KR20190096414A - 체세포를 유도된 혈관형성 세포로 재프로그래밍하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

체세포를 유도된 혈관형성 세포로 재프로그래밍하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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다니엘 갈레고-페레즈
찬단 센
두르바 팔
숩하딥 가딱
리 제임스 리
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오하이오 스테이트 이노베이션 파운데이션
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Abstract

체세포를 시험관내 및 생체내 둘 다에서 유도된 혈관형성 세포로 직접 재프로그래밍하기 위한 조성물 및 방법으로서 ETV2, FOXC2, FLI1 및 miR-200b 억제제 중 하나 이상을 함유하는 조성물을 사용하는 것을 수반하는 조성물 및 방법이 본원에 개시된다. 이러한 조성물 및 방법은 전-혈관신생 요법의 개발을 포함하여 다양한 목적에 유용하다.

Description

체세포를 유도된 혈관형성 세포로 재프로그래밍하기 위한 조성물 및 방법
관련 출원의 상호 참조
본원은 미국 가출원 제62/438,260호(2016년 12월 22일 출원) 및 제62/530,132호(2017년 7월 8일 출원)의 이점을 주장하고, 이들은 전문이 본원에 참고로 편입된다.
연방 지원된 연구 또는 개발에 대한 설명
본 발명은 국립 보건원(National Institutes of Health)에 의해 수여된 승인 번호 EB017539, GM077185, GM108014, NR015676, NS099869 및 TR001070, 국립 과학 재단(National Science Foundation)에 의해 수여된 승인 번호 EEC-0914790하의 정부 지원으로 수행되었다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 갖는다.
전-혈관신생 세포 요법은 다수의 허혈성 장애를 치료하기 위한 유망한 전략을 제공한다. 그러나, 전-혈관신생 세포 요법에 대한 현재의 접근법은 제한된 세포 공급원/공여체를 포함하는 주요 번역 장애물과 성가시고 위험한 생체외 세포 전처리 단계(예: 유도된 전분화능, 확장, 분화)의 필요성에 직면해 있다. 따라서, 생체내 직접 세포 재프로그로밍을 통한 혈관 유도를 위한 조성물 및 방법이 필요하다.
시험관내 및 생체내 모두에서 체세포를 혈관형성 세포 및/또는 내피 세포로 재프로그래밍하기 위한 조성물 및 방법이 본원에 개시된다. 하나의 구현예는 ETV2, FOXC2 및 FLI1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 둘 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 개시한다. 일부 구현예에서, ETV2, FOXC2 및 FLI1 단백질은 포유류 단백질, 예를 들어, 인간 단백질이다.
일부 구현예에서, ETV2, FOXC2 및 FLI1 단백질은 대략 동일한 비로 발현된다. 일부 구현예에서, ETV2, FOXC2 및 FLI1 단백질은 약 1:1:1, 2:1:1, 1:2:1, 1:1:2, 2:1:1, 2:2:1, 2:1:2, 1:2:2, 3:1:1, 1:3:1, 1:1:3, 3:2:1, 1:2:3, 1:3:2, 2:1:3, 2:3:1, 3:1:2, 2:3:2, 3:2:2, 2:2:3, 3:3:1, 3:1:3, 1:3:3, 3:3:2, 3:2:3 또는 2:3:3 (ETV2:FOXC2:FLI1)의 비로 발현된다.
ETV2, FOXC2 및 FLI1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 하나, 둘 또는 그 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 miR-200b 억제제를 포함하는 조성물도 또한 개시된다.
개시된 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 비바이러스성 벡터도 또한 개시된다. 특별한 구현예에서, 벡터는 재조합 박테리아 플라스미드이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 비바이러스성 벡터는 pCDNA3 백본을 갖는다. 일부 구현예에서, 벡터는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 포함한다.
ETV2, FOXC2 및 FLI1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 둘 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 체세포로 세포내 전달하는 단계를 포함하는, 체세포를 혈관형성 세포 및/또는 내피 세포로 재프로그래핑하는 방법도 또한 개시된다.
또 다른 구현예는 ETV2, FOXC2 및 FLI1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 하나, 둘 또는 그 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 miR-200b 억제제를 체세포로 세포내 전달하는 단계를 포함하는, 체세포를 혈관형성 세포 및/또는 내피 세포로 재프로그래핑하는 방법을 개시한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 FLI1만을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 체세포로 세포내 전달하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 miR-200b 억제제만을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 체세포로 세포내 전달하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 FLI1 및 ETV2를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 체세포로 세포내 전달하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 FLI1 및 FOXC2를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 체세포로 세포내 전달하는 단계를 포함한다.
체세포로 miR-200b 억제제를 세포내 전달하는 단계를 포함하여, 혈관형성 세포 및/또는 내피 세포로 피부 세포 또는 근육 세포에 제한되지 않는 체세포를 재프로그래밍하는 방법도 또한 개시된다. 예를 들어, miR-200b 억제제는 Dharmacon (카탈로그 # IH-300582-08-0005)으로부터 구입될 수 있는 핵산 서열 UAAUACUGCCUGGUAAUGAUGA (서열번호: 1)을 포함하는 항-miR-200b 안타고미어일 수 있다.
일부 구현예에서, 표적 세포를 EFF로 형질감염시킨 후, 이어서 세포는 형질감염된 유전자(예: cDNA)를 EV로 포장할 수 있고, 이는 다른 체세포에서 내피를 유도할 수 있다. 유사하게, miR-200b 억제제로 형질감염된 세포는 EV에서 그 억제제의 일부를 세포외 유출시키는 경향이 있고, 이는 이어서 다른/원격 체세포에서 내피를 유도하는 데 사용될 수 있다. 따라서, ETV2, FOXC2 및 FLI1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 함유하거나 발현하는 세포로부터 생성된 세포외 소포로 체세포를 노출시키는 단계를 포함하는, 혈관형성 세포 및/또는 내피 세포로 체세포를 재프로그래밍하는 방법도 또한 개시된다. 체세포를 miR-200b 억제제를 함유하는 세포로부터 생산된 세포외 소포로 노출시키는 단계를 포함하는, 혈관형성 세포 및/또는 내피 세포로 체세포를 재프로그래밍하는 방법도 또한 개시된다.
이러한 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 및 조성물은 이러한 전달에 적합한 유전자 건, 미세입자 또는 나노입자, 전기천공에 의한 형질감염, 3차원 나노채널 전기천공, 조직 나노형질감염 장치, 이러한 전달에 적합한 리포솜, 또는 심도 국소 조직 나노전기주사 장치를 통해 체세포 또는 공여체 세포로 세포내 전달될 수 있다. 이러한 구현예 중 일부에서, 폴리뉴클레오타이드는 비바이러스성 벡터, 예를 들어, 박테리아 플라스미드로 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스성 벡터가 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드는 바이러스성 벡터, 예를 들어, 아데노바이러스성 벡터에 도입될 수 있다. 그러나, 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 바이러스적으로 전달되지 않는다.
본 발명의 하나 이상의 구현예의 상세함은 수반되는 도면 및 이하 설명에 제시된다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 설명 및 도면, 및 청구범위로부터 분명할 것이다.
도 1a 내지 1i는 EFF TNT가 허혈성 조건하에 피부 조직의 증가된 혈관화 및 구조를 유도한다는 것을 보여준다. 도 1a는 조직 나노형질감염(TNT)을 통해 마우스 등쪽 피부를 EFF로 치료함을 보여주는 개략도이다. 도 1b는 내피 마커 Pecam-1 및 vWF의 증가된 발현에 의해 입증된 바와 같이 증가된 혈관신생을 나타내는 형광 현미경사진이다. 도 1c는 EFF TNT 처리된 등쪽 피부에서 Pecam-1 (약 450% 대조군) 및 vWF (약 200% 대조군, 즉 미처리된 피부)의 유전자 발현 분석을 도시한다. 도 1d는 경시적으로 EFF TNT 처리된 영역에 대한 강화된 관류를 나타내는 고해상도 레이저 스페클 이미징을 도시한다. 도 1e는 EFF TNT 처리된 피부 (점선) 및 대조군 피부 (실선)의 관류 비를 나타내는 그래프이다. EFF TNT 처리된 피부는 대조군 피부에 대해 경시적으로 강화된 관류를 나타낸다. 도 1f는 부모 순환계와 성공적인 문합을 시사하는 박동성 거동을 갖는 표재성 혈관(점선 원)의 존재를 확인하는 EFF TNT 처리된 피부의 초음파 이미지이다. 도 1g는 EFF TNT 처리된 피부와 비교하여 대조군 조직에 대한 플랩 괴사의 증가를 나타내는 단엽 플랩 실험의 결과를 도시한다. 도 1h는 플랩된 EFF TNT-피부로의 혈류 증가를 보여주는 고해상도 레이저 스페클 이미징을 도시한다. 도 1i는 플랩 괴사의 정량화를 나타내는 그래프이다. EFF TNT 처리된 피부는 대조군 피부에 비해 감소된 괴사를 나타냈다. * p < 0.05 (홀름-시닥(Holm-Sidak) 방법).
도 2a 내지 2i는 EFF 유전자 칵테일이 유도된 내피 세포(iEC)로의 더 빠르고 더 효율적인 섬유아세포 재프로그래밍을 구동한다는 것을 도시한다. 도 2a는 HDAF 세포가 3D 나노채널 전기천공(NEP)를 통해 EFF로 형질감염됨을 보여주는 개략도이다. 도 2b는 내피 마커 Pecam-1의 강한 발현뿐만 아니라 형질감염 7일 후 섬유아세포 마커 FSP의 감소된 발현을 보여주는 형광 현미경 사진이다. 도 2c는 2개의 상이한 형질감염 조건에 대한 내피 마커의 유전자 발현 분석 결과를 나타낸다: Etv2 단독 대 EFF의 동시형질감염. 이 분석은 유전자 발현의 현저한 차이를 나타내고, EFF는 Etv2 단독과 비교하여 형질감염 7일 후에 상당히 강한 내피 유전자 발현을 초래한다. 도 2d 및 2e는 EFF-형질감염된 세포가 내피 세포(HMEC, 양성 대조군)에 필적할 만한 매트리겔에서 배양될 때 혈관형 구조를 형성할 수 있었음을 보여주는 튜브 형성 검정으로부터의 결과를 도시한다. 한편, 대조군 HDAF 세포는 매트리겔에서 배양될 때 튜브형 구조를 형성할 수 없었다. 튜브 길이는 대조군 세포의 경우 약 100㎛이었고; EFF-형질감염된 세포의 경우 450㎛이었고; HMEC 세포의 경우 약 375㎛였다. 도 2f는 MEF 세포가 NEP(0일째)를 통해 EFF로 형질감염되고 마우스의 옆구리(1일째)에 주사됨을 나타내는 개략도이다. 도 2g는 EFF로 비바이러스적으로 형질감염된 MEF 세포가 형질감염 후 7일째 조기에 내피 마커 발현을 나타낸다는 것을 보여주는 형광 현미경 사진이다. 도 2h는 EFF 비바이러스적으로 형질감염된 td토마토-MEF 세포를 도시한다. 형질감염은 NSG 마우스의 옆구리 주사 후 혈관 형성을 조성한다. 도 2i는 Pecam-1의 증진된 발현을 나타내는 형광 현미경 사진이다. * p < 0.05 (홀름-시닥 방법).
도 3a 내지 3f는 EFF TNT가 괴사성 허혈로부터 전체 사지를 구조한다는 것을 도시한다. 도 3a는 마우스 대퇴 동맥의 결찰 및 절단(0일째)에 이어 EFF TNT(3일째)를 나타내는 개략도이다. 도 3b는 몇 초만 지속되는 허벅지 피부의 1회 치료가 대퇴 동맥의 절단 후 사지 재관류를 증가시킨다는 것을 보여주는 레이저 스페클 이미징이다. 도 3c는 EFF 치료(실선) 대 대조군(점선) 이후 사지 재관류의 증가를 나타내는 그래프이다. 관류는 허혈 대 정상/대측성 사지의 비를 기준으로 하여 계산되었다. 도 3d는 EFF TNT 처리된 사지(14일째)와 비교하여 조직 괴사의 더 현저한 징후를 나타내는 대조군 사지의 이미지이다. 도 3e는 NMR 스펙트럼이다. 근육 에너지론의 NMR 기반 측정은 대조군과 비교하여 EFF TNT-처리된 사지에 대한 ATP 및 PCr 수준의 증가를 확인했다. 도 3f는 강화된 혈관신생(14일째)을 보여주는 비장근의 면역형광 분석이다. * p < 0.05 (홀름-시닥 방법).
도 4a 및 4b는 EFF-TNT가 Balb/c 뒷다리 허혈 모델에서 괴사성 사지를 구조한다는 것을 도시한다. 도 4a는 EFF TNT 치료 후 성공적인 재관류를 나타내는 사지의 레이저 스페클 이미징을 도시한다. 도 4b는 TNT 치료를 하거나 하지 않고 허혈 사지의 거시적 변화를 도시한다.
도 5a 내지 5e는 EFF TNT 처리된 등쪽 피부로부터 단리된 세포외 소포(EV)가 허혈성 사지 재관류 및 구조를 매개하는 것을 돕는다는 것을 도시한다. 도 5a는 손상/EV-매개된 구조의 개략도이다. 마우스 대퇴(0일째) 동맥의 결찰 및 절단에 이어 EFF TNT 치료(1일째) 후, EV를 대퇴골(2일째)로부터 단리시킨 후, 대퇴골로 다시 주사하였다(3일째). 도 5b는 EV 함량의 qRT-PCR 특성화의 결과를 도시한다. 유전자 발현은 대조군 (미처리된) 마우스에서의 발현에 대해 측정했다. Etv2는 약 175x 대조군 수준으로 발현되었고; Fli1은 약 25x 대조군 수준으로 발현되었고; Foxc2는 약 50x 대조군 수준으로 발현되었고; VEGF(혈관 내피 성장 인자)는 약 26x 대조군 수준으로 발현되었고; bFGF(염기성 섬유아세포 성장 인자)는 약 6x 대조군 수준으로 발현되었다. 도 5c는 강화된 사지 재관류 및 구조를 나타내는 레이저 스페클 이미징을 도시한다. 도 5d는 EFF EV 주사(파선) 대 대조군 (점선) 후 증가된 관류를 나타내는 그래프이다. 관류는 허혈 대 정상/대측성 사지의 비를 기준으로 하여 계산되었다. 도 5d는 EV 처리된 사지에 대한 증가된 혈관신생을 나타내는 비장근의 면역형광 분석을 도시한다. * p < 0.05 (홀름-시닥 방법).
도 6a 및 6b는 피부의 iEC가 Col1A1-발현 진피 공급원으로부터 유래한다는 것을 도시한다. 도 6a는 또한 Pecam-1 내피 마커를 발현하는 Col1A1 기원의 피부 세포를 나타내는 Col1A1-GFP 마우스 모델로부터 EFF TNT 처리된 피부 절편의 형광 현미경 사진을 도시한다. 도 6b는 LCM/qRT-PCR 분석 결과를 도시한다. GFP 트레이서 및 Pecam-1 모두에 대해 면역반응성인 세포 요소를 LCM/qRT-PCR로 추가로 분석하였다. 결과는 이러한 이중-양성 요소가 상당히 높은 내피 마커 유전자 발현을 나타냈다는 것을 나타낸다. Pecam-1은 약 5x 대조군 수준으로 발현되었고; VEGFR2는 약 12x 대조군 수준으로 발현되었고; Col1A1은 약 1x 대조군 수준으로 발현되었다. * p < 0.05 (홀름-시닥 방법), # 0.05 < p < 0.07 (단측 t-테스트). K14-Cre 리포터 및 Col1A1-eGFP 마우스 모델을 이용한 실험은 재프로그래밍된 세포 집단이 대부분 진피 기원을 가졌다는 것을 확인했다. 유도된 뉴런 모델과 달리, 내피 마커를 발현하는 K14 기원 세포의 명확한 증거가 없다. GFP+/CD31+ 세포 요소의 LCM/qRT-PCR 측정은 내피 마커의 증가된 발현을 확인했다.
도 7. 진피 섬유아세포에서 miR-200b의 억제는 iEC로의 직접 전환을 유도한다. (a) 인간 성인 진피 섬유아세포(HADF)에서 FITC 태깅된 miR-200b 억제제의 나노-전기천공 전달 및 유도된 조약돌 내피 세포(iEC) 형성을 보여주는 대표적인 이미지의 개략도. 인간 미세혈관 내피 세포(HMEC)가 양성 대조군으로 사용된다. (b) 대조군 또는 miR200b 억제제 형질감염된 iEC에서 CD90 및 CD31 발현의 유동 세포 계측 분석. 각 플롯(노란색 상자)의 수는 CD31+CD90+ 전이 세포의 백분율을 나타낸다. (c) CD31+CD90+ (좌측) 또는 VEGFR2+섬유아세포+ (우측)에 대한 이중 양성 세포의 정량화를 플롯팅했다(n= 3). 값은 평균 ± s.d., *P <0.001; 대 1일을 나타낸다. (d) cDNA 마이크로어레이(n= 3)에 의한 대조군 또는 miR-200b 억제제 형질감염된 iEC의 유전자 발현 프로파일 분석. 데이터는 7일째에 대조군 억제제 처리된 HADF와 비교하여 miR-200b 억제제 형질감염된 iEC에서 차별적으로 발현된 유전자를 예시하는 '히트 맵' 이미지에 의해 나타낸다. 적색은 유전자가 평균보다 높은 수준에서 발현되고, 그린색은 유전자가 낮은 수준에서 발현된다는 것을 나타낸다. (e) 항-miR200b 형질감염된 iEC(n= 3)에서 Col1A1 및 Fsp-1 (섬유아세포 마커), Cd31 및 Vegfr2 (내피 마커), Tie2 (동맥 마커), Coup-TFII (정맥 마커) 및 Prox1 (림프계 마커) 발현 수준의 정량화. 유전자 발현은 상응하는 18s 값으로 표준화하였고, 대조군 샘플의 값(0일째)에 대한 배수 변화로서 나타난다. 데이터는 평균 ± s.d., **P<0.01; #P<0.05 대 대조군을 나타낸다. (f) iEC(n= 3)에 의한 아세틸화된 LDL (AcLDL) 흡수(상단) 및 평균 AcLDL 섭취(하단)의 정량화의 대표적인 이미지. 스케일 바, 50㎛. (g) 모세관형 구조(상단) 및 시험관내 매트리겔 플러그 검정(n=3)에서 iEC에 의한 튜브 길이(하단)의 정량화를 나타내는 대표적인 이미지. 스케일 바, 200㎛. 인간 미세혈관 내피 세포(HMEC)를 양성 대조군으로 사용했다. 데이터는 평균 ± s.d., *P<0.001 대 대조군 억제제를 나타낸다.
도 8. miR-200b 억제는 Fli-1을 탈사일런싱하여 혈관신생 스위치를 활성화시키는 Etv2 발현을 촉진시킨다. (a) miR 표적 리포터 루시퍼라제 검정은 대조군 또는 miR-200b 모방체 형질감염된 iEC에서 야생형 Fli-1 3'UTR 플라스미드 또는 돌연변이된 Fli-1 3'UTR 플라스미드를 형질감염시킴으로써 연구하였다. 결과는 레닐라 루시퍼라제 활성(n= 6)으로 표준화되었다. 데이터는 평균 ± s.d., *P<0.001 대 야생형 대조군 모방체; **P<0.01 대 돌연변이된 대조군 모방체를 나타낸다. (b) miR-200b 모방체 또는 억제제(inh) 전달된 iEC의 FLI-1 단백질 수준의 웨스턴 블롯 분석(좌측) 및 정량화(우측). β-액틴은 적재 대조군(n= 3)으로서 작용한다. 데이터는 평균 ± s.d., *P<0.001 대 대조군 대조군 억제제. *P<0.05 대 각각의 대조군을 나타낸다. (c) miR-200b inh 또는 Fli-1 siRNA 또는 둘 다로 형질감염된 HADF 세포에서 FLI-1 단백질 수준을 보여주는 웨스턴 블롯 분석 (상단) 및 정량화 (하단). β-액틴은 적재 대조군(n= 3)으로서 작용한다. 데이터는 평균 ± s.d., *P<0.001 (대 각각의 대조군 또는 대 miR-200b inh)로서 표현된다. (d) 튜브형 모세혈관 구조(좌측)를 보여주고, con 또는 Fli-1 siRNA(n= 3)의 부재 또는 존재하에 miR-200b inh 형질감염된 iEC의 7일째(우측) 튜브 길이를 정량화한 매트리겔 플러그 검정의 대표적인 이미지. 스케일 바, 100㎛. 데이터는 평균 ± s.d., *P<0.001 대 각각의 대조군을 나타낸다. (e) Fli-1 사일런싱된 또는 과발현된 HADF 세포에서 Etv2 프로모터에 대한 FLI-1 결합을 보여주는 ChIP 검정. IgG는 음성 대조군(n= 3)으로서 사용된다. (f) Etv2 프로모터 루시퍼라제 활성은 miR200b 모방체 또는 억제제(n= 4)로 동시 형질감염된 Fli-1 사일런싱된 또는 과발현된 HADF 세포에서 GLUC/SEAP 비를 계산함으로써 측정되었다. 데이터는 평균 ± s.d., #P<0.05; **P<0.01을 나타낸다. (g) miR-200b 억제제 또는 Fli-1 siRNA 또는 둘 다(n= 3)로 형질감염된 HADF 세포에서 Etv2 유전자 발현의 정량화. 데이터는 평균 ± s.d., #P<0.05; **P<0.01로서 표현된다.
도 9. miR200b의 상처 유도된 억제에 의해 진피 섬유아세포의 iEC로의 생체내 재프로그래밍. (a) C57BL/6 마우스 피부에서 miR-200b 발현의 RT-qPCR 분석 (좌측) 및 FLI-1 단백질 발현의 웨스턴 블롯 분석 (중간) 및 대조군-LNA 또는 항-miR-200b-LNA의 전달 후 정량화 (우측). 18s는 mRNA 표준화용으로 사용되고, β-액틴은 단백질용 적재 대조군으로서 작용한다(n= 3). 결과는 평균 ± s.d., **P<0.01 대 대조군-LNA이다. (b) C57BL/6 마우스의 상처 가장자리 피부 조직에서 상처 후 일의 FLI-1 발현 (상단) 및 정량화(하단)을 나타내는 웨스턴 블롯. β-액틴은 적재 대조군(n= 3)으로서 작용한다. 결과는 평균 ± s.d., **P<0.01 대 피부이다. (c) 항-CD31-FITC 항체로 염색될 때 그린색 형광과 일치된 (적색 내인성 형광) 섬유아세포를 발현하는 td-토마토를 보여주는 Fsp1-Cre:R26Rtd토마토 마우스를 추적하는 계통의 상처 가장자리 조직의 대표적인 면역형광 이미지. 상처-가장자리 진피 섬유아세포에서 td-토마토 및 CD31의 공편재화는 피어슨 상관 계수(n= 3)를 계산하여 정량화하였다. 스케일 바, 50㎛. *P<0.001 (d) 무손상 피부 및 상처-가장자리 피부 조직으로부터 LCM 포획된 td토마토+ 섬유아세포 세포의 RT-qPCR 분석은 5일째의 Fsp-1 (좌측) 및 Cd31 (우측) 유전자 발현(n= 4)을 나타냈다. 결과는 평균 ± s.d., n.s.=비유의성; *P<0.001 대 피부를 나타낸다. (e) 섬유아세포를 발현하는 td-토마토가 항-CD31-FITC 항체로 염색될 때 그린색 형광과 덜 일치한다는 것을 나타내는 Fsp1-Cre:R26Rtd토마토의 배경에서 STZ 유도된 당뇨병성 마우스의 상처-가장자리 조직의 대표적인 면역형광 이미지. 당뇨병성 진피 섬유아세포에서 td-토마토 및 CD31의 공편재화는 피어슨 상관 계수(n= 3)를 계산하여 정량화하였다. 스케일 바, 50㎛. *P<0.001
도 10. miR-200b의 억제는 Fli-1 발현을 탈사일런싱화하여 당뇨병성 상처 치유를 향상시킨다. (a) Cre/loxP 조절된 섬유아세포 특이적 Fli-1 shRNA 발현을 나타내는 개략도. (b) 상처 가장자리 섬유아세포에서 Fli-1의 표적화된 녹 다운에 대한 연구 설계의 도식도. (c) 대조군-LNA 또는 항-mir-200b-LNA가 스크램블된 LoxP 옆구리 대조군 또는 Fli1 shRNA-EGFP 카세트의 렌티바이러스 (LV) 주사와 함께 상처-가장자리에 전달되는 FSP-Cre 마우스의 대표적인 면역형광 이미지. Cre/loxP 조절된 RNA 간섭으로 인해, 상처-가장자리 섬유아세포는 그린색 형광을 발현했다(좌측). (d) 진피 섬유아세포 (그린색)는 또한 CD31 (적색) 내피 마커 (우측)(n= 6)를 발현한 공초점 이미지의 공편재화 분석을 나타내는 그래프. 스케일 바, 50㎛. 데이터는 평균 ± s.d. **P<0.01 대 con LNA + con shRNA LV; *P<0.001 대 항-miR-200b LNA + con shRNA LV를 나타낸다.
도 11. miR-200b의 억제는 Fli-1 발현을 탈사일런싱하여 당뇨병성 상처 치유를 향상시킨다. (a) 비당뇨병성(n= 3) 및 당뇨병성 인간 대상체(n= 3)의 상처 가장자리 조직에서 miR-200b 및 Fli-1 유전자 발현의 RT-qPCR 분석. 데이터는 평균 ± s.d., *P<0.001 대 비당뇨병성 대상체를 나타낸다. (b) 비당뇨병성 및 당뇨병성 대상체의 상처 가장자리 조직에서 저 (상단) 및 고 (하단) 확대도로 나타낸 FLI-1 단백질의 면역조직화학. 스케일 바, 200㎛. (c) 대조군-LNA 또는 항-miR-200b-LNA (n= 3)으로 처리된 당뇨병성 db/db 마우스의 상처 후-가장자리 조직의 miR-200b 발현의 RT-qPCR 분석. 데이터는 평균 ± s.d., *P<0.001; **P<0.01 대 대조군-LNA를 나타낸다. (d) db/db 마우스의 동일한 상처-가장자리 조직의 FLI-1 단백질 발현 (상단) 및 정량화 (하단)의 웨스턴 블롯 분석. β-액틴은 적재 대조군(n= 3)으로서 작용한다. 데이터는 평균 ± s.d., **P<0.01 대 대조군-LNA를 나타낸다. (e) db/db 마우스의 대조군-LNA 또는 항-miR-200b-LNA 전달된 상처 가장자리 조직에서 CD31 (적색) 및 FSP1 (그린색) (좌측 패널) 및 이의 공편재화 분석(우측)을 나타내는 대표적인 면역형광 이미지. 스케일 바, 200㎛. **P<0.01 대 대조군-LNA (f) 대조군-LNA 또는 항-miR-200b-LNA 처리된 db/db 마우스(n= 4)의 상처 침대에서 혈액 관류를 나타내는 대표적인 이미지. (g,h) 상기 마우스의 10일째 상처 혈관 구조(g) 및 상처 봉합(h)을 나타내는 대표적인 이미지. (i) 상처 봉합은 상기 마우스에서 상처 면적의 백분율을 계산하여 측정하였다. 데이터는 평균 ± s.d., *P<0.001; #P<0.05 대 대조군-LNA를 나타내다. (j) db/db 마우스의 대조군-LNA 또는 항-miR-200b-LNA 전달된 상처 가장자리 조직에서 CD31 (적색) 및 CD105 (그린색) 수준의 풍부함을 나타내는 대표적인 면역형광 이미지. 스케일 바, 500㎛.
도 12. 항-miR200b에 의한 내피 세포에 대한 진피 섬유아세포의 직접 재프로그래밍. (a) 인간 피부 및 상처 가장자리 피부 조직(n= 3)의 miR-200b 발현 수준. 값은 평균 ± s.d., #P <0.05 대 피부를 나타낸다. (b) 차별적 miR-200b 발현은 상처 후 일을 나타내는 C57BL/6 마우스(n= 3)의 진피 섬유아세포-풍부 상처 가장자리 조직의 레이저 포획된 현미해부(LCM)에서 RT-qPCR에 의해 분석했다. 값은 평균 ± s.d., #P <0.05; **P<0.01 대 피부를 나타낸다. (c) HADF 세포를 대조군 또는 miR-200 억제제의 나노전기형질감염 후 1, 4, 7, 10 및 28일째에 유동 세포 계측법 분석에 적용했다. VEGFR2+섬유아세포+ 발현을 갖는 이중 양성 세포 집단의 유동 세포 계측법 게이팅(상단) 및 분석 (하단)의 대표적인 이미지. 각 플롯(노란색 상자)에 매립된 수는 VEGFR2+섬유아세포+ 세포(n= 3)의 백분율을 나타낸다. (d) 7일째에 대조군 또는 miR-200b 억제제 형질감염된 HADF에서 FSP-1 (그린색) 및 CD31 (적색)의 면역형광 세포염색. DAPI는 핵 대조염색(n= 3)을 위해 사용되었다. 스케일 바, 100㎛. (e) 혈관신생, 혈관형성 및 혈관 성장에 관여하는 여러 유전자의 상향조절(적색) 및 하향조절(그린색)을 나타내는 Ingenuity® 경로 분석(IPA®)에 의해 생성된 대조군 또는 항-miR200b 형질감염된 HADF의 마이크로어레이 데이터의 계층적 클러스터링. (f) miR-200b 유도된 내피 세포는 Col1A1, Fsp-1 (섬유아세포)의 저발현 및 Ccl2 (내피) 마커(n= 3)의 고발현을 나타냈다. 데이터는 평균 ± s.d., # P<0.05, 대 대조군 inh를 나타낸다. (g) 항-miR200b 형질감염 후 HADF 세포의 전분해능 인자(Oct4, Sox2, Klf4 및 Nanog)의 유전자 발현 분석. 데이터는 평균 ± s.d., #P<0.05; **P<0.01; ns= 비유의성, 대 대조군(0일째로서)을 나타낸다.
도 13. Fli-1 및 이의 다운스트림 표적 조절의 인-실리코 분석. (a) TargetScan, miRDB, miRanda, PicTar 및 Diana-microT 데이터베이스에 의해 예측된 바와 같이, 각각 인간 및 마우스 miR-200b에 대한 인간 및 마우스 Fli-1 3'UTR에서 추정 결합 부위를 나타내는 인 실리코 연구. (b) 대조군 또는 miR-200b 모방체 또는 억제제 전달된 HADF 세포(n= 3)에서 miR-200b 유전자 발현을 나타내는 RT-qPCR 분석. 데이터는 평균 ± s.d. **p<0.01 대 각각의 대조군을 나타낸다. (c) Fli-1에 대한 가능한 결합 부위를 나타내는 MatInspector 데이터베이스에 의한 Etv2 프로모터 분석. 인간 Etv2 프로모터 영역 GXP_2054052 스패닝-1357/-642 단편은 6개의 Fli-1 (ETS 계열 전사 인자) 결합 부위를 함유하고, 영역 GXP_6038330 스패닝-183/-40은 Etv2의 전사 활성화를 담당하는 Fli-1에 대한 2개의 추정 결합 부위를 함유한다. 마우스에서, GXP_3623379 스패닝 -560/-151의 Etv2 프로모터 영역은 Etv2의 전사 활성화를 담당하는 Fli-1에 대한 5개의 결합 부위를 함유한다. (d) 결합 서열과 함께 인간 및 마우스 Etv2 프로모터 영역 상의 개시 및 종결 위치를 갖는 개별적 Fli-1 (ETS) 결합 부위의 상세한 설명을 보여주는 표. (e) Etv2 사일런싱된 세포 및 Fli-1 과발현된 세포에서 초기 혈관신생 마커(Tie2, Tal1, Cd31 및 Vegfr2)의 유전자 발현 분석. 데이터는 평균 ± s.d., *P<0.001; **P<0.01 대 대조군 세포를 나타낸다.
도 14. 항-miR200b-LNA 전달 후 증가된 상처 혈관신생. (a) C57BL/6 마우스(n= 3)의 피부에서 대조군-LNA 또는 항-miR200b-LNA로 형질감염 후 지시된 일에 레이저 스페클에 의해 측정된 피부 혈액 관류의 대표적인 이미지. 스케일 바, 10mm. (B) LCM에 의한 FSPcre td토마토+ 섬유아세포의 포획 전후를 나타내는 이미지.
도 15. 항-miR200b-LNA 전달 이후 증가된 상처 혈관신생은 Fli-1의 섬유아세포 특이적 사일런싱에 의해 폐기되었다. (a) LoxP 옆구리 Fli-1 shRNA 발현 카세트로 형질감염된 HADF-Cre 세포에서 EGFP 형광을 나타내는 대표적인 이미지. 스케일 바, 100㎛. (b) 4개의 상이한 Fli-1 shRNA 벡터는 STOP 카세트의 Cre 매개된 결실시 진피 섬유아세포에서 검증되었다. cre 재조합 벡터(pCSCre2, G. Ryffel의 선물, Addgene plasmid #31308) 및 4개의 상이한 Fli-1 shRNA 발현 카세트, CC, 대조군 shRNA 작제물 및 VC, 렌티바이러스 Fli-1 shRNA 작제물 각각으로 동시 형질감염된 세포에서 FLI-1 단백질 발현을 나타내는 웨스턴 블롯 (c) 섬유아세포-특이적 Fli-1 녹다운은 또한 Fli-1의 면역염색에 의해 상처 가장자리 조직에서 확인되었다. 상처 후 5일째에 피부 상처 가장자리 조직의 Fli-1 양성 염색의 대표적인 이미지. (d) 대조군 또는 Fli-1 shRNA 렌티바이러스 입자의 부재 또는 존재하에 대조군 LNA 또는 항-miR-200b-LNA로 처리된 마우스에서 상처 후 9일째에 상처 부위에서 혈액 관류의 대표적인 이미지. 스케일 바, 5mm. (e) 상처 관류는 상기한 마우스(n= 4)에서 측정되었다. 데이터는 평균 ± s.d., #P<0.05; **P<0.01 대 각각의 대조군을 나타낸다. (f) 대조군 또는 Fli-1 shRNA 렌티바이러스 입자의 부재 또는 존재하에 대조군-LNA 또는 항-miR-200bLNA로 처리된 마우스에서 상처 후 9일째에 상처 봉합의 대표적인 이미지. 스케일 바, 5mm. (g) 상처 봉합은 상처 면적(n= 4)의 백분율을 계산하여 상기 마우스에서 모니터링했다. 데이터는 평균 ± s.d., **P<0.01 대 각각의 대조군을 나타낸다. (h) 상처 상피화를 나타내는 K14의 면역형광 염색의 대표적인 이미지. 스케일 바, 500㎛.
도 16. 항-miR-200b-LNA의 투여는 db/db 마우스에서 상처 치유의 손상을 약화시킨다. (a) 비당뇨병성 (db/+) 및 당뇨병성 (db/db) 마우스(n= 3)의 혈당치. 데이터는 평균 ± s.d., *P<0.001 대 db/+를 나타낸다. (b) db/+ 및 db/db 마우스(n= 3)의 무손상 및 상처 피부에서 miR-200b 유전자 발현의 RT-qPCR 분석. 데이터는 평균 ± s.d., #P<0.05 대 무손상 피부를 나타낸다. (c) 4일째(n= 3) 대조군-LNA 또는 항-miR-200b-LNA로 처리된 db/db 상처에서 ETV2 단백질 수준의 풍부함을 보여주는 웨스턴 블롯. b-액틴은 적재 대조군으로서 작용한다. (d) 상처 관류는 상기한 마우스(n= 4)에서 측정되었다. 데이터는 평균 ± s.d., *P<0.001; **P<0.01 대 각각의 대조군 LNA를 나타낸다. (e) 대조군-LNA 상처와 비교하여 db/db 마우스의 항-miR-200b LNA 전달된 상처에서 딱지(10일째)의 초기 흘림을 보여주는 딱지 쉐딩 곡선. 그린색 선은 항-miR-200b-LNA 처리된 상처를 나타내는 반면, 적색 선은 대조군 LNA 처리된 상처를 나타낸다. (f,g) db/db 마우스의 대조군-LNA 및 항-miR-200b-LNA 전달된 상처 조직에서 CD31 (적색) 및 CD105 염색의 면역형광 이미지. 스케일 바, 각각 500mm(f) 및 1000mm(g).
도 17. TNT는 형질감염 경계를 넘어 향상된 재프로그래밍 인자 전달 및 전파를 매개한다. (a) 박리된 피부 조직에서 TNT 과정의 개략도. 박리는 피부 표면으로부터 죽은 세포를 제거하는 데 필요하다. 양극은 피내에 삽입되는 반면, 음극은 화물 용액과 접촉하게 된다. 이어서, 펄스화된 전기장(250V, 10ms 펄스, 10펄스)을 전극을 교차하여 인가하여 노출된 세포막을 나노천공시키고 화물을 사이토졸에 직접 주사한다. 나노기공 어레이를 나타내는 TNT 플랫폼 표면의 주사 전자 현미경사진(상단). (b) 모의실험 목적을 위한 경계 상태를 나타내는 개략도. 나노채널은 최외각 세포 층과 직접 접촉한다. (c) TNT (실선) 대 BEP (파선)를 경험하는 상이한 세포(즉, 패널 "b"로부터 세포 1, 3 및 5)의 천공 프로파일의 모의실험. 이 플롯은 TNT가 초점을 맞춘 천공을 유도하는 반면, BEP가 광범위한 천공을 유도한다는 것을 나타낸다. (d) 형질감염(n= 5) 후 24시간에 TNT 대 BEP에 대한 ABM 발현 결과. TNT는 우수한 ABM 발현을 유도했다. BEP는 ABM 플라스미드의 피내 주사에 이어 펄스화된 전기장에 의해 수행되었다. BEP 실험을 위한 대조군은 전기장 구현 없이 ABM 플라스미드의 피내 주사를 포함한다. (e) 대표적인 IVIS 형광 및 (f) 각각 표지된 DNA 및 ABM 인자로 TNT 치료 후 마우스 피부의 공초점 현미경 이미지. GFP는 Ascl1 플라스미드의 리포터 유전자이다. (g) 유전자 발현이 표피 형질감염 경계(n= 5-6)를 넘어 전파되었음을 보여주는 표피 및 진피(t= 24시간)에서 유전자 발현의 레이저 포획 현미해부(LCM) 및 qRT-PCR 결과. (h) 표피에서 진피로의 EV-매개된 형질감염 전파의 개념을 나타내는 개략도. (i) ABM cDNAs/mRNAs (n= 6-8)의 유의한 적재를 나타내는 EV 화물의 qRT-PCR 분석. (j) EV가 형질감염 및 재프로그래밍을 전파하기 위한 실행 가능한 비히클인지의 여부를 확인하기 위한 실험적 설계. (k) TNT 처리된 피부로부터 단리된 EV(그린색)를 자발적으로 내부화한 마우스 배아 섬유아세포(적색)를 보여주는 공초점 현미경 사진. (l) ABM-형질감염 피부로부터 단리된 ABM-적재된 EV에 24시간 노출 후 7일째 iN을 나타내는 MEF 배양물. 증가됨을 나타내는 면역염색 결과(4주) (m) ABM 형질감염 후 피부에서 Tuj1 및 (n) 신경필라멘트 (NF) 발현. (o) 신경 세포 클러스터 흥분성(n=8, p<0.05, 피셔의 정확한 테스트)의 결과로서 세포외 틈새의 이온 농도(삽입 부위당표준으로부터의 평균 표준 편차로서 정량화됨)의 변화를 나타내는 통계적으로 대표적인 막대 플롯으로서 제시된 전기생리학적 활성. 이 평균은 각 ABM 또는 대조군 마우스에 대해 5 내지 10회 시험(시험당 100회의 연속 별개 측정)에 대해 계산했다. 활성은 기준선(점선, 생리학적 식염수 용액에서 측정된 실험적 잡음으로서 확립됨)을 초과하는 이온 농도의 변화로 정의되었다. 각 막대는 독립적인 마우스에서 수집된 결과를 보여준다. * p<0.01 (Dunn's), # p<0.01 (터키 테스트(Tukey Test)), ## p<0.05 (홀름-시닥 방법).
도 18. EFF TNT는 허혈 상태하에 피부 조직의 증가된 혈관화 및 구조를 유도한다. (a-c) 몇 초만 지속하는 등쪽 피부의 1회 치료는 피부 조직(7일)(n= 3)의 혈관신생(Pecam-1, vWF)을 증가시켰다. (d, e) 고해상도 레이저 스페클 이미징은 경시적으로 EFF 처리된 영역(n= 5)에 대한 강화된 관류를 나타냈다. (f) EFF 처리된 피부의 초음파 이미징은 부모 순환계와 성공적인 문합을 시사하는 박동성 거동을 갖는 표피상 혈관(점선 원)의 존재를 확인했다. (g) EFF 처리된 피부와 비교하여 대조군에 대한 증가된 플랩 괴사를 보여주는 단엽 플랩 실험. (h) EFF TNT로 처리된 플랩화 조직으로의 혈류 증가를 보여주는 레이저 스페클 이미징. (i) 플랩 괴사(n=6)의 정량화. * p<0.05 (t 테스트), ## p<0.05 (홀름-시닥 방법).
도 19. EFF TNT는 괴사성 허혈로부터 전체 사지를 구조한다. (a-c) 몇 초만 지속하는 허벅지 피부의 1회 치료가 대퇴 동맥의 절단 후 사지 재관류를 증가시켰다. 관류는 허혈 대 정상/대측성 사지(n= 5-7)의 비에 기초하여 계산되었다. (d) EFF 처리된 사지(14일)와 비교하여 조직 괴사의 더 현저한 징후를 나타내는 대조군 사지. (e) 근육 에너지론의 NMR-기반 측정은 대조군과 비교하여 EFF 처리된 사지에 대한 ATP 및 PCr 수준의 증가를 확인했다. (f) 향상된 혈관신생을 나타내는 비장근의 면역형광 분석. ## p<0.05 (홀름-시닥 방법).
도 20. TNT 플랫폼 제조 및 나노채널 어레이 모의실험. (a) 양면 연마된 규소 웨이퍼. (b-d) 나노채널 패펀화 및 DRIE. (e) 에칭된 나노채널의 주사 전자 현미경(SEM) 이미지. (f) 미세저장소의 뒷면 에칭. (g) SEM 현미경 사진 및 (h, i) 상이한 조건하에 각각 에칭 프로파일 및 에칭 속도를 나타내는 플롯. (j, k) 비대칭성(즉, T-형) 나노채널 어레이 대 대칭성(즉, 십자형) 어레이에 대한 장 분포(j1, k1) 및 열 소산 프로파일(j, k 2-3)을 나타내는 모의실험 결과. 벌크 전기천공(BEP)은 생체내 비바이러스성 유전자 전달을 위한 현재의 금 표준이다. 그러나, BEP에서의 유전자 흡수는 비균일한 전기장에 의해 영향을 받을 뿐만 아니라 각각 1-3 엔도사이토시스 및 확산과 같은 다운스트림 및/또는 보다 수동적인 과정에 의해서도 매우 확률적인 과정이다. 이와 같이, 생체내에서 보다 활동적이고 결정론적인 유전자 전달을 촉진시키는 간단한 접근법이 분명히 필요하다. 여기서, 청정실 기반 기술(즉, 투사 리소그래피, 접촉성 포토리소그래피 및 심도 반응성 이온 에칭 -DRIE-)을 실행하여(도 20 a-i)) 자연적으로(예: 피부) 또는 수술로 접근가능한(예: 골격근) 조직 표면에 보다 결정론적인 방식으로 활성 비바이러스성 유전자 전달을 위한 규소 기반 TNT 장치를 촉진시켰다. TNT 플랫폼은 유전적 화물을 조직으로 형질도입되도록 유지할 수 있는 마이크로스케일 저장소에 상호 연결된 클러스터 나노채널의 대규모 병렬 어레이로 구성된다. 간단하게, 약 400 내지 500㎚ 채널의 어레이를 먼저 약 200㎛ 두께의 양면 연마된 규소 웨이퍼의 표면에서 투사 리소그래피 및 DRIE를 사용하여 규정했다. 모의실험 연구는, 이러한 비대칭성 T형 어레이가 더 대칭성인 나노기공 분포와 비교하여 전기장 분포 및 열 소산과 관련하여 몇몇 고유한 이점을 제공하고, 나노채널의 비대칭성 클러스터가 낮은 비활성 영역(도 20j1, k1, 적색 별)을 나타내는 동시에 피크와 계곡 온도를 20 내지 25%까지 감소시킨다(도 20j2-3, k2-3)는 것을 시사한다. 이어서, 나노채널과 병치된 마이크로저장소의 어레이의 접촉성 리토그래피 기반 패턴화 및 DRIE-매개된 드릴링이 이어졌다. 마지막으로, 플랫폼 표면은 질화규소의 얇은 절연층으로 부동태화되었다.
도 21. 생체내 나노채널 기반 전기천공 대 벌크 전기천공(BEP)의 모의실험 결과. (a) 실험 설정을 나타내는 개략도. (b, c) 250V 자극하의 모의실험된 전압 분포. (d-f) 단일 세포 벌크 전기천공에 대한 막관통 전위의 모의실험. (g) 나노채널에서 멀리 떨어져 있는 세포(세포 2 및 세포 3)와 비교하여 나노채널과 직접 접촉하는 세포(세포 1)에 대한 천공 프로파일. (h) TNT 대 BEP에서 천공 프로파일.
도 22. EV-매개된 세포 재프로그래밍. (a) 실험 설정을 나타내는 개략도. EV는 ABM TNT 처리된 등쪽 피부로부터 수집된다. (b) EV로부터 ABM 카피 수는 표준 절차에 따라 정량화하고, TNT를 통해 (형질감염 직후에 수집된 피부 조직으로부터) 직접 전달된 유전자 카피 수와 비교했다. 간단하게, 절대 qPCR 정량화는 CT 값을 표준 곡선에 관련시킴으로써 처리된 샘플 내에서 표적 유전자의 카피 수를 평가하는 데 사용되었다. 표준 곡선은 각 유전자/플라스미드의 10배 일련의 희석 시리즈를 사용하여 생성하였다. 예상된 바와 같이, 상당량의 ABM 카피는 EV 단리물에서 검출되었고, 이는 TNT를 통해 직접 전달되는 유전자 카피 수의 더 낮은 범위 내에 속한다. (c) MEF 세포가 시험관내에서 피부 유래된 EV에 노출된 추가의 실험은 ABM-적재된 EV에 노출될 때 iN의 존재에 의해 입증된 바와 같이 이러한 카피 수 크기가 양성 재프로그래밍 결과에 도움이 된다는 것을 추가로 나타낸다.
도 23. TNT 처리된 등쪽 피부로부터 단리된 자가 ABM-적재된 EV는 순수한 마우스에 피내 주사될 때 신경영양성 특징을 나타낸다. (a) 실험 설정을 나타내는 개략도. EV는 ABM TNT 처리된 등쪽 피부로부터 수집하고, 순수한 마우스에게 주사한다. (b) 14일 후에 수집된 조직 생검은 대조군 (미처리된) 마우스와 비교하여 Tuj1 발현의 증가를 나타낸다. ABM-적재된 EV는 Tuj1 발현을 약 26배 증가시킨다. 비교적, ABM TNT는 Tuj1 발현을 약 94배 증가시키고, 이는 EV-매개된 전파와 조합된 직접 재프로그래밍 인자 주사의 순 효과를 반영한다. 이 경우에 대조군 시험편은 미처리된 피부 생검이다. n= 3. * p<0.05 (홀름-시닥 방법).
도 24. TNT 처리된 등쪽 피부로부터 단리된 자가 ABM-적재된 EV는 MCAO 뇌졸중 마우스 (C57BL/6) 모델에서 신경영양성 특징을 나타낸다. (a) 실험 실정을 나타내는 개략도. MCAO 뇌졸중이 먼저 유도된다. 이어서, EV의 두개내 주사 전에 등쪽 피부로부터 ABM 또는 대조군 TNT 치료 및 EV 단리가 이어진다. (b, c) EV 주사 후 7일만에 경색된 용적의 유의한 감소를 나타내는 MRI 이미징 및 정량화. (d) 뇌실하(SVZ) 영역으로부터 경색 영역(흰색 화살표)을 향해 돌출하는 DCX+ 세포/과정을 나타내는 뇌졸중 유도 후 21일째의 면역형광 이미징. 대조군 뇌 중 DCX+ 세포는 대부분 SVZ 영역의 벽을 라이닝하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 예비 결과는 친뉴런 인자가 적재된 생체내 유래된 EV에 대한 잠재적인 치료 효과를 시사한다. n= 4-5. * p<0.05 (홀름-시닥 방법).
도 25. GeneChip® 마이크로어레이 및 IPA® 분석 및 클러스터링 알고리즘을 사용하여 시험관내 iN 대 생체내 iN 사이의 유전자 발현 프로파일 상동성의 동정. ABM-형질감염된 마우스 피부(생체내 iN)로부터 시험관내 생성되거나 레이저 포획 현미 해부된 iN은 뮤린 전사체 어레이(MTA 1.0) 분석에 이어 클러스터링 알고리즘을 사용하는 데이터 마이닝에 적용했다. 시험관내 유래된 iN 배양물은 ABM6의 비바이러스성 전기천공 기반 전달을 통해 수득되었다. 시험관내 iN 대 생체내 iN 사이의 발현 패턴에서 상동성을 동정하기 위해, 26225개의 주석이 달린 프로브 세트를 k-수단 자율 학습 알고리즘을 사용하여 16개의 그룹으로 클러스터링했다. 시험관내 iN 대 생체내 iN 사이의 발현 패턴 상동성을 나타나는 3503개의 프로브 세트의 클러스터는 IPA® 분석 및 계층적 클러스터링에 적용했다. (a) 히트 맵은 재프로그래밍되지 않은 섬유아세포 그룹과 비교하여 상당히 상이한 유전자(528)를 나타낸다. (b) 유전자 발현의 유도를 보여주는 IPA® 분석. (b)에 대한 추가의 상세함은 이하 표 1 및 2를 참조한다. 마이크로어레이-IPA® 분석은 시험관내 및 생체내 유래된 iN 둘 다에서 (특히) 후각 반응과 관련된 유전자의 큰 클러스터를 포함하여 뇌 조직 발달에 관여하는 유전자의 유도를 동정했다. 생체내 그룹에서 보다 강한 유도가 관찰되었다.
도 26. 피부의 전기생리학적 활성의 동일반응계 측정. (a) 실험 구성(PPy(DBS) 작업 전극, 진피층으로 대략 1 내지 2mm 분리로 삽입되고 20초 동안 5Hz 산화-환원 사건 동안 생리학적 식염수와 이온 결합된 Ag/AgCl 반대 전극 와이어)으로부터 데이터 수집(빠른 산화-환원 사건을 일으키고 생성되는 전류를 측정하는 입력 전위), 후처리(작업 전극 부근에서 수송 현상에 참여하는 이온의 수를 계산하고 전기 전도성 패러데이 재료에 대한 전하 방정식을 적합화하고, 전체 시간 의존 반응을 이의 평균으로 나누어 실험적 편향을 제거함으로써 데이터 세트를 표준화하고, 표준 편차를 계산하여 국소 세포의 흥분성을 정량화함을 통해 시간 의존적 농도 변화를 유도함) 및 해석(표준화된 플롯으로부터 생성되는 편차가 배경 전기 잡음보다 높아 PPy(DBS) 상단 근처의 세포가 흥분성 세포인지를 결정한다)으로의 생체내 작용 전위 감지 과정을 상세화하는 정보 흐름도, (b) 전도성 중합체의 근접 장에서 이온 수송을 묘사하고 이온 전달 속도에 대한 농도 의존성을 입증하는 개념적 개략도 뿐만 아니라 흥분성 및 비흥분성 세포가 주변 매질을 조절하는 방식 사이의 차이를 입증하는 개념적 개략도, (c) 1초 동안 작업 전극 및 반대/참조 전극 사이의 유입 전위(V)의 플롯, 동일한 1초 동안 측정된 전류(μA) 반응으로부터 계산된 생성 전하(μC), 환원 사건 동안 농도 의존적 K2의 값을 결정하는 전하 방정식의 적합도, 및 대표적인 K2 대 대표적인 ABM 처리된 (흥분성) 및 대조군 샘플에 대한 시간 플롯.
도 27. 피부의 iN은 표피 및 진피 공급원으로부터 기원한다. (a) K14-Cre 리포터 마우스 모델 및 (b) Tuj1 신경 마커를 또한 발현시키는 K14, 또는 Col1A1 기원(그린색/GFP)의 피부 세포를 보여주는 Col1A1-GFP 마우스 모델로부터 ABM 처리된 피부 절편의 형광 현미경 사진. Tuj1을 위해 사용된 2차 항체는 CY5-태깅되었고, 방출 신호는 의사착색된 적색이었다. td토마토 배경 채널은 병합된 이미지로부터 제외되었다. 스케일= 20㎛. (a.1, b.1) GFP 트레이서 및 Tuj1 둘 다에 대해 면역반응성이었던 세포 요소를 LCM/qRT-PCR에 의해 추가로 분석하였다. 결과는, 이러한 이중 양성 요소가 상당히 높은 뉴런 마커 유전자 발현 및 중간 내지 현저하게 감소된 피부 세포 마커 유전자 발현을 나타냈다는 것을 나타낸다. n= 3. * p<0.05 (홀름-시닥 방법). 케라틴 14 양성 (K14+) 세포가 궁극적으로 td토마토 발현으로부터 eGFP로 전환하는 ROSA 유전자좌의 cre-매개된 재조합을 겪는 K14-Cre 리포터 마우스 모델을 이용한 계통 추적 실험은 새롭게 유도된 뉴런이 부분적으로 K14+ 피부 세포로부터 유래되었다는 것을 확인했다. 활성 Col1A1 프로모터를 가진 세포가 eGFP를 발현하는 Col1A1-eGFP 마우스 모델을 이용한 실험은 Tuj1+로의 전이 단계에서 진피로부터 콜라겐/eGFP+ 세포의 수를 나타냈다. 이러한 세포들에서의 지속적인 Col1A1/GFP 활성은 섬유아세포와 유도된 뉴런 사이의 점진적인 표현형 이동을 분명히 반영한다. LCM은 GFP+ 및 Tuj1+ 둘 다인 유전자 도입 마우스 모델의 조직 절편으로부터 세포 요소의 유전자 발현 프로파일을 포획하고 추가로 특성화하는데 사용되었고, 이는 K14 기원이었으나 뉴런 마커를 발현하는 세포 또는 뉴런의 운명으로 전이하는 활성 콜라겐 프로모터(예: 섬유아세포)를 갖는 세포에 상응한다. 본 결과는 이러한 요소가 실제로 친뉴런 마커의 증가된 발현, 및 기원 세포 마커(즉, K14, Col1A1)의 감소된 발현을 나타냈다는 것을 나타냈다.
도 28. EFF 유전자 칵테일은 내피 운명(iEC)으로의 보다 빠르고 더 효율적인 섬유아세포 재프로그래밍을 유도한다. (a) HDAF 세포는 EFF로 비바이러스적으로 형질감염되었다. (b) 내피 마커 Pecam-1의 강한 발현 뿐만 아니라 섬유아세포 마커 FSP(t= 형질도입 후 7일)의 감소된 발현을 나타내는 형광 현미경 사진. (c) 두 개의 상이한 형질도입 조건(Etv2 단독 대 EFF의 동시-형질감염)에 대한 내피 마커의 유전자 발현 분석. 결과는 유전자 발현의 현저한 차이를 보여주고, EFF는 Etv2 단독과 비교하여 형질도입후 7일째에 상당히 더 강한 내피 유전자 발현을 유도한다. (d, e) EFF-형질도입된 세포가 내피 세포(HMEC, 양성 대조군)에 필적할 만한 매트리겔에서 배양될 때 혈관형 구조를 형성할 수 있었음을 보여주는 튜브 형성 검정으로부터의 결과. 한편, 대조군 HDAF 세포는 매트리겔에서 배양될 때 튜브형 구조를 형성할 수 없었다. (f) EFF 형질감염 후 1일, 3일 및 7일째에 내피 및 섬유아세포 마커 발현의 유동 세포 계측법 기반 분석. 3일 및 7일째까지, 집단의 약 6% 및 17%가 대조군 세포와 비교하여 각각 Pecam-1의 발현을 나타냈다. 이러한 동역학은 등쪽 피부에서 EFF TNT에 따른 증가된 관류에 대한 타임라인과 일치한다(도 19). 그러나, EFF TNT에 대한 생체내 관류의 증가는 기질 조직을 혈관 조직으로 재프로그래밍함으로써 반드시 완전히 구동될 수 있는 것은 아니다. 기존 혈관의 리모델링/스프라우팅도 또한 기여 인자일 수 있다. (g, h) EFF로 비바이러스적으로 형질감염된 MEF 세포도 또한 형질감염 후 7일째 조기에 내피 마커 발현을 나타낸다. (i, j) EFF로 비바이러스적으로 형질감염된 td토마토-MEF 세포는 NSG 마우스의 옆구리 주사 후 혈관 형성을 조성했다. n=3-4. * p<0.05 (홀름-시닥 방법).
도 29. 내인성 Foxc2 발현의 변동. 피부에서 상대적인 Foxc2 발현은 (a) 다수의 위치 또는 (b) 상이한 마우스 (동일한 위치)로부터 생검화했다. n=3. 최근 시험관내 연구가 렌티바이러스 Etv2 벡터의 게놈 통합이 높은 수준의 내인성 Foxc2를 갖는 세포주로 직접 내피 재프로그래밍을 유도할 수 있다는 것을 보고하였지만, 흔한 Foxc2 발현은 생체내에서 유의적으로 변하여(도 25) 일부 경우에 낮은 수준의 내인성 Foxc2 발현이 Etv2 단독의 비바이러스성 에피솜 발현을 통한 성공적인 내피 유도를 방해할 수 있음을 암시한다. 이와 같이, Etv2, Foxc2 및 Fli1 (EFF)에 기초하는 전사 인자의 새로운 칵테일이 제안되었고 시험되었다. Fli1은 공지된 인트론 인핸서이고, 따라서 재프로그래밍 칵테일 효능17을 강화시키는 능력을 가질 수 있었다.
도 30. EFF 처리된 피부는 강화된 세포 증식의 징후를 나타낸다. (a) repTOPTM mitoIRE 마우스의 IVIS 발광 분석은 EFF TNT 처리된 마우스(적색 점선)의 등쪽 피부에서 증식 활성을 확인한다. 이러한 마우스는 세포 증식18 동안 특이적으로 유도된 사이클린 B2 유전자로부터 유래된 인공 프로모터의 조절하에 루시퍼라제 리포터를 발현한다. (b) 내피 마커(Pecam-1)에 의한 증식 마커(Ki67)의 공편재화를 보여주는 등쪽 피부의 면역형광 분석.
도 31. 피부의 iEC는 Col1A1-발현 진피 공급원으로부터 유래된다. (a) 그들이 아마도 섬유아세포로부터 내피 표현형으로 전이하기 때문에 Pecam1 내피 마커를 또한 발현시키는 Col1A1 기원(그린색)의 피부 세포를 보여주는 Col1A1-GFP 마우스로부터 EFF TNT 처리된 피부 절편의 형광 현미경 사진. (b) GFP 트레이서 및 Pecam1 둘 다에 대해 면역반응성이었던 세포 요소를 LCM/qRT-PCR로 추가로 분석하였다. 결과는, 이러한 이중 양성 요소가 상당히 높은 내피 마커 유전자 발현을 나타냈다는 것을 나타낸다. n=3. * p<0.05 (홀름-시닥 방법), # 0.05<p<0.07 (단측 t-테스트). K14-Cre 리포터 및 Col1A1-eGFP 마우스 모델을 이용한 실험은 재프로그래밍된 세포 집단이 대부분 진피 기원을 가졌음을 확인했다. 감소된 뉴런 모델과 달리, 내피 마커를 발현하는 K14 기원 세포의 명백한 증거는 없었다.
도 32. 대퇴 동맥의 절단 뿐만 아니라 EFF 처리된 사지에서 부수물의 발생률 증가를 확인하는 HRLS 및 초음파 이미징. (a) HRLS 이미징은 그들의 비허혈성 대응물과 비교하여 대조군 및 EFF 처리된 마우스 둘 다의 허혈성 사지에서 대퇴 동맥으 부재를 확인한다. EFF 처리된 사지(백색 화살표)에서 발생하는 확산 LS 신호는 아마도 사지 재관류를 매개하는 작은 구경의 부수적인 혈관의 존재를 시사한다. (b) 초음파 영상은 또한 허혈성 사지에서 대퇴 동맥의 부재를 확인하여 사지 재관류가 심한 대퇴 동맥의 회복이 아니라 새로운/작은 부수물의 발달에 의해 조절될 수 있음을 추가로 시사한다.
도 33. EFF 형질감염은 Balb/c 뒷다리 허혈 모델에서 괴사를 예방하는 것을 돕는다. (a) EFF 형질감염 후 성공적인 재관류를 보여주는 사지의 레이저 스페클 이미징. (b) EFF 치료를 하거나 하지 않고 허혈 사지의 거시적인 변화.
도 34. Fsp1-Cre:R26Rtd토마토 마우스 모델을 사용하여 수행된 뒷다리 허혈 실험은 비장근에서 Pecam-1+ 세포의 일부가 또한 양성 td토마토 리포터 신호(백샌으로 도시된 공편재화)를 나타내어 가능한 섬유아세포 기원(예: 골격근 섬유아세포)을 시사함을 보여준다.
도 35. EFF TNT 처리된 등쪽 피부로부터 단리된 EV는 허헐성 사지 재관류를 매개하는데 도움을 준다. (a) 손상/EV-매개된 재관류의 개략도. (b) EV 함량의 qRTPCR 특성화. 이러한 EV는 다세포 조직 구조로부터 단리되었고, 따라서 이러한 배수 변화는 아마도 EFF (및 추가의 인자) 화물을 거의 내지 전혀 수반하지 않는 EV 및 비교적 다량의 EFF를 갖는 EV 사이의 평균 값을 나타낸다. 추가의 실험(도 25)은 이러한 EV가 원격 순수 세포를 재프로그래밍할 수 있음을 확인했다. (c, d) 레이저 스페클 재관류 분석. (e) 대조군(즉, 블랭크/모의 용액을 사용하여 TNT 처리된 등쪽 피부로부터 유래된 EV)과 비교하여 EFF EV 처리된 사지에 대해 증가된 혈관신생을 보여주는 비장근의 면역형광 분석. (f) 비복근으로 EV 주사 후 혈관 마커의 동시 발현을 보여주는 고배율 현미경 사진. 이러한 예비 결과는 친-내피 인자가 적재된 생체내 유래된 EV에 대한 잠재적 치료(전혈관형성) 효과를 시사한다. n=3. * p<0.05 (홀름-시닥 방법).
도 36. EFF-형질감염된 피부로부터 유래된 EFF-적재된 EV는 순수한 세포에서 재프로그래밍을 조절할 수 있다. (a) EV는 상이한 시점에 TNT 처리된 (EFF 대 대조군) 등쪽 피부로부터 단리되었고, 나노시력을 통해 분석했다. (b) EFF 형질감염은 EV 방출을 증가시켰다(>24 h)(n=3). (c) MEF 세포를 EFF-적재된 EV에 노출시키면 대조군 EV에 노출된 MEF 배양물에서는 관찰되지 않은 별개의 Pecam-1+ 세포 포켓의 형성을 유도했다. 그러나, 재프로그래밍 효율은 EFF 플라스미드의 직접 나노채널 기반 주사와 비교하여 더 낮은 것으로 보인다(도 27). 이는 잠재적으로 전달 기전의 차이(예: 직접 전기-주사 대 엔도시토시스/융합), 및/또는 시험관내 및 생체내 미세환경 사이의 국소 농도의 차이를 포함하는 다수의 인자에 기인할 수 있다. 부가적인 실험은 (d) EFF-적재된 EV를 손상되지 않은 조직(즉, 등쪽 피부)에 주사하면 Pecam-1 및 vWF와 같은 내피 마커를 발현하는 세포 성분의 현저한 증가를 유도했음을 보여주었다. (e) 그러나, 레이저 스페클 분석은 대조군 EV(적색 파선)(n= 4)와 비교하여 3일 후 피부 관류에서 완만한(약 20%, p>0.05, ANOVA) 증가만을 보여주었다. 이러한 결과는, EFF-적재된 EV에 의해 제공된 자극이 건강한/무손상 조직19에서 혈관 항상성을 조절하는데 책임이 있는 익히 공지된 혈관신생 기전의 작용을 극복할 가능성이 적음을 시사한다. * p<0.05 (홀름-시닥 방법).
도 37. TNT-기반 올리고 RNA 전달 및 재프로그래밍. 플라스미드 DNA-기반 재프로그래밍의 제한 중 하나는 삽입 돌연변이 유발의 잠재적인 위험이다. 게놈 통합이 재프로그래밍 유전자 플라스미드의 TNT-매개 전달 후 발생되었는지의 여부를 결정하기 위해, PCR은 TNT 처리된 피부로부터 단리된 게놈 DNA로부터 수행되고, 플라스미드 백본 및/또는 리포터 유전자와 일치하는 서열을 스크리닝하였다. (a) 본 결과는 게놈 DNA에서 플라스미드 백본 또는 리포터의 임의의 흔적을 나타내지 않아서 삽입/통합이 이 경우에 거의 가능하지 않았다는 것을 시사한다. 그러나, 이는 특히 플라스미드 구성이 변형된 경우(예: 상이한 백본, 선형 대 환형 구성 등), 미래에 일어나지 않도록 배제하지 않는다. 이를 고려하여, TNT 플랫폼이 RNA-기반 형질감염을 통해 피부 조직을 재프로그래밍하는 데 사용될 수 있는지를 시험하기 위한 실험을 수행하였다. (b, c) 체세포에서 전분화능을 시험관내20 유도하는 것으로 이전에 보고된 microRNA302/367 클러스터(즉, miRNA302a/b/c + miRNA367)를 이용한 TNT 실험은 이러한 칵테일의 TNT-기반 전달이 7일째 조기에 피부에서 전분화능 마커의 현저한 유도를 초래했음을 보여주었다. 유도된 전분화능은 스크램블된 miRNA로 TNT-처리된 피부 조직에서 검출되지 않았다.
도 38. 상이한 TNT 대조군의 비교. TNT는 ABM/EFF, 인산염 완충 식염수(PBS)의 블랭크 용액 및 PBS + sham/빈 플라스미드(PBS + SH)로 C57BL/6 마우스 (n= 3-5)의 등쪽 피부에서 수행하였다. 미처리된 피부는 비교 목적으로 사용되었다. 24시간 후 유전자 발현 분석은 임의의 대조군 그룹(PBS, PBS + SH, 또는 미처리된 피부) 사이의 유의한 차이(ANOVA, 홀름-시닥 방법)를 나타내지 않았다.
체세포를 시험관내 및 생체내 모두에서 혈관형성 세포 및/또는 내피 세포로 재프로그래밍하기 위한 조성물 및 방법이 본원에 개시된다.
조성물
ETV2, FOXC2 및 FLI1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 둘 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 개시된다.
ETV2, FOXC2 및 FLI1을 코딩하는 아미노산 및 핵산 서열은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 무스 무수쿨러스 ets 변이체 2(Mus musculus ets variant 2)(Etv2)에 대한 유전자 ID는 14008이다. 무스 무수쿨러스 포크헤드 박스 C2(Mus musculus forkhead box C2)(Foxc2)의 유전자 ID는 14234이다. 무스 무수쿨러스 친구 백혈병 통합 1(Mus musculus Friend leukemia integration 1)(Fli1)의 유전자 ID는 14247이다. 마우스(무스 무수쿨러스) 서열이 사용되었고, 본원에 개시되어 있는 반면, 인간 형태를 포함하는 이러한 단백질의 다른 포유류 형태는 당업계에 공지되어 있고, 개시된 방법에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, ETV2는 다음 무스 무수쿨러스 아미노산 서열 또는 서열번호 2와 적어도 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다:
MDLWNWDEASLQEVPPGDKLTGLGAEFGFYFPEVALQEDTPITPMNVEGCWKGFPELDWNPALPHEDVPFQAEPVAHPLPWSRDWTDLGCNTSDPWSCASQTPGPAPPGTSPSPFVGFEGATGQNPATSAGGVPSWSHPPAAWSTTSWDCSVGPSGATYWDNGLGGEAHEDYKMSWGGSAGSDYTTTWNTGLQDCSIPFEGHQSPAFTTPSKSNKQSDRATLTRYSKTNHRGPIQLWQFLLELLHDGARSSCIRWTGNSREFQLCDPKEVARLWGERKRKPGMNYEKLSRGLRYYYRRDIVLKSGGRKYTYRFGGRVPVLAYQDDMGHLPGAEGQ (서열번호: 2).
일부 구현예에서, ETV2를 코딩하는 핵산 서열은 다음 핵산 서열, 또는 엄격한 하이브리드화 조건하에 서열번호: 3으로 이루어진 핵산 서열로 하이브리드화하는 핵산 서열을 포함한다:
AGAACCGTCAGAACAAGCATCCATGGACCTGTGGAACTGGGATGAGGCGTCACTGCAGGAAGTGCCTCCTGGGGACAAGCTGACAGGACTGGGAGCGGAATTTGGTTTCTATTTCCCTGAAGTGGCTCTACAAGAGGACACACCGATCACACCAATGAACGTAGAAGGCTGCTGGAAAGGGTTCCCAGAGCTGGACTGGAACCCCGCTTTACCTCACGAAGACGTACCTTTCCAGGCGGAGCCCGTTGCTCACCCCCTTCCGTGGTCGCGAGACTGGACAGACCTGGGATGCAACACCTCGGACCCGTGGAGCTGTGCTTCACAGACGCCAGGCCCTGCCCCTCCTGGCACGAGCCCCTCCCCCTTCGTCGGCTTTGAAGGGGCGACCGGCCAGAATCCTGCCACCTCGGCAGGAGGGGTCCCCTCGTGGTCGCACCCTCCAGCTGCCTGGAGCACTACCAGCTGGGACTGTTCTGTGGGCCCCAGTGGCGCCACCTACTGGGACAATGGCCTGGGCGGGGAAGCGCATGAGGACTATAAAATGTCATGGGGCGGGTCTGCCGGTTCGGACTACACCACCACGTGGAATACTGGGCTGCAGGACTGCAGCATCCCTTTCGAGGGGCACCAGAGTCCAGCATTCACCACGCCCTCCAAATCGAACAAGCAGTCTGATAGAGCCACATTGACTCGCTACTCCAAAACTAACCACCGAGGTCCCATTCAGCTGTGGCAATTCCTCCTGGAGCTGCTCCACGACGGGGCTCGCAGCAGCTGCATCCGCTGGACGGGCAATAGCCGCGAGTTCCAGCTGTGCGACCCCAAAGAGGTGGCCCGGCTGTGGGGCGAGCGCAAGAGGAAGCCGGGAATGAATTATGAGAAACTGAGTCGAGGTCTACGTTATTATTACCGCCGCGACATCGTGCTCAAGAGTGGTGGGCGCAAGTACACATACCGCTTCGGGGGACGTGTGCCTGTCCTCGCCTATCAGGATGATATGGGGCATCTGCCAGGTGCAGAAGGCCAATAAAACAAAAAACAAAAACAAAA (서열번호: 3).
일부 구현예에서, FOXC2는 다음 아미노산 서열, 또는 서열번호: 4와 적어도 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다:
MQARYSVSDPNALGVVPYLSEQNYYRAAGSYGGMASPMGVYSGHPEQYGAGMGRSYAPYHHQPAAPKDLVKPPYSYIALITMAIQNAPEKKITLNGIYQFIMDRFPFYRENKQGWQNSIRHNLSLNECFVKVPRDDKKPGKGSYWTLDPDSYNMFENGSFLRRRRRFKKKDVPKDKEERAHLKEPPSTTAKGAPTGTPVADGPKEAEKKVVVKSEAASPALPVITKVETLSPEGALQASPRSASSTPAGSPDGSLPEHHAAAPNGLPGFSVETIMTLRTSPPGGDLSPAAARAGLVVPPLALPYAAAPPAAYTQPCAQGLEAAGSAGYQCSMRAMSLYTGAERPAHVCVPPALDEALSDHPSGPGSPLGALNLAAGQEGALGASGHHHQHHGHLHPQAPPPAPQPPPAPQPATQATSWYLNHGGDLSHLPGHTFATQQQTFPNVREMFNSHRLGLDNSSLGESQVSNASCQLPYRATPSLYRHAAPYSYDCTKY (서열번호: 4).
일부 구현예에서, FOXC2를 코딩하는 핵산 서열은 다음 핵산 서열, 또는 엄격한 하이브리드화 조건하에 서열번호: 5로 이루어진 핵산 서열로 하이브리드화하는 핵산 서열을 포함한다:
GAAACTTTTCCCAATCCCTAAAAGGGACTTTGCTTCTTTTTCCGGGCTCGGCCGCGCAGCCTCTCCGGACCCTAGCTCGCTGACGCTGCGGGCTGCAGTTCTCCTGGCGGGGCCCCGAGAGCCGCTGTCTCCTTTTCTAGCACTCGGAAGGGCTGGTGTCGCTCCACGGTCGCGCGTGGCGTCTGTGCCGCCAGCTCAGGGCTGCCACCCGCCAAGCCGAGAGTGCGCGGCCAGCGGGGCCGCCTGCCGTGCACCCTTCAGGATGCCGATCCGCCCGGTCGGCTGAACCCGAGCGCCGGCGTCTTCCGCGCGTGGACCGCGAGGCTGCCCCGAGTCGGGGCTGCCTGCATCGCTCCGTCCCTTCCTGCTCTCCTGCTCCGGGCCTCGCTCGCCGCGGGCCGCAGTCGGTGCGCGCAGGCGGCGACCGGGCGTCTGGGACGCAGCATGCAGGCGCGTTACTCGGTATCGGACCCCAACGCCCTGGGAGTGGTACCCTATTTGAGTGAGCAAAACTACTACCGGGCGGCCGGCAGCTACGGCGGCATGGCCAGCCCCATGGGCGTCTACTCCGGCCACCCGGAGCAGTACGGCGCCGGCATGGGCCGCTCCTACGCGCCCTACCACCACCAGCCCGCGGCGCCCAAGGACCTGGTGAAGCCGCCCTACAGCTATATAGCGCTCATCACCATGGCGATCCAGAACGCGCCAGAGAAGAAGATCACTCTGAACGGCATCTACCAGTTCATCATGGACCGTTTCCCCTTCTACCGCGAGAACAAGCAGGGCTGGCAGAACAGCATCCGCCACAACCTGTCACTCAATGAGTGCTTCGTGAAAGTGCCGCGCGACGACAAGAAGCCGGGCAAGGGCAGCTACTGGACGCTCGACCCGGACTCCTACAACATGTTCGAGAATGGCAGCTTCCTGCGGCGGCGGCGGCGCTTCAAGAAGAAGGATGTGCCCAAGGACAAGGAGGAGCGGGCCCACCTCAAGGAGCCGCCCTCGACCACGGCCAAGGGCGCTCCGACAGGGACCCCGGTAGCTGACGGGCCCAAGGAGGCCGAGAAGAAAGTCGTGGTTAAGAGCGAGGCGGCGTCCCCCGCGCTGCCGGTCATCACCAAGGTGGAGACGCTGAGCCCCGAGGGAGCGCTGCAGGCCAGTCCGCGCAGCGCATCCTCCACGCCCGCAGGTTCCCCAGACGGCTCGCTGCCGGAGCACCACGCCGCGGCGCCTAACGGGCTGCCCGGCTTCAGCGTGGAGACCATCATGACGCTGCGCACGTCGCCTCCGGGCGGCGATCTGAGCCCAGCGGCCGCGCGCGCCGGCCTGGTGGTGCCACCGCTGGCACTGCCATACGCCGCAGCGCCACCCGCCGCTTACACGCAGCCGTGCGCGCAGGGCCTGGAGGCTGCGGGCTCCGCGGGCTACCAGTGCAGTATGCGGGCTATGAGTCTGTACACCGGGGCCGAGCGGCCCGCGCACGTGTGCGTTCCGCCCGCGCTGGACGAGGCTCTGTCGGACCACCCGAGCGGCCCCGGCTCCCCGCTCGGCGCCCTCAACCTCGCAGCGGGTCAGGAGGGCGCGTTGGGGGCCTCGGGTCACCACCACCAGCATCACGGCCACCTCCACCCGCAGGCGCCACCGCCCGCCCCGCAGCCCCCTCCCGCGCCGCAGCCCGCCACCCAGGCCACCTCCTGGTATCTGAACCACGGCGGGGACCTGAGCCACCTCCCCGGCCACACGTTTGCAACCCAACAGCAAACTTTCCCCAACGTCCGGGAGATGTTCAACTCGCACCGGCTAGGACTGGACAACTCGTCCCTCGGGGAGTCCCAGGTGAGCAATGCGAGCTGTCAGCTGCCCTATCGAGCTACGCCGTCCCTCTACCGCCACGCAGCCCCCTACTCTTACGACTGCACCAAATACTGAGGCTGTCCAGTCCGCTCCAGCCCCAGGACCGCACCGGCTTCGCCTCCTCCATGGGAACCTTCTTCGACGGAGCCGCAGAAAGCGACGGAAAGCGCCCCTCTCTCAGAACCAGGAGCAGAGAGCTCCGTGCAACTCGCAGGTAACTTATCCGCAGCTCAGTTTGAGATCTCAGCGAGTCCCTCTAAGGGGGATGCAGCCCAGCAAAACGAAATACAGATTTTTTTTTTAATTCCTTCCCCTACCCAGATGCTGCGCCTGCTCCCCTTGGGGCTTCATAGATTAGCTTATGGACCAAACCCCATAGGGACCCCTAATGACTTCTGTGGAGATTCTCCACGGGCGCAAGAGGTCTCTCCGGATAAGGTGCCTTCTGTAAACGAGTGCGGATTTGTAACCAGGCTATTTTGTTCTTGCCCAGAGCCTTTAATATAATATTTAAAGTTGTGTCCACTGGATAAGGTTTCGTCTTGCCCAACTGTTACTGCCAAATTGAATTCAAGAAACGTGTGTGGGTCTTTTCTCCCCACGTCACCATGATAAAATAGGTCCCTCCCCAAACTGTAGGTCTTTTACAAAACAAGAAAATAATTTATTTTTTTGTTGTTGTTGGATAACGAAATTAAGTATCGGATACTTTTAATTTAGGAAGTGCATGGCTTTGTACAGTAGATGCCATCTGGGGTATTCCAAAAACACACCAAAAGACTTTAAAATTTCAATCTCACCTGTGTTTGTCTTATGTGATCTCAGTGTTGTATTTACCTTAAAATAAACCCGTGTTGTTTTTCTGCCCAAAAAAAAAAAAAAAAA (서열번호: 5).
일부 구현예에서, FLI1은 다음 아미노산 서열, 또는 서열번호: 6과 적어도 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다:
MDGTIKEALSVVSDDQSLFDSAYGAAAHLPKADMTASGSPDYGQPHKINPLPPQQEWINQPVRVNVKREYDHMNGSRESPVDCSVSKCNKLVGGGEANPMNYNSYMDEKNGPPPPNMTTNERRVIVPADPTLWTQEHVRQWLEWAIKEYGLMEIDTSFFQNMDGKELCKMNKEDFLRATSAYNTEVLLSHLSYLRESSLLAYNTTSHTDQSSRLNVKEDPSYDSVRRGAWNNNMNSGLNKSPLLGGSQTMGKNTEQRPQPDPYQILGPTSSRLANPGSGQIQLWQFLLELLSDSANASCITWEGTNGEFKMTDPDEVARRWGERKSKPNMNYDKLSRALRYYYDKNIMTKVHGKRYAYKFDFHGIAQALQPHPTETSMYKYPSDISYMPSYHAHQQKVNFVPSHPSSMPVTSSSFFGAASQYWTSPTAGIYPNPSVPRHPNTHVPSHLGSYY (서열번호: 6).
일부 구현예에서, FLI1을 코딩하는 핵산 서열은 다음 핵산 서열, 또는 엄격한 하이브리드화 조건하에 서열번호: 7로 이루어진 핵산 서열로 하이브리드화하는 핵산 서열을 포함한다:
AAAGTGAAGTCACTTCCCAAAATTAGCTGAAAAAAAGTTTCATCCGGTTAACTGTCTCTTTTTCGATCCGCTACAACAACAAACGTGCACAGGGGAGCGAGGGCAGGGCGCTCGCAGGGGGCACTCAGAGAGGGCCCAGGGCGCCAAAGAGGCCGCGCCGGGCTAATCTGAAGGGGCTACGAGGTCAGGCTGTAACCGGGTCAATGTGTGGAATATTGGGGGGCTCGGCTGCAGACTTGGCCAAATGGACGGGACTATTAAGGAGGCTCTGTCTGTGGTGAGTGACGATCAGTCCCTTTTTGATTCAGCATACGGAGCGGCAGCCCATCTCCCCAAGGCAGATATGACTGCTTCGGGGAGTCCTGACTACGGGCAGCCCCACAAAATCAACCCCCTGCCACCGCAGCAGGAGTGGATCAACCAGCCAGTGAGAGTCAATGTCAAGCGGGAGTATGACCACATGAATGGATCCAGGGAGTCTCCGGTGGACTGCAGTGTCAGCAAATGTAACAAGCTGGTGGGCGGAGGCGAAGCCAACCCCATGAACTATAATAGCTACATGGATGAGAAGAACGGCCCCCCTCCTCCCAACATGACCACCAACGAACGGAGAGTCATTGTGCCTGCAGACCCCACACTGTGGACACAGGAGCACGTTCGACAGTGGCTGGAGTGGGCTATAAAGGAATACGGATTGATGGAGATTGACACTTCCTTCTTCCAGAACATGGATGGCAAGGAATTGTGTAAAATGAACAAGGAGGACTTCCTCCGAGCCACCTCCGCCTACAACACAGAAGTGCTGTTGTCGCACCTCAGTTACCTCAGGGAAAGTTCACTGCTGGCCTATAACACAACCTCCCATACAGACCAGTCCTCACGACTGAATGTCAAGGAAGACCCTTCTTATGACTCTGTCAGGAGAGGAGCATGGAACAATAATATGAACTCTGGCCTCAACAAAAGTCCTCTCCTTGGAGGATCACAGACCATGGGCAAGAACACTGAGCAGCGGCCCCAGCCAGATCCTTATCAGATCCTGGGGCCAACCAGCAGCCGCCTAGCAAACCCTGGGAGTGGGCAGATCCAGCTGTGGCAGTTTCTCCTGGAACTACTGTCCGACAGCGCCAACGCCAGCTGTATCACCTGGGAGGGGACCAACGGGGAGTTCAAAATGACGGACCCTGATGAGGTGGCCAGGCGCTGGGGAGAGCGGAAGAGCAAGCCCAACATGAATTATGACAAGCTGAGCCGGGCCCTCCGATACTACTATGACAAAAACATTATGACCAAAGTGCATGGCAAAAGGTATGCCTACAAGTTTGACTTCCATGGCATTGCCCAGGCCCTGCAGCCACATCCAACAGAGACATCCATGTACAAGTATCCCTCTGATATCTCCTACATGCCTTCCTACCATGCCCATCAACAGAAGGTGAACTTTGTCCCGTCTCACCCATCCTCCATGCCTGTCACCTCCTCCAGCTTCTTTGGAGCAGCATCACAATACTGGACCTCCCCCACTGCTGGGATCTATCCAAACCCCAGTGTCCCCCGCCATCCTAACACCCACGTGCCTTCACACTTAGGCAGCTACTACTAGAACTAACACCAGTTGGCCTTCTGGCTGAAGTTCCAGCTCTCACTTTACTGGATACTCTGGACTCTAAAAGGCACAGTAGCCTTGAAGAGATAAGAAAACTGGATGTTCTTTCTTTTGGATAGAACCTTTGTATTTGTTCTTCTAAAAAAATTATTATTTTTATGTTAAAAACTTTTGTTTCCTCTACCTGAAAAAAAAAAAAGATCATTCCATGAGCCAGTCCACCAGTTTGGATTCTCAACCTCCTATCATCGAATGAGTTAAATATTTAGGTTACTGGAACGGTTTATACCATGATTCTGAGAAAGGAGTACGCATTTTCTTTACTCTTTTTTTTTATGACCAAAGCAGTTTCTTATCAGCACACGGGTCTCATCATTGTAGGATTCCCTACGATCATGAATCATGGACTTGACCAGGGTTGGTCTGGTTTGAGACTTAGTAAAAGTCAAGGCAGGATGTTTATAATCTTATCTTCGGAGGACTCAATTCAGTGGATGGCAACTGGAACACTGGCTCTGAGGCCAGTGAAGTTTTTTGCCCAACTGGAATTTAAAAGATGTGTGTCTATGTGTGTATTTAAGAAGCCATTATTATTACAAAATTCCTCACAATGGGCAGTATGTGTTTGGGTGACTCTTCTCCCCAGAAATAGTCAGAATATGAACAAAGAAAGTTTAACACAAACTCAGACACTCCTGACGGGCAGAGGATTAAATAACATTTTTTTGGAGGGTTTAATAACATTTTTGGAGGGGTTTTTTTGTTTGTTTTTGTTTTTGGGGGTTTTTTTTGTTTGTTTTTTGTTTTTTGGTTTTTGGTTTTTTTTTGTTTTTTTTTTTTTTTTGGTTTTGATTTTTAATGACAGTGAGTCCCAGAACTTTGAAAAGTCATGGGGATTTCTAAACTCAGATTCGCAAACGCTGTGCGTTTGTCAGACCACCAGACCAAGGTCAAACAATCAGAAGGCAACTAACTGTATAAATTATGCAGAGTTATTTTCCTATATCTCACAGTATTAAAAAAATAAATAATTAAAAATTAAAGAATAAGTAAACGAGTTGACCTCGGTCACAAATGCAGTTTTACTATCAAATCAATCATTGTTATTTTTTTAAAATATAATTTGTACATCTTTGTCAATCTGTACATTTGGGCTATTTGTACGTTTTTGTAACTGTTTTTTTTTAATAAGCATAATGTGACTATTGAAAACGAGGAGTTAAAAGTCACTGAGTTTTTAGGAAGAAAAACCTAAAAATACAGTTATTTAACACGCATGCCCAAACAAGATCTGTTTAGACCTACAACGCTTTAGAAATGTTTGTAAATAACAGAGTTGCAATAACCTGAAAAGGACAAACAAACTTTTCTCTGTGCACACGAGGCACTCTCCTGCTCTATATATGCAATATATTTTTAGATGTGCAAATATATATATAATTTTTCAGGTAATCGTGACTTTTTAAACGATATTGTTAAGGTGACAACTCTTAGTCCACTGAAGACTAAGTTGTAAAATAATTTGACCTTAATAAATTGTGCCTTCTTCTTTTTCTTCTTCTCTCAGAAAAAAAAAAA (서열번호: 7).
폴리펩타이드 또는 기능적 핵산을 발현시키기 위해, 뉴클레오타이드 코딩 서열을 적절한 발현 벡터에 삽입할 수 있다. 따라서, ETV2, FOXC2 및 FLI1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 둘 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 비바이러스성 벡터가 또한 개시되고, 여기서 상기 둘 이상의 핵산 서열은 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 단일 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 다른 구현예에서, 핵산 서열은 둘 이상의 별개의 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 비바이러스성 벡터는 그룹 pIRES-hrGFP-21, pAd-IRES-GFP 및 pCDNA3.0으로부터 선택된 플라스미드를 포함한다.
유전자 서열 및 적절한 전사 및 번역 조절 요소를 함유하는 발현 벡터를 작제하는 방법은 당업계에 익히 공지되어 있다. 이러한 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술, 및 생체내 유전자 재조합을 포함한다. 이러한 기술은 문헌[참조: Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., 1989), 및 Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1989)]에 기재되어 있다.
발현 벡터는 일반적으로 삽입된 코딩 서열의 번역 및/또는 전사에 필요 요소인 조절 서열을 함유한다. 예를 들어, 코딩 서열은 바람직하게는 목적하는 유전자 생성물의 발현을 조절하는 것을 돕기 위해 프로모터 및/또는 인핸서에 작동가능하게 연결된다.
"조절 요소" 또는 "조절 서열"은 전사 및 번역을 수행하기 위해 숙주 세포 단백질과 상호작용하는 벡터의 비번역 영역- 인핸서, 프로모터, 5' 및 3' 비번역 영역-이다. 이러한 요소는 강도 및 특이성이 다를 수 있다.
"프로모터"는 일반적으로 전사 개시 부위와 관련하여 상대적으로 고정된 위치에 있을 때 기능하는 DNA의 서열 또는 서열들이다. "프로모터"는 RNA 폴리머라제 및 전사 인자의 기본적인 상호작용에 필요한 코어 요소를 함유하고, 업스트림 요소 및 반응 요소를 함유할 수 있다.
"인핸서"는 일반적으로 전사 개시 부위로부터 고정된 거리 없이 기능하고 전사 단위에 대해 5' 또는 3'일 수 있는 DNA의 서열을 지칭한다. 또한, 인핸서는 코딩 서열 자체내 뿐만 아니라 인트론 내에 존재할 수 있다. 그들은 일반적으로 길이가 10 내지 300 bp이고, 그들은 시스로 기능한다. 인핸서는 근처 프로모터로부터 전사를 증가시키는 기능을 한다. 프로모터와 같은 인핸서는 또한 종종 전사의 조절을 매개하는 반응 요소를 함유한다. 인핸서는 종종 발현의 조절을 결정한다.
"내인성" 인핸서/프로모터는 게놈에서 소정의 유전자와 자연적으로 연결된 것이다. "외인성" 또는 "이종성" 인핸서/프로모터는 유전자 조작(즉, 분자 생물학적 기술)에 의해 유전자와 병치 배치되어 그 유전자의 전사가 연결된 인핸서/프로모터에 의해 지시되도록 하는 것이다.
생명공학에 사용되는 프로모터는 유전자 발현 조절의 의도된 유형에 따라서 상이한 유형이다. 그들은 일반적으로 구성적 프로모터, 조직-특이적 또는 발달 단계 특이적 프로모터, 유도성 프로모터 및 합성 프로모터로 나뉠 수 있다.
구성적 프로모터는 사실상 모든 조직에서 발현을 지시하고, 전적으로는 아니지만 대부분 환경 및 발달 요인과 독립적이다. 그들의 발현이 일반적으로 내인성 인자에 의해 조절되지 않기 때문에, 구성적 프로모터는 일반적으로 종에 걸쳐 및 심지어 킹덤에 걸쳐 활성이다. 구성적 프로모터의 예는 CMV, EF1a, SV40, PGK1, Ubc, 인간 베타 액틴 및 CAG를 포함한다.
조직 특이적 또는 발달 단계 특이적 프로모터는 특이적 조직(들) 또는 특정 발달 단계에서 유전자의 발현을 지시한다. 식물의 경우, 혈관계, 광합성 조직, 괴경, 뿌리 및 다른 식물성 장기, 또는 종자 및 다른 생식 기관에서 유전자를 발현시키거나 유전자의 발현에 영향을 미치는 프로모터 요소는 이종 시스템(예: 멀리 관련된 종 또는 심지어 다른 킹덤)에서 발견될 수 있지만, 대부분의 특이성은 일반적으로 상동성 프로모터(즉, 동일 종, 속 또는 계열)로 달성된다. 이것은 아마 전사 인자의 좌표 발현은 프로모터의 활성의 조절에 필요하기 때문이다.
유도성 프로모터의 성능은 내인성 인자가 아니라 인공적으로 조절될 수 있는 환경 조건 및 외부 자극에 따라 조절된다. 이 그룹내에, 빛, 산소 수준, 열, 냉기 및 상처와 같은 비생물적 인자에 의해 조절된 프로모터가 있다. 이러한 인자 중 일부는 실험적 환경 밖에서 조절하는 것이 어렵기 때문에, 관심이 있는 유기체에서 자연적으로 발견되지 않는 화학적 화합물에 반응하는 프로모터가 특히 중요하다. 이러한 라인을 따라, 다른 화합물 중에 항생제, 구리, 알콜, 스테로이드 및 제초제에 반응하는 프로모터는 자유롭게 다른 생물적 또는 비생물적 인자와 독립적으로 유전자 활성을 유도할 수 있도록 개조되고 정제되었다.
진핵 세포 생물학의 연구를 위해 두 개의 가장 일반적으로 사용되는 유도성 발현 시스템은 Tet-오프 및 Tet-온이라 칭명된다. Tet-오프 시스템은 에쉐리키아 콜리(Escherichia coli) 박테리아에서 발견된 하나의 단백질인 TetR (테트라사이클린 억제제)를 단순 헤르페스 바이러스에서 발견되는 다른 단백질인 VP16의 활성화 도메인으로 융합시킴으로써 생성되는 테트라사이클린 전사활성화제(tTA) 단백질을 사용하게 한다. 생성되는 tTA 단백질은 특이적 TetO 오퍼레이터 서열에서 DNA에 결합할 수 있다. 대부분의 Tet-오프 시스템에서, 이러한 TetO 서열의 몇몇 반복체는 CMV 프로모터와 같은 최소 프로모터의 업스트림에 위치한다. 최소한의 프로모터를 갖는 몇몇 TetO 서열의 전체는 테트라사이클린 반응 요소(TRE)라 칭명되는데, 이는 그것이 프로모터의 유전자 또는 유전자 다운스트림의 증가된 발현에 의한 테트라사이클린 전사활성화제 단백질 tTA의 결합에 반응하기 때문이다. Tet-오프 시스템에서, TRE-조절된 유전자의 발현은 테트라사이클린 및 이의 유도체에 의해 억제될 수 있다. 그들은 tTA에 결합하여 TRE 서열에 결합할 수 없도록 함으로써 TRE-조절된 유전자의 전사활성화를 방지한다. Tet-온 시스템은 유사하지만 반대 방식으로 작동한다. Tet-오프 시스템에서, tTA는 테트라사이클린 또는 독시사이클린과 같은 이의 유도체 중 하나에 결합하지 않는 경우에만 오퍼레이터에 결합할 수 있지만, Tet-온 시스템에서, rtTA 단백질은 테트라사이클린에 의해 결합될 경우에만 오퍼레이터에 결합할 수 있다. 따라서, 시스템에 독시사이클린을 도입하면 유전자 생성물의 전사를 개시한다. Tet-온 시스템은 가끔 이의 빠른 반응성에 대해 Tet-오프보다 바람직하다.
일부 구현예에서, ETV2, FOXC2 및/또는 FLI1을 코딩하는 핵산 서열은 동일한 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 대안적으로, 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 요소는 다중유전자 또는 폴리시스트론 메시지를 생성하는데 사용될 수 있다. IRES 요소는 5' 메틸화 Cap 의존 번역의 리보솜 스캐닝 모델을 바이패스할 수 있고, 내부 부위에서 번역을 시작할 수 있다. IRES 요소는 이종 개방 판독 프레임에 연결될 수 있다. 다중 개방 판독 프레임은 함께 전사될 수 있고, 각각은 IRES로 분리되어 폴리시스트론 메시지를 생성한다. IRES 요소 덕분에, 각각의 개방 판독 프레임은 효율적인 번역을 위해 리보솜에 접근할 수 있다. 다중 유전자는 단일 프로모터/인핸서를 사용하여 효율적으로 발현되어 단일 메시지를 전사할 수 있다.
발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된 본원에 개시된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 비바이러스성 벡터가 개시된다. 이러한 비바이러스성 벡터의 예는 올리고뉴클레오타이드를 단독으로 또는 적합한 단백질, 폴리사카라이드 또는 지질 제형과 조합하여 포함한다. 비바이러스성 방법은 단순한 대규모 생산 및 낮은 숙주 면역원성이 단지 2개인 바이러스 방법에 비해 특정 이점을 제공한다. 이전에는, 유전자의 낮은 수준의 형질감염 및 발현은 비바이러스 방법을 단점으로 유지하지만, 벡터 기술의 최근 발전은 바이러스와 유사한 형질감염 효율을 갖는 분자 및 기술을 생성시켰다.
적합한 비바이러스성 벡터의 예는 pIRES-hrGFP-2a, pAd-IRES-GFP 및 pCDNA3.0을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
개시된 조성물 및 방법에 사용하기 위한 miR-200b 억제제(길항제)가 또한 개시되었다. miRNA 길항제는 miRNA가 표적 mRNA에 결합하는 것을 방지하는 표적 miRNA와 듀플렉스를 형성한다. 이는 miRNA에 의해 표적화되는 mRNA의 번역을 증가시킨다.
개시된 miRNA 길항제는 선택된 miRNA 또는 프리-miRNA 표적 서열으로 하이브리드화기에 충분히 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단일 가닥, 이중 가닥, 부분적으로 이중 가닥 또는 헤어핀 구조화된 올리고뉴클레오타이드이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "부분적으로 이중 가닥"은 상보적 가닥보다 적은 뉴클레오타이드를 함유하는 이중 가닥 구조물을 지칭한다. 일반적으로, 부분적으로 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드는 75% 미만의 이중 가닥 구조, 바람직하게는 50% 미만, 더욱 바람직하게는 25%, 20% 또는 15% 미만의 이중 가닥 구조를 가질 것이다.
miRNA 또는 프리-miRNA는 길이가 18 내지 100개 뉴클레오타이드이고, 보다 바람직하게는 길이가 18 내지 80개 뉴클레오타이드이다. 성숙한 miRNA는 19 내지 30개 뉴클레오타이드, 바람직하게는 21 내지 25개 뉴클레오타이드, 특히 21, 22, 23, 24 또는 25개 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. MicroRNA 전구체는 전형적으로 약 70 내지 100개 뉴클레오타이드의 길이를 갖고, 헤어핀 형태를 갖는다.
miRNA 또는 프리-miRNA의 서열이 주어지면, miRNA 또는 프리-miRNA의 부분에 충분히 상보적인 miRNA 길항제는 왓슨 및 크릭(Watson and Crick) 염기쌍의 규칙에 따라 설계될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "충분히 상보적"은 두 개의 서열이 충분히 상보적이어서 듀플렉스가 생리학적 조건하에 그들 사이에 형성될 수 있다는 것을 의미한다. miRNA 또는 프리-miRNA 표적 서열에 충분히 상보적인 miRNA 길항제는 miRNA 또는 프리-miRNA 서열과 70%, 80%, 90% 이상 동일할 수 있다. 하나의 구현예에서, miRNA 길항제는 miRNA 또는 프리-miRNA 표적 서열에 상보적이지 않은 1, 2 또는 3개 이하의 뉴클레오타이드를 함유한다. 바람직한 구현예에서, miRNA 길항제는 miRNA 또는 프리-miRNA 표적 서열에 100% 상보적이다.
유용한 miRNA 길항제는 내인성 miRNA 또는 프리-miRNA에 실질적으로 상보적인 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 인접 뉴클레오타이드를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 개시된 miRNA 길항제는 바람직하게는 약 12 내지 25개의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 약 15 내지 23개의 뉴클레오타이드의 miRNA 표적 서열로 하이브리드화하기에 충분히 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상보성의 영역에서 뉴클레오타이드 불일치가 존재할 것이다. 바람직한 구현예에서, 상보성의 영역은 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 불일치를 가질 것이다.
일부 구현예에서, miRNA 길항제는 인간 miRNA에 "정확히 상보적"이다. 따라서, 하나의 구현예에서, miRNA 길할제는 miRNA에 어닐링하여 정확한 상보성 영역에서 왓슨-크릭 염기쌍으로만 제조된 하이브리드를 형성할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, miRNA 길항제는 단일-뉴클레오타이드 차이를 특이적으로 구별한다. 이 경우에, miRNA 길항제는 정확한 상보성이 단일-뉴클레오타이드 차이의 영역에서 발견되는 경우에만 miRNA 활성을 억제한다.
하나의 구현예에서, miRNA 길항제는 리보핵산(RNA) 또는 데옥시리보핵산(DNA) 또는 이의 변형체의 올리고머 또는 중합체이다. miRNA 길항제는 천연 핵 염기, 당 및 공유 뉴클레오사이드간 (백본) 결합을 함유하는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
miRNA 길항제는 변형된 염기를 함유할 수 있다. 아데닌, 구아닌, 시토신 및 우라실은 RNA에서 발견되는 가장 일반적인 염기이다. 이러한 염기는 변형되거나 대체되어 개선된 특성을 갖는 RNA를 제공할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제 내성 올리고리보뉴클레오타이드는 이러한 염기 또는 합성 및 천연 핵염기(예: 이노신, 티민, 크산틴, 하이포크산틴, 누뷸라린, 이소구아니신 또는 투베르시딘)로 제조될 수 있다. 대안적으로, 임의의 상기 염기의 치환되거나 변형된 유사체가 사용될 수 있다. 이의 예는 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실 (슈도우라실), 4-티오우라실, 5-할로우라실, 5-(2-아미노프로필)우라실, 5-아미노 알릴우라실, 8-할로, 아미노, 티올, 티오알킬, 하이드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-트리플루오로메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌, 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 포함하는 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린, 디하이드로우라실, 3-데아자-5-아자시토신, 2-아미노퓨린, 5-알킬우라실, 7-알킬구아닌, 5-알킬 시토신, 7-데아자아데닌, N6, N6-디메틸아데닌, 2,6-디아미노퓨린, 5-아미노-알릴-우라실, N3-메틸우라실, 치환된 1,2,4-트리아졸, 2-피리디논, 5-니트로인돌, 3-니트로피롤, 5-메톡시우라실, 우라실-5-옥시아세트산, 5-메톡시카보닐메틸우라실, 5-메틸-2-티오우라실, 5-메톡시카보닐메틸-2-티오우라실, 5-메틸아미노메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-카복시프로필)우라실, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N4-아세틸 시토신, 2-티오시토신, N6-메틸아데닌, N6-이소펜틸아데닌, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, N-메틸구아닌, 또는 O-알킬화 염기를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
개시된 miRNA 길항제는 뉴클레아제에 대한 향상된 내성으로 변형될 수 있다. 따라서, 개시된 miRNA 길항제는 핵산분해 분해에 대해 이를 안정화시킨 뉴클레오타이드 변형을 포함하는 올리고머일 수 있다. 올리고머는 토탈머(totalmer), 믹스머(mixmer), 갭머(gapmer), 테일머(tailmer), 헤드머(headmer) 또는 블록머(blockmer)일 수 있다. "토탈머"는 비천연 뉴클레오타이드만을 포함하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이다. 용어 "갭머"는 적어도 5개의 천연 뉴클레오타이드(즉, 비변형된 핵산)에 인접하는 변형된 핵산 세그먼트로 구성된 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다. 용어 "블록머"는 적어도 5개의 천연 뉴클레오타이드의 핵산 세그먼트가 인접된 중앙 변형된 핵산 세그먼트를 지칭한다. 용어 "테일머"는 5'-말단에 적어도 5개의 천연 뉴클레오타이드에 이어 3'-말단에 변형된 핵산 세그먼트를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다. 용어 "헤드머"는 5'-말단에 변형된 핵산 세그먼트에 이어 3'-말단에 적어도 5개의 천연 뉴클레오타이드를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다. 용어 "믹스머"는 천연 및 비천연 뉴클레오타이드를 모두 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다. 그러나, 갭타머, 테일머, 헤드머 및 블록머와 달리, DNA 단위와 같은 5개 이상의 천연 뉴클레오타이드의 연속 서열은 존재하지 않는다.
변형된 핵산 및 뉴클레오타이드 대용물은 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: (i) 비연결성 포스페이트 산소의 하나 또는 둘 다 및/또는 하나 이상의 연결성 포스페이트 산소의 대체; (ii) 리보스 당의 구성 성분, 예를 들어, 리보스 당의 2' 하이드록실의 대체, 또는 리보스 당의 리보스 이외의 구조로의 전체 대체; (iii) 포스페이트 잔기의 "데포스포" 링커로의 전체 대체; (iv) 천연 염기의 변형 또는 대체; (v) 리보스-포스페이트 백본의 대체 또는 변형; 또는 (vi) RNA의 3' 말단 또는 5' 말단의 변형, 예를 들어, 말단 포스페이트 그룹의 제거, 변형 또는 대체 또는 잔기, 예를 들어, 형광적으로 표지된 잔기의 RNA의 3' 또는 5' 말단에의 접합.
miRNA 길항제는 변형된 당 그룹을 함유할 수 있다. 예를 들어, 2' 하이드록실 그룹(OH)은 다수의 상이한 "옥시" 또는 "데옥시" 치환체로 변형되거나 대체될 수 있다.
"옥시"-2' 하이드록실 그룹 변형의 예는 알콕시 또는 아릴옥시, 2' 하이드록실이, 예를 들어, 메틸렌 브릿지 또는 에틸렌 브릿지에 의해 동일한 리보스 당의 4' 탄소에 연결된 "로킹된" 핵산(LNA); 아미노, O-아민 및 아미노알콕시를 포함한다. 메톡시에틸 그룹(MOE)만을 함유하는 올리고뉴클레오타이드는 견고한 포스포로티오에이트 변형으로 변형된 것들과 필적할 만한 뉴클레아제 안정성을 나타낸다.
"데옥시" 변형은 수소, 할로, 아미노, 시아노; 머캅토, 알킬-티오-알킬, 티오알콕시, 및 임의로 치환될 수 있는 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 알케닐 및 알키닐을 포함한다. 바람직한 치환체는 2'-메톡시에틸, 2'-OCH3, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 및 2'-플루오로이다.
당 그룹은 또한 리보스 내의 상응하는 탄소의 것보다 대향하는 입체화학적 구성을 포함하는 하나 이상의 탄소를 함유할 수 있다. 따라서, 변형된 RNA는, 예를 들어, 당으로서 아라비노스를 함유하는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
또한, C-1'에 핵염기가 결여된 "무염기" 당이 포함된다. 이러한 무염기 당은 또한 하나 이상의 구성 당 원자에서의 변형을 추가로 함유할 수 있다.
뉴클레아제 내성을 최대화하기 위해, 2' 변형은 하나 이상의 포스페이트 링커 변형(예: 포스포로티오에이트)과 조합하여 사용될 수 있다. 소위 "키메라" 올리고뉴클레오타이드는 2개 이상의 상이한 변형을 함유하는 것들이다.
개시된 miRNA 길항제는 변형된 포스페이트 그룹을 함유할 수 있다. 포스페이트 그룹은 음으로 하전된 종이다. 전하는 2개의 비연결성 산소 원자에 동일하게 분포된다. 그러나, 포스페이트 그룹은 하나의 산소를 상이한 치환체로 대체함으로서 변형될 수 있다. RNA 포스페이트 백본에 대한 이 변형의 하나의 결과는 핵산 분해 붕괴에 대한 올리고리보뉴클레오타이드의 내성을 증가시킬 수 있다.
변형된 포스페이트 그룹의 에는 포스포로티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노 포스페이트, 보라노 포스페이트 에스테르, 수소 포스포네이트, 포스포로아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트 및 포스포트리에스테르를 포함한다. 포스포로디티오에이트는 황으로 대체된 비연결성 산소를 모두 갖는다. 포스포로디티오에이트 중 인 중심은 올리고리보뉴클레오타이드 디아스테레오머의 형성을 배제하는 아키랄(achiral)이다. 디아스테레오머 형성은 개별적인 디아스테레오머가 뉴클레아제에 대한 다양한 내성을 나타내는 제제를 초래할 수 있다. 또한, 키랄 포스페이트 그룹을 함유하는 RNA의 하이브리드화 친화도는 상응하는 비변형된 RNA 종에 비하여 낮을 수 있다.
포스페이트 그룹은 비인 함유 커넥터로 대체될 수 있다. 포스페이트 그룹을 대체할 수 있는 잔기의 예는 실록산, 카보네이트, 카복시메틸, 카바메이트, 아미드, 티오에테르, 에틸렌 옥사이드 링커, 설포네이트, 설폰아미드, 티오포름아세탈, 포름아세탈, 옥심, 메틸렌이미노, 메틸렌메틸이미노, 메틸렌하이드라조, 메틸렌디메틸하이드라조 및 메틸렌옥시메틸이미노를 포함한다. 바람직한 대체물은 메틸렌카보닐아미노 및 메틸렌메틸이미노 그룹을 포함한다.
포스페이트 링커 및 리보스 당이 뉴클레아제 내성 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드 대용물로 대체된 올리고뉴클레오타이드-모방 스캐폴드가 또한 작제될 수 있다. 이의 예는 모필리노, 사이클로부틸, 피롤리딘 및 펩타이드 핵산(PNA) 뉴클레오사이드 대용물을 포함한다. 바람직한 대용물은 PNA 대용물이다.
개시된 miRNA 길항제는 또한 3' 및/또는 5' 말단에서 변형될 수 있다. 말단 변형은 활성을 조절하거나 분해 내성을 조절하거나 세포에 의한 miRNA 길항제의 흡수를 조절하는 것을 포함하여 다수의 이유로 첨가될 수 있다. 변형은 전체 말단 포스페이트 또는 포스페이트 그룹의 하나 이상의 원자의 변형 또는 대체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드의 3' 및 5' 말단은 다른 작용성 분자 본체, 예를 들어, 표지화 잔기 또는 보호 그룹에 접합될 수 있다. 작용성 분자 본체는 포스페이트 그룹 및/또는 스페이서를 통해 당에 부착될 수 있다. 스페이서의 말단 원자는 포스페이트 그룹의 연결 원자 또는 당의 C-3' 또는 C-5' O, N, S 또는 C 그룹의 연결 원자에 연결되거나 이를 대체할 수 있다. 대안적으로, 스페이서는 뉴클레오타이드 대용물의 말단 원자에 연결되거나 이를 대체할 수 있다. 말단 변형의 다른 예는 염료, 삽입제, 가교결합제, 포르피린, 폴리사이클릭 방향족 탄화수소, 인공 엔도뉴클레아제, 친유성 담체 및 펩타이드 접합체를 포함한다.
일부 구현예에서, miRNA 길항제는 안타고미어이다. 안타고미어는, 예를 들어, US2007/0213292(Stoffel 등)에 기재된 miRNA 길항제의 특정 부류이다. 안타고미어는 RNase 보호 및 약리학적 특성, 예를 들어, 향상된 조직 및 세포 흡수에 대한 다양한 변형을 함유하는 RNA-유사 올리고뉴클레오타이드이다. 안타고미어는 3'-말단에 당의 완전한 2'-O-메틸화, 포스포로티오에이트 백본 및 콜레스테롤-잔기를 가짐으로써 정상 RNA와 상이하다.
안타고미어는 뉴클레오타이드 서열의 5' 또는 3' 말단에 적어도 제1, 제2 또는 제3의 뉴클레오타이드간 연결을 갖는 포스포로티오에이트를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 안타고미어는 6개의 포스포로티오에이트 백본 변형을 함유하고; 두 개의 포스포로티오에이트는 5'-말단에 위치되고, 4개는 3'-말단에 위치된다. 포스포로티오에이트 변형은 RNase 활성에 대한 보호를 제공하고, 이들의 친유성은 향상된 조직 흡수에 기여한다.
안타고미어 및 다른 miRNA 억제제의 예는 WO2009/020771, WO2008/091703, WO2008/046911, WO2008/074328, WO2007/090073, WO2007/027775, WO2007/027894, WO2007/021896, WO2006/093526, WO2006/112872, WO2007/112753, WO2007/112754, WO2005/023986 또는 WO2005/013901에 기재되어 있고, 이들 모두는 참조로 인용된다.
맞춤 설계된 항-miRTM 분자는 Applied Biosystems으로부터 시판된다. 따라서, 일부 구현예에서, 안타고미어는 Ambion® 항-miRTM 억제제이다. 이러한 분자는 세포에서 천연 성숙 miRNA 분자를 특이적으로 억제하도록 설계된 화학적으로 변형되고, 최적화된 단일 가닥 핵산이다.
맞춤 설계된 Dharmacon meridianTM microRNA 헤어핀 억제제는 또한 Thermo Scientific으로부터 시판된다. 이러한 억제제는 화학적 변형 및 2차 구조 모티프를 포함한다. 예를 들어, US2006/0223777(Vermeulen 등)에는 이러한 분자의 효능을 향상시키는 2차 구조 요소의 동정이 보고되어 있다. 구체적으로, 역 보체 코어 주위에 매우 구조화된 이중 가닥의 측면 영역을 도입하면 억제제 기능을 상당히 증가시키고, 1나노몰 이하의 농도에서 다중-miRNA 억제를 가능하게 한다. 안타코미어 설계에서 다른 이러한 개선은 개시된 방법에서의 사용이 고려된다.
개시된 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 치료적으로 사용될 수 있다. "약제학적으로 허용되는"이란 생물학적으로 또는 다른 방식으로 바람직하지 않은 물질을 의미하고, 즉 물질은 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 유발하거나 그것이 함유된 약제학적 조성물의 임의의 다른 성분과 유해한 방식으로 상호작용하지 않고 핵산 또는 벡터와 함께 대상체에게 투여될 수 있다. 담체는 당업자에게 익히 공지되어 있는 바와 같이 활성 성분의 임의의 분해를 최소화하고 대상체에서 임의의 부작용을 최소화하기 위해 자연적으로 선택될 것이다.
물질은 용액, 현탁액(예: 미립자, 리포좀 또는 세포에 혼입됨)일 수 있다. 이들은 항체, 수용체 또는 수용체 리간드를 통해 특정 세포 유형에 표적화될 수 있다. 다음 참조 문헌은 특이적 단백질을 종양 조직에 표적화하는데 이 기술을 사용한 예이다(참조: Senter, 등, Bioconjugate Chem., 2:447-451, (1991); Bagshawe, K.D., Br. J. Cancer, 60:275-281, (1989); Bagshawe, 등, Br. J. Cancer, 58:700-703, (1988); Senter, 등, Bioconjugate Chem., 4:3-9, (1993); Battelli, 등, Cancer Immunol. Immunother., 35:421-425, (1992); Pietersz and McKenzie, Immunolog. Reviews, 129:57-80, (1992); 및 Roffler, 등, Biochem. Pharmacol, 42:2062-2065, (1991)). "스텔스"와 같은 비히클 및 다른 항체 접합 리포솜(결장 암종으로 표적화하는 지질 매개된 약물 포함), 세포 특이적 리간드를 통해 DNA의 수용체 매개된 표적화, 림프구 지시된 종양 표적화, 및 생체내에서 뮤린 신경교종 세포의 매우 특이적인 치료적 레트로바이러스 표적화. 다음 참조 문헌은 특이적 단백질을 종양 조직으로 표적화하는 데 이 기술을 사용하는 예이다(참조: Hughes 등, Cancer Research, 49:6214-6220, (1989); 및 Litzinger and Huang, Biochimica et Biophysica Acta, 1104:179-187, (1992)). 일반적으로, 수용체는 구성적이거나 리간드 유도된 엔도시토시스의 경로에 관련된다. 클라트린 코팅된 구덩이 중 이러한 수용체 클러스터는 클라트린 코팅된 소포를 통해 세포에 들어가고, 수용체가 분류된 산성화된 엔도솜을 통해 통과한 다음, 세포 표면으로 재활용되어 세포내로 저장되거나 리소솜에서 분해된다. 내부화 경로는 영양소 섭취, 활성화된 단백질의 제거, 거대분자의 클리어런스, 바이러스 및 독소의 기회적 유입, 리간드의 해리 및 분해, 및 수용체-수준 조절과 같은 다양한 기능을 제공한다. 많은 수용체는 세포 유형, 수용체 농도, 리간드의 유형, 리간드 원자가, 및 리간드 농도에 따라 하나 이상의 세포내 경로를 따른다. 수용체 매개된 엔도시토시스의 분자 및 세포 기전이 재검토되었다(참조: Brown and Greene, DNA and Cell Biology 10:6, 399-409 (1991)).
적합한 담체 및 그들의 제형은 문헌(참조: Remington: The Science 및 Practice of Pharmacy (19th ed.) ed. A.R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA 1995)에 기재되어 있다. 전형적으로, 적합한 양의 약제학적으로 허용되는 염은 제형을 등장성이도록 하기 위해 제형에 사용된다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예는 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 용액의 pH는 바람직하게는 약 5 내지 약 8, 더욱 바람직하게는 약 7 내지 약 7.5이다. 추가의 담체는 서방성 제제, 예를 들어, 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투성 매트릭스를 포함하고, 이 매트릭스는 성형된 물품, 예를 들어, 필름, 리포솜 또는 미립자의 형태이다. 특정 담체가, 예를 들어, 투여 경로 및 투여되는 조성물의 농도에 따라 더 바람직할 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다.
약제학적 담체는 당업자에게 공지되어 있다. 이들은 가장 전형적으로 생리학적 pH에서 멸균수, 식염수 및 완충된 용액과 같은 용액을 포함하여 인간에게 약물을 투여하기 위한 표준 담체일 것이다. 상기 조성물은 근육내 또는 피하로 투여될 수 있다. 다른 화합물은 당업자에 의해 사용되는 표준 절차에 따라 투여될 것이다.
약제학적 조성물은 선택되는 분자 이외에 담체, 증점제, 희석제, 완충제, 방부제, 표면 활성제 등을 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 또한 하나 이상의 활성 성분, 예를 들어, 항균제, 항염증제, 마취제 등을 포함할 수 있다.
비경구 투여용 제제는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다. 비수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예를 들어, 올리브유, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예를 들어, 에틸 올레에이트이다. 수성 담체는 식염수 및 완충된 매질을 포함하여 물, 알콜성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거의 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 락테이트화 링거 또는 불휘발성 오일을 포함한다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양 보충제, 전해질 보충제(예: 링거의 덱스트로스에 기초하는 것들) 등을 포함한다. 예를 들어, 항균제, 항산화제, 킬레이트제 및 불활성 가스 등과 같은 방부제 및 다른 첨가제가 또한 존재할 수 있다.
국소 투여용 제형은 연고, 로션, 크렘, 겔, 점적제, 좌제, 스프레이, 액체 및 분말을 포함할 수 있다. 통상적인 약제학적 담체, 수성 분말 또는 유성 기제, 증점제 등이 필요하거나 바람직할 수 있다.
경구 투여용 조성물은 분말 또는 과립, 물 또는 비수성 매질 중 현탁액 또는 용액, 캡슐, 사세 또는 정제를 포함한다. 증점제, 향미제, 희석제, 유화제, 분산제 또는 결합제가 바람직할 수 있다.
조성물 중 일부는 잠재적으로 무기산, 예를 들어, 염산, 브롬화수소산, 과염소산, 질산, 티오시안산, 황산 및 인산, 및 유기 산, 예를 들어, 포름산, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 락트산, 피루브산, 옥살산, 말론산, 석신산, 말레산 및 푸마르산과의 반응에 의해 또는 무기 염기, 예를 들어, 수산화나트륨, 수산화암모늄, 수산화칼륨, 및 유기 염기, 예를 들어, 모노-, 디-, 트리알킬 및 아릴 아민 및 치환된 에탄올아민과의 반응에 의해 형성된 약제학적으로 허용되는 산- 또는 염기 부가염으로서 투여될 수 있다.
약제학적 조성물을 포함하여 본원에 개시된 조성물은 국소 또는 전신 치료가 목적시되는지의 여부 및 치료될 영역에 따라 다수의 방식으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 개시된 조성물은 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 공동내 또는 경피로 투여될 수 있다. 상기 조성물은 국소 비내 투여 또는 흡입제에 의한 투여를 포함하여 경구, 비경구(예: 정맥내), 근육내 주사, 복강내 주사, 경피적, 체외적, 안과적, 질내, 직장내, 비강내, 국소 등으로 투여될 수 있다
방법
ETV2, FOXC2 및 FLI1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 둘 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 체세포에 세포내 전달하는 단계를 포함하는, 혈관형성 세포 및/또는 내피 세포로 체세포를 재프로그래밍하는 방법이 또한 개시된다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 비바이러스성 벡터에 존재한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 다른 구현예에서, 핵산은 둘 이상의 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된다.
ETV2, FOXC2 및 FLI1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 하나, 둘 또는 그 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 miR-200b 억제제를 체세포로 세포내 전달하는 단계를 포함하여, 체세포를 혈관형성 세포 및/또는 내피 세포로 재프로그래밍하는 방법도 또한 개시된다.
miR-200b 억제제를 체세포로 세포내 전달하는 단계를 포함하여, 체세포를 혈관형성 세포 및/또는 내피 세포로 재프로그래밍하는 방법도 또한 개시된다.
다양한 방법이 당업계에 공지되어 있고, 바이러스 및 비바이러스 매개된 기술을 포함하여 세포에 핵산을 도입하는데 적합하다. 전형적인 비바이러스 매개된 기술의 예는 전기천공, 인산칼슘 매개된 전달, 뉴클레오펙션, 소노포레이션, 열 충격, 미그네토펙션, 리포솜 매개 전달, 미세주사, 미세투사 매개된 전달(나노입자), 양이온성 중합체 매개 전달(DEAE-덱스트란, 폴리에틸렌이민, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 등) 또는 세포 융합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 표적 세포를 EFF로 형질감염시킨 후, 세포는 형질감염된 유전자(예: cDNA)를 EV로 포장할 수 있고, 이는 이어서 다른 체세포에서 내피를 유도할 수 있다. 유사하게, miR-200b 억제제로 형질감염된 세포는 EV에서 그 억제제의 일부를 세포외 유출하는 경향이 있고, 이는 이후 다른/원격 체세포에서 내피를 유도하는데 사용될 수 있다. 따라서, ETV2, FOXC2 및 FLI1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 함유하거나 발현하는 세포로부터 생성된 세포외 소포로 체세포를 노출시키는 단계를 포함하는, 혈관형성 세포 및/또는 내피 세포로 체세포를 재프로그래밍하는 방법이 또한 개시된다. miR-200b 억제제를 함유하는 세포로부터 생성된 세포외 소포로 체세포를 노출시키는 단계를 포함하는 혈관형성 세포 및/또는 내피 세포로 체세포를 재프로그래밍하는 방법도 또한 개시된다.
따라서, ETV2, FOXC2 및 FLI1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 외인성 폴리뉴클레오타이드를 발현하거나 함유하는 세포로부터 단리된 세포외 소포(EV)에 체세포를 노출시키는 단계를 포함하는, 혈관형성 세포 및/또는 내피 세포로 체세포를 재프로그래밍하는 방법이 개시된다. 또한, miR-200b 억제제로 형질감염된 세포로부터 단리된 세포외 소포(EV)에 체세포를 노출시키는 단계를 포함하는, 혈관형성 세포 및/또는 내피 세포로 체세포를 재프로그래밍하는 방법이 개시된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 공여체 세포는 하나 이상의 개시된 폴리뉴클레오타이드 또는 miR-200b 억제제로 형질감염되고, 시험관내에서 배양된다. 이어서, 공여체 세포에 의해 분비된 EV는 배양 배지로부터 수집될 수 있다. 이어서, 이러한 EV는 체세포에 투여되어 그들을 혈관형성 세포 및/또는 내피 세포로 재프로그래밍할 수 있다. 일부 구현예에서, 공여체 세포는 피부 섬유아세포, 근육 섬유아세포, 피부 상피, 장 상피 및 도관 상피를 포함하지만 (이에 제한되지 않는) 결합 조직 또는 상피 조직으로부터의 임의의 기질/지지체 세포일 수 있다.
엑소좀 및 미세소포는 크기 및 표면 단백질 마커를 포함하는 생물 발생 과정 및 생물 물리학적 특성에 기초하여 상이한 EV이다. 엑소좀은 크기가 40 내지 150nm 범위의 균일한 작은 입자이고, 그들은 일반적으로 식작용 재순환 경로로부터 유도된다. 엔도시토시스에서, 식작용 소포는 원형질막에서 형성되고 융합하여 조기 엔도좀을 형성한다. 이들은 성숙해지고, 관내 소포가 소포내 루멘으로 발아되기 시작하는 후기 엔도좀이 된다. 리소좀과 융합되는 대신, 이러한 다중소포체는 원형질막과 직접 융합되어 엑소좀을 세포외 공간으로 방출한다. 엑소좀 생물 발생, 단백질 화물 분류 및 방출은 수송을 위해 필요한 엔도좀 분류 복합체(ESCRT 복합체) 및 다른 관련 단백질, 예를 들어, Alix 및 Tsg101을 포함한다. 대조적으로, 미세소포는 원형질막으로부터 막 소포의 외부 발아 및 분열을 통해 직접 생성되며, 따라서 그들의 표면 마커는 원래의 막의 조성에 크게 의존한다. 또한, 그들은 직경이 150 내지 1000nm에 이르는 세포외 소포의 보다 크고 보다 이질적인 집단을 구성하는 경향이 있다. 그러나, 두 종류의 소포는 수용체 세포에 기능적 mRNA, miRNA 및 단백질을 전달하는 것으로 나타났다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 유전자 총, 이러한 전달에 적합한 미립자 또는 나노입자, 전기천공에 의한 형질감염, 3차원 나노채널 전기천공, 조직 나노형질감염 장치, 이러한 전달에 적합한 리포솜, 또는 심도-국소 조직 나노전기주사 장치를 통해 체세포로 또는 EV의 경우 공여체 세포로 세포내 전달된다. 일부 구현예에서, 바이러스성 벡터가 사용될 수 있다. 그러나, 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 바이러스적으로 전달되지 않는다.
전기천공은 전기장이 세포에 인가되어 세포막의 침투성을 증가시키고, 화물(예: 재프로그래밍 인자)이 세포에 도입되도록 하는 기술이다. 전기천공은 외래 DNA를 세포로 도입하기 위한 일반적인 기술이다.
조직 나노형질감염은 매우 강렬하고 집중된 전기장을 배열된 나노채널을 통해 인가함으로써 화물(예: 재프로그래밍 인자)의 세포로의 직접 세포질 전달을 가능하게 하며, 이는 병치 조직 세포 막을 양성으로 나노천공하고, 전기영동적으로 화물을 세포로 구동한다.
하나의 구현예에서, 개시된 조성물은 약 0.1ng 내지 약 100g/체중 1kg, 약 10ng 내지 약 50g/체중 1kg, 약 100ng 내지 약 1g/체중 1kg, 약 1㎍ 내지 약 100mg/체중 1kg, 약 1㎍ 내지 약 50mg/체중 1kg, 약 1mg 내지 약 500mg/체중 1kg; 및 약 1mg 내지 약 50mg/체중 1kg의 비경구 투여에 등가인 용량으로 투여된다. 대안적으로, 치료적 유효량을 달성하기 위해 투여되는 개시된 조성물의 양은 약 0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng, 1㎍, 10㎍, 100㎍, 1mg, 2mg, 3mg, 4mg, 5mg, 6mg, 7mg, 8mg, 9mg, 10mg, 11mg, 12mg, 13mg, 14mg, 15mg, 16mg, 17mg, 18mg, 19mg, 20mg, 30mg, 40mg, 50mg, 60mg, 70mg, 80mg, 90mg, 100mg, 500mg/체중 1kg 이상이다.
일부 구현예에서, 개시된 조성물 및 방법은 스캐폴딩 구조로서 작용할 수 있는 혈관계를 생성하는데 사용된다. 이어서, 이 스캐폴딩 구조는, 예를 들어, 신경 조직의 회복을 돕기 위해 사용될 수 있다. 이의 적용은 말초 신경 손상, 및 외상성 뇌 손상 또는 뇌졸중과 같은 중추신경계에 대한 병리학적/해로운 손상을 포함한다. 일부 구현예에서, 생성된 혈관계는 복합 조직 이식체 또는 임의의 조직 이식편에 영양분을 공급하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 개시된 조성물 및 방법은 "원치 않는" 조직(예: 지방, 흉터 조직)을 혈관계로 전환시키는데 사용된다. 이러한 새롭게 형성된 혈관계는 비허혈 조건하에 "재흡수"될 것으로 기대된다.
정의
용어 "대상체"는 투여 또는 치료의 표적인 임의의 개체를 지칭한다. 대상체는 척추동물, 예를 들어, 포유동물일 수 있다. 따라서, 대상체는 인간 또는 수의 환자일 수 있다. 용어 "환자"는 임상의, 예를 들어, 의사의 치료하에 있는 대상체를 지칭한다.
용어 "치료적으로 효과적인"은 사용된 조성물의 양이 질환 또는 장애의 하나 이상의 원인 또는 증상을 개선시키기에 충분한 양임을 지칭한다. 이러한 개선은 반드시 제거하는 것이 아니라 감소 또는 변경만을 필요로 한다.
용어 "약제학적으로 허용되는"은 건강한 의학적 판단 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 합리적인 이익/위험 비에 상응하는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭한다.
용어 "담체"는 화합물 또는 조성물과 함께 의도된 사용 또는 목적을 위한 화합물 또는 조성물의 제조, 저장, 투여, 전달, 유효성, 선택성 또는 임의의 다른 특징을 보조하거나 촉진시키는 화합물, 조성물, 물질 또는 구조를 의미한다. 예를 들어, 담체는 활성 성분의 임의의 분해를 최소화하고, 대상체에서 임의의 부작용을 최소화하기 위해 선택될 수 있다.
용어 "치료"는 질환, 병리학적 상태 또는 장애를 치료, 개선, 안정화시키거나 예방하려는 의도를 갖는 환자의 의학적 관리를 지칭하다. 이 용어는 활성적 치료, 즉 질환, 병리학적 상태 또는 장애의 개선을 위해 구체적으로 지시된 치료를 포함하고, 또한 인과적 치료, 즉 관련된 질환, 병리학적 상태 또는 장애의 원인을 제거하기 위해 지시된 치료를 포함한다. 또한, 이 용어는 완화적 치료, 즉 질환, 병리학적 상태 또는 장애의 치료보다는 증상의 완화를 위해 설계된 치료; 예방적 치료, 즉 관련된 질환, 병리학적 상태 또는 장애의 발병을 최소화하거나 부분적으로 또는 완전히 억제하기 위해 지시된 치료; 및 보조적 치료, 즉 관련된 질환, 병리학적 상태 또는 장애의 개선을 위해 지시된 다른 특정 요법을 보완하기 위해 사용된 치료를 포함한다.
용어 "억제하다"는 활성, 반응, 상태, 질환 또는 다른 생물학적 파라미터의 감소를 지칭한다. 이는 활성, 반응, 상태 또는 질환의 완전한 제거를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 이는 또한, 예를 들어, 순수한 또는 대조군 수준과 비교하여 활성, 반응, 상태 또는 질환의 10% 감소를 포함할 수 있다. 따라서, 감소는 순수한 또는 대조군 수준과 비교하여 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100%, 또는 그 사이의 임의의 감소량일 수 있다.
용어 "폴리펩타이드"는 펩타이드 결합 또는 변형된 펩타이드 결합, 예를 들어, 펩타이드 등배전자체에 의해 서로 결합된 아미노산을 지칭하고, 20개의 유전자 코딩된 아미노산 이외의 변형된 아미노산을 함유할 수 있다. 폴리펩타이드는 번역후 처리와 같은 천연 공정에 의해 또는 당업계에 익히 공지되어 있는 화학적 변형 기술에 의해 변형될 수 있다. 변형은 펩타이드 백본, 아미노산 측쇄 및 아미노 또는 카복실 말단을 포함하는 폴리펩타이드 중 어디서든 발생할 수 있다. 동일한 유형의 변형이 소정의 폴리펩타이드 중 다수의 부위에서 동일하거나 다양한 정도로 존재할 수 있다. 또한, 소정의 폴리펩타이드는 많은 유형의 변형을 가질 수 있다. 변형은, 비제한적으로, 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 공유 가교결합 또는 사이클릭화, 플라빈의 공유 부착, 헴 잔기의 공유 부착, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유도체의 공유 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유 부착, 포스피티딜이노시톨의 공유 부착, 디설파이드 결합 형성, 탈메틸화, 시스테인 또는 피로글로타메이트의 형성, 포르밀화, 감마-카복실화, 글리코실화, GPI 앵커 형성, 하이드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 페길화, 단백질 분해 처리, 포스포릴화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황화 및 아르기닐화와 같은 단백질에 대한 아미노산의 전달-RNA 매개된 첨가를 포함한다(참조: Proteins - Structure and Molecular Properties 2nd Ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pp. 1-12 (1983)).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "아미노산 서열"은 아미노산 잔기를 나타내는 약어, 문자, 글자 또는 단어의 목록을 지칭한다. 본원에 사용된 아미노산 약어는 아미노산에 대한 통상적인 1 문자 코드이고, 다음과 같이 표현된다: A, 알라닌; B, 아스파라긴 또는 아스파르트산; C, 시스테인; D 아스파르트산; E, 글루타메이트, 글루탐산; F, 페닐알라닌; G, 글리신; H 히스티딘; I 이소류신; K, 리신; L, 류신; M, 메티오닌; N, 아스파라긴; P, 프롤린; Q, 글루타민; R, 아르기닌; S, 세린; T, 트레오닌; V, 발린; W, 트립토판; Y, 티로신; Z, 글루타민 또는 글루탐산.
본원에 사용된 어구 "핵산"은 DNA 또는 RNA 또는 DNA-RNA 하이브리드, 단일 가닥 또는 이중 가닥, 센스 또는 안티센스의 천연 또는 합성 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 지칭하고, 이는 왓슨-크릭 염기쌍에 의해 상보적 핵산으로 하이브리드화할 수 있다. 핵산은 또한 뉴클레오타이드 유사체(예: BrdU), 및 비-포스포디에스테르 뉴클레오사이드간 결합(예: 펩타이드 핵산(PNA) 또는 티오디에스테르 결합)을 포함할 수 있다. 특히, 핵산은, 비제한적으로 DNA, RNA, cDNA, gDNA, ssDNA, dsDNA 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "뉴클레오타이드"는 염기 잔기, 당 잔기 및 포스페이트 잔기를 함유하는 분자이다. 뉴클레오타이드는 그들의 포스페이트 잔기 및 당 잔기를 통해 함께 결합되어 뉴클레오사이드간 결합을 생성할 수 있다. 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 때로 함께 연결된 둘 이상의 뉴클레오타이드를 함유하는 분자를 지칭하기 위해 사용된다. 뉴클레오타이드의 염기 잔기는 아데닌-9-일(A), 시토신-1-일(C), 구아닌-9-일(G), 우라실-1-일(U), 및 티민-1-일(T)일 수 있다. 뉴클레오타이드의 당 잔기는 리보스 또는 데옥시리보스이다. 뉴클레오타이드의 포스페이트 잔기는 5가 포스페이트이다. 뉴클레오타이드의 비제한적인 예는 3'-AMP(3'-아데노신 모노포스페이트) 또는 5'-GMP(5'-구아노신 모노포스페이트)일 것이다.
뉴클레오타이드 유사체는 염기, 당 및/또는 포스페이트 잔기에 대한 일부 유형의 변형을 함유하는 뉴클레오타이드이다. 뉴클레오타이드에 대한 변형은 당업계에 익히 공지되어 있고, 예를 들어, 5-메틸시토신(5-me-C), 5 하이드록시메틸 시토신, 크산틴, 하이포크산틴, 및 2-아미노아데닌 뿐만 아니라 당 또는 포스페이트 잔기에서의 변형을 포함할 것이다.
뉴클레오타이드 치환체는 뉴클레오타이드와 유사한 기능적 성질을 갖지만, 펩타이드 핵산(PNA)과 같은 포스페이트 잔기를 함유하지 않는 분자이다. 뉴클레오타이드 치환체는 왓슨-크릭 또는 호그스틴(Hoogsteen) 방식으로 핵산을 인식하지만 포스페이트 잔기 이외의 잔기를 통해 함께 연결된 분자이다. 뉴클레오타이드 치환체는 적절한 표적 핵산과 상호작용할 때 이중 나선형 구조와 일치할 수 있다.
용어 "벡터" 또는 "작제물"은 세포에 벡터 서열이 연결된 또 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 서열을 지칭한다. 용어 "발현 벡터"는 세포(예: 전사 조절 요소에 연결됨)에 의한 발현에 적합한 형태로 유전자 작제물을 함유하는 임의의 벡터(예; 플라스미드, 코스미드 또는 파지 염색체)를 포함한다. "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 통상적으로 사용되는 벡터의 형태이기 때문에 상호교환적으로 사용된다. 또한, 본 발명은 동등한 기능을 수행하는 다른 벡터를 포함하도록 의도된다.
용어 "~에 작동가능하게 연결된"은 핵산과 다른 핵산 서열의 기능적 관계를 지칭한다. 프로모터, 인핸서, 전사 및 번역 정지 부위 및 다른 신호 서열은 다른 서열에 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 예이다. 예를 들어, 전사 조절 요소에 대한 DNA의 작동가능한 결합은 이러한 DNA의 전사가 특이적으로 DNA를 인식하고, 이에 결합하고, 이를 전사하는 RNA 폴리머라제에 의해 프로모터로부터 개시되도록 DNA와 프로모터 사이의 물리적 및 기능적 관계를 지칭한다.
본원의 목적을 위해, 소정의 핵산 서열 D에 대한 소정의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 C의 % 서열 동일성(대안적으로, 소정의 서열 D에 대한 특정의 % 서열 동일성을 갖거나 포함하는 소정의 서열 C로서 표현될 수 있음)은 다음과 같이 계산된다:
100 x 분획 W/Z,
상기 식에서, W는 C와 D의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램에 의해 동일하게 일치하는 것으로 스코어화된 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 수이고, Z는 D 중 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 총 수이다. 서열 C의 길이가 서열 D의 길이와 같지 않을 경우, D에 대한 C의 % 서열 동일성은 C에 대한 D의 % 서열 동일성과 같지 않을 것이라는 것을 이해할 것이다. % 서열 동일성을 결정할 목적을 위한 정렬은, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 당업계의 기술 범위 내에 있는 다양한 방법으로 달성될 수 있다.
"특이적으로 하이브리드화한다"란 프로브, 프라이머 또는 올리고뉴클레오타이드가 매우 엄격한 조건하에 실질적으로 상보적인 핵산(예: c-met 핵산)을 인식하고 물리적으로 상호작용하고(즉, 염기-쌍), 실질적으로 다른 핵산과 염기쌍을 이루지 않는다는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "엄격한 하이브리드화 조건"은 프로브와 표적 서열 사이에 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 97% 서열 동일성이 존재하는 경우 하이브리드화가 일반적으로 일어날 것이라는 것을 의미한다. 엄격한 하이브리드화 조건의 예는 50% 포름아미드, 5X SSC (150mM NaCl, 15mM 삼나트륨 시트레이트), 50mM 인산나트륨(pH 7.6), 5X 덴하르트(Denhardt's) 용액, 10% 덱스트란 설페이트, 및 20㎍/ml 변성된 전단 담체 DNA, 예를 들어, 연어 정자 DNA를 포함하는 용액에서 밤새 배양 후, 약 65℃에서 0.1X SSC로 하이브리드화 지지체를 세척한다. 다른 하이브리드화 및 세척 조건은 익히 공지되어 있고, 문헌(참조: Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), 특히 chapter 11)에 예시되어 있다.
본 발명의 다수의 구현예가 기재되어 있다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 취지 및 범위로부터 벗어나지 않고 다양한 변형이 이루어질 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 다른 구현예는 다음 청구범위의 범위 내에 있다.
실시예
실시예 1: 체세포의 유도된 내피 세포로의 시험관내 재프로그래밍.
도 2를 참조하면, 시험관내 비바이러스성 형질감염 및 재프로그래밍 실험은, 유전자 Etv2, Foxc2 및 Fli1 (EFF)의 동시 형질감염이 1주일 미만에 인간 및 마우스의 1차 섬유 아세포를 유도된 내피 세포로 효율적으로 재프로그래밍한다는 것을 나타냈다. 이러한 실험에서, HDAF 세포는 EFF로 비바이러스적으로 형질감염되었다. 형질감염된 세포의 형광 현미경 사진은 내피 마커 Pecam-1의 강한 발현 뿐만 아니라 섬유아세포 마커 FSP(t= 형질감염 후 7일)의 감소된 발현을 나타냈다. 2개의 상이한 형질감염 조건(Etv2 단독 대 EFF의 동시 형질감염)에 대한 내피 마커의 유전자 발현 분석. 결과는 유전자 발현의 현저한 차이를 나타냈고, EFF는 Etv2 단독과 비교하여 형질감염 후 7일째에 상당히 더 강한 내피 유전자 발현을 초래한다. 튜브 형성 검정으로부터의 결과는 EFF-형질감염 세포가 내피 세포(HMEC, 양성 대조군)에 필적할 만한 매트리겔에서 배양될 때 혈관형 구조를 형성할 수 있음을 나타냈다. 한편, 대조군 HDAF 세포는 매트리겔에서 배양될 때 튜브형 구조를 형성할 수 없었다. EFF로 비바이러스적으로 형질감염된 MEF 세포는 형질감염 후 7일째 조기에 내피 마커 발현을 나타냈다. EFF로 비바이러스적으로 형질감염된 td토마토-MEF 세포는 NSG 마우스의 옆구리 주사 후 혈관 형성을 조성했다. 이러한 데이터는 이하 표 1에 추가로 요약된다.
Figure pct00001
실시예 2: EFF TNT는 허혈 조건하에 피부 조직의 증가된 혈관화 및 구조를 유도한다.
도 1을 참조하면, 직접 내피 세포 재프로그래밍을 유도하는 EFF의 효능이 시험관내에서 확립되면, 생체내 재프로그래밍 방법을 시험하였다. 몇 초만 지속하는 C57BL/6 마우스의 등쪽 피부를 1회 치료하면, 대조군 피부에 비해 Pecam-1 및 vWF의 발현의 상당한 증가로 입증된 바와 같이, 7일째 피부 조직의 혈관신생을 증가시켰다. 고해상도 레이저 스페클 이미징은 경시적으로 EFF TNT 처리된 영역에 대한 향상된 관류(혈류)를 나타냈다. EFF TNT 처리된 피부의 초음파 이미징은 피부의 표면으로부터 단지 3mm 떨어진 박동성 거동을 갖는 표피상 혈관의 존재를 확인했고, 이는 부모 순환계와의 성공적인 문합을 시사한다.
단엽 플랩 실험은 TNT 처리된 피부와 비교하여 대조군 조직에 대한 플랩 괴사가 증가되었음을 나타냈다. 레이저 스페클 이미징은 플랩된 EFF TNT 처리된 조직으로의 증가된 혈류를 나타냈다. 이러한 실험은, EFF-매개된 피부 재프로그래밍은 허혈 조직의 기능적 재관류를 유도하고, EFF 전달은 허혈 조건하에 조직 괴사를 방해함을 입증한다.
실시예 3. EFF TNT는 괴사성 허혈로부터 전체 사지를 구조한다.
도 3을 참조하면, 추가의 실험은 EFF 전달이 뒷다리 허혈 C57BL/6 마우스 모델에서 전체 사지 구조를 유도한다는 것을 입증하였다. 몇 초만 지속하는 허벅지 피부의 1회 치료는 대대퇴 동맥의 절단 후 사지 재관류를 증가시켰다. 관류는 허혈 대 정상/대측성 사지의 비율에 기초하여 계산되었다. 대조군 사지는 14일째에 EFF TNT 처리된 사지와 비교하여 조직 괴사의 더 현저한 징후를 보였다. 근육 에너지론의 NMR-기반 측정은 대조군과 비교하여 EFF TNT 처리된 사지에 대한 증가된 ATP 및 PCr 수준을 확인했다. 비장근의 면역형광 분석은 14일째에 향상된 혈관신생을 나타냈다.
실시예 4. EFF -TNT는 Balb/c 뒷다리 허혈 모델에서 괴사성 사지를 구조한다.
도 4를 참조하면, 손상 유도된 사지 허혈로부터 더 해로운 부작용을 겪는 경향이 있는 Balb/c 마우스에서의 추가 실험은 EFF 치료가 성공적인 사지 관류를 유도한 후 괴사 및 자동-절단으로부터 구조한다는 것을 보여주었다. 사지의 레이저 스페클 이미징은 EFF TNT 치료 후 성공적인 재관류를 보였다. 도 4의 패널(b)는 TNT 치료를 하거나 치료를 하지 않고 허혈성 사지의 거시적인 변화를 도시한다.
실시예 5. EFF TNT 처리된 등쪽 피부로부터 단리된 세포외 소포는 허혈성 사지 재관류 및 구조를 매개하는데 도움을 준다.
도 5를 참조하면, PCR 분석은, 형질감염 EFF mRNAs/cDNA 이외에, 세포외 소포(EV) 단리된 EFF TNT 처리된 등쪽 피부가 전혈관신생 VEGF 및 bFGF mRNA가 미리 적재된 것으로 나타난다는 것을 나타냈다. 이는, EFF TNT-처리된 피부로부터 유래된 EV가 표적 조직 전반에 걸쳐 EFF 재프로그래밍 신호를 전파시키는 생존 가능한 기전을 나타낼 뿐만 아니라 형질감염 후 첫 번째 시간 내에 전혈관신생 신호를 전파함으로써 틈새 전처리에 역할을 할 수도 있음을 시사한다. 도 5의 패널 (a)는 손상/EV-매개된 구조의 개략도를 도시한다. qRT-PCR은 EV 함량을 특성화하는 데 사용되었다. 도 5의 패널 (b)는 EFF 처리된 피부의 레이저 스페클 재관류 분석을 도시한다. EV 처리된 사지에 대한 증가된 혈관신생을 보여주는 비장근의 면역형광 분석.
실시예 6. 피부에서 유도된 내피 세포는 Col1A1-발현 진피 공급원으로 유래된다.
도 6을 참조하면, K14-Cre 리포터 및 Col1A1-eGFP 마우스 모델을 이용한 실험은 재프로그래밍된 세포 집단이 대부분 진피 기원을 가졌음을 확인했다. Pecam-1 내피 마커를 또한 발현하는 Col1A1 기원(그린색)의 피부 세포를 나타내는 Col1A1-GFP 마우스 모델로부터 EFF TNT 처리된 피부 절편의 형광 현미경 사진. GFP 트레이서 및 Pecam-1 둘 다에 대해 면역반응성이었던 세포 요소를 LCM/qRT-PCR로 추가로 분석하였다. 결과는, 이러한 이중 양성 요소가 유의하게 높은 내피 마커 유전자 발현을 나타냈다는 것을 나타낸다. GFP+/CD31+ 세포 요소의 LCM/qRT-PCR 측정은 내피 마커의 증가된 발현을 확인했다.
방법
TNT 플랫폼 제조.
TNT 장치는 얇은(약 200㎛) 양면 연마된(100) 규소 웨이퍼로 제조되었다. 간단하게, 약 1.5㎛ 두께 층의 AZ5214E 감광성 내식막을 약 3000rpm에서 규소 웨이퍼에서 먼저 스핀 코팅했다. 이어서, 나노스케일 개구부를 GCA 6100C 스텝퍼를 사용하여 감광성 내식막 상에서 패턴화했다. 100-mm 웨이퍼당 나노스케일 개구부 어레이의 최대 16개 다이를 패턴화했다. 이어서, 이러한 개구부를 심도 반응성 이온 에칭(DRIE)(Oxford Plasma Lab 100 system)을 사용하여 규소 표면에서 약 10㎛ 깊이의 나노채널을 뚫기 위해 에칭 마스크로서 사용했다. 최적화된 에칭 조건은 SF6 가스: 13s/100 sccm 가스 유동/700W ICP 전력/40W RF 전력/30mT APC 전압; C4F8 가스 조건: 7s/100 sccm 가스 유동/700W ICP 전력/10W RF 전력/30mT APC 전압을 포함한다. 이어서, 마이크로스케일 저장소를 접촉식 포토리소그래피 및 DRIE를 통해 웨이퍼의 뒷면에서 패턴화하였다. 최종적으로, 질화규소의 약 50nm 두께의 절연/보호 층을 TNT 플랫폼 표면 위에 증착시켰다.
축산업.
수컷 C57BL/6 마우스(8 내지 10주령)를 Harlan Laboratory로부터 입수했다. Jackson laboratories로부터 입수된 B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-td토마토,-EGFP)Luo/J 마우스를 K14cre와 교배하여 K14cre/Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-td토마토-EGFP)Luo/J 마우스를 생산하였다. pOBCol3.6GFPtpz 마우스는 트레시 윌구스(Traci Wilgus) 박사(오하이오 주립 대학)의 선물이었다. ROSAmT/mG 마우스의 유전자형 분석 PCR은 프라이머 oIMR7318-CTC TGC TGC CTC CTG GCT TCT (서열번호: 8), oIMR7319-CGA GGC GGA TCA CAA GCA ATA (서열번호: 9) 및 oIMR7320-TCA ATG GGC GGG GGT CGT T (서열번호: 10)를 사용하여 수행한 반면, K-14 Cre 도입유전자는 프라이머 oIMR1084-GCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC (서열번호: 11); oIMR1085-GTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT (서열번호: 12)를 사용하여 확인하였다. 모든 동물 연구는 오하이오 주립 대학의 실험 동물 관리 및 사용 위원회가 승인한 프로토콜에 따라서 수행되었다. 동물은 컴퓨터 기반 알고리즘을 사용하여 태깅하고 무작위로 그룹화하였다.
포유동물 세포 배양 및 시험관내 재프로그래밍.
1차 인간 성인 진피 섬유아세포(ATCC PCS-201-012)를 섬유아세포 성장 키트-무혈청(ATCC PCS 201-040) 및 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 섬유아세포 기초 배지에서 확장시켰다. E12.5-E14 마우스 배아 섬유아세포(MEF)를 10% 태아 소 혈청이 보충된 DMEM/F12에서 배양했다. 비바이러스성 세포 형질감염 및 재프로그래밍 실험은 이전에 기재된 바와 같이 3D 나노채널 전기천공(NEP)을 통해 수행하였다. 간단히, 세포를 먼저 3D NEP 장치에서 밤새 완전 컨플루언시로 성장시켰다. 후속적으로, 펄스화된 전기장을 사용하여 플라스미드의 칵테일(0.05 ㎍/μl)을 Fli1:Etv2:Foxc2의 1:1:1 혼합물로 이루어진 세포로 전달했다. 이어서, 세포를 플라스미드 전달 후 24시간에 수확하고, EGM-2 MV SingleQuot 키트(CC-4147, Lonza)가 보충된 EBM-2 기초 배지(CC-3156, Lonza)에 넣고, 추가의 실험/측정을 위해 추가로 처리했다. Etv2 및 Fli1 플라스미드는 안와룰 페르두스(Anwarul Ferdous) 박사(텍사스주 UT 남서부 의료 센터 내과 의학과)에 의해 친절하게 기증되었다. Foxc2 플라스미드는 쓰토무 쿠메(Tsutomu Kume) 박사(시카고 노스웨스턴 대학-FCVRI 의과 대학 심장내과 및 약리학과)에 의해 친절하게 기증되었다.
생체내 재프로그래밍.
치료할 영역은 TNT 24 내지 48시간 전에 먼저 네어화했다. 이어서, 피부를 박리시켜 죽은/케라틴 세포 층을 제거하고, 표피에서 유핵 세포를 노출시킨다. TNT 장치를 박리된 피부 표면에 직접 위치시켰다. EFF 플라스미드 칵테일을 저장소에 0.05-0.1㎍/μl의 농도로 적재했다. 금 코팅된 전극(즉, 캐소드)을 플라스미드 용액에 침지시키면서, 24G 바늘 반대-전극(즉, 애노드)을 피내로 삽입하여 TNT 플랫폼 표면에 병치시켰다. 이어서, 펄스화된 전기 자극(즉, 진폭에서 250V의 10 펄스 및 펄스당 10ms 지속 기간)을 전극에 인가하여 노출된 세포 막을 나노천공시키고 플라스미드 화물을 나노채널을 통해 세포로 구동시킨다.
뒷다리 허혈 수술.
편측성 뒷다리 허혈을 대퇴 동맥의 폐색 및 후속적 절단을 통해 유도했다. 간단히, 8 내지 10주령 마우스를 1 내지 3% 이소플루란으로 마취시키고, 가열된 패드 상에서 입체현미경(Zeiss OPMI)하에 반드시 누운 듯 위치시켰다. 대퇴 동맥을 노출시키고 약 1cm 절개를 통해 대퇴 정맥으로부터 분리시켰다. 근위 및 원위 말단 폐색을 7 내지 0 실크 봉합사로 유도하였고, 이어서, 동맥의 완전한 형질감염이 이어졌다. 최종적으로, 부프레노르핀의 단일 용량을 피하 투여하여 통증을 조절하였다. 레이저 스페클 이미징(MoorLDI-Mark 2)을 수술 후 2시간 수행하여 성공적인 혈류 폐색을 확인했다.
세포외 소포(EV)의 단리.
EV는 OCT 블록에서 수집된 12mm 직경의 피부 생검으로부터 단리시키고, 이후 사용을 위해 냉동 저장했다. 간단히, 블록을 해동시키고, 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척하여 OCT를 제거했다. 메스로 지방 조직을 제거 후, 피부 조직을 약 1mm 조각으로 다지고, PBS에서 마이크로-그라인더로 균질화하였다. 3000g에서 원심분리 후, Exoquick 키트(System Biosciences)를 1:5 비(Exoquick:상청액)로 사용하여 4℃에서 12시간 동안 상청액으로부터 EV를 단리시켰다. EV를 1500g에서 30분 동안 원심분리를 통해 침전시켰다. 이어서, 총 RNA를 제조업자에 의해 제공된 권장 사항에 따라 mirVana 키트(Life technologies)를 사용하여 펠릿으로부터 추출시켰다.
DNA 플라스미드 제조.
EFF 플라스미드는 플라스미드 DNA 정제 키트(Qiagen Maxi-prep, 카탈로그 번호 12161, 및 Clontech Nucleobond 카탈로그 번호 740410)를 사용하여 제조했다. DNA 농도는 Nanodrop 2000c 분광 광도계(Thermoscientific)를 사용하여 수득하였다. 플라스미드 DNA 작제물 및 그들의 최초 공급원의 목록은 표 2를 참조한다.
Figure pct00002
레이저 포획 현미해부 (LCM) 및 정량적 실시간 PCR.
LCM은 PALM Technologies(Bernreid, Germany)로부터의 레이저 현미해부 시스템을 사용하여 수행하였다. 형태 및/또는 면역염색에 기초하여 동정된 조직 절편의 특정 영역을 절단하고, 20x 안구 렌즈하에 포획하였다. 샘플을 25μl의 세포 직접 용해 추출 완충제(Invitrogen)로 발사시켰다. 약 1,000,000㎛2의 조직 면적을 각 캡으로 포획한 다음, 용해물을 추가의 처리를 위해 -80℃에서 저장했다. LCM 샘플의 qRT-PCR은 제조업자 지침에 따라 세포 직접 용해 완충제로부터 수행하였다. 프라이머의 목록은 표 3에 제공된다.
Figure pct00003
면역조직화학 및 공초점 현미경 검사.
조직 면역염색은 특이적 항체 및 표준 절차를 사용하여 수행하였다. 간단히, OCT-매립된 조직은 10㎛ 두께로 저온 절단하고, 차가운 아세톤으로 고정시키고, 10% 정상 염소 혈청으로 차단하고, 특이적 항체(표 4)와 함께 배양했다. 신호는 형광 태깅된 적절한 2차 항체(Alexa 488-태깅된 α-기니 피그, 1:200, Alexa 488-태깅된 α-래빗, 1:200; Alexa 568-태깅된 α-래빗, 1:200)와의 후속적 배양으로 가시화하고, DAPI로 반대 염색했다. 이미지를 레이저 스캐닝 공초점 현미경(Olympus FV 1000 필터/스펙트럼)에 의해 포획했다.
IVIS 이미징.
Figure pct00004
동물은 IVIS Lumina II 광학 이미징 시스템을 사용하여 FAM-DNA 형질감염 24시간 후 마취로 이미지화했다. 발광 이미지를 갖는 중첩 이미지는 리빙 이미지 소프트웨어를 사용하여 제조했다.
뇌졸중 뇌의 자기 공명 이미징(MRI).
자기 공명 혈관조영술을 사용하여 마우스에서 본 MCAO 모델을 확인하고, 효과적인 MCAO를 위한 폐색기 크기 및 내부 경동맥 삽입 거리를 최적화하였다. T2-계량된 MRI는 9.4 T MRI(Bruker Corporation, Bruker BioSpin Corporation, Billerica, MA, USA)를 사용하여 MCA-재관류 후 48시간에 마취된 마우스에 대해 수행하였다. MR 이미지는 다음 파라미터를 사용하여 완화 향상(RARE) 서열을 이용한 급속 획득을 사용하여 획득하였다: 시계(FOV) 30 x 30mm, 획득 매트릭스 256 x 256, TR 3,500 ms, TE 46.92 ms, 슬라이스 갭 1.0mm, 희귀 요소 8, 평균 수 3. mm당 8.5 픽셀의 해상도. 미가공 MR 이미지는 표준 DICOM 포맷으로 전환시켜 처리했다. Osirix v3.4를 사용하여 이미지의 적절한 소프트웨어 콘트라스트 향상 후, 디지털 면적 측정을 마스킹된 관찰자가 수행하여 각각의 코로나 뇌 슬라이스에서 경색 영역을 기술했다. 뇌 슬라이스로부터 경색 영역을 합산하고, 슬라이스 두께를 곱하고, 경색 용적을 결정하기 위해 이전에 기재된 바와 같이 부종 유도된 팽윤을 교정했다(참조: Khanna S, 등 J Cereb Blood Flow Metab 2013, 33(8):1197-1206).
근육 에너지론의 분석.
근육 에너지론은 RF 전송을 위한 용적 코일 및 수신을 위한 31P 코일을 사용하여 9.4 Tesla 스캐너(Bruker BioSpec)에서 NMR 분광학 측정을 평가했다. 생체내 이미징은 맞춤 제작된 1H/31P 트랜시버 코일 어레이에서 수행되었다. 데이터는 단일 펄스 서열을 사용하여 획득했다. 미가공 데이터는 잡음 감소를 위해 윈도우화하고, 스펙트럼 도메인으로 푸리에 변환시켰다.
혈관의 초음파 기반 이미징 및 특성화.
혈관 형성은 초음파 이미징을 통해 병렬 모니터링했다. 간단히, Vevo 2100 시스템(Visual Sonics, Toronto, ON, Canada)을 사용하여 MS 250 선형 어레이 프로브를 사용하는 B-방식에서 초음파 이미지를 수득했다. 도플러 컬러 유동 이미징을 구현하여 심장 수축기 및 확장기 혈류 특성을 모니터링하고 정량화했다.
통계 분석.
샘플을 코딩하고, 데이터 분석을 맹검 방식으로 수행했다. 동물 연구의 경우, 데이터는 적어도 3마리 동물의 평균 ± SD로서 보고된다. 시험관내 데이터는 3 내지 6회 실험의 평균 ± SD로서 보고된다. 모든 통계는 SigmaPlot 버전 13.0으로 수행되었다.
실시예 7. 단일 miRNA를 표적화하여 진피 섬유아세포의 기능적 내피 세포로의 직접 생체내 재프로그래밍
결과
miR-200b 단독의 억제는 배양된 섬유아세포를 전환시켜 내피 세포(iEC)를 유도한다
이 조사 라인은 만성 상처 환자의 상처 가장자리에서 miR-200b 수준이 피부에서보다 급격히 낮다는 관찰에 의해 시작되었다(도 12a). 마우스에서, 상처는 상처 봉합 후 상처 이전 값으로 회복된 miR-200b의 일시적 억제를 유도했다(도 12b). miR-200b의 이러한 상처 유도된 억제의 유의성을 이해하기 위해, 항-miR-200b 억제제 분자를 나노채널 기반 전기천공을 통해 인간 성인 진피 섬유아세포로 전달했다(참조: Boukany 등, 2011; Gallego-Perez 등, 2016). 조약돌 형태에 대한 세포 구조의 강력한 표현형 스위치가 주시되어 예비적으로 섬유아세포의 내피 세포로의 전환을 시사한다(도 7a). 섬유아세포 세포에서 miR-200b 억제는 4일째부터 계속 섬유아세포 특이적 CD90에 비해 내피 마커 CD31을 현저하게 유도했다. 이러한 전이는 28일째에 최대로 진행되어(98.4%) 섬유아세포 세포에서 내피 특성의 신속한 출현 및 유지를 입증한다(도 7b 및 7c). 이 관찰은 섬유아세포 FSP1+ 세포에 대한 또 다른 혈관형성 인자 VEGFR2+의 점진적인 출현과 일치하였다(도 7c 및 12c). 섬유아세포 FSP-1의 부수적인 손실과 커플링된 내피 마커 CD31의 증가는 miR-200b 억제 세포에서 입증되었다(도 12d). 항-miR200b 형질감염된 섬유아세포의 전사체 어레이는 Col1A, MMP, CXCL5와 같은 섬유아세포 특이적 유전자로부터 혈관신생 CCL2(Stamatovic 등, 2006) 및 CXCL8(Heidemann 등, 2003)로 제시되는 내피 유전자 클러스터를 향한 발현 프로파일의 이동을 입증했다(도 7d 및 12e-12f). iEC의 특성화는 섬유아세포(Col1A1 및 FSP1) 마커의 미량의 나머지와 함께 동맥(PECAM1, VEGFR2 및 TIE2), 정맥(COUP-TFII), 림프(PROX1) 특징의 공존을 나타냈다(도 7e). 인간 미세혈관 내피 세포와 유사하게, Ac-LDL 흡수(도 7f) 및 매트리겔 튜브 형성은 miR-200b 억제된 섬유아세포에서 높았다(도 7g). 따라서, 섬유아세포는 miR-200b 억제에 반응하여 내피 세포의 기능적 특징을 달성했다. Oct4, Sox2, Klf4 및 Nanog와 같은 전분화능 유전자는 항-miR-200b 형질감염 후 4일째부터 계속 매우 낮은 수준으로 유지되어(도 12g) 섬유아세포 대 iEC 전환이 직접적이었음을 나타낸다.
miR-200b 억제는 Fli-1을 탈사일런싱한다
TargetScan, miRanda, 및 Diana-MicroT 알고리즘을 사용하는 인실리코 연구는 혈관신생 결과를 조절할 수 있는 miR-200b의 표적을 예측했다. 친구 백혈병 통합 1 (Fli-1) 전사 인자의 3'-비번역 영역(3'UTR)은 miR-200b의 결합 부위를 함유한다(도 13a). miR-200b 모방체의 전달은 Fli-1-3'UTR 리포터 루시퍼라제 활성을 상당히 억제했다(도 8a). 이러한 효과는 Fli-1 발현의 조절에서 miR-200b 결합의 특이성의 유의성을 인식하여 돌연변이된 Fli-1 3'UTR (도 8a)를 갖는 세포에서 폐기되었다. 따라서, 혈관 발달 및 혈관신생(Meadows 등, 2011; De Val 등, 2009)에 관련된 중심 조절인자인 전사 인자의 ETS 계열의 구성원인 Fli-1은 miR-200b에 의한 전사 후 유전자 사일런싱에 적용된다. miR-200b가 1차 인간 진피 섬유아세포에서 Fli-1을 표적화한다는 개념에 대한 직접적인 지원은 miR-200b 모방체 또는 억제제를 사용하는 연구에서 수득되었다(도 13b). miR-200b 모방체는 Fli-1 단백질 수준을 낮춘 반면, Fli-1 단백질은 miR-200b 억제제로 형질감염된 섬유아세포에서 유도되었다(도 8b). miR-200b 억제 섬유아세포에 의해 유발된 혈관신생 결과에서 Fli-1의 유의성을 결정하기 위해 항-miR-200b 또는 Fli-1 siRNA 단독 또는 조합으로 형질감염시켰다. miR-200b 단독의 억제는 Fli-1 단백질의 탈사일런싱에서 강력했지만, 이러한 효과는 Fli-1 녹-다운에 적용된 세포에서 둔화되었다(도 8c). 이러한 결과와 일치하여, 매트리겔 검정에서 내피 튜브 길이에 대한 miR-200b 억제의 혈관신생 효과가 Fli-1 의존적이었음이 관찰되었다(도 8d).
Etv2의 Fli-1 의존적 전사 활성화는 혈관신생 스위치를 유발했다
miR-200b 억제에 의해 유발된 혈관신생의 경로에서, Fli-1 작용의 성분 다운스트림은 프로모터 분석을 위한 MatInspector 소프트웨어를 사용하여 특성화되었다. Etv2 프로모터 영역은 Etv2의 활성화에 필요한 8개의 공지괸 ETS 결합 부위를 함유한다(도 13c 및 13d). 크로마틴 면역침전(ChIP) 검정은 Etv2 프로모터에 대한 Fli-1의 강화된 결합이 Fli-1 사일런싱된 진피 섬유아세포에서 억제된 반면, Fli-1의 강제 발현은 Fli-1에 의한 Etv2 프로모터 점령을 향상시켰음을 입증했다(도 8e). 이러한 결과는 각각 miR-200b 억제제 또는 모방체로 처리된 Fli-1 사일런싱되거나 과별현된 세포에서 Etv2 프로모터-리포터 검정을 사용하여 확증되었다. 증가된 리포터 활성은 miR-200b 억제제로 형질감염된 세포에서 검출되었다. Fli1 녹다운에 반응하여 이러한 활성이 둔화되면 Etv2 전사활성화에서 Fli-1의 유의성이 강조되었다. 일관되게, Fli-1 과발현된 세포에서 증가된 Etv2 프로모터 활성은 세포가 miR-200b 모방체 및 Fli-1 강제된 발현 벡터로 동시 형질감염되었을 때 완전히 제거되었다(도 8f). iEC에서 Fli-1의 사일런싱 또는 탈사일런싱은 각각 Etv2 mRNA 발현을 하향조절하거나 상향조절했다(도 8g). 따라서, miR-200b 억제는 결국 Etv2를 상향조절하여 혈관신생 스위치를 활성화하는 Fli-1을 탈사일런싱화한다(도 13e).
진피 섬유아세포의 혈관형성 iEC로의 직접 생체내 재프로그래밍을 위한 계통 추적 증거
생체내에서 진피 섬유아세포의 iEC로의 직접 전환은 면역 충분한 C57BL/6 마우스의 무손상 피부에서 miR-200b의 억제에 의해 달성되었다. 항-miR200b-LNA의 피부로의 국소적 나노전기천공 기반 전달은 Fli-1을 탈사일런싱화한다(도 9a). 동시에, 등쪽 피부에서 개선된 혈류가 관찰되었다. 이러한 개선은 일시적이었고, miR-200b 억제 7일째 피크화에 이어 후속적인 4일 동안 유도된 재관류가 감소되었다(도 14a). 무손상 피부에서 유도된 혈관계의 적시 퇴행을 가리키는 이러한 일련의 증거는 생체내에서 iEC를 생성함으로써 기형종 형성 가능성에 무게를 둔다. 적절하게 관류된 무손상의 건강한 피부와 달리, 유도된 관류의 유의성은 혈관신생이 필요한 상처에서 상이하다(Tonnesen 등, 2000). 조직 회복 생리학에서 직접 세포 전환의 필수적인 역할의 개념과 일치하여, 손상 자체는 상처 가장자리 조직에서 miR-200b 억제를 유발했다(도 12a). 이러한 억제는 상처 후 7일 및 일째에 상처 가장자리 조직에서 Fli-1 발현의 동시 증가와 관련되었다(도 9b). 생체내에서 세포 전환의 직접적인 증거에 대한 연구는 Fsp1-Cre:R26Rtd토마토 마우스를 사용하는 계통 추적 연구를 필요로 했다(Ubil 등, 2014). 손상 후 5일째에 또한 CD31+인 섬유아세포 계통의 전이 세포의 풍부한 존재에 의해 마킹되었다(도 9c). 레이저 포획 현미해부(LCM)(도 14b)에 의해 단리된 상처-가장자리 섬유아세포는 내피 마커 CD31(도 9d)의 증가와 함께 감쇠된 FSP1 발현과 같은 전이 특징을 나타냈다. 이는 섬유아세포가 miR-200b가 억제되는 손상 부위에서 iEC로 전환된다는 직접적인 증거를 구성한다. 그러나, 섬유아세포의 내피 세포로의 이러한 손상-유도된 miR-200b-의존적 생리학적 전환이 당뇨병 마우스(도 9e)에서 손상되어 당뇨병성 상태를 이러한 혈관형성 세포 전환에 대한 장벽으로서 인식한다.
진피 섬유아세포에서 Fli-1의 조건부 생체내 녹다운은 iEC로의 생리학적 재프로그래밍을 손상시킨다
손상 부위에서 섬유아세포의 iEC로의 전환에서 Fli-1의 유의성을 시험하기 위해, Cre/loxP 조절된 RNA 간섭을 이용하여 마우스에서 조건부 섬유아세포 특이적 유전자 녹다운을 수득했다(Hitz 등, 2007; Kasim 등, 2004). 섬유아세포 특이적 Fli-1은 LoxP-옆구리 Fli-1 shRNA 발현 카세트에 의해 생체내에서 녹다운되었다(도 10a). 4개의 LoxP 옆구리 Fli-1 shRNA 발현 카세트가 설계되었고, 시험관내에서 Fli-1 단백질 발현을 하향조절하는 효율에 기초하여(도 15a 및 15b) 3개의 카세트를 풀링하고 Fsp1-Cre 마우스의 상처 가장자리에서 렌티바이러스 형질감염을 위해 사용했다. Fli-1 shRNA 벡터의 확인은 도 15b 및 15c에 보고되어 있다. 상처 가장자리 조직에서 항-miR200b-LNA의 전달(도 10b)은 섬유아세포의 iEC로의 전환에서 miR-200b의 역할을 지지하여 FSP1 및 CD31의 공편재화의 증가를 나타냈다(도 10c 및 10d). 이러한 공편재화는 Fli-1의 섬유아세포 표적화 녹다운에 의해 현저하게 둔화되어 miR-200b 기능의 중요한 매개자로서 Fli-1을 암시한다(도 10c 및 10d). 실제로, 동일한 실험 조건하에서, 진피 섬유아세포에서 Fli-1 녹다운은 상처 관류를 상당히 감쇠시키고(도 15d 및 15e), 상처 봉합을 손상시켰다(도 15f-15h). 이러한 결과는, miR-200b 억제에 의해 유발된 손상 부위에서 섬유아세포 기원된 성숙한 iEC가 조직 혈관화를 돕는 Fli-1 의존적임을 입증한다.
국소 항-miR-200b-LNA는 진피 섬유아세포의 iEC로의 생체내 전환에 의해 당뇨병 상처 혈관신생을 구조한다
손상된 상처 치유는 일반적인 당뇨병성 합병증이다(Brem and Tomic-Canic, 2007). 비당뇨병 대상체와 비교하여, 당뇨병 환자의 상처 가장자리는 현저하게 증가된 miR-200b 풍부함을 나타낸 반면, Fli-1 mRNA 수준은 낮았다(도 11a). 면역조직화학적 연구는 비당뇨병 인간 대상체와 비교하여 당뇨병 환자의 상처 가장자리 조직에서 Fli-1 단백질의 불량한 풍부함을 나타냈다(도 11b). II형 당뇨병의 확립된 모델인 db/db 마우스에서, 상처는 miR-200b 발현을 억제하지 못했다(도 16a 및 16b). db/db 마우스의 상처-가장자리에 단일 항-miR200b-LNA 분자를 전달함으로써 강제된 miR-200b 억제(도 11c)는 Fli-1(도 11d) 및 이의 다운스트림 Etv2 단백질 발현(도 16C)을 상당히 증강시키고, 이어서 당뇨병 마우스의 상처 가장자리 조직에서 iEC를 풍적재게 출현시켰다(도 11e). 이러한 반응은 개선된 상처 관류 및 치유에서 절정에 달했다(도 11f-11i 및 16d-16e). 개선된 혈관화는 또한 db/db 마우스의 항-miR200b 처리된 상처 가장자리 조직에서 CD31+ 및 CD105+ 내피 세포의 더 높은 풍부함에 의해 입증되었다(도 11j 및 16f-16g). 요약하면, 이 연구는 진피 섬유아세포의 miR-200b를 손상 동안 일시적으로 꺼지면, iEC로의 직접 세포 전환을 위한 Fli-1-Etv2 축을 유도하는 중요한 스위치로서 인식하는 새로운 패러다임을 도입한다.
물질 및 방법
시약 및 항체. 모든 조직 배양 물질은 Gibco-BRL/Life Technologies, Gaithersburg, MA 또는 Lonza, Allendale, NJ에서 입수했다. miRIDIAN microRNA 헤어핀 억제제 음성 대조군(카탈로그 번호 IN-001005-01-05), miRIDIAN microRNA hsa-miR-200b-3p 헤어핀 억제제(카탈로그 번호 IH-300582-08-0005), miRIDIAN microRNA 모방체 음성 대조군(카탈로그 번호 CN-001000-01-05), miRIDIAN microRNA 인간 hsa-miR-200b-3p 모방체(카탈로그 번호 C-300582-07-0010) 및 ON-TARGETplus FLI1 siRNA(카탈로그 번호 L-003892-00-0005)는 GE Dharmacon, Lafayette, CO로부터 구입했다. 인간 Fli1-3'UTR(카탈로그 번호 HmiT056673-MT05), 대조군 벡터(CS-MmiT027104-MT06-01) 및 Etv2를 위한 프로모터 클론(NM_014209)(카탈로그 번호 HPRM12894-PG04)은 GeneCopoeia, Rockville, MD로부터 입수했다. 항체는 FLI-1(카탈로그 번호 ab15289), Etv2 (카탈로그 번호 ab181847), S100A4 (FSP-1로서 공지되기도 함)(카탈로그 번호 ab27957), CD105 (카탈로그 번호 ab107595), 전흡착된 염소 항-랫트 IgG H&L (Cy5R)(카탈로그 번호 ab6565)을 Abcam, Cambridge, MA로부터 구입했다. 정제된 랫트 항-마우스 CD31 (PECAM-1로서 공지되기도 함)(카탈로그 번호 550274)은 BD PharmingenTM, San Jose, CA로부터 입수했다. 알로피코시아닌(APC) 접합된 항-인간 CD31 항체(클론: WM59, 카탈로그 번호 303115), 플루오레세인-이소티오시아네이트(FITC) 접합된 항-인간 CD90 (Thy1) 항체(클론: 5E10, 카탈로그 번호 328107) 및 피코에리트린(PE) 태깅된 항-인간 CD309 (VEGFR2) 항체(클론: 7D4-6, 카탈로그 번호 359903)는 BioLegend, San Diego, CA로부터 입수했다. 항-섬유아세포 항체, 인간(클론: REA165, 카탈로그 번호 130-100-135)은 Miltenyi Biotec Inc, San Diego, CA로부터 입수했다. 항-마우스 β-액틴(카탈로그 번호 A5441), 스트렙토조토신(카탈로그 번호 S0130)은 Sigma, St. Louis, MO로부터 구입했다. 서양고추냉이 퍼옥시다제 접합된 항-래빗-IgG(카탈로그 번호 NA934V), 항-마우스-IgG(카탈로그 번호 NA931V) 및 Amersham ECL Prime 웨스턴 블롯팅 검출 시약은 GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburgh, PA로부터 입수했다. 인간 혈장으로부터의 저밀도 지단백질인 아세틸화된 Alexa Fluor® 594 접합체(Alexa Fluor® 594 AcLDL)(카탈로그 번호 L35353) 및 칼세인 AM (카탈로그 번호 C3099)은 Molecular ProbesTM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA로부터 구입했다. Cultrex PathClear 감소된 성장 인자 BME(카탈로그 번호 3433-005-01)는 R&D Systems, Minneapolis, MN로부터 입수하고, 분비-쌍 이중 발광 검정 키트(카탈로그 번호 SPDA-D010)는 GeneCopoeia로부터, SimpleChIP® Plus 효소 크로마틴 IP 키트(아가로스 비드)(카탈로그 번호 9004)는 Cell Signaling Technology, Danvers, MA로부터 입수했다. U6 snRNA 프라이머(카탈로그 번호 4427975; ID: 001973) 및 hsa-miR-200b 프라이머(카탈로그 번호 4427975; ID: 002251)는 Applied Biosystem, Foster City, CA로부터 입수했다. 모든 다른 화학약품은 Sigma-Aldrich로부터 입수했다.
비바이러스성 나노-전기천공 장치 제조. 조직 나노형질감염 장치는 표준 청정실 제조 기술을 사용하여 얇은(약 200㎛) 양면 연마된(100) 규소 웨이퍼로부터 제조되었다. 간단히, 약 1.5㎛ 두께 층의 AZ5214E를 웨이퍼 표면에 스핀 코팅시켰다. 이어서, 나노기공을 투사 리소그래피를 통해 감광성 내식막에서 패턴화했다. 이어서, 이러한 기공을 에칭 마스크로서 사용하여 SF6/C4F8 가스의 조합을 사용하는 심도 반응성 이온 에칭(DRIE)에 의해 규소 표면에 약 10㎛ 깊이의 나노채널을 뚫었다. 이어서, 마이크로스케일 저장소는 접촉식 포토리소그래피 및 DRIE를 통해 웨이퍼의 뒷면에서 에칭시켜 나노채널로의 유체 접근을 달성하였다. 최종적으로, 약 50nm 두께의 질화규소의 절연층을 웨이퍼 표면에 증착시켰다.
세포 배양 및 시험관내 비바이러스성 형질감염. 1차 인간 성인 진피 섬유아세포(ATCC, Manassas, VA, 카탈로그 번호 PCS-201-012)를 95% 공기 및 5% CO2로 이루어진 가습화 대기에서 37℃에서 페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL) 용액(GibcoTM/Life Technologies, Waltham, MA, 카탈로그 번호 15140122)을 함유하는 섬유아세포 성장 키트-무혈청(ATCC, 카탈로그 번호 PCS-201-040)이 보충된 섬유아세포 기초 배지(ATCC 카탈로그 번호 PCS-201-030)에 확장시켰다. 인간 진피 미세혈관 내피 세포(HMEC)는 MCDB-131 배지(GibcoTM/Life Technologies, 카탈로그 번호 10372-019)에서 배양했다.
비바이러스성 세포 형질감염은 이전에 기재된 바와 같이(Gallego-Perez 등, 2016 Nanomedicine 12, 399-409) 3D 나노채널 전기천공(NEP)을 통해 수행하였다. 간단히, 세포를 먼저 3D NEP 장치에서 밤새 완전 컨플루언시로 성장시켰다. 이어서, 펄스화된 전기장을 사용하여 대조군 또는 miR200b 억제제 (50nM)를 세포로 전달했다. 이어서, 세포를 miRNA 전달 24시간 후에 수확하고, EGM-2 MV SingleQuot 키트 성분(Lonza, 카탈로그 번호 CC-4147)이 보충된 EBM-2 기초 배지(Lonza, 카탈로그 번호 CC-3156)에 위치시키고, 추가의 실험을 위해 추가로 처리했다.
miR 억제제/모방체 및 siRNA 형질감염. 세포를 형질감염 24시간 전에 항생제 비함유 배지에서 0.1x106 세포/웰의 밀도로 12-웰 플레이트에 시딩했다. 컨플루언스는 형질감염 시점에 약 70%에 도달할 것이다. 형질감염은 DharmaFECTTM 1 형질감염 시약(GE Dharmacon) 및 OptiMEM 무혈청 배지(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)를 사용하여 miR-200b 억제제 (100nM) 또는 miR-200b 모방체 (50nM), 또는 인간 FLI-1용 siRNA 스마트 풀(100nM)의 리포솜 매개된 전달에 의해 달성되었다. 샘플은 miRNA, mRNA, 또는 단백질 발현의 정량화를 위해 대조군 및 miR200b 억제제/모방체 또는 대조군 및 Fli-1 siRNA 형질감염 72시간 후에 수집했다.
동물 연구 및 생체내 재프로그래밍 및 렌티바이러스 전달. 수컷 C57BL/6 마우스 (8 내지 10주령)는 Harlan Laboratory, Indianapolis, IN으로부터 입수했다. 렙틴 수용체(Leprdb) 또는 그들 각각의 비당뇨병성 희박 대조군 한배 새끼 m+/db (8 내지 10주령)의 자발적 돌연변이를 위한 마우스 동형접합체(BKS.Cg-m+/+Leprdb/J, 또는 db/db; 스톡 번호 000642)는 Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME로부터 입수했다. FSP1-Cre 마우스가 수득되었다(University of California, Los Angeles, California 90095, USA). FSP1-Cre 마우스는 플록스트 td토마토 대립유전자를 갖는 R26Rtd토마토 마우스(JAX)와 교배했다. FSP1이 섬유아세포에서 특이적으로 발현되기 때문에, 이러한 마우스의 자손(FSP1-Cre:R26Rtd토마토)은 섬유아세포에서 특이적으로 적색 형광성 단백질 td토마토를 발현시킬 것이다(Ubil 등, 2014). C57BL/6 마우스는 스트렙토조토신(STZ; 5일 동안 50 mg/kg 체중) 또는 비히클인 시트레이트 완충제(0.05M 나트륨 시트레이트, pH 4.5)의 복강내 주사로 당뇨병으로 만들고, 혈당치를 Accu-Chek 혈당측정기(Roche, Basel, Switzerland)를 사용하여 규칙적으로 평가했다. 음식물 섭취량 및 체중을 또한 매일 기록했다. 20 mmol/L보다 큰 혈당치를 갖는 마우스는 당뇨병으로 정의되고, 실험용으로 선택되었다. 모든 동물 연구는 오하이오 주립대학의 실험 동물 관리 및 사용위원회가 승인한 프로토콜에 따라 수행하였다. 동물을 태깅하고 무작위로 그룹화하였다.
관심 영역의 동물의 털은 형질감염 전에 잘라냈다. Exiqon, Inc, Woburn, MA로부터 구입한 miR-200b의 miRCURY LNATM microRNA Power 억제제(카탈로그 번호 4104042-101) 또는 음성 대조군(카탈로그 번호 199006-101)을 함유하는 용액을 비바이러스성 형질감염 장치의 저장소에 적재하고(100nM의 농도), 이어서 장치를 피부와 접촉시켰다. 금 코팅된 전극(즉, 캐소드)을 화물 용액에 침지시키면서, 24G 바늘 반대 전극(즉, 애노드)을 형질감염 플랫폼에 병치하여 피내 삽입했다. 이어서, 펄스화된 전기적 자극(즉, 진폭에서 250V의 10 펄스 및 펄스당 10ms의 지속 기간)을 전극에 교차 인가하여 피부 세포를 나노천공하고 억제제 또는 대조군 화물을 나노채널을 통해 세포로 구동시켰다.
shRNA 렌티바이러스 입자(LV)의 전달은 피내 주사로 달성되었다. loxp-STOP-loxp-센스-루프-안티센스 구조 및 shRNA 스크램블화 대조군을 갖는 렌티바이러스성 벡터에서 마우스 Fli1에 대한 shRNA 클론 세트(4개의 작제물)는 GeneCopoeia로부터 주문제작되었다. 간단히, LV 입자(3개의 Fli-1 shRNA 클론 세트)를 상처 2일 전에 상처 가장자리로부터 1mm 떨어진 1X107 cfu/mL (50μL/상처)의 역가로 피부에 피내 주사했다. 주사 절차는 상처의 날 및 상처 후 3일째에 반복했다.
상처 모델. 2개의 6mm 생검 천공 절제 상처를 정중선과 4개의 사지 부근에서 등거리에 등쪽 피부에 생성시키고, 규소 시트로 부목을 대어 수축을 방지하여 과립화 및 재상피화를 통해 상처가 치유되도록 하였다. 상처 절차 동안, 마우스를 표준 권고에 따라 저용량 이소플루란 흡입으로 마취시켰다. 각각의 상처를 디지털 방식으로 사진 촬영하고, 관류를 언급된 상이한 시점에 레이저 스페클로 체크했다. 상처 면적은 ImageJ 소프트웨어로 분석했다. 연령 일치된 비상처 동물의 피부가 대조군으로 작용했다. 모든 동물 연구는 OSU 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 의해 승인되었다. 동물을 지시된 시간에 안락사시키고, 상처 가장자리를 분석용으로 수집했다. 상처 가장자리 수확을 위해, 상처를 입은 피부의 선단 가장자리로부터 1 내지 1.5mm의 조직을 전체 상처 주위에서 절제했다. 조직을 급속 냉동시키고, 4% 파라포름알데히드 또는 최적 절단 온도(OCT) 화합물에서 수집했다.
진피 섬유아세포의 레이저 포획 현미해부(LCM). 레이저 포획 현미해부는 본 그룹에 의해 이전에 기재된 바와 같이 PALM Technologies (Bernreid, Germany)로부터 레이저 현미해부 시스템을 사용하여 수행했다. 진피-섬유아세포 풍부 영역 포획을 위해, 절편을 30초 동안 헤마톡실린으로 염색한 다음, DEPC-H2O로 세척하고, 에탄올로 탈수시켰다. 진피 분획은 조직학에 기초하여 동정되었다. FSP1-Cre:R26Rtd토마토 마우스로부터 섬유아세포의 포획을 위해, 절편을 후속적으로 DEPC-H2O로 세척하고, 에탄올로 탈수시켰다. 섬유아세포는 적색 형광에 기초하여 동정되었다. 조직 절편은 전형적으로 절단되고, 20x 안구 렌즈하에 포획되었다. 샘플을 25μl의 세포 직접 용해 추출 완충제(Invitrogen)로 발사시켰다. 약 10,00,000㎛2의 조직 면적을 각 캡으로 포획한 다음, 용해물을 추가의 처리를 위해 -80℃에서 저장했다.
인간 샘플. 인간 피부 및 상처 생검 샘플은 OSU 종합 상처 센터(CWC)에서 건강한 성인 인간 대상체 또는 만성 상처 환자로부터 각각 입수했다. 모든 인간 연구는 오하이오 주립 대학(OSU) 기관 검토 위원회(IRB)의 승인을 받았다. 헬싱키 프로토콜의 선언문을 따르고, 환자는 서면 동의서를 제출했다.
면역조직화학(IHC), 면역세포화학(ICC) 및 공초점 현미경 검사. 면역염색은 특이적 항체를 사용하여 상처 샘플의 냉동 절편 상에서 수행했다. 간단히, OCT 매립된 조직을 10㎛ 두께로 저온 절단하고, 차거운 아세톤으로 고정시키고, 10% 정상 염소 혈청으로 차단하고, CD31 (1:400 희석), CD105 (1:400 희석), 케라틴14 (1:1000 희석)에 대한 특이적 항체와 함께 배양하였다. 면역세포화학을 위해, 세포(0.1 x 106 세포/웰)를 커버슬립에 시딩하고, ICC 고정 완충제(BD Biosciences, San Jose, CA; 카탈로그 번호 550010)로 고정시키고, 10% 정상 염소 혈청으로 차단하고, CD31 및 FSP1에 대한 1차 항체와 함께 밤새 배양했다. 신호는 형광 태깅된 적절한 2차 항체(Alexa 568-태깅된 α-랫트, 1:200 희석; Alexa 488-태깅된 α-래빗, 1:200 희석)와의 후속적 배양으로 가시화하고, DAPI로 반대 염색했다. 이미지는 현미경으로 포획하고, 분석은 Axiovision Rel 4.8 소프트웨어(Axiovert 200M; Carl Zeiss Microscopy GmbH, Germany)를 사용하여 수행하였다.
웨스턴 블롯. 조직 추출물 또는 세포 용해물의 단백질 농도는 BCA 방법으로 결정되었고, 단백질 샘플은 SDS-PAGE 상에서 분해하고, 그것을 PVDF 막(GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburgh, PA, 카탈로그 번호 IPVH00010)으로 옮겼다. 막을 먼저 10% 탈지유로 차단하고, 1차 항체와 1:1000 희석으로 40℃에서 밤새 배양한 다음, 서양고추냉이 퍼옥시다제와 접합된 특이적 2차 항체로 1:3000 희석으로 배양했다. 신호는 Amersham ECL Prime 웨스턴 블롯팅 검출 시약을 사용하여 가시화했다. 픽셀 농도계 분석은 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 개별 밴드에 대해 수행했다. 항-마우스 ß-액틴(1:10000 희석)은 적재 대조군으로서 작용한다.
RNA 추출 및 실시간 정량적 PCR. 세포 또는 상처 가장자리 조직 샘플로부큉cveata뵨 RNA는 제조업자의 지침에 따라서 miRVana miRNA 단리 키트(AmbionTM, Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 AM1560)를 사용하여 추출시켰다. RNA 양은 NanoDrop ND-1000 분광광도계(NanoDrop Technologies, Wilmington, DE)를 사용하여 측정하였고, RNA 품질은 Agilent BioAnalyzer 2100(AgilentTechnologies, Santa Clara, CA) 상에서 RNA6000 NanoAssay를 사용하여 체크했다. RNA는 SuperScript® III 제1-가닥 합성 시스템(InvitrogenTM, ThermoFisher Scientific, 카탈로그 번호 18080051)을 사용하여 역전사시켰다. 유전자 특이적 프라이머를 사용함으로써 SYBR 그린색 기반 실시간 정량적 PCR 반응(Applied Biosystems)이 사용되었다. 최종 확장 후, 용융 곡선 분석을 수행하여 생성물의 특이성을 확인했다. 18s를 별도의 반응으로 동시에 증폭시키고, Ct 값을 보정하기 위해 사용했다. miRNA 발현을 결정하기 위해, miRNA용 특정 TaqMan 검정 및 TaqMan miRNA 역전사 키트(Applied BiosystemsTM, ThermoFisher Scientific, Foster City, CA, 카탈로그 번호 4366596)가 사용되고, Universal PCR Master Mix(Applied BiosystemsTM, 카탈로그 번호 4304437)를 사용하는 실시간 PCR이 사용된다.
miR 표적 루시퍼라제 리포터 검정. HADF 세포를 48시간 동안 리포펙타민 LTX/Plus 시약을 사용하여 100ng의 인간 Fli1-3'UTR 또는 돌연변이체 벡터로 형질감염시켰다. 친구 백혈병 바이러스 통합 1(pLuc-Fli1-3'UTR 인간 플라스미드)(카탈로그 번호 HmiT054456-MT06)의 리포터 작제물 3'UTR은 GeneCopoeia로부터 입수했다. 돌연변이된 작제물의 경우, 씨드 서열 영역은 비-센스 서열로 대체되었다(세부 사항은 도 16을 참조한다). 반딧불이 루시퍼라제는 CMV 프로모터의 조절하에 클론화하였다. 세포를 용해시키고, 루시퍼라제 활성은 제조업자의 프로토콜에 따라 이중-루시퍼라제 리포터 검정 시스템(Promega, Madison, WI)을 사용하여 결정되었다. 데이터 표준화는 세포를 레닐라 플라스미드(10ng)로 동시 형질감염시킴으로써 달성되었다. 데이터는 반딧불이 대 레닐라 루시퍼라제 활성의 비(FL/RL)로서 제시된다.
프로모터 루시퍼라제 검정. Etv2 프로모터 활성화에서 Fli-1 관련성을 분석하기 위해, Etv2 프로모터 리포터 클론을 HDAF 세포에서 대조군 또는 miR200b 억제제 또는 모방체 또는 Fli-1 siRNA로 동시형질감염시켰다. 72시간 형질감염 후, 분비-쌍 이중 발광 검정 키트를 사용하여 제조업자의 지침에 따라서 세포 배양 배지에서 Gaussia 루시퍼라제(GLuc) 및 분비된 알칼리성 포스파타제(SEAP)의 활성을 분석하였다. Etv2는 GLuc 리포터 유전자 발현을 조절하는 반면, SEAP는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터에 의해 조절된다. SEAP 발현을 표준화 인자(내부 표준 대조군)로서 사용했다. 간단히, 10μl의 배양 배지 샘플을 100μl의 GLuc 검정 작업 용액 또는 SEAP 검정 작업 용액과 혼합하고, 실온에서 1분(GLuc) 또는 5분(SEAP) 동안 배양하고, 후속적으로 발광을 광도계로 측정했다. SEAP에 대한 GLuc의 발광 강도의 비(RLU, 상대적 광 단위)를 각 샘플에 대해 계산하였다.
유동 세포 계측법 분석. 대조군 또는 miR200b 억제제 형질감염된 HDAF 세포 상의 CD31 및 CD90 또는 VEGFR2 및 섬유아세포 단백질의 발현은 유동 세포 계측법(BDTM LSR II 유동 세포 계측기)을 통해 평가했다. 간단히, HDAF 세포(1x106)를 형질감염 후 1, 4, 7, 10 및 28일째에 수확하고, PBS-함유 2% FBS 및 2mM EDTA에 재현탁시킨 다음, 실온에서 30분 동안 CD90 및 CD31 또는 VEGFR2 및 섬유아세포 단백질에 대한 형광 색소 표지된 항체(5μl/시험)로 염색했다. 데이터는 BD CellQuest Pro 소프트웨어(버전 5.2.1)로 분석했다.
LDL 흡수 검정. HDAF 세포를 대조군 또는 miR200b 억제제로 형질감염시키고, 7일째에 세포를 37℃에서 4시간 동안 DMEM에서 AlexaFluor 594-표지된 Ac-LDL(10㎍/ml)과 함께 배양했다. HDMEC는 양성 대조군 세포로서 사용했다. 배양 종료시, 세포를 인산염 완충된 식염수(PBS)로 세척하고, 4% 파라포름알데히드로 30분 동안 고정시켰다. Ac-LDL의 흡수는 AxioVision Rel 4.8 소프트웨어(Zeiss)를 사용하여 형광 현미경으로 분석하였다.
시험관내 혈관신생 검정. 시험관내 혈관신생은 이전에 기재된 바와 같이(Chan 등, 2012) 매트리겔에 대한 튜브 형성 능력에 의해 평가했다. 간단히, HADF 세포를 대조군 또는 miR200b 억제제로 형질감염시키고, 형질감염 7일 후, 세포를 매트리겔 예비코팅된 4-웰 플레이트에 5 x 104 세포/웰로 시딩했다. HMEC는 양성 대조군 세포로서 사용되었다. 혈관신생 특성은 AxioVision Rel 4.8 소프트웨어(Zeiss)를 사용하여 세포 시딩 8시간 후 튜브 길이를 측정하여 평가하였다.
크로마틴 면역침전(ChIP) 검정. 크로마틴 면역침전(ChIP) 검정은 제조업자의 지침에 따라 수행하여 상이한 치료 조건에서 Etv2 프로모터에 대한 Fli-1 결합을 평가하였다. 간단히, 대조군 또는 Fli-1 siRNA 및 대조군 또는 Fli-1 강제된 발현 벡터 형질감염된 HADF 세포를 실온에서 10분 동안 1% 포름알데히드로 고정시킨 다음, 글리신을 첨가하여 급냉시켰다. 세포를 핵 제조를 위해 처리하고, 마이크로코컬 뉴클레아제와 함께 배양된 핵을 펠렛화하여 평균 단편 크기 150 내지 900bp를 갖는 크로마틴 샘플을 생성하였다. 효소 소화를 0.5M EDTA를 첨가하여 정지시킨 다음, 샘플을 얼음 위에서 초음파 처리하고, 10,000rpm에서 10분 동안 4℃에서 원심분리했다. 샘플을 회전자에서 밤새 4℃에서 Fli-1 항체 또는 대조군 정상 래빗 IgG와 함께 배양했다. 항체-크로마틴 복합체를 단백질 G-아가로스 비드로 펠렛화하였고, 면역침전된 DNA를 용출시키고 정제했다. 이어서, RT-PCR을 Etv2 유전자의 프로모터 영역을 표적화하는 프라이머를 사용하여 수행하였다. 인간 Etv2 프로모터 서열의 증폭용으로 사용된 프라이머는 생성물 길이 214bp의 5'-TGATCTTGGCTCACTGCAAC-3'(정방향) 및 5'-TAATCCCAGCACTTTGGGAG-3'(역방향)였다. PCR 생성물은 브롬화에티듐-염색된 1.5% 아가로스 겔에서 작동시키고, 이미지를 이미지 Lab 소프트웨어를 사용하여 Bio-Rad 겔 문서화 시스템으로 포획하였다.
통계 분석. 샘플을 코딩하고, 데이터 분석을 맹검 방식으로 수행하였다. 스튜던츠 t 시험(양측)을 사용하여 유의한 차이를 결정했다. 여러 그룹 간의 비교는 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 시험하였다. p<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
실시예 8. 국소 조직 나노-형질감염은 비바이러스성 기질 재프로그래밍 및 구조를 매개한다
세포 요법이 다수의 상태에 대한 유망한 전략을 나타내지만, 현재의 접근법은 제한된 세포 공급원 및 성가신 전처리 단계(예: 단리, 유도된 전분화능)의 필요성을 포함하는 주요 번역 장애물에 직면한다(참조: Rosova I, 등 Stem Cells 2008, 26(8): 2173-2182; Kinoshita M, 등 Atherosclerosis 2012, 224(2): 440-445; Losordo DW, 등 Circulation 2004, 109(22): 2692-2697; Lee AS, 등 Nat Med 2013, 19(8): 998-1004; Cunningham JJ, 등 Nat Biotechnol 2012, 30(9): 849-857; Leduc PR, 등 Nat Nanotechnol 2007, 2(1): 3-7). 생체내 세포 재프로그래밍은 쉽게 이용가능한 세포 공급원(예: 섬유아세포)를 이용하고 생체외 전처리의 필요성을 우회하여 세포 기반 요법이 더 효과적이도록 할 수 있는 잠재력을 갖는다(참조: Heinrich C, 등 Nat Cell Biol 2015, 17(3): 204-211; Karagiannis P, 등 Nat Methods 2014, 11(10): 1006-1008). 그러나, 기존의 재프로그래밍 방법론은 바이러스성 형질감염에 대한 높은 의존성을 포함하여 주의사항이 다양하다(참조: Grande A, 등 Nat Commun 2013, 4: 2373; Morita R, 등 Proc Natl Acad Sci U S A 2015, 112(1): 160-165). 또한, 캡시드 크기 제약 및/또는 현상 유지 접근법(바이러스성 및 비바이러스성)의 확률적인 특성은 추가의 제한을 부과하고, 따라서 보다 안전하고 보다 결정론적인 생체내 재프로그래밍 방법의 필요성을 강조한다(참조: Gallego-Perez D, 등 Nanomedicine 2016, 12(2): 399-409; Marx V. Nat Meth 2016, 13(1): 37-40). 각각 유도된 뉴런 및 내피의 익히 확립되고 새로 발달된 재프로그래밍 모델로 검증된 나노채널화 장치를 통해 조직을 국소적으로 재프로그래밍하는 새롭지만, 구현하기 간단한 비바이러스성 접근법이 개시된다. 이 접근법의 단순성 및 유용성은 괴사성 조직 및 전체 사지를 손상 유도된 허혈의 두 뮤린 모델을 사용하여 구조함으로써 입증된다.
물질 및 방법
TNT 플랫폼 제조.
TNT 장치는 얇은(약 200㎛) 양면 연마된(100) 규소 웨이퍼로 제조되었다(도 20). 간단히, 약 1.5㎛ 두께 층의 AZ5214E 감광성 내식막을 약 3000rpm에서 규소 웨이퍼에서 먼저 스핀 코팅했다. 이어서, 나노스케일 개구부를 GCA 6100C 스텝퍼를 사용하여 감광성 내식막 상에서 패턴화했다. 100-mm 웨이퍼당 나노스케일 개구부 어레이의 최대 16개 다이를 패턴화했다. 이어서, 이러한 개구부를 심도 반응성 이온 에칭(DRIE)(Oxford Plasma Lab 100 system)을 사용하여 규소 표면에서 약 10㎛ 깊이의 나노채널을 뚫기 위해 에칭 마스크로서 사용했다. 최적화된 에칭 조건은 SF6 가스: 13s/100 sccm 가스 유동/700W ICP 전력/40W RF 전력/30mT APC 전압; C4F8 가스 조건: 7s/100 sccm 가스 유동/700W ICP 전력/10W RF 전력/30mT APC 전압을 포함한다. 이어서, 마이크로스케일 저장소를 접촉식 포토리소그래피 및 DRIE를 통해 웨이퍼의 뒷면에서 패턴화하였다. 최종적으로, 질화규소의 약 50nm 두께의 절연/보호 층을 TNT 플랫폼 표면 위에 증착시켰다.
축산업.
C57BL/6 마우스를 Harlan Laboratory로부터 입수했다. Jackson laboratories로부터 입수된 B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-td토마토,-EGFP)Luo/J 마우스를 K14cre와 교배하여 K14cre/Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-td토마토-EGFP)Luo/J 마우스를 생산하였다. pOBCol3.6GFPtpz 마우스는 트레시 윌구스(Traci Wilgus) 박사(오하이오 주립 대학)의 선물이었다. repTOPTM mitoIRE 마우스는 Charles River Laboratories로부터 입수했다. Fsp1-Cre 마우스가 수득되었다(University of California, Los Angeles). Fsp1-Cre 마우스를 B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-td토마토)Hze/J 마우스 (Jackson laboratories)와 교배하여 섬유아세포에 특이적인 td토마토 발현을 갖는 마우스를 생성시켰다. 모든 마우스는 수컷이었고, 연구 당시 8 내지 12주령이었다. ROSAmT/mG 마우스의 유전자형 분석 PCR은 프라이머 oIMR7318- CTC TGC TGC CTC CTG GCT TCT, oIMR7319- CGA GGC GGA TCA CAA GCA ATA 및 oIMR7320- TCA ATG GGC GGG GGT CGT T를 사용하여 수행한 반면, K-14 Cre 도입유전자는 프라이머 oIMR1084-GCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC; oIMR1085-GTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT를 사용하여 확인하였다. Fsp1-Cre 마우스의 유전자형 분석 PCR은 프라이머 정방향- CTAGGCCACAGAATTGAAAGATCT, 역방향- GTAGGTGGAAATTCTAGCATCATCC (야생형의 경우, 생성물 길이= 324bp) 및 정방향- GCGGTCTGGCAGTAAAAACTATC, 역방향-GTGAAACAGCATTGCATTGCTGTCACTT (Cre 도입유전자의 경우, 생성물 길이=100bp)를 사용하여 수행된 반면, td 토마토는 프라이머 정방향-AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA, 역방향-CCGAAAATCTGTGGGAAGTC (야생형의 경우, 생성물 길이=196bp) 및 정방향-GGCATTAAAGCAGCGTATCC, 역방향- CTGTTCCTGTACGGCATGG (돌연변이체 유형, 생성물 길이=297bp)를 사용하여 확인하였다. 모든 동물 연구는 오하이오 주립 대학의 실험 동물 관리 및 사용 위원회가 승인한 프로토콜에 따라서 수행되었다. 어떤 통계 방법도 샘플 크기를 미리 결정하는데 사용되지 않았다. 이 연구에서는 전력 분석이 필요하지 않았다. 동물은 컴퓨터 기반 알고리즘(www.random.org)을 사용하여 태깅하고 무작위로 그룹화하였다.
포유동물 세포 배양 및 시험관내 재프로그래밍.
1차 인간 성인 진피 섬유아세포(ATCC PCS-201-012)를 구매하고, 마이코플라스마 부재이고 ATCC로부터 직접 인증받았다. 추가의 세포주 인증/시험은 수행되지 않았다. 이러한 세포는 섬유아세포 성장 키트-무혈청(ATCC PCS 201-040) 및 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 섬유아세포 기초 배지에서 확장시켰다. E12.5-E14 마우스 배아 섬유아세포(MEF)를 10% 태아 소 혈청이 보충된 DMEM/F12에서 배양했다. 비바이러스성 세포 형질감염 및 재프로그래밍 실험은 이전에11 기재된 바와 같이 3D 나노채널 전기천공(NEP)을 통해 수행되었다. 간단히, 세포를 먼저 3D NEP 장치에서 밤새 완전 컨플루언시로 성장시켰다. 후속적으로, 펄스화된 전기장을 사용하여 플라스미드의 칵테일(0.05 ㎍/μl)을 Fli1:Etv2:Foxc2의 1:1:1 혼합물로 이루어진 세포로 전달했다. 이어서, 세포를 플라스미드 전달 후 24시간에 수확하고, EGM-2 MV SingleQuot 키트(CC-4147, Lonza)가 보충된 EBM-2 기초 배지(CC-3156, Lonza)에 넣고, 추가의 실험/측정을 위해 추가로 처리했다. Etv2 및 Fli1 플라스미드가 수득되었다(텍사스주 UT 남서부 의료 센터 내과 의학과). Foxc2 플라스미드는 쓰토무 쿠메(Tsutomu Kume) 박사(시카고 노스웨스턴 대학-FCVRI 의과 대학 심장내과 및 약리학과)에 의해 친절하게 기증되었다.
생체내 재프로그래밍.
치료할 영역은 TNT 24 내지 48시간 전에 먼저 네어화했다. 이어서, 피부를 박리시켜 죽은/케라틴 세포 층을 제거하고, 표피에서 유핵 세포를 노출시킨다. TNT 장치를 박리된 피부 표면에 직접 위치시켰다. ABM 또는 EFF 플라스미드 칵테일을 저장소에 0.05-0.1㎍/μl의 농도로 적재했다. 금 코팅된 전극(즉, 캐소드)을 플라스미드 용액에 침지시키면서, 24G 바늘 반대-전극(즉, 애노드)을 피내로 삽입하여 TNT 플랫폼 표면에 병치시켰다. 이어서, 펄스화된 전기 자극(즉, 진폭에서 250V의 10 펄스 및 펄스당 10ms 지속 기간)을 전극에 인가하여 노출된 세포 막을 나노천공시키고 플라스미드 화물을 나노채널을 통해 세포로 구동시킨다. ABM 플라스미드를 이전에11 기재된 바와 같이 2:1:1 몰 비로 혼합했다. 다르게 구체화되지 않는 한, 대조군 시험편은 블랭크, 인산염 완충 식염수(PBS)/모의 플라스미드 용액을 사용한 TNT 치료를 포함했다(도 38).
전기생리학적 활성 측정.
세포외 기록의 일반적인 원리는 피부에서 전기생리학적 활성을 검출하는데 사용되었다. 진정 효가가 있는 마우스의 피부에서 2개의 작은 절개를 통해 신경흥분성을 검출하기 위해 PPy-기반 프로브를 사용하여 크로노 전류법 측정을 수행했다.
MCAO 뇌졸중 수술 및 분석.
일시적인 국소 뇌 허혈은 이전에 기재된 관내 필라멘트 삽입 기술(Khanna S, 등 J Cereb Blood Flow Metab 2013, 33(8): 1197-1206)을 사용함으로써 달성된 중간 대뇌 동맥 폐색(MCAO)에 의해 마우스에서 유도되었다. MRI 이미지를 사용하여 부종을 교정한 후 대측성 반구의 백분율로서 경색 크기를 결정하였다.
허혈성 피부 플랩.
C57BL/6 마우스의 등쪽 피부에 20mm x 10mm를 측정하는 단엽 (즉, 무작위-패턴) 허혈 플랩을 생성시켰다. 간단히, 8 내지 10주령 마우스를 1 내지 3% 이소플루란으로 마취시켰다. 등쪽은 네어화하고, 청정화시키고, 베타딘으로 멸균시켰다. 10mm 간격으로 20mm 길이의 전체 두께 평형 절개를 하여 마우스의 등쪽 피부에 단엽 플랩을 생성시켰다. 피부의 바닥 부분을 절단하여 자유 행잉(hanging) 플랩을 제조했다. 플랩 가장자리를 지졌다. 0.5mm 규소 시트를 플랩하에 위치시킨 다음, 5 내지 0 에티콘 실크 봉합사로 인접한 피부에 봉합했다. 최종적으로, 부프레노르핀의 단일 용량을 피하 투여하여 통증을 조절했다. 레이저 스페클 이미징(Perimed)을 수술 후 2시간 동안 수행하여 성공적인 혈류 폐색을 확인했다. TNT-기반 형질감염은 피부 플랩핑 24시간 전에 수행했다.
뒷다리 허혈 수술.
편측성 뒷다리 허혈을 대퇴 동맥의 폐색 및 후속적 절단에 이은 절단을 통해 유도했다(참조: Limbourg A, 등 Nat Protoc 2009, 4(12): 1737-1746). 간단히, 8 내지 10주령 마우스를 1 내지 3% 이소플루란으로 마취시키고, 가열된 패드 상에서 입체현미경(Zeiss OPMI)하에 반드시 누운 듯 위치시켰다. 대퇴 동맥을 노출시키고, 약 1cm 절개를 통해 대퇴 정맥으로부터 분리시켰다. 근위 및 원위 말단 폐색을 7 내지 0 실크 봉합사로 유도하였고, 이어서, 동맥의 완전한 형질감염이 이어졌다. 최종적으로, 부프레노르핀의 단일 용량을 피하 투여하여 통증을 조절하였다. 레이저 스페클 이미징(MoorLDI-Mark 2)을 수술 후 2시간 수행하여 성공적인 혈류 폐색을 확인했다.
세포외 소포(EV)의 단리.
EV는 OCT 블록에서 수집된 12mm 직경의 피부 생검으로부터 단리시키고, 이후 사용을 위해 냉동 저장했다. 간단히, 블록을 해동시키고, PBS로 세척하여 OCT를 제거했다. 메스로 지방 조직을 제거 후, 피부 조직을 약 1mm 조각으로 다지고, PBS에서 마이크로-그라인더로 균질화하였다. 3000g에서 원심분리 후, Exoquick 키트(System Biosciences)를 1:5 비(Exoquick:상청액)로 사용하여 4℃에서 12시간 동안 상청액으로부터 EV를 단리시켰다. EV를 1500g에서 30분 동안 원심분리를 통해 침전시켰다. 이어서, 총 RNA를 제조업자에 의해 제공된 권장 사항에 따라 mirvana 키트(Life technologies)를 사용하여 펠릿으로부터 추출시켰다.
DNA 플라스미드 제조.
플라스미드는 플라스미드 DNA 정제 키트(Qiagen Maxi-prep, 카탈로그 번호 12161, 및 Clontech Nucleobond 카탈로그 번호 740410)를 사용하여 제조했다. DNA 농도는 Nanodrop 2000c 분광 광도계(Thermoscientific)를 사용하여 수득하였다.
레이저 포획 현미해부 (LCM) 및 정량적 실시간 PCR.
LCM은 PALM Technologies(Bernreid, Germany)로부터의 레이저 현미해부 시스템을 사용하여 수행하였다. 형태 및/또는 면역염색에 기초하여 동정된 조직 절편의 특정 영역을 절단하고, 20x 안구 렌즈하에 포획하였다. 샘플을 25μl의 세포 직접 용해 추출 완충제(Invitrogen)로 발사시켰다. 약 1,000,000㎛2의 조직 면적을 각 캡으로 포획한 다음, 용해물을 추가의 처리를 위해 -80℃에서 저장했다. LCM 샘플의 qRT-PCR은 제조업자 지침에 따라 세포 직접 용해 완충제로부터 수행하였다.
면역조직화학 및 공초점 현미경 검사.
조직 면역염색은 특이적 항체 및 표준 절차를 사용하여 수행하였다. 간단히, OCT-매립된 조직은 10㎛ 두께로 저온 절단하고, 차가운 아세톤으로 고정시키고, 10% 정상 염소 혈청으로 차단하고, 특이적 항체와 함께 배양했다. 신호는 형광 태깅된 적절한 2차 항체(Alexa 488-태깅된 α-기니 피그, 1:200, Alexa 488-태깅된 α-래빗, 1:200; Alexa 568-태깅된 α-래빗, 1:200)와의 후속적 배양으로 가시화하고, DAPI로 반대 염색했다. 혈관의 렉틴 기반 가시화는 조직 이전에 30분동안 FITC-표지된 렉틴의 꼬리 정맥 주사를 통해 수행하였다. 이미지를 레이저 스캐닝 공초점 현미경(Olympus FV 1000 필터/스펙트럼)에 의해 포획했다.
IVIS 이미징.
동물은 IVIS Lumina II 광학 이미징 시스템을 사용하여 마취하에 이미지화했다. repTOPTM mitoIRE 마우스에게 이미징 전 5 내지 10분 동안 100mg/kg의 용량으로 기질 루시페린(딱정벌레 포시페린의 칼륨 염, Promega)을 사전 주입하였다. 발광 이미지를 갖는 중첩 이미지는 리빙 이미지 소프트웨어를 사용하여 제조했다.
뇌졸중 뇌의 자기 공명 이미징(MRI).
자기 공명 혈관조영술을 사용하여 마우스에서 본 MCAO 모델을 확인하고, 효과적인 MCAO를 위한 폐색기 크기 및 내부 경동맥 삽입 거리를 최적화하였다. T2-계량된 MRI는 9.4 T MRI(Bruker Corporation, Bruker BioSpin Corporation, Billerica, MA, USA)를 사용하여 MCA-재관류 후 48시간에 마취된 마우스에 대해 수행하였다. MR 이미지는 다음 파라미터를 사용하여 완화 향상(RARE) 서열을 이용한 급속 획득을 사용하여 획득하였다: 시계(FOV) 30 x 30mm, 획득 매트릭스 256 x 256, TR 3,500 ms, TE 46.92 ms, 슬라이스 갭 1.0mm, 희귀 요소 8, 평균 수 3. mm당 8.5 픽셀의 해상도. 미가공 MR 이미지는 표준 DICOM 포맷으로 전환시켜 처리했다. Osirix v3.4를 사용하여 이미지의 적절한 소프트웨어 콘트라스트 향상 후, 디지털 면적 측정을 마스킹된 관찰자가 수행하여 각각의 코로나 뇌 슬라이스에서 경색 영역을 기술했다. 뇌 슬라이스로부터 경색 영역을 합산하고, 슬라이스 두께를 곱하고, 경색 용적을 결정하기 위해 이전에 기재된 바와 같이 부종 유도된 팽윤을 교정했다(참조: Khanna S, 등 J Cereb Blood Flow Metab 2013, 33(8):1197-1206).
근육 에너지론의 분석.
근육 에너지론은 RF 전송을 위한 용적 코일 및 수신을 위한 31P 코일을 사용하여 9.4 Tesla 스캐너(Bruker BioSpec)에서 NMR 분광학 측정을 평가했다(Fiedler GB, 등 MAGMA 2015, 28(5): 493-501). 생체내 이미징은 맞춤 제작된 1H/31P 트랜시버 코일 어레이에서 수행되었다. 데이터는 단일 펄스 서열을 사용하여 획득했다. 미가공 데이터는 잡음 감소를 위해 윈도우화하고, 스펙트럼 도메인으로 푸리에 변환시켰다.
혈관의 초음파 기반 이미징 및 특성화.
혈관 형성은 초음파 이미징을 통해 병렬 모니터링했다. 간단히, Vevo 2100 시스템(Visual Sonics, Toronto, ON, Canada)을 사용하여 MS 250 선형 어레이 프로브를 사용하는 B-방식에서 초음파 이미지를 수득했다(Gnyawali SC, 등 J Vis Exp. 2010 9(41)). 도플러 컬러 유동 이미징을 구현하여 심장 수축기 및 확장기 혈류 특성을 모니터링하고 정량화했다.
GeneChip® 프로브 어레이 및 Ingenuity Pathway (IPA)® 분석.
LCM을 사용하여 ABM-형질감염된 마우스 피부로부터 생체내 유래된 iN이 붕부한 조직 단리물을 제조하였다(참조: Roy S, 등 Proc Natl Acad Sci U S A 2007, 104(36): 14472-14477; Rink C, 등 J Cereb Blood Flow Metab 2010, 30(7): 1275-1287). 단리된 조직을 PicoPure® RNA 단리 키트(ThermoFisher)로부터 용해 완충제로 처리했다. RNA 추출, 표적 표지화, GeneChip® 및 데이터 분석을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다(참조: Roy S, 등 Proc Natl Acad Sci U S A 2007, 104(36): 14472-14477; Rink C, 등 J Cereb Blood Flow Metab 2010, 30(7): 1275-1287; Roy S, 등 Physiol Genomics 2008, 34(2): 162-184). 샘플을 Affymetrix 마우스 전사체 어레이 1.0 (MTA1.0)으로 하이브리드화하였다. 어레이를 세척하고, 이전에 기재된 바와 같이 오하이오 주립 대학 시설에서 GeneArray 스캐너(Affymetrix)로 스캐닝하였다(참조: Roy S, 등 Proc Natl Acad Sci U S A 2007, 104(36): 14472-14477; Roy S, 등 Physiol Genomics 2008, 34(2): 162-184). 발현 데이터는 일련의 수탁 번호 GSE92413을 사용하여 Gene Expression Omnibus(GEO; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)에 제출되었다. 미가공 데이터는 RMA16을 사용하여 표준화하고, Genespring GX (Agilent, Santa Clara CA)를 사용하여 분석했다. 데이터의 추가 처리는 dChip® 소프트웨어(하버드 대학)를 사용하여 수행하였다(참조: Roy S, 등 Proc Natl Acad Sci U S A 2007, 104(36): 14472-14477; Roy S, 등 Physiol Genomics 2008, 34(2): 162-184). 그룹에 대한 유사한 유전자의 기능적 주석을 IPA® 분석을 사용하여 수행했다. 표 5 및 6을 참조한다.
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
통계 분석.
샘플을 코딩하고, 데이터 분석을 맹검 방식으로 수행했다. 데이터는 3 내지 8개의 생물학적 복제물의 평균 ± 표준 오차로서 보고된다. 실패한 형질감염(예를 들어, 피부와 나노채널 사이의 불량한 접촉, 또는 나노채널 클로깅 등으로 인해)은 분석으로부터 제외되었다. 실험은 재현성을 확인하기 위해 적어도 2회 반복되었다. 그룹간의 비교는 분산 분석(ANOVA)에 의해 수행되었다. 통계적 차이는 SigmaPlot 버전 13.0으로 적절하게 파라메트릭/비-파라메트릭 시험을 통해 결정되었다.
데이터 이용가용성.
GeneChip 발현 데이터는 Gene Expression Omnibus를 통해 접근할 수 있다. 추가의 데이터는 합리적인 요청이 있을 경우 상응하는 저자들로부터 이용가능하다.
피부의 전기생리학적 활성의 동일반응계 측정.
생체내에서 유도된 뉴런의 고유한 흥분성을 검출하기 위한 노력이 집중되었으며, 세포외 기록의 일반적인 원리를 사용하여 이 목적을 달성하였다. 그러나 세포외 기록에 사용된 전통적인 전기생리학적 기술은 마우스로부터 조직을 해적재고, 유도된 뉴런을 형태론적으로 동정한 다음, 세포외 전극을 관심있는 세포에 밀접하게 근접하게 위치시키기 위한 본 필요성으로 인해 구현하기 위한 도전이었다. 패치-클램프 기술 또는 통상적인 전기생리학적 측정을 수행하는 상기한 복잡성을 극복하기 위해, 세포외 공간에 위치된 전도성 중합체 전극의 크로노 전류법 측정법을 사용하여 뉴런 흥분성을 검출했다. 중합체로 및 중합체로부터 전하의 주입 및 방출을 위한 전달 기능을 측정된 데이터에 적용하고, 전도성 중합체의 이중층 및 패러데이 반응에 상응하는 기공 및 잔기를 계산한다. 전달 기능 분석으로부터 계산된 잔기는 베누고팔 등(Venugopal et al)에서 설명된 바와 같이 중합체에 근접한 양이온 농도의 변화에 상응한다(참조: Venugopal V, 등 J Intel Mat Syst Str 2016, 27(12): 1702-1709). 도 25에 도시된 바와 같이, 마우스의 ABM 처리된 영역에 전도성 중합체 전극을 위치시킴으로써, 패러데이 반응에 상응하는 잔기의 시간적 변화가 관찰되어 뉴런 흥분성을 나타낸다.
산화환원 기반 전도성 중합체 양이온 센서의 작동 물리학. 도데실벤젠설포네이트로 도핑된 폴리피롤(PPy(DBS))은 전기적 전위의 개시시 국소 매질과 양이온을 교환하는 전도성 중합체이다. 양이온 주입 속도는 인가된 전기적 전위, 중합체 기하학, 중합체의 전류 상태, 및 전해질의 농도의 함수이다(참조: Venugopal V, 등 Sensors 및 Actuators B: Chemical 2014, 201(0): 293-299). 이 농도 의존성은 5 내지 100mM11의 범위에서 NaCl 농도와 선형 관계를 갖는 것으로 입증된 양이온 센서의 생성을 가능하게 한다. 또한, PPy(DBS) 센서는 그들의 기능을 손상시키지 않거나 영향을 주지 않으면서 생물학적 물질의 국소 양이온 농도를 결정할 수 있는 무독성의 산화환원 매개자 비함유 시스템이다. 따라서, 메소스케일 PPy(DBS) 센서는 동일반응계 양이온 농도를 측정하기 위해 진피층 내에 존재할 수 있는 프로브로 제조되었다.
PPy(DBS) 막의 단일 산화-환원 스위치(산화환원 사건)는 패러데이 및 이중층 기반 이온 수송 둘 다를 일으킨다. 시간 의존적 이온 수송 동역학은 아래 방정식으로 기재되었고, 여기서 k1 및 τ1 값은 전기 이중층을 형성하는 이온의 총 수 및 속도에 상응하고, k2 및 τ2 값은 중합체에 삽입하는 이온의 총 수 및 속도에 상응한다. 이에 기초하여, 이중층 캐패시터의 효과는 무시할 만하여 k2 값을 양이온 농도에 민감한 파라미터로서 남겨놓을 수 있다(참조: Venugopal V, 등 J Intel Mat Syst Str 2016, 27(12): 1702-1709).
Figure pct00008
양이온 농도의 시간-의존적 변화를 포획하기 위해서, PPy(DBS)의 다수의 산화환원 사이클이 필요하다. 스위칭 주파수는 관심 있는 시스템 내에서 농도 변화 속도의 추정에 기초하여 선택되어야 한다. 이 경우에, 전기생리학적 활성의 속도는 공지되어 있지 않고, 산화환원 주파수는 5Hz이도록 선택되었다. 이 주파수에서, 각각의 환원 사이클의 시간은 시스템이 정상 상태에 도달하는데 필요한 시간보다 현저히 더 짧다(중합체 두께 및 전해질 농도에 기초하여 2.5 내지 10초)(참조: Northcutt RG, 등 Physical Chemistry Chemical Physics 2016, 18(26): 17366-17372). 이것은 중합체가 각각의 산화환원 상태 사이에서 일정한 플럭스에서 작동하게 하고, k2가 중합체가 0.1초 윈도우 내에서 수용할 수 있는 이온의 총 수에 따라 변화되는 조건을 생성한다. 따라서, 측정된 k2는 국소 양이온 농도에 비례한다. 시간이 지남에 따라 k2의 변화를 모니터링하면 국소 세포의 흥분성으로 인한 양이온 농도의 변화를 직접 측정한다.
PPy(DBS) 미세전극의 제조.
백금 와이어(0.025mm 직경, Goodfellow, USA로부터 99.9% 순수 템퍼 하드)를 석영 모세관(75x1 mm, Sutter Instruments)을 통해 삽입하여 2mm 돌출부를 형성했다. 돌출 단부를 에폭시로 밀봉하고, 1mm 노출된 백금 와이어를 작동 전극(WE)으로서 남겼다. 은 와이어(0.5mm 직경, Sigma Aldrich로부터 99.9% 순수)를 유사하게 처리하여 1mm 돌출부를 갖는 참조 전극(RE)을 형성한다. 삽입 전에, 은 와이어를 20분 동안 하이포아염소산나트륨 용액(10 내지 15% 염소)에 침지시켜 Ag/AgCl 층을 형성했다. 전기중합 용액(0.2mM 피롤, 98% 순도 및 Sigma Aldrich로부터 0.1mM 나트륨 도데실벤젠설포네이트)을 형성하고, 30분 동안 정치시켰다. 전기중합 셀은 Pt 와이어, Ag/AgCl 및 백금 와이어 반대 전극(CE)으로 구성된다. 순환 전압 전류법 실험(CV)을 수행하여 전기화학적 연결성, 피롤 활성, 및 중합체 성장 영역을 확인했다. 이어서, 크로노 전류법 실험(CA)을 118.5μC의 전하가 증착되어 0.15 C.cm-2 전하 밀도를 갖는 PPy(DBS) 막을 생성할 때까지 인가된 0.52V 전위(CV에 기초)로 수행했다. 이어서, PPy(DBS) 팁을 DI 수로 세정하고, 질소 스트림하에 건조시켰다.
PPy(DBS) 미세전극의 평형 및 교정. N2 스트림하에 건조시킨 후, PPy(DBS) 센서를 생리학적 조건(DI 수 중 Sigma Aldrich로부터 125 mM NaCl)과 유사한 스톡 용액에서 평형화했다. 이는 10 주기에 걸쳐 CV에 의해 수행되어 주기에 걸쳐 불필요한 전류 반응을 보장하고, 양이온 주입에 대한 PPy(DBS) 팁의 민감도를 증가시켰다.
뉴런 흥분성을 검출하기 위한 프로토콜. 마우스를 ABM 또는 대조군으로 분류하고, 측정 전에 진정시켰다. 2개의 1mm 천공을 진피층(3 내지 5mm 간격)에서 생성시켰다. 표피 전반에 걸쳐 전해질 전도성을 보장하기 위해, 생리학적 0.9% NaCl 용액을 홀 사이에 주사했다. 이어서, PPy(DBS) 프로브 및 Ag/AgCl 프로브를 나노포지셔너(Sutter Instruments)를 사용하여 주사 부위에 삽입하여 1mm의 각 프로브가 표피 층에 노출되도록 했다. 이어서, 순환 전압 전류를 기록하여 전기화학적 연결성을 보장하고 시스템에서 잡음을 특성화했다. 후속적으로, 일련의 크로노 전류법 측정을 100회 산화환원 사이클이 20초 동안 완료될 때까지 0.1초 마다 환원 및 산화 전위 사이를 스위칭하여 수행했다. 인가된 환원 및 산화 전위는 CV 동안 관찰된 산화환원 피크에 기초하여 선택되었다(환원 피크보다 0.2V 작고 산화 피크보다 0.2V 큼). 5초 평형(0V 인가됨) CA를 산화환원 스위칭 전후에 수행하였다. CA 공정은 반응이 시험간에 유사할 때까지 5 내지 10회 반복하여 정상 상태 거동을 나타냈다. 하나의 삽입 부위뿐만 아니라 다중 삽입 부위에서 다중 시도가 기록되었다. 이는 삽입 부위가 임의로 제조되었기 때문에, 뉴런 세포 활성을 포획할 기회를 증가시키기 위해 수행되었다.
농도 변동에 대한 센서 반응의 기준선 특성화. 센서에 대한 환경적 잡음의 영향을 추가로 이해하기 위해, 순환 전압 전류법 측정 및 크로노 전류법 측정을 10mL 용기에서 0.9% NaCl 용액을 사용하여 (상기한 방법을 사용하여) 수행하였다. 이 실험을 사용하여 시스템의 고유한 잡음이 특성화된 기준선 미터법을 확립했다. 이는 ABM 또는 대조군 마우스의 "활성"을 규정하는데 사용되었다. 이에 따라서, 3% +- 편차는 "흥분성" 세포의 증거인 것으로 간주되었다. 일시성을 제거하기 위해, 측정의 처음 25회 사이클을 무시했다. 나머지 75회 산화환원 사이클 중, 이온 방출을 무시하면서 이온 주입 효과를 포획하기 위해 환원 사이클만이 고려되었다. 첫 번째 섹션에서 기재된 모델을 사용하여 2항 지수 함수를 데이터에 적합화하였고, k2 값을 수득했다. 전극 사이에 상당한 오프셋뿐만 아니라 시간 의존적 편향이 존재하였음이 주시되었다. 결과적으로, k2 값은 k2 값을 그들의 평균으로 나누고 5차 다항식 적합도를 뺌으로써 표준화되었다. 이 방법을 사용하면 사용된 전극과 관계없이 비교를 위한 객관적인 기준을 제공했다.
결과
생체내 핵 재프로그래밍에서의 최근의 진보는 "현장" 환자 특이적 세포 기반 요법의 개발 가능성을 열었다. 비바이러스성 접근법을 구현하기 위한 새롭지만 간단한 방법을 개발하여 재프로그래밍 인자를 나노채널화 장치를 통해 조직에 국소적이고 조절가능하게 전달하였다(도 17). 이러한 조직 나노-형질감염(TNT) 접근법은 배열된 나노채널을 통해 고도로 강렬하고 집중된 전기장을 인가함으로써 재프로그래밍 인자의 직접 세포질 전달을 가능하게 하고(참조: Gallego-Perez D, 등 Nanomedicine 2016, 12(2): 399-409; Boukany PE, 등 Nat Nanotechnol 2011, 6(11): 747-754), 이는 양성으로 병치된 조직 세포 막을 전기천공시키고, 재프로그래밍 인자를 세포로 전기영동적으로 구동한다(도 17a-d). TNT 시스템 제조 공정 및 모의실험 결과에 대한 상세한 정보는 도 20 및 21에서 찾을 수 있다. 유전자 전달이 특성상 매우 확률이 높고, 부작용(예: 염증 반응, 세포사)(Sen CK, 등 Am J Pathol 2015, 185(10): 2629-2640)을 일으킬 수 있는 현재 생체내 형질감염 기술(예: 바이러스, 통상적인 조직 벌크 전기천공 또는 BEP)과 대조적으로, 나노채널 기반 형질감염은 단일 세포 수준에서 더욱 집중되고(도 17b, c) 충분한(도 17d) 재프로그래밍 인자 전달을 가능하게 하여 이를 결정론적인 생체내 유전자 형질감염 및 재프로그래밍을 위한 강력한 도구이도록 한다(참조: Gallego-Perez D, 등 Nanomedicine 2016, 12(2): 399-409; Boukany PE, 등 Nat Nanotechnol 2011, 6(11): 747-754).
C57BL/6 마우스에서 FAM 표지된 DNA를 이용한 실험은 TNT가 화물을 신속하고(1초 미만) 비침습성/국소적 방식으로 피부로 전달할 수 있음을 확립했다(도 17e). 이어서, 재프로그래밍 인자의 TNT 기반 국소 전달이 성공적인 피부 재프로그래밍을 유도할 수 있는지의 여부는 Ascl1/Brn2/Myt1l (ABM)의 과별현이 섬유아세포를 시험관내에서 유도된 뉴런(iN)으로 직접 재프로그래밍하는 것으로 공지된 강력한 모델을 사용하여 시험하였다(참조: Gallego-Perez D, 등 Nanomedicine 2016, 12(2): 399-409; Vierbuchen T, 등 Nature 2010, 463(7284): 1035-1041). 결과는, TNT가 재프로그래밍 인자의 국소 전달용으로 사용될 뿐만 아니라(도 17f), 다른 그럴 듯한 기전 중에서(Davis DM, 등 Nat Rev Mol Cell Biol 2008, 9(6): 431-436) 가능하게는 표적 유전자 cDNAs/mRNA(도 17h,i)(Valadi H, 등 Nat Cell Biol 2007, 9(6): 654-659)에서 풍부한 세포외 소포(EV)의 디스패치를 통해 초기 형질감염 경계(즉, 표피)(도 17g-i)를 넘어서 재프로그래밍 자극 전파(즉, 표피 대 진피)를 유도하는 통합된 반응을 조정할 수 있다는 것을 보여주었다. 순수한 세포를 TNT 처리된 피부로부터 단리된 ABM-적재된 EV에 노출시키면(도 17j-l) 이러한 EV가 원격 세포 및 유발 재프로그래밍에 의해 자발적으로 내부화될 수 있음이 확립되었다(도 17k, l, 및 22). 또한, 유전자 발현 분석은 증가된 Tuj1 발현에 의해 입증된 바와 같이 피부에서 피내 ABM EV 주사 유발된 변화가 뉴런 유도와 일치한다(도 23)는 것을 나타냈다. 피부-유도된 ABM67 적재된 EV의 신경영양 효과는 중간 뇌동맥 폐색(MCAO) 뇌졸중 마우스 모델(도 24)에서 추가로 확인되었다(참조: Khanna S, 등 J Cereb Blood Flow Metab 2013, 33(8): 1197-1206).
성공적인 피부 세포 재프로그래밍은 경시적으로 Tuj1 및 신경필라멘트 발현이 증가되었음을 나타내는 면역형광에 의해 확인되었다(도 17m,n). 추가의 특성화는 시험관내 및 생체내 유도된 iN과 비교하는 게놈 방식 전사체 어레이 분석을 통해 수행되었다(도 25). 뉴런 흥분성을 나타내는 전기생리학적 활성이 성공적으로 검출되었고, 신규한 폴리피롤(PPy)-기반 생물감지 플랫폼(도 26)을 통해 ABM 형질감염된 마우스(도 17o)의 약 50%에서 모니터링되었다(동일반응계)(참조: Venugopal V, 등 J Intel Mat Syst Str 2016, 27(12): 1702-1709). 이러한 활성은 임의의 대조군 마우스에서 검출되지 않았다. K14-Cre 리포터 마우스 모델을 이용한 계통 추적 실험은 새로 유도된 뉴런이 K14+ 피부 세포로부터 부분적으로 유래되었다는 것을 확립했다(도 27). 모낭은 또한 지속적으로 현저한 Tuj1 면역반응성을 나타내어 여포 세포가 재프로그래밍 과정에 참여할 수 있음을 시사한다(참조: Hunt DP, 등 Stem Cells 2008, 26(1): 163-172; Higgins CA, 등 J Invest Dermatol 2012, 132(6): 1725-1727). 활성 Col1A1 프로모터(예: 진피 섬유아세포)를 갖는 세포가 eGFP를 발현시키는 Col1A1-eGFP 마우스 모델을 이용한 추가의 실험(도 27)은 Tuj1+로의 전이 단계 중 진피에서 다수의 콜라겐/eGFP+ 세포를 나타내므로, 피부에서 재프로그래밍된 세포의 일부에 대한 섬유아세포 기원을 시사한다.
사례 연구로서 iN을 사용하여 성공적인 생체내 재프로그래밍을 위한 TNT 플랫폼을 검증하여, 피부 세포를 유도된 내피 세포(iEC)로 재프로그래밍할 수 있는 강력하고 간단한 비바이러스성 방법이 개발되었다. 이를 위해, 재프로그래밍 인자인 Etv2, Foxc2 및 Fli1 (EFF)의 세트가 동정되었고, 이전 보고(참조: Morita R, 등 Proc Natl Acad Sci U S A 2015, 112(1): 160-165)와 비교하여 체세포의 iEC(도 28 및 29)로의 보다 신속하고 효과적인 재프로그래밍을 촉진하기 위해 검증되었다(시험관내). 시험관내 비바이러스성 형질감염 및 재프로그래밍 실험(참조: Gallego-Perez D, 등 Nanomedicine 2016, 12(2): 399-409)은 EFF가 인간 및 마우스 1차 섬유아세포를 iEC로 신속하고(1주 미만) 효율적으로(도 28) 재프로그래밍할 수 있음을 나타냈다.
직접 내피 세포 재프로그래밍을 유도하는 EFF의 효능이 시험관내에서 확립되면, 이 패러다임은 생체내에서 시험하였다. C57BL/6 마우스의 등쪽 피부에 이러한 3개의 유전자의 동시 형질감염은, 대조군 피부(도 18a-c)와 비교하여 Pecam-1 및 vWF 발현의 유의한 증가에 의해 입증된 바와 같이, 증가된 증식 활성(도 30) 이외에, 1주일 내에 현저한 기질 재프로그래밍을 초래했다. K14-Cre 리포터 및 Col1A1-eGFP 마우스 모델을 이용한 실험은 재프로그래밍된 세포 집단이 대부분 진피 기원을 가졌다(도 31)는 것을 입증했다. 등쪽 피부의 고해상도 레이저 스페클(HRLS) 이미징은 EFF의 TNT 기반 전달이 3일 이내에 처리된 영역으로 의 혈류를 증강시켰음을 나타냈다(도 18d, e). 초음파 이미징은 피부의 표면으로부터 단지 3mm 떨어진 곳에서 예기치 않은 박동성 혈류를 검출하여(도 18f, 우측), 국소 기능적 피부 동맥과 새로 형성된 혈관의 성공적인 문합을 입증한다. 대조군 마우스에서, 혈관은 전형적으로 피부 표면 근처에서 검출되지 않았음(도 18f, 좌측)을 주의한다.
혈관 내피를 유도하기 위한 EFF 칵테일의 견고성이 시험관내 및 생체내 모두에서 입증되면, 실험을 수행하여 EFF TNT-매개된 국소 피부 재프로그래밍이 허혈성 조직의 기능적 재관류를 유도할 수 있는지의 여부를 연구했다. 이 개념은 C57BL/6 마우스에서 전체 두께 2x1 cm2 단엽 등쪽 피부 플랩으로 먼저 시험하였고, 이에 의해 플랩된 조직으로의 혈액 공급은 두부 부착(도 18g)에서만 이루어졌다. EFF 치료 후 레이저 스페클 모니터링은 대조군 플랩과 비교하여 높은 혈액 관류를 나타냈다(도 2h). 예상된 바와 같이, 대조군 플랩은 조직 괴사의 유의한 징후를 나타냈다(도 18g-상단, i). 이러한 조직 손상은 EFF 형질감염에 반응하여 상당히 제한되었다. 따라서, TNT-매개된 EFF 전달 및 후속적인 기질 재프로그래밍은 허혈성 조건하에 조직 괴사를 효과적으로 방해했다.
최종적으로, EFF의 TNT 기반 전달이 전체 사지 구조를 유도할 수 있는지를 확인하기 위해서, TNT는 뒷다리 허혈 C57BL/6 마우스 모델에서 시험하였다(도 19a). EFF TNT는 대퇴 동맥 절단 후 3일 동안 내부 허벅지 피부에서 수행하였다. 레이저 스페클 모니터링은 수술 직후 사지로의 혈류의 상당한 감소를 기록했다(도 19b). 대조군 허혈성 사지와 비교하여, EFF 처리된 사지는 TNT 후 7일째 조기에 개선된 관류를 나타냈다(도 19b, c). HRLS 이미징은 대조군과 비교하여 EFF 처리된 사지에서 작은 대측물 발생률의 증가를 입증했다(도 32). 거시 분석은 EFF 처리된 것들과 비교하여 대조군 사지에서 조직 괴사의 더 현저한 징후를 나타냈다(도 19d). 손상 유도된 사지 허혈23,24로부터 더 유해한 부작용을 겪는 경향을 갖는 Balb/c 마우스에서의 추가의 실험은 EFF 형질감염이 또한 성공적인 사지 관류 및 괴사 및 자동 절단의 최소화된 발생률을 유도했음을 나타냈다(도 33). 핵 자기 공명 이미징(NMR)에 의한 근육 에너지론 시험은 대조군과 비교하여 EFF 처리된 사지에서 ATP 및 포스포크레아틴(PCr)의 증가된 수준을 나타냈다(도 19e). 면역형광 분석은 치료 영역을 훨씬 넘어 현저한 재혈관화를 나타냈다. 혈관신생은 또한 비장근과 같은 사지 내의 더 먼 위치에서 유도되었다(도 19f, 34). 이러한 반응을 위한 근본적인 기전이 더 명확해져야 하지만, EFF 처리된 등쪽 피부로부터 단리된 자가 EV는 뒷다리 허혈 마우스 모델의 비장근으로 직접 주사될 때 혈관형성을 유도할 가능성을 갖는 것으로 나타났다(도 35). 평행 시험관내 실험은 이러한 EV가 순수한 세포에서 재프로그래밍을 유도할 수 있음을 입증했다(도 36). 따라서, EFF 처리된 조직으로부터 디스패치된 EV는 프로-iEC 재프로그래밍 신호의 전파 매개체로서 역할을 한다고 제안되었다. PCR 분석은, 유전자도입된 EFF cDNA/mRNA 이외에, 이러한 EV가 또한 전혈관신생 VEGF 및 bFGF mRNA와 함께 예비적재되는 것으로 나타난다는 것을 나타냈다(도 35). 이는 EFF 처리된 피부로부터 유래된 EV는 표적 조직 전반에 걸쳐 EFF 재프로그래밍 신호를 전파시키기 위한 실행 가능한 기전을 나타낼 뿐만 아니라 형질감염 후 최초 시간 내에 전혈관신생 신호를 전파함으로써 틈새 전처리에서 역할을 할 수 있음을 시사한다.
따라서, TNT는 재프로그래밍 인자를 신속하고 매우 효과적이며 비침습성 방식으로 피부에 전달하는 데 사용될 수 있다. 이러한 TNT 전달은 각각 iN 및 iEC의 익히 확립되고 새로 개발된 재프로그래밍 모델로 입증된 바와 같이 맞춤형 피부 조직 재프로그래밍을 유도한다. TNT-유도된 피부 유도된 iEC는 부모 순환계와 성공적으로 문합되고 손상 유도된 허혈의 두 마리 뮤린 모델에서 조직 및 사지 관류를 회복한 혈관 네트워크를 신속히 형성했다. TNT 기반 조직 재프로그래밍은 궁극적으로 환자 자신의 조직을 수확시 국소적/현장 또는 원위치로 상태를 분해할 수 있는 자가 세포를 생산하기 위한 다산성 면역감시된 생물 반응기로서 사용할 수 있도록 할 가능성을 갖는다. 몇 초만 지속되는 국소적 1회 치료를 통해 강력하게 유리한 생물학적 반응을 유도하여 전파하는 구현하기 간단한 이 TNT 접근법은 또한 올리고 RNA(예: miR, siRNA)-매개된 재프로그래밍(도 37)(참조: Anokye-Danso F, 등 Cell Stem Cell 2011, 8(4): 376-388), 유전자 조절, 편집 등을 포함하는 플라스미드 DNA 기반 재프로그래밍 전략 이상의 적용을 찾을 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 개시된 발명이 속하는 기술 분야의 숙련가에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 인용된 공보 및 그들이 인용하는 자료는 구체적으로 참조로 도입된다.
당업자는 단지 통상적인 실험을 사용하여 본원에 기재된 본 발명의 특정 구현예의 다수의 등가물을 사용하여 인식하거나 확인할 수 있다. 이러한 등가물은 다음 청구범위에 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> OHIO STATE INNOVATION FOUNDATION <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR REPROGRAMMING SOMATIC CELLS INTO INDUCED VASCULOGENIC CELLS <130> IPA190752-US <150> US 62/438,260 <151> 2016-12-22 <150> US 62/530,132 <151> 2017-07-08 <160> 49 <170> KoPatentIn version 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 uaauacugcc ugguaaugau ga 22 <210> 2 <211> 335 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Met Asp Leu Trp Asn Trp Asp Glu Ala Ser Leu Gln Glu Val Pro Pro 1 5 10 15 Gly Asp Lys Leu Thr Gly Leu Gly Ala Glu Phe Gly Phe Tyr Phe Pro 20 25 30 Glu Val Ala Leu Gln Glu Asp Thr Pro Ile Thr Pro Met Asn Val Glu 35 40 45 Gly Cys Trp Lys Gly Phe Pro Glu Leu Asp Trp Asn Pro Ala Leu Pro 50 55 60 His Glu Asp Val Pro Phe Gln Ala Glu Pro Val Ala His Pro Leu Pro 65 70 75 80 Trp Ser Arg Asp Trp Thr Asp Leu Gly Cys Asn Thr Ser Asp Pro Trp 85 90 95 Ser Cys Ala Ser Gln Thr Pro Gly Pro Ala Pro Pro Gly Thr Ser 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Gly Ile Ala Gln Ala 355 360 365 Leu Gln Pro His Pro Thr Glu Thr Ser Met Tyr Lys Tyr Pro Ser Asp 370 375 380 Ile Ser Tyr Met Pro Ser Tyr His Ala His Gln Gln Lys Val Asn Phe 385 390 395 400 Val Pro Ser His Pro Ser Ser Met Pro Val Thr Ser Ser Ser Phe Phe 405 410 415 Gly Ala Ala Ser Gln Tyr Trp Thr Ser Pro Thr Ala Gly Ile Tyr Pro 420 425 430 Asn Pro Ser Val Pro Arg His Pro Asn Thr His Val Pro Ser His Leu 435 440 445 Gly Ser Tyr Tyr 450 <210> 7 <211> 3184 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 7 aaagtgaagt cacttcccaa aattagctga aaaaaagttt catccggtta actgtctctt 60 tttcgatccg ctacaacaac aaacgtgcac aggggagcga gggcagggcg ctcgcagggg 120 gcactcagag agggcccagg gcgccaaaga ggccgcgccg ggctaatctg aaggggctac 180 gaggtcaggc tgtaaccggg tcaatgtgtg gaatattggg gggctcggct gcagacttgg 240 ccaaatggac gggactatta aggaggctct gtctgtggtg agtgacgatc agtccctttt 300 tgattcagca tacggagcgg cagcccatct ccccaaggca gatatgactg cttcggggag 360 tcctgactac gggcagcccc acaaaatcaa ccccctgcca 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20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 22 gccctgcttg ttctcgcggt 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 23 ggaccagtcc ccgaagcagc 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 24 agtggagcag ctggcctgga 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 25 agcgctgtga acgcttgcct 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 26 catgagaggc cctcccggct 20 <210> 27 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 27 ccgtccagct cgaccag 17 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 28 gatcacatgg tcctgctg 18 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 29 gtgcaacgag cagggcgagt 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> 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Claims (25)

  1. ETV2, FOXC2 및 FLI1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 둘 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
  2. 청구항 1의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 비바이러스성 벡터로서, 상기 둘 이상의 핵산 서열이 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결되는, 비바이러스성 벡터.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 핵산 서열 각각이 단일 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결되는, 비바이러스성 벡터.
  4. 청구항 2 또는 3에 있어서, 상기 비바이러스성 벡터가 그룹 pIRES-hrGFP-2a, pAd-IRES-GFP 및 pCDNA3.0으로부터 선택된 플라스미드를 포함하는, 비바이러스성 벡터.
  5. 청구항 2 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드가 세포내 전달에 적합한 리포솜, 미세입자 또는 나노입자로 캡슐화되는, 비바이러스성 벡터.
  6. 청구항 1의 폴리뉴클레오타이드 또는 청구항 2 내지 5 중 어느 한 항의 비바이러스성 벡터, 및 miR-200b 억제제를 포함하는 조성물.
  7. 체세포를 혈관형성 세포로 재프로그래밍하는 방법으로서,
    (a) ETV2, FOXC2 및 FLI1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 단백질, 또는 ETV2, FOXC2 및 FLI1 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 체세포로 세포내 전달하는 단계; 또는
    (b) 체세포를 ETV2, FOXC2 및 FLI1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 단백질, 또는 ETV2, FOXC2 및 FLI1 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하거나 발현시키는 세포로부터 생성된 세포외 소포에 노출시키는 단계를 포함하는, 방법.
  8. 청구항 7에서, 상기 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드가 순차적으로 투여되는, 방법.
  9. 청구항 8에서, FLI1 단백질, 또는 FLI1 단백질을 코딩하는 핵산이 먼저 투여되는, 방법.
  10. 청구항 7에 있어서, FLI1 단백질, 또는 FLI1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 단독으로 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  11. 청구항 7에 있어서, FLI1 단백질 및 ETV2 단백질, 또는 FLI1 단백질 및 ETV2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  12. 청구항 7에 있어서, FLI1 단백질 및 FOXC2 단백질, 또는 FLI1 단백질 및 FOXC2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  13. 청구항 7에 있어서, 청구항 1의 폴리뉴클레오타이드, 청구항 2 내지 5 중 어느 한 항의 비바이러스성 벡터 또는 청구항 6의 조성물을 체세포로 세포내 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
  14. 청구항 7 내지 13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 체세포가 피부 세포인, 방법.
  15. 청구항 7 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 전달이 3차원 나노채널 전기천공을 포함하는, 방법.
  16. 청구항 7 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 전달이 조직 나노형질감염 장치에 의한 전달을 포함하는, 방법.
  17. 청구항 7 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 전달이 심도-국소 조직 나노전기주사 장치에 의한 전달을 포함하는, 방법.
  18. 체세포에 miR-200b 억제제를 세포내로 전달하는 단계를 포함하여, 체세포를 혈관형성 세포로 재프로그래밍하는 방법.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 miR-200b 억제제가 세포내 전달에 적합한 리포솜, 미세입자 또는 나노입자로 캡슐화되는, 방법.
  20. 청구항 18 또는 19에 있어서, 세포내 전달이 전기천공에 의한 형질감염을 포함하는, 방법.
  21. 청구항 18 또는 19에 있어서, 세포내 전달이 3차원 나노채널 전기천공을 포함하는, 방법.
  22. 청구항 18 또는 19에 있어서, 세포내 전달이 조직 나노형질감염 장치에 의한 전달을 포함하는, 방법.
  23. 청구항 18 또는 19에 있어서, 세포내 전달이 심도-국소 조직 나노전기주사 장치에 의한 전달을 포함하는, 방법.
  24. 청구항 18 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 상기 체세포가 피부 세포인, 방법.
  25. 청구항 18 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 상기 체세포가 근육 세포인, 방법.
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