143의 과발현에 의한 Dlk-1 유전자(pref-1)의 발현수준 변화를 나타내는 그래프 및 사진이다. 3T3-L1 세포에 분화를 유도하고, 분화유도후 각 반응시간마다 3T3-L1 세포로부터 총 RNA를 수득하고, pref-1와 miR-143를 측정하기 위한 정량적인 실시간 RT-PCR을 수행하였다. Pref-1 mRNA에 대한 보정은 GAPDH로 하였으며, miR-143은 U6 snRNA로 보정하였다. 표는 means ± standard error로 표시되었다. 분화에 따른 pref-1의 단백질 발현은 westen blot을 통하여 측정하였다. 3T3-L1 전지방구 세포에 50uM miR-143 유사체 또는 음성 대조군을 도입하였다. 도입후 48시간 이후 Total RNA를 추출하여 real-time PCR을 수행하였다. Pref-1의 mRNA 발현 값의 보정은 GAPDH로 하였다. miR-143에 과발현에 의한 Dlk-1의 발현양은 웨스턴 블럿 분석으로 측정하였다.
도 2의 (A)는 pref-1의 3' UTR에 위치한 miR-143의 표적 부위를 나타내는 개략도이다. 마우스 pref-1의 3' UTR에 위치한 miR-143의 단일 결합부위를 굵게 표시하였다. (B)는 리포터 플라스미드를 개략적으로 나타낸 개열지도이다. pGL3-pref-1 wt은 pGL3-대조군 벡터에 루시퍼라제 유전자의 뒷 부분에 pref-1 3' UTR을 클로닝하였다. pGL3-pref-1 mu는 pGL3-pref-1 wt 벡터에 pref-1 3' UTR miR-143의 결합부분을 이탤릭체로 표기한데로 부위특이적 돌연변이를 도입하였다. (C)는 pref-1 3' UTR에 대한 miR-143의 특이적인 결합을 나타내는 그래프이다. (B)에서 표시된 벡터를 COS7 세포에 단독으로 또는 miR-143과 조합하여 도입하였다. 도입후 48시간이 경과한 후에, dual luciferase assay kit를 통하여 분석하였다. Renilla 루시퍼라제의 활성은 firefly 루시퍼라제로 정상화되었다. 그래프는 means ± standard error로 표기되었다.
도 3은 miR-143에 의한 Dlk-1 기능 조절을 나타내는 사진이다. (A)는 3T3-L1세포를 완전히 배양하고, miR-NC(negative control; non-targeting miRNA) 및 miR-143 억제제를 도입하고, 48시간이 경과한 후에 성장배지(growth medium, GM)와 분화배지(differentiation medium, DM)을 처리한 세포에서 48시간 후에 총 RNA를 추출한 다음, pref-1의 발현수준을 RT-PCR로 분석한 결과를 나타낸다. (B)는 3T3-L1 세포를 완전히 배양할 때 miR-NC과 miR-143의 유사체를 도입하고 2일 후 DM를 2일간 처리한 다음, 세포에서 단백질을 추출하여 Erk1/2의 활성화를 측정하기 위하여 웨스턴 블럿 분석법으로 phosphor-erk1/2를 측정하고, total erk1/2로 정상화시켰다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 방법

실시예 1-1: 플라스미드 구성

Firefly luciferase reporter pGL3-대조군 벡터(Promega)에 마우스 Dlk-1 유전자(pref-1)의 3' UTR(GenBank Accession No. NM_003836)을 포함하도록 구성하였다. 상기 단편은 PCR로 생성시켰다. 상기 PCR 산물을 제한효소 XbaI로 분해하여 적절한 돌출말단을 생성하였다. 루시퍼라제 프로모터(pGL3- pref-1 wt)의 부위특이적 돌연변이가 QuikChange site-directed mutagenesis kit(Stratagene)를 사용한 사용자 매뉴얼에 따라 수행되었다. Dlk-1 3' UTR의 miR-143 표적영역에서 원래의 서열 TCATCTC를 TCAGACC로 변이시켰다. 염기서열을 분석하여 돌연변이가 제대로 수행되었는지를 확인하였다.

실시예 1-2: 세포배양

3T3-L1 전지방구 세포를 10% 우혈청이 포함된 DMEM 배지에서 배양하고, 배양접시에 가득하도록 배양하였다. 2일이 경과한 후(Day 0), 10㎍/㎖ 인슐린, 1μM DEX, 0.5mM MIX(3-Isobutyl-l-methylxanthine) 및 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지를 사용하여 전지방구세포의 분화를 시작하였다. 48시간이 경과한 후(Day 2), 배양배지를 10㎍/㎖ 인슐린 및 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지로 교체하고, 하루걸러 세포에 배지를 교체하였다. 다시 2일이 경과한 시점에서 세포질내 중성지방 방울이 관찰되었고, 상기 세포는 분화시작으로부터 8일이 경과한 시점에서 완전히 분화되었다.

실시예 1-3: 실시간 PCR 분석

TRIzol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 총 RNA를 3T3-L1 세포로부터 분리하였다. MMLV-reverse transcriptase (Takara, Shinga, Japan) 및 올리고dT 프라이머(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 상기 총 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. BIO-RAD iCycler iQ system (BioRad, Hercules, CA, USA)을 이용한 사용자 매뉴얼에 따라, 실시간 정량을 수행하였다. 형광 역치값은 iCycle iQ system software를 사용하여 산출하였다. 역전사 반응 혼합물을 iQ SYBR Green supermix (BioRad, Hercules, CA, USA)와 함께 반응시켰다. 자료는 comparative cycle threshold method으로 가공되고, 기저 전사수준에 대한 상대적 증가비율로서 표시되었다. 표적 mRNA의 양은 GAPDH mRNA의 수준에 따라 정상화되었다.

상기 사용된 올리고뉴클레오티드는 다음과 같다:

Dlk-1 F: 5'-TGGCTTCTCAGGCAACTTCT-3'(서열번호 2)

Dlk-1 R: 5'-CTTGCACAGACACTCGAAGC-3'(서열번호 3)

GAPDH F: 5'- GACTTCAACAGCAACTCCCAC-3'(서열번호 4)

GAPDH R: 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'(서열번호 5)

miR qRT-PCR을 수행하기 위하여 총 RNA를 TRIzol (Invitrogen)를 사용하여 추출하고; 인간의 miR-143 및 내부대조군인 U6 snRNA에 특이적인 프라이머 및 프로브를 Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)로 부터 입수한 다음; 증폭 및 검출을 BIO-RAD iCycler iQ system을 이용하여 수행하였다(40cycle, 변성 95℃ 15초, 연결/신장 60℃ 60초).

이는 42℃에서 30분간의 역전사 및 85℃에서 5분간의 변성에 의하여 수행되었다.

실시예 1-4: 일시적인 도입 및 루시퍼라제 리포터 분석

일시적으로 miRNA를 도입시키기 위하여, 3T3-L1 세포에 Oligofectamine(Invitrogen)을 이용하여 그의 사용자 매뉴얼에 따라, miR-143 유사체(mimic) 또는 miR-143 억제제(GenePharma, Shanghai, China), 또는 대조군 올리고뉴클레오티드를 도입시켰다. 루시퍼라제 활성을 분석하기 위하여, 리포터 플라스미드를 lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen)를 이용하여 그의 사용자 매뉴얼에 따라, COS7 세포에 도입하였다. Dual-Luciferase assay kit (Promega)를 이용하여 도입후 48시간이 경과한 시점에서 루시퍼라제 활성을 측정하였다. COS7 세포에 pcDNA3.1 또는 pcDNA3.1-miR-143과 조합하여 리포터 플라스미드를 함께 도입시켰다. GloMax20/20 luminometer (Turner BioSystem,USA)를 사용하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다.

실시예 1-5: 웨스턴 블럿 분석

상기 세포를 냉장된 PBS로 세척하고, 냉장된 세포용해 완충액(50mM Tris?HCl, 150mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, protease inhibitor cocktail(Roche, IN, USA), 50mM NaF 및 0.2M Na^3VO^4)으로 용해시켰다. 단백질 추출물을 SDS-PAGE로 분리시키고, 니트로셀룰로스 전이막상에서 웨스턴 블럿을 수행하였다. 이때, 블로킹은 5% 탈지분유를 포함하는 TBS-T로 실온에서 1시간 동안 수행하고, 그런 다음 항-Erk1/2 항-phospho-Erk1/2 항체(cell signaling), 항-Dlk1 항체(pref-1; Santa cruz) 또는 항--actin(Sigma) 항체를 가하여 반응시켰다. PBS로 세척하고, 상기 막에 HRP-결합된 이차항체를 가하여 반응시켰다. 단백질 신호를 화학형광발색 키트(chemiluminescence kit, Santa Cruz Inc.,CA, USA))로 가시화하였다.

실시예 2: 결과분석

실시예 2-1: 지방세포 분화에 따른 miR -143의 변 화

miR-143의 잠재적인 조절활성을 알아보기 위하여, 3T3-L1 세포에서 지방세포의 분화시에 miR-143의 발현양상을 조사하였다. miR-143은 미분화 지방세포에서보다 지방세포로 분화된 세포에서 더 많이 발현됨을 확인하였다(도 1의 A). miR-143의 표적인 pref-1의 발현수준은 지방세포의 분화가 진행됨에 따라 감소하였다(도 1의 A). pref-1의 감소는 유전자 수준에서 뿐 아니라 단백질 수준에서도 분화에 따라 감소함을 확인하였다(도 1의 B). pref-1의 발현 감소가 miR-143의 증가에 따른 것인지 확인하여 보기 위하여, miR-143 유사체를 과발현시키고, pref-1의 발현수준을 확인한 결과, miR-143을 일시적으로 도입하여 과발현시키면 pref-1의 mRNA 뿐 아니라 단백질 수준에서도 감소됨을 확인하였다(도 1의 C 및 D).

상기 결과에서 보듯이, 지방분화시에 miR-143의 발현수준이 증가하고, 이러한 miR-143의 과발현은 pref-1의 발현을 감소시켰으므로, 지방세포의 분화시에 miR-143이 pref-1의 발현을 조절할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 2-2: pref -1의 3' UTR 에 존재하는 miR -143의 표적부위 확인

miR-143이 직접적으로 pref-1을 하향조절하는지의 여부를 확인하기 위하여, pref-1의 3' UTR 부위를 targetscan과 miRANDA로 조사하였다.

pref-1은 3' UTR의 246 내지 252뉴클레오티드 부위에 miR-143의 표적부분이 있는 것으로 예측되었다(도 2의 A). 상기 예측된 부분이 miR-143에 의해 인식되는 지의 여부를 확인하기 위하여 miR-143과 반응할 것으로 추정된 부분이 포함된 리포터 플라스미드와 그 부분에 부위특이적 돌연변이를 도입한 플라스미드를 각각 제조하였다(도 2의 B). pref-1의 3' UTR이 포함된 리포터 벡터의 발현은 miR-143이 과발현될 경우에 60% 이상 억제되었다(도 2의 C). 그러나 miR-143의 표적부위에 돌연변이를 도입한 벡터의 경우 miR-143을 과발현시켜도 리포터 활성이 변화되지 않음을 확인하였다(도 2의 C).

상기 결과로부터 miR-143의 과발현에 의한 pref-1의 발현 억제가 3' UTR에 직접적으로 반응함에 의하여 유발됨을 알 수 있었다.

실시예 2-3: pref -1 활성에 미치는 miR -143의 효과

외부적인 요인에 의한 전지방구 세포의 분화시에 pref-1의 발현이 감소되므로, 이러한 감소가 분화에 따른 miR-143이 증가에 의한 것인지의 여부를 확인하고자 하였다.

miR-143의 억제제를 3T3-L1을 배양할 때 처리하고, 2일 후 성장 배지와 분화배지를 처리하고, 다시 2일 후에 pref-1의 발현수준을 측정하였다. 그 결과, 상기 세포에 분화배지를 처리하면(대조군) pref-1의 발현수준이 크게 감소하지만, miR-143의 억제제를 처리하고 분화배지를 처리한 경우에는 pref-1의 발현이 대조군에 비하여 증가함을 확인할 수 있었다(도 3의 A).

통상적으로, pref-1의 지방분화 억제는 erk1/2를 활성화를 통하여 이루어진다고 알려져 있으므로, miR-143의 발현에 의한 pref-1의 하류(downstream)에 미치는 영향을 조사하기 위하여 erk1/2의 활성화 수준을 측정하였다. miR-143를 과발현시키고, 분화배지를 가한 후에 erk1/2의 인산화 정도를 측정한 결과, miR-143이 과발현되었을 때 erk1/2의 인산화가 감소됨을 확인하였다(도 3의 B).

상기 결과로부터, 지방세포의 분화시에, miR-143이 pref-1의 발현을 감소시키는 조절자임을 알 수 있다.

<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> Composition for inhibiting expression of Dlk-1 gene <130> PA110842/KR <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-143 <400> 1 ugagaugaag cacuguagcu c 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dlk-1 F primer <400> 2 tggcttctca ggcaacttct 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dlk-1 R primer <400> 3 cttgcacaga cactcgaagc 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH F primer <400> 4 gacttcaaca gcaactccca c 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH R primer <400> 5 tccaccaccc tgttgctgta 20

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8. 서열번호 1의 miR-143(microRNA 143) 핵산분자를 유효성분으로 포함하는, 지방전구세포에서 Dlk-1(Delta like 1 homologue) 유전자 발현을 억제하기 위한 조성물.
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