JP2015109833A - 線維芽細胞から血管内皮細胞を製造する方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、発がん性のリスクが低く、比較的短期間で簡便かつ多量に、しかも低コストで血管内皮細胞を製造し得る、より実用的な血管内皮細胞の製造方法、該製造方法により製造される血管内皮細胞、及び該血管内皮細胞を含有する血管新生促進剤を提供する。【解決手段】線維芽細胞にＥＴＶ２遺伝子又はＥＴＶ２タンパク質を導入し、次いで、該線維芽細胞を血管内皮細胞増殖用培地で培養することを特徴とする。上記線維芽細胞の種類としては、皮膚線維芽細胞、肺線維芽細胞、心臓線維芽細胞、大動脈外膜線維芽細胞、子宮線維芽細胞を挙げることができ、中でも、採取が比較的容易であることから皮膚線維芽細胞を好ましく挙げることができる。【選択図】なし

Description

本発明は、人工多能性幹細胞を経由せずに、線維芽細胞から血管内皮細胞を製造する方法、該方法により製造される血管内皮細胞、及び該血管内皮細胞を含有する血管新生促進剤に関し、より詳しくは、ＥＴＶ２遺伝子を線維芽細胞に導入し、該線維芽細胞を血管内皮細胞増殖用培地で培養することを含む血管内皮細胞の製造方法、該製造方法により製造される血管内皮細胞、及び該血管内皮細胞を含有する血管新生促進剤に関する。

胚性幹細胞（ＥＳＣ）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む多能性幹細胞（ＰＳＣ）から作製されるヒト血管内皮細胞（ＶＥＣ）は、虚血性血管疾患の治療法への応用が期待されている（非特許文献１及び２）。特にｉＰＳＣは、血管内皮細胞の有望な作製源であるが、不完全な分化及び発がん性といったリスクがｉＰＳＣの応用を主に制限している（非特許文献３及び４）。完全な多能性状態をバイパスするため、多数の研究グループが、２又は４つのｉＰＳＣ誘導因子（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びｃ−ＭＹＣ）を形質導入した線維芽細胞を、規定の血管内皮細胞培養条件下にて培養することにより血管内皮細胞を作製してきた（非特許文献２、５及び６）。しかし、ＰＳＣ由来の血管内皮細胞は増殖能が低く、徐々に非血管系になるため、長期的な安定性が十分でないという問題があった（非特許文献７及び８）。

特定の系統に特異的な複数の転写因子を組み合わせて発現させると、多能性をバイパスして体細胞を別の系統の細胞に直接転換させ得ることが示されている。例えばＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５は、マウス心臓線維芽細胞を機能的心筋細胞に転換し（非特許文献９、特許文献１）、Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、及びＭｙｔ１は、マウス線維芽細胞からニューロンを誘導することが知られている（非特許文献１０）。しかし、線維芽細胞を、ｉＰＳＣを経由せずに、血管内皮細胞の系統に直接転換し得るかどうかなどは知られていなかった。

内皮及び造血系の細胞は両方とも、共通の前駆体である血球血管芽細胞（hemangioblast）から生じ、この前駆体は卵黄嚢の血島に存在する（非特許文献１１及び１２）。マウスとゼブラフィッシュの研究では、ＥＴＳ転写因子が萌芽期の血液−内皮分化に関与すること（非特許文献１３）、ＥｒｇがＫｌｆ２と関係して、血管発達の間にＦｌｋ１の発現を誘導すること（非特許文献１４）、Ｆｌｉ１が、Ｔａｌ１及びＧａｔａ２をはじめとする多くの初期内皮遺伝子の上流で機能することにより、血球血管芽細胞の発生初期に働くこと（非特許文献１５）、及び妊娠初期の内皮及び造血系分化にとってＥｔｖ２が必須であること（非特許文献１６）が解明されている。最近では、３つのＥＴＳ因子であるＥＴＶ２、ＦＬＩ１、及びＥＲＧの組合せがヒト羊膜細胞を、安定的なＥＣ表現型を示す機能的血管内皮細胞に直接的に転換することが報告されている（非特許文献７）。上記羊膜細胞由来の血管内皮細胞は、低い増殖性及び系が不安定である等のＰＳＣ由来血管内皮細胞の問題点を克服できるかもしれない。しかし、羊膜細胞は採取が容易でない上、男性はかかる細胞を有していないため、拒絶反応のない、自己の細胞由来の血管内皮細胞をいずれの患者にも提供する上では、依然として問題があった。

特表２０１３−５２４８３７号公報

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前述したように、ＥＳＣやｉＰＳＣから血管内皮細胞（ＶＥＣ）を作製する方法には、発がん性のリスクがあるという問題のほか、インビトロ培養での血管内皮細胞への誘導効率が低いという問題もあった。本発明の課題は、従来法のこれらの問題を克服した、血管内皮細胞の製造方法を提供することにあり、すなわち、発がん性のリスクが低く、比較的短期間で簡便かつ多量に、しかも低コストで血管内皮細胞を製造し得る、より実用的な血管内皮細胞の製造方法、該製造方法により製造される血管内皮細胞、及び該血管内皮細胞を含有する血管新生促進剤を提供することにある。

線維芽細胞に２又は４つのｉＰＳＣ誘導因子（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びｃ−ＭＹＣ）の遺伝子を導入してｉＰＳＣを作製し、該ｉＰＳＣをＥＧＭ−２培地等の血管内皮細胞増殖用培地で培養することによって、血管内皮細胞を製造する方法は従来より知られていた。しかし、この方法には前述したような問題点があったため、本発明者らは、これらの問題点を克服するべく鋭意研究を行ったところ、線維芽細胞にＥＴＶ２遺伝子を導入した上で、ＥＧＭ−２培地等の血管内皮細胞増殖用培地で培養することにより、線維芽細胞からｉＰＳＣを経由せずに血管内皮細胞を製造し得ることを見いだし、本発明を完成するに至った。なお、血管内皮細胞に本来分化しない線維芽細胞を、血管内皮細胞に分化し得る系統の細胞に直接的に転換するには、３種類か４種類以上の因子の遺伝子を線維芽細胞に導入する必要があると考えられていたが、意外なことに、わずか１種類の因子の遺伝子（ＥＴＶ２遺伝子）を線維芽細胞に導入すれば、血管内皮細胞へ分化し得る系統の細胞に直接的に転換できること、すなわち、線維芽細胞を血管内皮細胞に誘導するために、細胞内に導入することが必要な因子はＥＴＶ２のみであることが本発明者らの今回の実験によって判明した。

また、本発明者らは、本発明の血管内皮細胞の製造方法（以下、単に「本発明の製造方法」とも表示する。）により製造した血管内皮細胞を、生体内に移植したところ、機能的な血管構造を形成することが示された。また、本発明の製造方法により製造した血管内皮細胞を、生体の虚血部位に移植したところ、虚血部位の血流が有意に回復することが示された。

さらに、本発明者らは、ＥＴＶ２による線維芽細胞からＥＴＶＥＣへの誘導には、線維芽細胞中の内因性ＦＯＸＣ２が必須であることを見いだした。

以上の知見を得ることによって、本発明者らは本発明を完成した。

すなわち、本発明は、（１）以下の工程（Ｐ）及び工程（Ｑ）を有することを特徴とする、血管内皮細胞の製造方法；
工程（Ｐ）：以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかのポリヌクレオチドからなるＥＴＶ２遺伝子、又は以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのタンパク質からなるＥＴＶ２タンパク質を線維芽細胞に導入する工程；及び
工程（Ｑ）：前記ＥＴＶ２遺伝子又は前記ＥＴＶ２タンパク質が導入された線維芽細胞を血管内皮細胞増殖用培地で培養する工程；
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＥＴＶ２活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＥＴＶ２活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＥＴＶ２活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＥＴＶ２活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＥＴＶ２活性を有するタンパク質；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＥＴＶ２活性を有するタンパク質；や、
（２）さらに、以下の工程（Ｒ）を有することを特徴とする上記（１）に記載の血管内皮細胞の製造方法；
工程（Ｒ）：工程（Ｑ）で培養して得られる細胞から血管内皮細胞を分取する工程；や、（３）工程（Ｒ）において、工程（Ｑ）で培養して得られる細胞から血管内皮細胞を分取する方法が、工程（Ｑ）で得られる細胞から血管内皮細胞マーカー陽性細胞を分取する方法であることを特徴とする上記（２）に記載の血管内皮細胞の製造方法や、
（４）血管内皮細胞マーカーがＣＤ３１であることを特徴とする上記（３）に記載の血管内皮細胞の製造方法や、
（５）さらに、以下の工程（Ｓ）を有することを特徴とする上記（２）〜（４）のいずれかに記載の血管内皮細胞の製造方法；
工程（Ｓ）：工程（Ｒ）で分取した血管内皮細胞を、血管内皮細胞増殖用培地で培養する工程；や、
（６）ＥＴＶ２遺伝子の線維芽細胞への導入が、前記ＥＴＶ２遺伝子を発現し得る発現ベクターを前記線維芽細胞へ導入することによりなされることを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれかに記載の血管内皮細胞の製造方法や、
（７）ＥＴＶ２遺伝子を発現し得る発現ベクターが、ＥＴＶ２遺伝子を発現し得るレンチウイルスベクターであることを特徴とする上記（６）に記載の血管内皮細胞の製造方法や、
（８）血管内皮細胞増殖用培地が、少なくとも血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及び塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含むことを特徴とする上記（１）〜（７）のいずれかに記載の血管内皮細胞の製造方法や、
（９）ＥＴＶ２遺伝子がヒトＥＴＶ２遺伝子であり、ＥＴＶ２タンパク質がヒトＥＴＶ２タンパク質であり、線維芽細胞がヒト線維芽細胞であることを特徴とする上記（１）〜（８）のいずれかに記載の血管内皮細胞の製造方法や、
（１０）線維芽細胞が、皮膚線維芽細胞であることを特徴とする上記（１）〜（９）のいずれかに記載の血管内皮細胞の製造方法に関する。

また、本発明は、（１１）上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の血管内皮細胞の製造方法により製造される血管内皮細胞に関する。

さらに、本発明は、（１２）上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の血管内皮細胞の製造方法により製造される血管内皮細胞を含有する血管新生促進剤に関する。

本発明によれば、線維芽細胞からｉＰＳＣを経由せずに血管内皮細胞を製造することができるため、比較的短期間で簡便かつ多量に、しかも低コストで血管内皮細胞を製造することができる。例えば、線維芽細胞からｉＰＳＣを経由して血管内皮細胞を製造する場合、通常約５−６ヶ月の期間を要するが、本発明によれば、線維芽細胞から約１ヶ月間程度で血管内皮細胞を製造することが可能となる。

また、本発明の製造方法では、多能性状態の細胞を用いず、また、がん原遺伝子としても知られるｃ−Ｍｙｃ遺伝子も用いないため、ＥＳＣやｉＰＳＣを用いる場合に懸念される発がん性の問題もない。

また、本発明の製造方法により得られた血管内皮細胞を投与する対象の組織から採取した線維芽細胞を本発明の製造方法に用いれば、その対象に投与した際に拒絶反応が生じない血管内皮細胞を作製することができる。

また、本発明の製造方法により製造された血管内皮細胞は、生体内で機能的な血管構造を形成し、また、虚血部位の血流を有意に回復し得るなど、生体内で優れた機能を発揮することができる。

図１Ａは、１８種類のヒト転写因子（ＥＲＧ、ＥＴＶ２、ＦＬＩ１、ＦＯＸＣ２、ＧＡＴＡ２、ＨＨＥＸ、ＨＯＰＸ、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＢ４、ＫＬＦ４、ＬＭＯ２、ＭＥＦ２Ａ、ＭＥＩＳ１、ＲＵＮＸ１、ＳＯＸ４、ＴＡＬ１、ＴＣＦ４、及びＶＥＺＦ１）（以下、「１８ＴＦ」ともいう）発現レンチウイルスベクターを導入した後、後述の［細胞培養］の４）の記載の方法にしたがって、本件ＥＧＭ−２培地中で該細胞の培養を、導入から１４日後まで行ったヒト繊維芽細胞（ヒト胎児肺線維芽細胞［Human fetal lung fibroblast-1；ＨＦＬ-１細胞］）について、ＣＤ３１、Ｖｅｎｕｓ、及びＶＥＧＦ−Ｒ２の発現を解析した結果を示す図である。図１Ａの上段の四角で囲った箇所は、ＣＤ３１陽性（^＋）Ｖｅｎｕｓ^＋ＨＦＬ−１細胞（全細胞中１．３５％）を示す。図１Ａの下段グラフ中の右側のピークは、ＣＤ３１^＋Ｖｅｎｕｓ^＋ＨＦＬ−１細胞を示し、左側のピークはＣＤ３１⁻Ｖｅｎｕｓ^＋ＨＦＬ−１細胞を示す。図１Ｂは、上記ＣＤ３１^＋Ｖｅｎｕｓ^＋ＨＦＬ−１細胞を位相差顕微鏡（上段）及び蛍光顕微鏡（下段）で観察した結果を示す図である（スケールバーは５０μｍを示す）。図１Ｃは、上記ＣＤ３１^＋Ｖｅｎｕｓ^＋ＨＦＬ−１細胞の毛細血管様構造形成能を解析した結果を示す図である（スケールバーは３００μｍを示す）。 図２Ａは、１８ＴＦＤＮＡを検出するためのプライマーセットがアニールする部位を模式的に示す図である。図２Ｂ及びＣは、１８ＴＦ発現レンチウイルスベクターを導入し、その後本件ＥＧＭ−２培地中で培養したＨＦＬ-１細胞から得られたＣＤ３１^＋細胞について遺伝子解析した結果を示す図である。図中「Ｍ」はＤＮＡサイズマーカーを示し、図中の数値は塩基対（ｂｐ）の長さを示す。図２Ｄは、ＨＯＰＸ発現レンチウイルスベクター又はＥＴＶ２発現レンチウイルスベクターを導入し、その後本件ＥＧＭ−２培地中で培養したＨＦＬ-１細胞について、ＣＤ３１の発現を解析した結果を示す図である。縦軸は、全細胞に対するＣＤ３１^＋ＨＦＬ−１細胞の割合を示す（平均値±標準偏差、［ｎ＝４］）。図２Ｅは、ＥＴＶ２発現レンチウイルスベクターを導入したヒト新生児皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ細胞）について、ＣＤ３１及びＶｅｎｕｓの発現を解析した結果を示す図である。図の四角で囲った箇所はＣＤ３１^＋Ｖｅｎｕｓ^＋ＮＢ１ＲＧＢ細胞（全細胞中１．８０％）を示す。 図３Ａは、ＨＡタグを付加した５種類のＥＴＶ２（全長ＥＴＶ２、ＥＴＳドメイン［２３９〜３２３番目アミノ酸領域］欠失ＥＴＶ２［ΔＥＴＳ］、ＴＡＤ［１〜１６２番目アミノ酸領域］欠失ＥＴＶ２［ΔＴＡＤ］、ＴＡＤのＮ末端側領域［１〜８１番目アミノ酸領域］欠失ＥＴＶ２［ΔＴＡＤＮ］、及びＴＡＤのＣ末端側領域［８１〜１６２番目アミノ酸領域］欠失ＥＴＶ２［ΔＴＡＤＣ］）を模式的に示した図である。図３Ｂは、ＨＡタグを付加した上記５種類のＥＴＶ２を発現する各レンチウイルスベクターを導入した初代ヒト成人皮膚線維芽細胞（ＨＡＦｓ細胞）について、ＣＤ３１及びＶＥＧＦ−Ｒ２の発現を解析した結果を示す図である。 図４Ａは、ＥＴＶ２発現レンチウイルスベクターを導入した後、後述の［細胞培養］の４）の記載の方法にしたがって、本件ＥＧＭ−２培地中で該細胞の培養を行ったＨＡＦｓ細胞について、導入後１５日及び２５日目にＣＤ３１の発現を解析した結果を示す図である。左図の四角で囲った箇所は、導入後１５日目におけるＣＤ３１^＋Ｖｅｎｕｓ^＋ＨＡＦｓ細胞（全細胞中３．４±０．６％）を示し、右図の四角で囲った箇所は、かかるＣＤ３１^＋Ｖｅｎｕｓ^＋ＨＡＦｓ細胞を選別し、さらに１０日間培養後（導入後２５日目）のＣＤ３１^＋Ｖｅｎｕｓ^＋ＨＡＦｓ細胞（全細胞中９５．３±３．２％）を示す。図４Ｂは、ＥＴＶ２発現レンチウイルスベクターを導入したＨＡＦｓ細胞について、導入後１５日、２５日及び３２日目にＣＤ３１^＋Ｖｅｎｕｓ^＋ＨＡＦｓ細胞数を計測した結果を示す図である（平均値±標準偏差、［ｎ＝３］）。図４Ｃは、ＥＴＶ２発現レンチウイルスベクターを導入した後、後述の［細胞培養］の４）の記載の方法にしたがって、本件ＥＧＭ−２培地中で該細胞の培養を行ったＨＡＦｓ細胞について、導入後３２日目に細胞の形態を位相差顕微鏡で解析した結果である。上段が低倍率画像（スケールバーは５０μｍを示す）を示し、下段が高倍率画像（スケールバーは５０μｍを示す）を示す。図４Ｄは、ＥＴＶ２発現レンチウイルスベクターを導入した後、後述の［細胞培養］の４）の記載の方法にしたがって、本件ＥＧＭ−２培地（ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦ添加；ＶＦ［＋］）、又はＥＧＭ−２培地（ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦ無添加；ＶＦ［−］）中で該細胞の培養を行ったＨＡＦｓ細胞について、導入後１５日目にＣＤ３１^＋ＶＥＧＦ−Ｒ２^＋ＨＡＦｓ細胞を解析した結果を示す図である。右図の縦軸は、ＣＤ３１^＋ＶＥＧＦ−Ｒ２^＋ＨＡＦｓ細胞数を示す（平均値±標準偏差、［ｎ＝４］）。また、右図中の「＊＊」は、統計的（スチューデントのt検定）に有意差（Ｐ＜０．０１）があることを示す。 図５Ａは、ＥＴＶ２発現レンチウイルスベクターを導入した後、後述の［細胞培養］の４）の記載の方法にしたがって、本件ＥＧＭ−２培地中で該細胞の培養を行ったＨＡＦｓ細胞について、導入後３２日目にＥＴＶ２遺伝子のｍＲＮＡの発現の他、８種類のＶＥＣマーカー遺伝子（ＥＲＧ、ＦＬＩ１、ＴＡＬ１、ＰＥＣＡＭ１、ＣＤＨ５、ＥＧＦＬ７、ＫＤＲ、及びｖＷＦ）のｍＲＮＡの発現や、繊維芽細胞マーカー遺伝子（ＣＯＬ１Ａ２）のｍＲＮＡの発現を解析した結果を示す図である。縦軸には、上記１０種類の遺伝子のｍＲＮＡの発現量をＨＰＲＴ１遺伝子のｍＲＮＡの発現量に対する相対値として示す（平均値±標準偏差、［ｎ＝３］）。各遺伝子における３つの棒グラフは、左から順にＨＡＦｓ細胞、ＥＴＶ２発現レンチウイルスベクターを導入したＨＡＦｓ細胞、及びヒト臍帯静脈内皮細胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells；ＨＵＶＥＣ）から得られた結果を示す。図５Ｂ〜Ｄは、ＥＴＶ２発現レンチウイルスベクターを導入したＨＡＦｓ細胞について、導入後３２日目にｖＷＦ（図５Ｂの右パネル）やVE-cadherinの発現（図５Ｂの左パネル）や、ＡｃＬＤＬの取り込み活性（図５Ｃ）や、毛細血管様構造形成能（図５Ｄ）を解析した結果を示す図である（図５Ｃ；スケールバーは５０μｍを示す）（図５Ｄ；スケールバーは３００μｍを示す）。 図６Ａは、ＨＡＦｓ細胞における、ＦＯＸＣ１及びＦＯＸＣ２のｍＲＮＡ発現を示す図である。図６Ｂは、ＦＯＸＣ２のｓｈＲＮＡを発現するＨＡＦｓ細胞へ、上記［繊維芽細胞への遺伝子導入法］の項目に記載の方法にしたがって、ＥＴＶ２を発現するレンチウイルスベクターを導入し、その後、上記［細胞培養］の４）の記載の方法にしたがって、本件ＥＧＭ−２培地中で該細胞の培養を行い、導入から１５日後にセルソーター（FACSAria II［BD biosciences社製］）を用いて選別したＶｅｎｕｓ^＋細胞（ＦＯＸＣ２遺伝子ノックダウン細胞）における、ＥＲＧ遺伝子（ＶＥＣマーカー遺伝子の１種）、ＥＴＶ２遺伝子、ＦＬＩ１遺伝子（ＶＥＣマーカー遺伝子の１種）、ＦＯＸＣ２遺伝子のｍＲＮＡの発現を解析した結果を示す図である。また、ＦＯＸＣ２のｓｈＲＮＡに代えて、コントロールのｓｈＲＮＡを用いて得たコントロール細胞についても同様の解析を行った結果を示す。縦軸には、上記４種類の遺伝子のｍＲＮＡの発現量をＨＰＲＴ１遺伝子のｍＲＮＡの発現量に対する相対値として示す（平均値±標準偏差、［ｎ＝３］）。各遺伝子に関する２つの棒グラフは、左の棒グラフがＦＯＸＣ２遺伝子ノックダウン細胞の結果を示し、右の棒グラフがコントロール細胞の結果を示す。図中の「＊」は、統計的（スチューデントのt検定）に有意差（Ｐ＜０．０１）があることを示す。図６Ｃは、ＦＯＸＣ２遺伝子ノックダウン細胞（図６右パネル）及びコントロール細胞（図６左パネル）において、ＣＤ３１の発現を解析した結果を示す図である。両パネルにおいて、横軸はＣＤ３１の蛍光シグナルを表し、縦軸は細胞の側方散乱を表す。両パネル中の数値は、Ｖｅｎｕｓ^＋の細胞中のＣＤ３１^＋細胞の割合（％）を表す。 図７は、ＥＴＶ２により誘導したＣＤ３１^＋Ｖｅｎｕｓ^＋ＨＡＦｓ細胞を、マウスに皮下移植した結果を示す図である（スケールバーはすべて５０μｍを示す）。図７Ａは、移植後２８日目に、移植部位のヒト（ｈ）ＣＤ３４の発現を解析した結果を示す。また、図７Ｂは、移植後２８日目に、移植部位のハリエニシダアグルチニン−Ｉ（ＵＥＡＩ：Ulex europaeus agglutinin I）の局在を解析した結果を示す。また、図７Ｃは、移植後２８日目に、移植部位のｈＣＤ３４及びα−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）の発現を解析した結果を示す。なお、図７ＢやＣにおける白矢印は、赤血球を含有する血管であることを示し、この血管内の球状の粒は赤血球を示す。また、図７Ｄは、移植後４２日目に、移植部位のｈＣＤ３４及びα−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）の発現を解析し、立体画像を作成した結果を示す。また、図７Ｅは、移植後２８日目に、移植部位のｈＣＤ３４及び内皮一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）の発現を解析した結果を示す。 図８は、ＥＴＶ２により誘導したＣＤ３１^＋Ｖｅｎｕｓ^＋ＨＡＦｓ細胞を、後肢虚血モデルマウスの後肢虚血部位に移植した結果を示す図である。図８Ａは、移植後１４日目の後肢虚血部位を示す図である。また、図８Ｂは、移植後１４日目の後肢虚血部位をヘマトキシリン・エオシン染色した結果を示す図である。また、図８Ｃ及びＤは、移植後１４日目の後肢虚血部位をレーザードップラー画像解析した結果を示す図である。図８Ｄの縦軸は、後肢虚血モデルマウスの後肢虚血部位における血流を同じマウスの非虚血後肢における血流も対する相対値として示す（平均値±標準偏差、［ＰＢＳ溶液移植群；ｎ＝１０、ＨＡＦｓ細胞移植群；ｎ＝１０、ＥＴＶ２により誘導したＣＤ３１^＋Ｖｅｎｕｓ^＋ＨＡＦｓ細胞移植群；ｎ＝６］）。また、図８Ｄ中の「＊」及び「＊＊」は、それぞれ統計的に有意差（Ｐ＜０．０５及びＰ＜０．０１）があることを示す。なお、統計処理は、両側スチューデントのt検定（Student's t-test）又は片側ＡＮＯＶＡ検定を用いて行った。図８Ｅは、移植後１４日目の後肢虚血部位のｈＣＤ３４の発現を解析した結果を示す図である（スケールバーは５０μｍを示す）。

本発明の血管内皮細胞の製造方法としては、ＥＴＶ２遺伝子又はＥＴＶ２タンパク質を線維芽細胞に導入する工程（Ｐ）、及び、ＥＴＶ２遺伝子又はＥＴＶ２タンパク質が導入された線維芽細胞を血管内皮細胞増殖用培地で培養する工程（Ｑ）を有する方法である限り特に制限されず、ここで「培地」とは、細胞を培養できる「培地成分」に水を添加した状態のものをいう。本発明の作用機序の詳細は不明であるが、導入したＥＴＶ２遺伝子から発現したＥＴＶ２タンパク質、又は、導入したＥＴＶ２タンパク質が、線維芽細胞内で転写因子として作用することにより、線維芽細胞を、血管内皮細胞へ分化し得る系統の細胞に直接的に転換するものと考えられる。

本発明におけるＥＴＶ２遺伝子としては、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＥＴＶ２活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＥＴＶ２活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＥＴＶ２活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＥＴＶ２活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
のいずれかのポリヌクレオチドからなるＥＴＶ２遺伝子であれば特に制限されず、また、本発明におけるＥＴＶ２タンパク質としては、
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＥＴＶ２活性を有するタンパク質；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＥＴＶ２活性を有するタンパク質；のいずれかのタンパク質であれば特に制限されず、ここで、「ＥＴＶ２活性を有するタンパク質」とは、そのタンパク質、又はそのタンパク質をコードする遺伝子を線維芽細胞に導入し、次いで、該細胞を血管内皮細胞増殖用培地で培養した場合に、血管内皮細胞を製造し得るタンパク質を意味する。

上記の配列番号１はヒトＥＴＶ２遺伝子のヌクレオチド配列を表し、上記の配列番号２はヒトＥＴＶ２タンパク質のアミノ酸配列を表す（GenBankアクセッションナンバーNM_014209.2）。ＥＴＶ２の配列データは、ヒト以外の様々な脊椎動物でもすでに公知となっており、GenBankのような公共のデータバンクに開示されている。例えばマウスについてはNM_007959.2、モルモットについてはXM_003466622.2、ヤギについてはXM_005692503.1、イノシシについてはXM_005664531.1、ハイイロオオカミについてはXM_005616699.1、カニクイザルについてはXM_005588874.1、ウシについてはNM_001191317.1、ウマについてはXM_001915107.3、アフルカツメガエルについてはNM_001096131.1、ゼブラフィッシュについてはNM_001037375.1に、ＥＴＶ２の配列データが開示されている。

上記「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜３０個の範囲内、好ましくは１〜２０個の範囲内、より好ましくは１〜１５個の範囲内、さらに好ましくは１〜１０個の範囲内、より好ましくは１〜５個の範囲内、さらに好ましくは１〜３個の範囲内、より好ましくは１〜２個の範囲内の数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味し、また、上記「１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列」とは、例えば１〜４０個の範囲内、好ましくは１〜３０個の範囲内、より好ましくは１〜２０個の範囲内、さらに好ましくは１〜１５個の範囲内、より好ましくは１〜１０個の範囲内、より好ましくは１〜５個の範囲内、さらに好ましくは１〜３個の範囲内、より好ましくは１〜２個の範囲内の数のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列を意味する。

例えば、これら１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド（変異ポリヌクレオチド）は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらポリヌクレオチドに変異を導入することにより、変異ポリヌクレオチドを取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Molecular Cloning: Alaboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,NY.,1989.以後 "モレキュラークローニング第２版" と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38,John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ポリヌクレオチドを適切な発現系を用いて発現させることにより、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。

上記「配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列」とは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列との同一性が８０％以上であれば特に制限されるものではなく、好ましくは８５％以上、より好ましくは８８％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上であることを含んでいる。

上記「配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列」とは、配列番号２に示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であれば特に制限されるものではなく、好ましくは８５％以上、より好ましくは８８％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上であることを含んでいる。

上記のＥＴＶ２遺伝子の取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、配列番号１や２に示されるヒトのＥＴＶ２の配列情報や、他の生物種の公知のＥＴＶ２の配列情報に基づいて適当なオリゴヌクレオチドをプローブもしくはプライマーとして合成し、ヒト等の脊椎動物の細胞・組織由来のｍＲＮＡ、ｃＤＮＡもしくはｃＤＮＡライブラリーから、ハイブリダイゼーション法や（ＲＴ−）ＰＣＲ法（モレキュラークローニング第２版に記載の方法等）を用いてヒト等の脊椎動物のＥＴＶ２のｃＤＮＡをクローニングし、ヒト等の脊椎動物のＥＴＶ２遺伝子を取得する方法のほか、常法に従って化学合成により調製することもできる。また、取得したＥＴＶ２遺伝子又はその一部をプローブとして用いたハイブリダイゼーション法などにより、そのＥＴＶ２遺伝子の由来する脊椎動物とは別の種類の脊椎動物からＥＴＶ２遺伝子を取得することもできる。

上記のＥＴＶ２タンパク質の取得方法や、調製方法は特に限定されず、天然由来のタンパク質でも、化学合成したタンパク質でも、遺伝子組換え技術により作製した組み換えタンパク質の何れでもよい。天然由来のタンパク質を取得する場合には、かかるタンパク質を発現している細胞又は組織からタンパク質の単離・精製方法を適宜組み合わせることにより、本発明のタンパク質を取得することができる。化学合成によりタンパク質を調製する場合には、例えば、Fmoc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、tBoc法(t−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法に従って本発明のタンパク質を合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のタンパク質を合成することもできる。遺伝子組換え技術によりＥＴＶ２タンパク質を調製する場合には、該ＥＴＶ２タンパク質をコードするポリヌクレオチド（ヒトＥＴＶ２であれば、配列番号１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド）を好適な発現系に導入することにより本発明のタンパク質を調製することができる。これらの中でも、比較的容易な操作でかつ大量に調製することが可能な遺伝子組換え技術による調製が好ましい。

例えば、遺伝子組換え技術によって、本発明におけるＥＴＶ２タンパク質を調製する場合、かかるタンパク質を細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本発明におけるＥＴＶ２タンパク質に対するモノクローナル抗体等の抗体を結合させたカラムや、上記本発明におけるＥＴＶ２タンパク質に通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、これらのタンパク質の精製物を得ることができる。また、本発明におけるＥＴＶ２タンパク質が細胞膜に発現している場合は、細胞膜分解酵素を作用させた後、上記の精製処理を行うことにより精製標品を得ることができる。

さらに、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質や、配列番号２に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号１や２に示されるヒトのＥＴＶ２の配列情報や、他の生物種の公知のＥＴＶ２の配列情報に基づいて、当業者であれば適宜調製又は取得することができる。例えば、配列番号１や２に示されるヒトのＥＴＶ２の配列情報や、他の生物種の公知のＥＴＶ２の配列情報に基づいて適当なオリゴヌクレオチドをプローブもしくはプライマーとして合成し、ヒト等の脊椎動物の細胞・組織由来のｍＲＮＡ、ｃＤＮＡもしくはｃＤＮＡライブラリーから、ハイブリダイゼーション法や（ＲＴ−）ＰＣＲ法（モレキュラークローニング第２版に記載の方法等）を用いてヒト等の脊椎動物のＥＴＶ２のｃＤＮＡをクローニングし、ヒト等の脊椎動物のＥＴＶ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを取得する。また、かかるポリヌクレオチドをプローブとして用いたハイブリダイゼーション法などにより、そのポリヌクレオチドが由来する脊椎動物とは別の種類の脊椎動物からＥＴＶ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを取得することもできる。このようにして得られたＥＴＶ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込んだ後、適当な宿主細胞に導入して培養し、培養した細胞又はその馴化培地から組換えタンパク質を回収することにより、ヒト等の脊椎動物由来のＥＴＶ２タンパク質を取得することができる。

本発明におけるＥＴＶ２遺伝子を線維芽細胞へ導入する方法としては、本発明におけるＥＴＶ２遺伝子を線維芽細胞へ導入できる方法である限り特に制限されないが、該ＥＴＶ２遺伝子を発現し得る発現ベクターを線維芽細胞へ導入する方法を挙げることができる。発現ベクターの種類としては、例えば、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどのウイルスベクター、動物細胞発現プラスミドベクター（例、pA1-11，pXT1，pRc/CMV，pRc/RSV，pcDNAI/Neo）などを挙げることができ、中でもレンチウイルスベクターを好ましく挙げることができる。

上記のＥＴＶ２遺伝子を発現し得る発現ベクターにおいて、ＥＴＶ２遺伝子は、目的の線維芽細胞で機能し得るプロモーターに作動可能に連結されていることが好ましく、かかるプロモーターとしては、例えばＥＦ−１αプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）ＬＴＲ、ＨＳＶ−ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーター、ＣＡＧプロモーターなどを挙げることができ、中でも、ＥＦ−αプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲ、ＣＡＧプロモーターなどを好ましく挙げることができる。

上記の発現ベクターは、ＥＴＶ２遺伝子及びプロモーターの他に、所望によりエンハンサー、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー遺伝子、ＳＶ４０複製起点などを含有していてもよい。選択マーカー遺伝子としては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等を挙げることができる。

ＥＴＶ２遺伝子を発現し得る発現ベクターは、ベクターの種類に応じて、自体公知の手法により線維芽細胞に導入することができる。例えば、ウイルスベクターの場合、ＥＴＶ２遺伝子を含むプラスミドを適当なパッケージング細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞細胞など）に導入して、培養上清中に産生されるウイルスベクターを回収し、各ウイルスベクターに応じた適切な方法により、該ベクターを線維芽細胞に感染させることができる。例えば、ベクターとしてレンチウイルスベクターを用いる場合の具体的手段については、Science,318, 1917-1920 (2007)などを参照することができ、レトロウイルスベクターを用いる場合については、WO2007/69666、Cell, 126, 663-676 (2006) 及び Cell, 131, 861-872 (2007)などを参照することができ、アデノウイルスベクターを用いる場合については、Science, 322, 945-949 (2008)を参照することができる。

一方、ＥＴＶ２遺伝子を発現し得る発現ベクターが、非ウイルスベクターであるプラスミドベクターには、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）デキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法などを用いて該ベクターを線維芽細胞に導入することができる。

本発明におけるＥＴＶ２タンパク質を線維芽細胞へ導入する方法としては、本発明におけるＥＴＶ２タンパク質を線維芽細胞へ導入できる方法である限り特に制限されないが、例えば、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）−又は細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）−融合タンパク質を用いる方法、マイクロインジェクション法などを挙げることができる。タンパク質導入試薬としては、カチオン性脂質をベースとしたBioPOTER Protein Delivery Reagent（Gene Therapy Systmes社製）、Pro-JectTM Protein Transfection Reagent（PIERCE社製）及びProVectin（IMGENEX社製）、脂質をベースとしたProfect-1（Targeting Systems社製）、膜透過性ペプチドをベースとしたPenetrain Peptide（Q biogene社製）及びChariot Kit（Active Motif社製）、ＨＶＪエンベロープ（不活化センダイウイルス）を利用したGenomONE（石原産業社製）等が市販されている。導入はこれらの試薬に添付のプロトコルに従って行うことができるが、一般的な手順は以下の通りである。ＥＴＶ２タンパク質を適当な溶媒（例えば、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ等の緩衝液）に希釈し、導入試薬を加えて室温で５−１５分程度インキュベートして複合体を形成させ、これを無血清培地に交換した細胞に添加して３７℃で１ないし数時間インキュベートすることができる。その後培地を除去して血清含有培地に交換することができる。

上記のＰＤＴとしては、ショウジョウバエ由来のＡｎｔＰ（アンティナペディア）、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）由来のＴＡＴ(Frankel, A. et al, Cell 55,1189-93 (1988) 又は Green, M. & Loewenstein, P. M. Cell 55, 1179-88 (1988))、Penetratin (Derossi, D. et al, J. Biol. Chem. 269, 10444-50 (1994))、Buforin II (Park, C. B. etal. Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 8245-50 (2000))、Transportan (Pooga, M. et al. FASEB J. 12, 67-77 (1998))、MAP (model amphipathic peptide) (Oehlke, J. et al.Biochim. Biophys. Acta. 1414, 127-39 (1998)), K-FGF (Lin, Y. Z. et al. J. Biol.Chem. 270, 14255-14258 (1995))、Ku70 (Sawada, M. et al. Nature Cell Biol. 5, 352-7 (2003))、Prion (Lundberg, P. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 299, 85-90 (2002))、pVEC (Elmquist, A. et al. Exp. Cell Res. 269, 237-44 (2001))、Pep-1 (Morris, M. C. et al. Nature Biotechnol. 19, 1173-6 (2001))、Pep-7 (Gao, C. et al. Bioorg. Med. Chem. 10, 4057-65 (2002))、SynBl (Rousselle, C. et al. MoI. Pharmacol. 57, 679-86 (2000))、HN-I (Hong, F. D. & Clayman, G L. Cancer Res. 60, 6551-6 (2000))、及びＨＳＶ（単純ヘルペスウイルス）由来のＶＰ２２等のタンパク質の細胞通過ドメインを用いたものが開発されている。ＰＴＤ由来のＣＰＰとしては、11R (Cell Stem Cell, 4:381-384 (2009)) 及び 9R (Cell Stem Cell, doi:10.1016/j.stem.2009.05.005 (2009))のようなポリアルギニンが挙げられる。ＥＴＶ２タンパク質のｃＤＮＡとＰＴＤ又はＣＰＰ配列とを組み込んだ融合タンパク質発現ベクターを作製して組換え発現させ、融合タンパク質を回収して導入に用いることができる。この場合の導入は、タンパク質導入試薬を添加しない以外は上記と同様にして行うことができる。

上記のマイクロインジェクションは、先端径１μｍ程度のガラス針にタンパク質溶液を入れ、細胞に穿刺導入する方法であり、確実に細胞内にタンパク質を導入することができる。

本発明の製造方法に用いる上記線維芽細胞の種類としては、皮膚線維芽細胞、肺線維芽細胞、心臓線維芽細胞、大動脈外膜線維芽細胞、子宮線維芽細胞を挙げることができ、中でも、採取が比較的容易であることから皮膚線維芽細胞を好ましく挙げることができる。また、上記線維芽細胞の由来となる生物種としては、脊椎動物である限り特に制限されず、該脊椎動物としては、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、魚類等を挙げることができ、中でも、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、サル、ヒツジ、ヤギ、ブタ等の哺乳動物を好ましく挙げることができ、中でもヒトを特に好ましく挙げることができる。また、上記線維芽細胞は、株化細胞であってもよいし、組織から採取した細胞（初代培養細胞や継代培養細胞を含む）であってもよい。本発明に用いる線維芽細胞のより具体的な例として、初代ヒト成人皮膚線維芽細胞（ＨＡＦｓ細胞）、株化されたヒト胎児肺線維芽細胞（ＨＦＬ−１細胞）、株化されたヒト新生児皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ細胞）などを挙げることができる。

本発明の製造方法に用いる線維芽細胞は、Invitrogen社、Lonza社やPromoCell社やCELLAPPLICATIONS社や、RIKEN Bioresource Center CELL BANK、独立行政法人医薬基盤研究所 ＪＣＲＢ細胞バンクなどの企業や独立行政法人から市販又は分譲しているものを用いてもよいが、本発明の製造方法により得られた血管内皮細胞を投与する対象の組織から採取した線維芽細胞を本発明の製造方法に用いれば、その対象に投与した際に拒絶反応が生じない血管内皮細胞を作製することができるため、かかる線維芽細胞を好ましく挙げることができる。

線維芽細胞をドナー（採取源）の組織から採取、分離する方法としては、公知の方法などを用いることができ、例えば、ドナーから、線維芽細胞を含む組織を切り取り、該組織を粉砕し、次いで、トリプシン等の酵素を用いて該組織を単細胞に解離させる方法を挙げることができる。

本発明の製造方法に用いる血管内皮細胞増殖用培地としては、血管内皮細胞を増殖及び維持できる培地である限り特に制限されないが、血管内皮細胞を一定期間生存させ得る血管内皮細胞基本培地に、血管内皮細胞添加因子が添加された培地を好ましく挙げることができる。かかる内皮細胞添加因子としては、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）、ＥＧＦ（上皮成長因子）、ヒドロコルチゾン、ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）（ＦＣＳとも表示する。）、Ｒ３−ＩＧＦ（インシュリン様成長因子）−１、アスコルビン酸、ヘパリン、ゲンタマイシン、アンホテリシン−Ｂからなる群から選ばれる１種又は２種以上を挙げることができ、中でも、少なくともＶＥＧＦ及びｂＦＧＦを用いることを好ましく挙げることでき、中でも、ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦに加えて、ＥＧＦ、ヒドロコルチゾン、ＦＢＳ、Ｒ３−ＩＧＦ−１、アスコルビン酸、ヘパリン、ゲンタマイシン、アンホテリシン−Ｂからなる群から選ばれる１種又は２種以上を用いることをより好ましく挙げることでき、中でも、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ及びＦＢＳを少なくとも用いることをさらに好ましく挙げることでき、中でも、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＦＢＳ、ヒドロコルチゾン、Ｒ３−ＩＧＦ−１、アスコルビン酸、ヘパリン（併せて以下、「８種類の添加因子」とも表示する。）を少なくとも用いることをさらにより好ましく挙げることでき、上記１０種類の添加因子を全て用いることをさらにより好ましく挙げることができる。また、上記ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、Ｒ３−ＩＧＦ−１の由来としては、ヒトでなくてもよいが、ヒトであることが好ましい。

上記の内皮細胞添加因子は、ＥＧＭ（登録商標）−２ Single Quots（登録商標）（Lonza社製）や、Endothelial cell growth medium, advanced（provitro社製）など、市販されているものを用いることができる。なお、上記ＥＧＭ−２ Single Quots（Lonza社製）は上記１０種類の添加因子を含んでおり、上記Endothelial cell growth medium, advanced（provitro社製）は、上記８種類の添加因子を含んでおり、任意成分として、ゲンタマイシン、アンホテリシン−Ｂを挙げている。Endothelial cell growth medium, advanced（provitro社製）の各成分の濃度は、ＶＥＧＦが０．５ｎｇ／ｍＬ、ｂＦＧＦが１０ｎｇ／ｍＬ、ＥＧＦが５ｎｇ／ｍＬ、ＦＢＳが２％、ヒドロコルチゾンが０．２μｇ／ｍＬ、Ｒ３−ＩＧＦ−１が２０ｎｇ／ｍＬ、アスコルビン酸が１μｇ／ｍＬ、ヘパリンが２２．５μｇ／ｍＬ、ゲンタマイシン（任意）が５０μｇ／ｍＬ、アンホテリシン−Ｂ（任意）が５０ｎｇ／ｍＬである。

上記の血管内皮細胞増殖用培地中の各内皮細胞添加因子の濃度としては、ＥＴＶ２遺伝子又はＥＴＶ２タンパク質を導入した線維芽細胞をその培地で培養することによって、血管内皮細胞を製造し得る限り特に制限されず、例えば、市販の内皮細胞添加因子の濃度と同等の濃度であってもよいが、ＶＥＧＦとｂＦＧＦについてはより高い濃度とすると、線維芽細胞から血管内皮細胞への製造効率が上がる点で好ましい。上記の血管内皮細胞増殖用培地中の各内皮細胞添加因子の好ましい濃度範囲として、それぞれ以下の濃度範囲を挙げることができる。
ＶＥＧＦ：好ましくは０．３ｎｇ／ｍＬ〜１０５ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２．１ｎｇ／ｍＬ〜５２．５ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは５．２５ｎｇ／ｍＬ〜２１ｎｇ／ｍＬ、さらにより好ましくは８．４ｎｇ／ｍＬ〜１２．６ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは１０．５ｎｇ／ｍＬ。
ｂＦＧＦ：好ましくは２ｎｇ／ｍＬ〜２００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは４ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ〜４０ｎｇ／ｍＬ、さらにより好ましくは１６ｎｇ／ｍＬ〜２４ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ。
ＥＧＦ：好ましくは０．５ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１ｎｇ／ｍＬ〜２５ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは２．５ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬ、さらにより好ましくは４ｎｇ／ｍＬ〜６ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは５ｎｇ／ｍＬ。
ＦＢＳ：好ましくは０．２％〜２０％、より好ましくは０．４％〜１０％、さらに好ましくは１％〜４％、さらにより好ましくは１．６％〜２．４％、特に好ましくは２％。ヒドロコルチゾン：好ましくは０．０２μｇ／ｍＬ〜２μｇ／ｍＬ、より好ましくは０．０４μｇ／ｍＬ〜１μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは０．１μｇ／ｍＬ〜０．４μｇ／ｍＬ、さらにより好ましくは０．１６μｇ／ｍＬ〜０．２４μｇ／ｍＬ、特に好ましくは０．２μｇ／ｍＬ。
Ｒ３−ＩＧＦ−１：好ましくは２ｎｇ／ｍＬ〜２００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは４ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ〜４０ｎｇ／ｍＬ、さらにより好ましくは１６ｎｇ／ｍＬ〜２４ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ。
アスコルビン酸：好ましくは０．１μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬ、より好ましくは０．２μｇ／ｍＬ〜５μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは０．５μｇ／ｍＬ〜２μｇ／ｍＬ、さらにより好ましくは０．８μｇ／ｍＬ〜１．２μｇ／ｍＬ、特に好ましくは１μｇ／ｍＬ。
ヘパリン：好ましくは２．２５μｇ／ｍＬ〜２２５μｇ／ｍＬ、より好ましくは４．５μｇ／ｍＬ〜１１２．５μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１１．２５μｇ／ｍＬ〜４５μｇ／ｍＬ、さらにより好ましくは１８μｇ／ｍＬ〜２７μｇ／ｍＬ、特に好ましくは２２．５μｇ／ｍＬ。
ゲンタマイシン：好ましくは５μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ、より好ましくは１０μｇ／ｍＬ〜２５０μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは２５μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬ、さらにより好ましくは４０μｇ／ｍＬ〜６０μｇ／ｍＬ、特に好ましくは５０μｇ／ｍＬ。
アンホテリシン−Ｂ：好ましくは５ｎｇ／ｍＬ〜５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ〜２５０ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは２５ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬ、さらにより好ましくは４０ｎｇ／ｍＬ〜６０ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ。

上記の血管内皮細胞基本培地としては、血管内皮細胞を一定期間生存させ得る培地である限り特に制限されないが、例えば、１又は２種類以上の糖（類）と、１又は２種類以上の無機塩（類）、１又は２種類以上のアミノ酸（類）、及び１又は２種類以上のビタミン（類）、及び１又は２種類以上のその他成分を含むことが好ましい。

上記糖類としては、具体的には、グルコース、ラクトース、マンノース、フルクトース、ガラクトース等の単糖類や、スクロース、マルトース、ラクトース等の二糖類を挙げることができるが、中でもグルコースが特に好ましく、これら糖類は、１又は２以上組み合わせて添加することもできる。

上記無機塩類としては、具体的には、塩化カルシウム、硝酸カルシウム、硫酸銅五水和物、硝酸鉄(III)九水和物、硫酸鉄(II)七水和物、塩化マグネシウム六水和物、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム二水和物、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム一水和物、リン酸二水素ナトリウム二水和物、亜セレン酸ナトリウム五水和物、硫酸亜鉛七水和物から選ばれる１種又は２種以上の無機塩（類）を挙げることができるが、線維芽細胞からの血管内皮細胞の製造に有利に作用する成分であればいずれの無機塩類又はその組合せも用いることができる。

上記アミノ酸類としては、具体的には、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、シスチン、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、グルタミン酸、ヒドロキシプロリン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン等から選ばれる１種又は２種以上のアミノ酸（類）、好ましくはＬ−体のアミノ酸とそれらの誘導体及びそれらの塩並びにそれらの水和物などの派生物を挙げることができる。例えば、上記アルギニンとしては、Ｌ−塩酸アルギニン、Ｌ−アルギニン一塩酸塩等のアルギニンの派生物を挙げることができ、上記アスパラギン酸としては、Ｌ−アスパラギン酸ナトリウム塩一水和物、Ｌ−アスパラギン酸一水和物、Ｌ−アスパラギン酸カリウム、Ｌ−アスパラギン酸マグネシウム等のアスパラギン酸の派生物を挙げることができ、上記システインとしては、Ｌ−システイン二塩酸塩、Ｌ-システイン塩酸塩一水和物等のシステインの派生物や、Ｌ−リジン塩酸塩等のリジンの派生物を挙げることができ、上記グルタミン酸としては、Ｌ−グルタミン酸一ナトリウム塩等のグルタミンの派生物を挙げることができ、上記アスパラギンとしては、Ｌ−アスパラギン一水和物等のアスパラギンの派生物を挙げることができ、上記チロシンとしては、Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物等のチロシンの派生物を挙げることができ、上記ヒスチジンとしては、ヒスチジン塩酸塩、ヒスチジン塩酸塩一水和物等のヒスチジンの派生物を挙げることができ、上記リジンとしては、Ｌ−リジン塩酸塩等のリジンの派生物を挙げることができる。

上記ビタミン類としては、具体的には、ビオチン、コリン、葉酸、イノシトール、ナイアシン、パントテン酸、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、ビタミンＢ１２、パラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、アスコルビン酸から選択される１種又は２種以上のビタミン（類）と、これらの成分各々の誘導体及びそれらの塩並びにそれらの水和物などの派生物を挙げることができる。例えば、上記コリンとしては、塩化コリン等のコリンの派生物を挙げることができ、ナイアシンとしては、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ニコチニックアルコール等のナイアシンの派生物を挙げることができ、パントテン酸としては、パントテン酸カルシウム、パントテン酸ナトリウム、パンテノール等のパントテン酸の派生物を挙げることができ、ピリドキシンとしては、ピリドキシン塩酸塩、ピリドキサール塩酸塩、リン酸ピリドキサール、ピリドキサミン等のピリドキシンの派生物を挙げることができ、チアミンとしては、塩酸チアミン、硝酸チアミン、硝酸ビスチアミン、チアミンジセチル硫酸エステル塩、塩酸フルスルチアミン、オクトチアミン、ベンフォチアミン等のチアミンの派生物等を挙げることができ、アスコルビン酸としては、アスコルビン酸２−リン酸エステル（Ascorbic acid 2-phosphate）、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸硫酸ナトリウム、リン酸アスコルビルアミノプロピル、アスコルビン酸リン酸ナトリウム等のアスコルビン酸の派生物を挙げることができる。

上記その他成分としては、ＨＥＰＥＳ等の緩衝剤、ヌクレオチド等の核酸、ピルビン酸、及びその誘導体及びそれらの塩並びにそれらの水和物などの派生物、フェノールレッドなどを挙げることができ、上記ヌクレオチドとしては、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、好ましくはこれら４種の等モル混合物）を好ましく挙げることができ、あるいは、ペニシリン-ストレプトマイシン溶液を好ましく挙げることができ、ピルビン酸の派生物としてはピルビン酸ナトリウムを好ましく挙げることができる。

上記血管内皮細胞基本培地の具体例としては、市販のＥＢＭ（登録商標）‐２培地（Lonza社製）、ＥＢＭ培地（Lonza社製）、“Endothelial cell growth medium, basal”（provitro社製）、α改変イーグル培地（αＭＥＭ）（Invitrogen社製など）、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（Invitrogen社製など）、ＲＰＭＩ １６４０培地（Invitrogen社製など）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Invitrogen社製など）、最小必須培地（ＭＥＭ）（Invitrogen社製など）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）（Invitrogen社製など）などを好ましく挙げることができ、ＥＢＭ‐２培地（Lonza社製）、ＥＢＭ培地（Lonza社製）、“Endothelial cell growth medium, basal”（provitro社製）をより好ましく挙げることができ、ＥＢＭ‐２培地（Lonza社製）、“Endothelial cell growth medium, basal”（provitro社製）を特に好ましく挙げることができる。

本発明の製造方法に用いる好ましい血管内皮細胞増殖用培地の具体例としては、内皮細胞基本培地に、市販の内皮細胞添加因子（ＥＧＭ−２ Single Quots（Lonza社製）や、Endothelial cell growth medium, advanced（provitro社製））を添加した培地に、さらに１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦと１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加した培地を挙げることができ、中でも、上記内皮細胞基本培地としてＥＢＭ‐２（Lonza社製）を用い、内皮細胞添加因子としてＥＧＭ−２ Single Quots（Lonza社製）を用い、さらに１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦと１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加した培地（以下、「本件ＥＧＭ−２培地」とも表示する。）を特に好ましく挙げることができる。

本発明における培養条件としては、線維芽細胞を本発明に用いる血管内皮細胞増殖用培地で培養することにより血管内皮細胞を製造し得る限り特に制限されないが、培養温度として通常１２〜４５℃の範囲内、好ましくは１５〜４０℃の範囲内を挙げることができ、上記工程（Ｑ）における培養期間として通常４〜４０日間の範囲内、好ましくは６〜３０日間、より好ましくは２０〜３０日間の範囲内を挙げることができる。また、培養の際は、培養ディッシュ等の培養容器を、細胞外マトリックスでコーティングしたものを用いることが好ましく、該細胞外マトリックスとしては、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、マトリゲル（登録商標）（ベクトン・ディキンソン社製）などを挙げることができる。

本発明の製造方法は、培養している細胞中の血管内皮細胞の割合をより高め、血管内皮細胞を短期間でより多量に製造する観点から、工程（Ｐ）及び（Ｑ）に加えて、工程（Ｑ）で培養して得られる細胞から血管内皮細胞を分取する工程（Ｒ）をさらに有していることが好ましく、工程（Ｒ）で分取した血管内皮細胞を、血管内皮細胞増殖用培地で培養する工程（Ｓ）をさらに有していることがより好ましい。

上記工程（Ｒ）において、工程（Ｑ）で培養して得られる細胞から血管内皮細胞を分取する方法としては血管内皮細胞を分取することができる限り特に制限されないが、簡便性及び迅速性の観点から、工程（Ｑ）で培養して得られる細胞から血管内皮細胞マーカー陽性細胞を分取する方法を好ましく挙げることができ、中でも、血管内皮細胞マーカーを特異的に認識する抗体の免疫反応を利用した方法をより好ましく挙げることでき、中でも、フローサイトメーターを用いたフローサイトメトリー解析法をさらに好ましく挙げることでき、中でも、セルソーター付きのフローサイトメーターを用いたフローサイトメトリー解析法を特に好ましく挙げることができる。セルソーター付きのフローサイトメーターを用いると、工程（Ｑ）で培養して得られる細胞から、血管内皮細胞マーカー陽性細胞を非常に簡便かつ迅速に血管内皮細胞を分取することができる。フローサイトメトリー解析法についてはフローサイトメーターに付属しているプロトコールなどの標準的な方法を用いることができる。

上記の血管内皮細胞マーカーとしては特に制限されないが、ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ１）、ＶＥＧＦ−Ｒ２（ＫＤＲ）、ＣＤ３４、Ｔｉｅ２、Endoglin、ＮＲＰ１、ＣＸＣＲ４、ｖＷＦ、VE-cadherin、ＥＲＧ、ＦＬＩ１、ＴＡＬ１、ＣＤＨ５及びＥＧＦＬ７などを挙げることができ、中でも、ＣＤ３１を好ましく挙げることができる。用いる血管内皮細胞マーカーは１種のみでもよいし、２種以上併用してもよい。これらの血管内皮細胞マーカーに対する抗体は、BioLegend社、Abcam社、AbDserotec社などから購入したものを用いることができる。

上記の工程（Ｓ）としては、上記工程（Ｒ）で分取した血管内皮細胞を、血管内皮細胞増殖用培地で培養する限り特に制限されず、上記工程（Ｑ）の培養条件と同様の条件で培養することができ、該工程（Ｒ）における培養期間として、通常４〜４０日間の範囲内、好ましくは６〜３０日間、より好ましくは２０〜３０日間の範囲内を挙げることができる。

本発明の製造方法により得られる細胞が血管内皮細胞であるかどうかは、血管内皮細胞を特徴付ける１種又は２種以上の表現型を有しているかどうかを調べることによって確認することができる。かかる表現型としては、血管内皮細胞マーカー、血管内皮細胞に特徴的な形態、血管内皮細胞に特徴的な酵素活性などを挙げることができる。

血管内皮細胞マーカーを有しているかどうかは、前述したような、血管内皮細胞マーカーのタンパク質を特異的に認識する抗体の免疫反応を利用した方法のほか、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法などの、血管内皮細胞マーカーのｍＲＮＡの発現レベルを調べる方法によっても確認することができる。上記の血管内皮細胞マーカーの配列データは、ＧｅｎＢａｎｋのような公共のデータバンクから得ることができ、前述のノーザンブロット法やＲＴ−ＰＣＲ法は公知の標準的な方法で行うことができる。

上記の血管内皮細胞に特徴的な形態としては、丸石様形態（図１Ｂ参照）のほか、マトリゲルなどの細胞外マトリックスでコーティングした培養容器にて血管内皮細胞増殖用培地中に培養した場合（本願実施例中の［毛細血管様構造形成アッセイ］の記載参照）に形成される毛細血管様構造（図１Ｃ、図５Ｄ参照）や、マトリゲルなどの細胞外マトリックスと共に、マウス等の哺乳動物の側腹部等に皮下注射した場合（本願実施例中の［マトリゲルプラグアッセイ］の記載参照）に形成される血管構造（図７Ａ〜Ｄ参照）などを挙げることができる。

上記の血管内皮細胞に特徴的な酵素活性としては、アセチル化低密度リポタンパク質の取り込み活性や、内皮型一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）の活性などを挙げることができる。アセチル化低密度リポタンパク質（ＡｃＬＤＬ）の取り込み活性を調べるためのアッセイの方法としては常法を用いることができ、例えば、Ｉ型コラーゲンなどの細胞外マトリックスでコーティングした培養容器にて血管内皮細胞増殖用培地中に培養する際に、標識したＡｃＬＤＬを添加し、一定時間培養後の培地中のＡｃＬＤＬの減少量を測定することによって、ＡｃＬＤＬの取り込み活性を測定することができる。また、ｅＮＯＳ活性を測定する方法としては常法を用いることができ、例えば該細胞をホモジネートしたものと、標識アルギニン（アルギニンはｅＮＯＳの基質）とを反応させ、反応せずに残ったアルギニンの量を調べることによって、ｅＮＯＳ活性を測定することができる。なお、ｅＮＯＳの検出は、ｅＮＯＳ活性を測定する方法のほか、ｅＮＯＳを特異的に認識する抗体の免疫反応を利用した方法でも行うことができる。

本発明の製造方法により製造される血管内皮細胞（以下、「本発明の血管内皮細胞」とも表示する。）は、血管新生促進剤や血管新生促進用医薬組成物（以下、併せて「本発明の血管新生促進剤等」とも表示する。）として用いることもできる。本発明の血管新生促進剤等としては、本発明の血管内皮細胞のみを含有していてもよいが、薬学的に許容される担体をさらに含有していることが好ましい。かかる薬学的に許容される担体としては、本発明の血管内皮細胞による血管新生を妨げない限り特に制限されず、細胞外マトリックス、希釈剤、注入剤、塩、緩衝剤、安定剤および当技術分野において周知である他の材料を挙げることができ、中でも、細胞外マトリックスを好ましく挙げることができる。
なお、従来の成熟血管内皮細胞には、ＥＴＶ２遺伝子は発現していないか、あるいは発現しているとしても発現レベルが極めて低いため、本発明の血管内皮細胞がＥＴＶ２遺伝子の導入により得られた場合は、本発明の血管内皮細胞は、このような外来性のＥＴＶ２遺伝子を含む点で、従来の成熟血管内皮細胞とは異なる新規な血管内皮細胞である。また、本発明の血管内皮細胞がＥＴＶ２タンパク質の導入により得られた場合は、前述のような外来性のＥＴＶ２遺伝子は含まないが、例えばＤＮＡマイクロアレイなどを用いて多数の遺伝子の発現を解析し、その結果を従来の成熟血管内皮細胞と比較するなどして、本発明の血管内皮細胞に特徴的な発現プロファイルを見いだすことにより、従来の血管内皮細胞との差異を確認することができる。このような発現プロファイルの比較は、本発明の血管内皮細胞がＥＴＶ２遺伝子の導入により得られた場合にも用いることができ、本発明者らは、かかる本発明の血管内皮細胞において、ＨＯＸＡ３遺伝子の発現がＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）に比べて非常に低いことを確認している。

本発明の血管内皮細胞や血管新生促進剤等が予防、改善又は治療の対象とする症状や疾患としては、虚血性症状や、虚血性症状を伴う疾患である限り特に制限されず、例えば、１）事故や手術等による血管損傷や組織損傷等の外因的な要因による虚血性症状、２）心筋梗塞、狭心症、閉塞性動脈硬化症、バージャー病、脳梗塞、胸郭出口症候群、高安病、高血圧症等の内因的な要因による虚血性症状又は虚血性疾患などを挙げることができる。

本発明の血管内皮細胞や血管新生促進剤の投与方法としては、従来の血管内皮細胞や血管新生促進剤の投与方法を用いることができ、例えば、虚血性症状や、虚血性症状を伴う疾患を有する対象（生体）の虚血部位に、本発明の血管内皮細胞や血管新生促進剤をカテーテルや注射等により投与する方法を挙げることができる。

投与対象の生物種としては、前述したような脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを挙げることができる。本発明における血管内皮細胞を製造する際に用いた線維芽細胞の由来である脊椎動物の種類は、本発明における血管内皮細胞や血管新生促進剤の投与対象となる脊椎動物の種類と一致していることが、より優れた血管新生促進作用等を得る観点から好ましい。

投与量としては、対象の体重、症状や疾患の性質及び重篤度などに応じて適宜調節することができ、例えば血管内皮細胞の細胞数として、約１０^３〜１０^２０個の範囲内を挙げることができ、約１０^５〜１０^１５個の範囲内を好ましく挙げることができる。

また、本発明の血管内皮細胞や血管新生促進剤は、組織移植片や再生臓器を作製する際に、組織や臓器に分化し得る細胞と共に用いることにより、組織移植片や再生臓器に血管を付与又は血管新生を促進するためにも用いることができる。このように用いると、対象への移植に適した組織移植片や再生臓器の作製や維持を可能又は容易にすることができる。このような用途に用いる方法としては、例えば、組織移植片や再生臓器を形成し得るｉＰＳＣ等の細胞と、本発明の血管内皮細胞や血管新生促進剤とを共培養する方法（Takebe, T. et al., Nature, 499, 481-484 (2013)）などを挙げることができる。

なお、本発明には、以下の態様も含まれる。
「本発明の血管内皮細胞を脊椎動物に投与する工程を含む、血管新生の促進方法」や、「本発明の血管内皮細胞を脊椎動物に投与する工程を含む、虚血性症状又は虚血性症状を伴う疾患の予防、改善又は治療方法」や、「血管新生を促進するための、本発明の血管内皮細胞」や、「虚血性症状又は虚血性症状を伴う疾患予防、改善又は治療するための、本発明の血管内皮細胞」や、「血管新生促進剤の製造のための、本発明の血管内皮細胞の使用」や、「本発明の血管内皮細胞を含有する、虚血性症状又は虚血性症状を伴う疾患の予防、改善又は治療剤」。

以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

［細胞培養］
１）３種類のヒト繊維芽細胞（ＨＦＬ-１細胞［「RIKEN Bioresource Center CELL BANK」より入手］、ＮＢ１ＲＧＢ細胞［「RIKEN Bioresource Center CELL BANK」より入手］、及びＨＤＦａ（Human Dermal Fibroblasts, adult）細胞［Invitrogen社製］）の培養は、１０ｃｍディッシュ上、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Invitrogen社製）及びペニシリン並びにストレプトマイシンを含むα−ＭＥＭ（Invitrogen社製）培地中で行った。これらの細胞は、実験に用いる前に３回継代培養を行った。なお、上記ＨＤＦａは、本明細書において、ＨＡＦｓ（human adult skin fibroblasts）とも表示する。
２）ＨＵＶＥＣ（DS Pharma Biomedical社製）の培養は、１００μｇ／ｍＬ Ｉ型コラーゲン（新田ゼラチン社製）でコーティングした１０ｃｍディッシュ上、ＥＧＭ−２（Lonza社製）培地中で行った。
３）レンチウイルスベクター（組換えレンチウイルス）作製に用いるＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養は、１０％ＦＢＳ、２ｍＭＬ−グルタミン、及びペニシリン並びにストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ（Gibco社製）培地中で行った。
４）繊維芽細胞へのＥＴＶ２遺伝子導入後の細胞培養は、１００μｇ／ｍＬ Ｉ型コラーゲン（新田ゼラチン社製）でコーティングしたディッシュ（６ｃｍ又は１０ｃｍ径）上、１０ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＶＥＧＦ_１６５（Peprotech社製）及び１０ｎｇ／ｍＬ塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）（和光社製）を添加したＥＧＭ−２（Lonza社製）培地（以下、「本件ＥＧＭ−２培地」という）中で行った。培養期間は各実験で設定した期間にしたがった。培養期間中、２又は３日毎に培地交換を行った。

［繊維芽細胞への遺伝子導入法］
繊維芽細胞から血管内皮細胞（以下、「ＶＥＣ」ということがある）へ誘導するために必要な候補因子（遺伝子）として、これまでの知見や経験に基づき、１８種類の転写因子（ＴＦ：Transcription Factor）（表１参照）を選択し、１８種類のＴＦ（以下「１８ＴＦ」と表示する）を、レンチウイルスベクター（組換えレンチウイルス）を用いて繊維芽細胞へ導入した。具体的な方法を以下に示す。
まず、ＥＦ−１αプロモーターの下流に、ＭＣＳ（Multiple cloning site）、ＩＲＥＳ（internal ribosome entry sites）、及びＶｅｎｕｓ遺伝子が順次配置されたレンチウイルスベクター用のプラスミド（CSII-EF-MCS-IRES2-Venus）（RIKENより入手）のＭＣＳに、１８ＴＦのうちいずれかのＴＦのｃＤＮＡを挿入した。このレンチウイルスベクター用のプラスミドをＴＦの種類毎に作製した。各ＴＦについてのレンチウイルスベクター用のプラスミドを、ＶＳＶ−Ｇ（Vesicular Stomatitis Virus G glycoprotein）発現ベクター（pCMV-VSV-G-RSV-Rev）と、パッケージングベクター（pMDLg/p-RRE）とともにＨＥＫ２９３Ｔ細胞へ導入した。１８時間後に培養液を新しいＤＭＥＭに交換し、さらに４８時間培養後、レンチウイルスベクターを含む培養液を単離し、０．４５μｍフィルターで濾過した後、遠心処理（８４００ｇ、４℃、１６時間）によりレンチウイルスベクターを沈殿させ、ＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline）溶液に懸濁し、レンチウイルスベクター含有ＰＢＳ溶液を調製した。以上のような方法で、１８ＴＦのうちいずれかのＴＦを発現するレンチウイルスベクターを、１８種すべてのＴＦについて作製した。
続いて、３種類のヒト繊維芽細胞（ＨＦＬ−１細胞、ＮＢ１ＲＧＢ細胞、及びＨＡＦｓ細胞）を、１ウェル当たり７×１０^４細胞で１２ウェルプレートに播種し、２４時間後、５μｇ／ｍＬのプロタミンを添加した１ｍＬレンチウイルスベクター含有１０％ウシ胎仔血清含有α−ＭＥＭ培地にて培養し、細胞をレンチウイルスベクターに感染させた。ヒト線維芽細胞を、レンチウイルスベクター含有α−ＭＥＭ培地に最初に接触させた時点から４８時間後に、細胞をＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline）で２回洗浄した。なお、本明細書において、細胞に遺伝子あるいは発現ベクターを導入した時点とは、その遺伝子を含む発現ベクターをその細胞に最初に接触させた時点を意味するものとし、例えば「ウイルスベクター導入から１５日後」といった場合は、前述の時点から期間を起算する。

［フローサイトメトリー解析及びセルソーティング］
フローサイトメトリー解析に用いる細胞をトリプシン処理によりディッシュから剥離し、２％ＰＢＳ及び２ｍＭ ＥＤＴＡを含む溶液中に懸濁した後、蛍光色素（アロフィコシアニン［ＡＰＣ］又はフィコエリトリン［ＰＥ／Ｃｙ７］）でコンジュゲートした７種類のＶＥＣマーカーに対する抗体（抗ＣＤ３１抗体［ＷＭ５９］、抗ＶＥＧＦ−Ｒ２抗体［ＨＫＤＲ−１］、抗ＣＤ３４抗体［５８１］、抗Ｔｉｅ２抗体［３３．１］、抗Endoglin抗体［４３Ａ３］、抗ＮＲＰ１抗体［１２Ｃ２］、及び抗ＣＸＣＲ４抗体［１２Ｇ５］［すべてBioLegend社製］）及び１種類の造血細胞マーカーに対する抗体（抗ＣＤ４５抗体［ＨＩ３０］）（BioLegend社製）と２０分間、４℃条件下で反応させた。７−アミノ‐アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）で死細胞を染色し、セルソーター（FACSAria II［BD biosciences社製］）を用いて死細胞を除去することにより生細胞を選別した後、上記抗体で検出される細胞マーカーの発現を、フローサイトメーター（FACSCant II［BD biosciences社製］）を用いて解析した。また、ＣＤ３１陽性（^＋）細胞は、セルソーター（FACSAria II［BD biosciences社製］）を用いて選別し、FlowJo software（Tree Star社製）を用いて解析した。また、細胞の形態は光学顕微鏡（Nikon社製）を用いて観察した。

［蛍光色素（Ｄｉｌ）でラベルしたアセチル化低密度リポタンパク質（ＡｃＬＤＬ）（Ｄｉｌ−ＡｃＬＤＬ）取り込みアッセイ］
Ｄｉｌ−ＡｃＬＤＬ取り込みアッセイに用いる細胞（４×１０^４個）を、１００μｇ／ｍＬＩ型コラーゲン（新田ゼラチン社製）でコーティングした８ウェルプレート（BD Biosciences社製）に播種し、本件ＥＧＭ−２培地中で培養した。２４時間後に、Ｄｉｌ−ＡｃＬＤＬ（Biomedical Technologies社製）を１０μｇ／ｍＬとなるように培地へ添加し、４時間培養を行い、後述の［間接蛍光抗体法］の項目に記載の方法にしたがって免疫蛍光染色した。

［毛細血管様構造形成アッセイ］
毛細血管様構造形成アッセイに用いる細胞（２×１０^４個）を、３０μＬマトリゲル（BD biosciences社製）でコートした９６ウェルプレートに播種し、本件ＥＧＭ−２培地中に培養した。１８時間後に細胞中のＶｅｎｕｓの蛍光を、蛍光顕微鏡（BZ-8000［Keyence社製］）を用いて検出することにより、毛細血管様構造の形成を観察した。

［ＣＤ３１^＋ＨＦＬ−１細胞における１８ＴＦＤＮＡの検出］
上記［繊維芽細胞への遺伝子導入法］の項目に記載の方法にしたがって、１８ＴＦのうちいずれか１種のＴＦを発現するレンチウイルスベクターを、１８種すべてのＴＦについて用意し、これら１８種すべてのＴＦについてのＴＦ発現レンチウイルスベクターをＨＦＬ−１細胞へ導入した。その後、上記［細胞培養］の４）の記載の方法にしたがって、本件ＥＧＭ−２培地中で該細胞の培養を行い、導入から１４日後に上記［フローサイトメトリー解析及びセルソーティング］の項目に記載の方法にしたがって、ＣＤ３１^＋ＨＦＬ−１細胞を選別・単離した後、Wizard SV Genomic DNA Purification System（Promega社製）を用い、製品添付のプロトコールにしたがってゲノムＤＮＡを単離した。単離したゲノムＤＮＡ（１５ｎｇ）をテンプレートとし、プライマーセット（フォワード及びリバース：表２参照）とHerculase II fusion DNA polymerase（Agilent Technologies社製）を用いたＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）を、製品添付のプロトコールにしたがって行った。得られたＰＣＲ産物は１．５％又は２．０％アガロースゲルで分離し、エチジウムブロマイドでＤＮＡを染色した後、ＵＶトランスイルミネーターを用いて検出した。

表中の(E)フォワード、(E)リバース、(F)フォワード １８ＴＦ、及び(F)リバースがアニール・増幅するＤＮＡ領域は、図２Ａに示す。

［定量ＲＴ（reverse transcription）−ＰＣＲ解析］
培養細胞から、gDNA Eliminator Solutionを備えたRNeasy Plus Micro Kit（QIAGEN社製）を用いて全ＲＮＡを単離・精製し、High Capacity cDNA Reverse Transcription kits（Applied Biosystems社製）を用いてｃＤＮＡを調製した。ＥＴＶ２遺伝子由来のｃＤＮＡや、８種類のＶＥＣマーカー遺伝子（ＥＲＧ、ＦＬＩ１、ＴＡＬ１、ＰＥＣＡＭ１、ＣＤＨ５、ＥＧＦＬ７、ＫＤＲ、及びｖＷＦ）、及び１種類の繊維芽細胞マーカー遺伝子（ＣＯＬ１Ａ２）、更に２種類の造血細胞マーカー遺伝子（ＰＴＰＲＣ（ＣＤ４５），ＩＴＧＡ２Ｂ（ＣＤ４１））の計１２種類の遺伝子由来のｃＤＮＡの他、内部コントロール遺伝子（ＨＰＲＴ１）由来のｃＤＮＡを定量するために、プライマーセット（フォワード及びリバース：表３参照）と、KAPA SYBR FAST qPCR kit（KAPABIOSYSTEM社製）、又はSso Fast Eva Green Supermix（Bio-Rad社製）を用いて上記ｃＤＮＡを増幅し、iCycler iQ multicolor real-time PCR detection system（Bio-Rad社製）を用いてｃＤＮＡ増幅産物が一定量になるＰＣＲのサイクル数（threshold cycle；Ｃｔ値）を測定し、比較Ｃｔ法（デルタデルタＣｔ法）によりＨＰＲＴ１遺伝子のｃＤＮＡ増幅産物のＣｔ値を基準とした上記１０種類の遺伝子のｃＤＮＡ増幅産物のＣｔ値の相対値を求め、かかるＣｔ値の相対値から、上記１２種類の遺伝子（ＥＴＶ２遺伝子、８種類のＶＥＣマーカー遺伝子［ＥＲＧ、ＦＬＩ１、ＴＡＬ１、ＰＥＣＡＭ１、ＣＤＨ５、ＥＧＦＬ７、ＫＤＲ、及びｖＷＦ］、１種類の繊維芽細胞マーカー遺伝子［ＣＯＬ１Ａ２］、及び２種類の造血細胞マーカー遺伝子［ＣＤ４５、ＣＤ４１］）のｍＲＮＡの相対量を算出した。

［マトリゲルプラグアッセイ］
マトリゲルプラグアッセイは、文献（Laib, A.M. et al. Nat. Protoc. 4, 1202-1215 (2009)）に記載の方法にしたがって行った。すなわち、３００ｎｇ／ｍＬヒトｂＦＧＦ及び１０Ｕ／ｍＬのヘパリン（Novo Nordisk Pharma社製）を添加した５００μＬ増殖因子低含量マトリゲル（growth factor-reduced Matrigel）（BD Biosciences社製）に、１×１０^６個の細胞を懸濁し、ＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄ／Ｊ（ＮＯＤ ＳＣＩＤ）マウス（Charles River社製）の側腹部に皮下注射した。移植後２８日目に皮膚及び全筋肉層を含む腹壁を広範囲に切除してマトリゲルプラグを除去し、４％ＰＦＡに４時間室温にて固定し、その後室温でさらに１８時間、３０％ショ糖中でインキュベートした。使用時まで、上記マトリゲルプラグを４％カルボキシメチルセルロース中に包埋し、−８０℃で保存した。クリオスタット（Carl Zeiss社製）を用いて厚さ２０μｍの凍結切片を作製した。ホールマウント染色用に、移植後４２日目にマトリゲルプラグを除去し、上記方法で凍結切片を作製した。作製した凍結切片を、後述の［間接蛍光抗体法］の項目に記載の方法にしたがって免疫蛍光染色した。なお、マトリゲルプラグアッセイは、慶応大学動物実験委員会の承諾を受けて行ったものである。

［後肢虚血モデルマウスを用いた血管形成解析］
動物麻酔装置（Model TK-5、Bio Machinery社製）から供給されるイソフルラン（導入用に１００％酸素中５％イソフルラン、持続用に１００％酸素中１〜２％イソフルラン）を用いて９〜１０週齢雄ＣＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１^ｎｕ／ＣｒｌＣｒｌｊ（ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ）マウス（Charles River社製）を麻酔した。電気凝固装置（Vetroson, V-10 Bi-polar, Electrosurgical Unit、Summit Hill Laboratories社製）を用い、大腿動脈の近位部及び伏在動脈の遠位部を閉塞することにより、片側の後肢を虚血させた。ＰＢＳ溶液に懸濁した５×１０^５個の細胞を、この処置後直ちにマウスの虚血大腿部の内転筋の上に移植した。移植後１４日目に、後述の［レーザードップラー画像解析］の項目に記載の方法にしたがって移植部位における血流を測定し、その後マウスを安楽死させた。上記マウスの虚血及び非虚血内転筋を切断してＯＣＴ化合物（Sakura Finetek社製）に包埋し、クリオスタット（Carl Zeiss社製）を用いて厚さ７μｍの凍結切片を作製した。作製した凍結切片を、後述の［間接蛍光抗体法］の項目に記載の方法にしたがって免疫蛍光染色した。なお、上記血管形成解析は、アメリカ国立衛生研究所が発行する実験動物の管理と使用に関する指針に従ったものであり、また、久留米大学医学部動物実験委員会の承諾を受けたものである。

［間接蛍光抗体法］
培養細胞や、上記［マトリゲルプラグアッセイ］や［後肢虚血モデルマウスを用いた血管形成解析］の項目で作製した凍結切片を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で１０分間、室温、又は１００％アセトンで５分間、−２０℃で固定し、０．１％TritonX-100／ＰＢＳ溶液で透過処理を行った後、３％ヤギ血清でブロッキング処理を行った。続いて、各種１次抗体（抗ＶＥ−カドヘリン抗体［ＢＶ９］［２００倍希釈で使用；BioLegend社製］、抗ｖＷＦ抗体［ラビットポリクローナル］［１００倍希釈で使用；Abcam社製］、抗ｅＮＯＳ抗体［ラビットポリクローナル］［１００倍希釈で使用；Abcam社製］、抗α‐ＳＭＡ抗体［ERP5368］［５００倍希釈で使用；GeneTex社製］、及び抗ｈＣＤ３４抗体［ＱＢＥＮＤ／１０］［４００倍希釈で使用；AbDserotec社製］）を用いて室温で１．５時間抗原抗体反応処理を行った後、各種２次抗体（抗マウスIgG-Alexa Fluor 546抗体［１０００倍希釈で使用；Invitrogen社製］、及び抗ラビットIgG-Alexa Fluor 633抗体［１０００倍希釈で使用；Invitrogen社製）を用いて室温で３０分間抗体反応処理を行い、細胞核を、５μｇ／ｍＬHoechest 33342（同仁化学研究所社製）で染色した。また、上記凍結切片と、RhodamineでコンジュゲートしたＵＥＡＩ（１６０倍希釈で使用；Vector Laboratories社製）は、室温で１．５時間反応させた。共焦点蛍光画像は、Zeiss LSM 710 laser scanning microscope（Carl Zeiss社製）用いて取得した。

［レーザードップラー画像解析］
文献（Taniguchi, K. et al. PloS One 4, e5467 (2009)）に記載の方法にしたがってレーザードップラー画像解析を行った。要約すると、移植後１４日目にマウスを３７℃の加温パッドに載せ、レーザードップラー血流画像化装置MoorLDI-Mark 2（レーザードップラー灌流画像化システム、MoorLDI-Mark 2、Moor Instruments社製）や、Moor Instruments社が提供するソフトウェアを用いて、平均レーザードップラー流動を解析することにより移植部位における血流を測定した。なお、内部コントロールとして同じマウスの非虚血後肢における血流を測定した。

［ヘマトキシリン・エオシン染色法］
上記［後肢虚血モデルマウスを用いた血管形成解析］の項目で作製した凍結切片を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で１０分間、室温で固定し、ヘマトキシリン（SakuraFinetek社製）で３分間、室温で染色した後、エオシン（Sakura Finetek社製）で３分間、室温で染色し、エタノール及びClear Plus（Falma社製）で洗浄後、光学顕微鏡（Nikon社製）を用いて観察した。

［結果１：１８ＴＦが繊維芽細胞を血管内皮細胞へ誘導する］
上記［繊維芽細胞への遺伝子導入法］の項目に記載の方法にしたがって、１８種すべてのＴＦについてのＴＦ発現レンチウイルスベクターをＨＦＬ−１細胞へ導入した後、上記［細胞培養］の４）の記載の方法にしたがって、本件ＥＧＭ−２培地中で該細胞の培養を行い、導入から１４日後に上記［フローサイトメトリー解析及びセルソーティング］の項目に記載の方法にしたがって、ＶｅｎｕｓやＣＤ３１の発現を解析したところ、Ｖｅｎｕｓ^＋細胞、すなわちＴＦ発現ＨＦＬ−１細胞中に、ＣＤ３１^＋細胞が含まれていることが示された（図１Ａ上段参照）。かかるＣＤ３１^＋細胞は、血管内皮細胞や血管芽細胞マーカーであるＶＥＧＦ−Ｒ２を発現することが明らかとなった（図１Ａ下段参照）。また、上記ＣＤ３１^＋細胞は、ＣＤ３１やＶＥＧＦ−Ｒ２以外のＶＥＣマーカー（ＣＤ３４、Ｔｉｅ２、ＮＲＰ１、及びＣＸＣＲ４）を発現することが確認された。他方、上記ＣＤ３１^＋細胞は、繊維芽細胞マーカーであるＣＯＬ１Ａ２の発現が大幅に低下することや、造血細胞マーカーであるＣＤ４５やＣＤ４１は発現しないことも確認された。また、上記ＣＤ３１^＋細胞は、ＶＥＣの特徴の一つである丸石様形態（cobblestone-like morphology）を示すことが確認された（図１Ｂ参照）。

また、上記ＣＤ３１^＋細胞を上記［Ｄｉｌでラベルしたアセチル化低密度リポタンパク質（ＡｃＬＤＬ）（Ｄｉｌ−ＡｃＬＤＬ）取り込みアッセイ］の項目に記載の方法に用いてＡｃＬＤＬの取り込み活性の解析を行ったところ、上記ＣＤ３１^＋細胞は、ＶＥＣの特徴の一つであるＡｃＬＤＬの取り込み活性を有することも確認した。さらに、上記ＣＤ３１^＋細胞を上記［毛細血管様構造形成アッセイ］の項目に記載の方法用いて毛細血管構造の解析を行ったところ、上記ＣＤ３１^＋細胞は、ＶＥＣの特徴の一つである毛細血管様構造を形成できることが示された（図１Ｃ参照）。
以上の結果は、ＨＦＬ−１細胞中に１８ＴＦのうちのいずれか１つ又は２つ以上を発現させた後、該細胞を本件ＥＧＭ−２培地等の血管内皮細胞増殖用培地で培養すると、ＣＤ３１やＶＥＧＦ−Ｒ２等のＶＥＣ表面マーカーを発現するＶＥＣを誘導できることを示している。

［結果２：ＥＴＶ２が繊維芽細胞を血管内皮細胞へ誘導する］
上記１８ＴＦのうちどの転写因子がＶＥＣの誘導に関わっているか調べるために、上記［ＣＤ３１^＋ＨＦＬ−１細胞における１８ＴＦＤＮＡの検出］の項目に記載の方法にしたがって遺伝子解析を行った。その結果、１８ＴＦにより誘導されたＶＥＣは、ＥＴＶ２及びＨＯＰＸ発現レンチウイルスベクターが導入されたものであることが確認された（図２Ｂ及びＣ参照）。次に、これら２つの転写因子（ＥＴＶ２及びＨＯＰＸ）が、ＶＥＣを誘導するものであるかを調べるために、上記［繊維芽細胞への遺伝子導入法］の項目に記載の方法にしたがって、ＥＴＶ２又はＨＯＰＸ発現レンチウイルスベクターをＨＦＬ−１細胞へ導入し、その後、上記［細胞培養］の４）の記載の方法にしたがって、本件ＥＧＭ−２培地中で該細胞の培養を行い、導入から１４日目に上記［フローサイトメトリー解析及びセルソーティング］の項目に記載の方法にしたがって、ＣＤ３１の発現を解析したところ、ＨＯＰＸ発現レンチウイルスベクターをＨＦＬ−１細胞へ導入した場合、ＣＤ３１^＋細胞は誘導されなかったのに対して、ＥＴＶ２発現レンチウイルスベクターをＨＦＬ−１細胞へ導入した場合、ＣＤ３１^＋細胞が誘導されることが明らかとなった（図２Ｄ参照）。これらの結果は、ＨＦＬ−１細胞をＶＥＣへ誘導するために導入が必要な転写因子は、ＥＴＶ２のみであることを示している。また、ＨＯＰＸはＶＥＣの誘導には関与してないことも確認された。

さらに、ＥＴＶ２発現レンチウイルスベクターを、ＨＦＬ−１細胞とは別の繊維芽細胞株であるＮＢ１ＲＧＢ細胞へ導入した場合においてもＣＤ３１^＋細胞（ＶＥＣ）が誘導されることが確認された（図２Ｅ参照）。
以上の結果は、ＨＦＬ−１細胞やＮＢ１ＲＧＢ細胞等の繊維芽細胞をＶＥＣへ誘導するために導入が必要な転写因子は、ＥＴＶ２のみであることを示している。

上記結果１及び２から、ＨＦＬ−１細胞やＮＢ１ＲＧＢ細胞等の繊維芽細胞中にＥＴＶ２を発現させた後、該細胞をＥＧＭ−２等の血管内皮細胞増殖用培地で培養することにより、ＣＤ３１やＶＥＧＦ−Ｒ２等のＶＥＣ表面マーカーを発現し、血管内皮細胞としての特性を有する細胞（以下、「ＥＴＶＥＣ」ということがある）を誘導できることが明らかとなった。

［結果３：繊維芽細胞からＥＴＶＥＣへの誘導には、ＥＴＶ２のトランス活性化ドメイン（ＴＡＤ）とＥＴＳドメインが必要である］
ＥＴＶ２は、ＥＴＳファミリーに属する因子の一つであり、そのアミノ（Ｎ）末端側にＴＡＤを有し、カルボキシ（Ｃ）末端側にＤＮＡと結合するＥＴＳドメインを有する（DeHaro, L. and Janknecht, R. Nucleic Acids Res. 30, 2972-2979 (2002)）。繊維芽細胞からＥＴＶＥＣへの誘導に必要なＥＴＶ２のドメインを調べるために、ＨＡタグを付加した４種類のＥＴＶ２（ΔＥＴＳ、ΔＴＡＤ、ΔＴＡＤＮ、及びΔＴＡＤＣ）をコードする遺伝子（図３Ａ参照）をCSII-EF-MCS-IRES2-VenusのＭＣＳに挿入し、上記［繊維芽細胞への遺伝子導入法］の項目に記載の方法にしたがって、上記ＨＡタグを付加した４種類のＥＴＶ２発現レンチウイルスベクターをＨＡＦｓ細胞へ導入し、その後、上記［細胞培養］の４）の記載の方法にしたがって、本件ＥＧＭ−２培地中で該細胞の培養を行い、導入から１５日目に上記［フローサイトメトリー解析及びセルソーティング］の項目に記載の方法にしたがって、ＣＤ３１やＶＥＧＦ−Ｒ２の発現を解析した。なお、コントロールとしてＨＡタグを付加した全長ＥＴＶ２を用いた。その結果、ΔＥＴＳやΔＴＡＤを用いた場合、ＣＤ３１^＋細胞及びＶＥＧＦ−Ｒ２^＋細胞は誘導されなかった（図３Ｂ参照）。また、ΔＴＡＤＮやΔＴＡＤＣを用いた場合、ＶＥＧＦ−Ｒ２^＋細胞は誘導されたものの、ＣＤ３１^＋細胞誘導されなかった（図３Ｂ参照）。以上の結果は、ＥＴＶ２のＴＡＤドメインとＥＴＳドメインのいずれか一方を大きく欠失させてしまうと繊維芽細胞からＥＴＶＥＣへの誘導は生じず、繊維芽細胞からＥＴＶＥＣへの誘導には、少なくともＥＴＶ２のＴＡＤドメインとＥＴＳドメインの両方の機能が必要であることを示している。

［結果４：ＥＴＶＥＣは、ＶＥＣとしての性質を安定に保持し、且つ高い増殖能を有する］
ＥＴＶＥＣが、ＶＥＣとしての性質を安定に保持した状態で増殖できるかどうかを調べるため、上記［繊維芽細胞への遺伝子導入法］の項目に記載の方法にしたがって、ＥＴＶ２発現レンチウイルスベクターをＨＡＦｓ細胞へ導入し、その後、上記［細胞培養］の４）の記載の方法にしたがって、本件ＥＧＭ−２培地中で該細胞の培養を行い、導入から１５日後にセルソーター（FACSAria II［BD biosciences社製］）を用いてＣＤ３１^＋細胞を選別し、１０日間（細胞への遺伝子導入後２５日間）本件ＥＧＭ−２培地中で継代培養を行った。上記［フローサイトメトリー解析及びセルソーティング］の項目に記載の方法にしたがってＣＤ３１の発現を解析したところ、細胞への遺伝子導入後２５日間培養した細胞は４．１２〜９．７６×１０^５個まで増殖し、そのほとんど（９５．３％、６．９２×１０^５個）がＣＤ３１^＋細胞（ＥＴＶＥＣ）であることが確認された（図４Ａ及びＢ参照）。

上記ＣＤ３１^＋細胞（ＥＴＶＥＣ）をセルソーター（FACSAria II［BD biosciences社製］）を用いて選別し、さらに７日間（細胞への遺伝子導入後３２日間）本件ＥＧＭ−２培地中で継代培養を行ったところ、丸石様形態を示す細胞（ＥＴＶＥＣ）を５．０５〜１１．４０×１０^６個まで増殖できることが確認された（図４Ｂ及びＣ参照）。また、上記［定量ＲＴ−ＰＣＲ解析］の項目に記載の方法にしたがってＶＥＣマーカー遺伝子や繊維芽細胞マーカー遺伝子の発現を解析したところ、細胞への遺伝子導入後３２日間培養した上記ＥＴＶＥＣは、ＨＵＶＥＣと同様、成熟ＶＥＣマーカーであるｖＷＦ遺伝子のｍＲＮＡの他、７種類のＶＥＣマーカー遺伝子（ＥＲＧ、ＦＬＩ１、ＴＡＬ１、ＰＥＣＡＭ１（ＣＤ３１）、ＣＤＨ５、ＥＧＦＬ７、及びＫＤＲ）のｍＲＮＡを発現するのに対して、繊維芽細胞マーカー遺伝子（ＣＯＬ１Ａ２）のｍＲＮＡの発現は抑制されることが明らかとなった（図５Ａ参照）。また、上記［フローサイトメトリー解析及びセルソーティング］の項目に記載の方法にしたがって、ＶＥＣマーカーの発現を解析したところ、細胞への遺伝子導入後３２日間培養した上記ＥＴＶＥＣは、ＣＤ３１やＶＥＧＦ−Ｒ２の他、４種類のＶＥＣマーカー（ＣＤ３４、Ｔｉｅ２、Endoglin、及びＣＸＣＲ４）を発現することが確認された。
また、細胞への遺伝子導入後３２日間培養した上記ＥＴＶＥＣは、ｖＷＦや血管内皮細胞特異的な細胞接着分子であるVE-cadherinを発現することや（図５Ｂ参照）、ＡｃＬＤＬの取り込み活性を有することや（図５Ｃ参照）、毛細血管様構造を形成できること（図５Ｄ参照）も確認された。
以上の結果は、ＥＴＶＥＣは、ＶＥＣとしての性質を安定に保持し、且つ高い増殖能を有する細胞であることを示している。また、ＥＴＶＥＣは、成熟ＶＥＣマーカーであるｖＷＦを発現することから、成熟した（血管形成能を有する）ＶＥＣであることが示唆された。

ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦは、ＶＥＣの増殖や生存に必要であることが報告されている（Marcelo, K.L. et al. Circulation research 112, 1272-1287 (2013)、Flamme, I. & Risau, W. Development 116, 435-439 (1992)）。本件ＥＧＭ−２培地では、市販のＥＧＭ−２培地にＶＥＧＦ及びｂＦＧＦを添加してＶＥＧＦ及びｂＦＧＦの濃度を上げているが、これら両成分を添加しなかった場合、すなわち、培地中のＶＥＧＦ及びｂＦＧＦの濃度を本件ＥＧＭ−２培地よりも減少させた場合に、繊維芽細胞からＥＴＶＥＣへの誘導に影響を及ぼすかどうか調べるために、ＥＴＶ２発現レンチウイルスベクターをＨＡＦｓ細胞へ導入した後、ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦを添加しないＥＧＭ−２培地（市販のＥＧＭ−２培地）中で継代培養を行い、ＣＤ３１^＋ＶＥＧＦ−Ｒ２^＋ＨＡＦｓ細胞を解析した。その結果、ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦを添加しないＥＧＭ−２培地を用いた場合（ＶＦ（−））、本件ＥＧＭ−２培地、すなわちＶＥＧＦ及びｂＦＧＦを添加したＥＧＭ−２培地を用いた場合（ＶＦ（＋））と比べ、ＣＤ３１^＋ＶＥＧＦ−Ｒ２^＋ＨＡＦｓ細胞（ＥＴＶＥＣ）の誘導効率は大幅に低下していた（図４Ｄ）。この結果は、ＥＧＭ−２培地中に含まれるＶＥＧＦやｂＦＧＦの濃度を増加させると、繊維芽細胞からＥＴＶＥＣへの誘導効率を顕著に上昇できることを示している。

［結果５：ＨＡＦｓ細胞における内因性のＦＯＸＣ２発現が、ＥＴＶＥＣへの誘導に必須である］
ＥＴＶ２による繊維芽細胞からＥＴＶＥＣへの誘導に、転写因子の１つであるＦＯＸＣが関与しているかどうかを調べるために、以下の一連の実験を行った。

まず、ＨＡＦｓ細胞における、ＦＯＸＣ１及びＦＯＸＣ２のｍＲＮＡ発現を、上記［定量ＲＴ（reverse transcription）−ＰＣＲ解析］の項目に記載の方法にしたがって確認した。その結果、ＨＡＦｓ細胞はＦＯＸＣ１、ＦＯＸＣ２のいずれも発現していること、及び、ＦＯＸＣ２の発現の方がＦＯＸＣ１の発現よりも高いことが示された（図６Ａ）。

次に、ＦＯＸＣ２遺伝子のノックダウンによる影響を以下の方法で調べた。ＦＯＸＣ２のｓｈＲＮＡを発現するプラスミドベクター（ＦＯＸＣ２のｓｈＲＮＡに対応するＤＮＡ配列は配列番号５０）を導入したＨＡＦｓ細胞へ、上記［繊維芽細胞への遺伝子導入法］の項目に記載の方法にしたがって、ＥＴＶ２を発現するレンチウイルスベクターを導入し、その後、上記［細胞培養］の４）の記載の方法にしたがって、本件ＥＧＭ−２培地中で該細胞の培養を行い、導入から１５日後にセルソーター（FACSAria II［BD biosciences社製］）を用いてＶｅｎｕｓ^＋細胞を選別した細胞を、ＦＯＸＣ２遺伝子ノックダウン細胞とした。一方、ＦＯＸＣ２のｓｈＲＮＡを発現するプラスミドベクターを導入したＨＡＦｓ細胞に代えて、コントロールのｓｈＲＮＡを発現するプラスミドベクター（コントロールのｓｈＲＮＡに対応するＤＮＡ配列は配列番号５１）を導入したＨＡＦｓ細胞を用いたこと以外は先の方法により得た細胞を、コントロール細胞とした。上記［定量ＲＴ−ＰＣＲ解析］の項目に記載の方法にしたがって、ＦＯＸＣ２遺伝子ノックダウン細胞及びコントロール細胞における、ＥＲＧ遺伝子（ＶＥＣマーカー遺伝子の１種）、ＥＴＶ２遺伝子、ＦＬＩ１遺伝子（ＶＥＣマーカー遺伝子の１種）、ＦＯＸＣ２遺伝子のｍＲＮＡの発現を確認した。その結果、ＦＯＸＣ２遺伝子ノックダウン細胞では、ＦＯＸＣ２遺伝子の発現が実際に抑制されていること、及び、ＥＲＧ遺伝子及びＦＬＩ１遺伝子の発現が顕著に抑制されていることが示された（図６Ｂ）。

さらに、ＦＯＸＣ２遺伝子ノックダウン細胞及びコントロール細胞から死細胞を除いた細胞について、上記［フローサイトメトリー解析及びセルソーティング］の項目に記載の方法にしたがって、ＣＤ３１の発現を解析した。その結果を図６Ｃに示す。コントロール細胞においては、Ｖｅｎｕｓ^＋の細胞中のＣＤ３１^＋細胞の割合が７．７２％であったが（図６Ｃ左パネル）、ＦＯＸＣ２遺伝子ノックダウン細胞においては、その割合はわずか０．５３％にまで顕著に抑制されていることが示された（図６Ｃ右パネル）。このことは、ＦＯＸＣ２遺伝子のノックダウンによって、ＨＡＦｓ細胞からＥＴＶＥＣへの誘導が顕著に抑制されることを示すものである。

以上の結果は、ＥＴＶ２による線維芽細胞からＥＴＶＥＣへの誘導には、線維芽細胞の内因性ＦＯＸＣ２が必須であることを示している。

［結果６：ＥＴＶＥＣは、血管形成能を有する成熟したＶＥＣである］
ＥＴＶＥＣが、血管形成能を有する成熟したＶＥＣであるかどうかを調べるために、上記［マトリゲルプラグアッセイ］の項目に記載の方法にしたがってマトリゲルプラグアッセイを行った。その結果、コントロールのＨＡＦｓ細胞をマウスに移植した場合、移植部位において、ＶＥＣマーカーであるｈＣＤ３４や、血管内皮細胞の周囲を裏打ちする壁細胞の指標であるα−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）の発現は認められず、また、ヒトＥＣに特異的に結合するＵＥＡＩにより染色される脈管構造（血管）が形成されなかったのに対して、ＥＴＶＥＣをマウスに移植した場合、移植部位において、ヒトＣＤ３４やα−ＳＭＡの発現が認められ、脈管構造（血管）が形成された（図７Ａ〜Ｄ参照）。また、ＥＴＶＥＣにより構成される血管は赤血球を循環していることが明らかとなった（図７Ｂ及びＣの白矢印の血管内の球状の粒（赤血球）参照）。このことは、ＥＴＶＥＣ由来の血管が、マウスが元々有している血管といずれかの部位で融合し、実際の血液循環を担っていることを意味する。さらに、ＥＴＶＥＣにより構成される血管は一酸化窒素を合成して内皮細胞の生存を促進し、アテローム性動脈硬化症を予防するｅＮＯＳを発現することも確認された（図７Ｅ参照）。
以上の結果は、ＥＴＶＥＣを移植すると、ＥＴＶＥＣから機能的な血管構造が形成されることを示している。

ＥＴＶＥＣを虚血領域に移植した場合、虚血による組織変性（損傷）を抑制できるかどうかを調べるために、上記［後肢虚血モデルマウスを用いた血管形成解析］や［ヘマトキシリン・エオシン染色法］の項目に記載の方法にしたがって解析を行った。その結果、コントロールのＰＢＳ溶液やＨＡＦｓ細胞を後肢虚血部位に移植した場合、移植部位において、虚血領域の広範な筋肉の変性（損傷）が認められ（図８Ｂ参照）、自然切断により後肢が失われたのに対して（図８Ａ参照）、ＥＴＶＥＣを後肢虚血部位に移植した場合、移植部位において、上記虚血領域の筋肉の変性（損傷）が抑制され（図８Ｂ参照）、後肢の自然切断が抑制された（図８Ａ参照）。また、ＥＴＶＥＣを移植した後肢虚血部位においては、ｈＣＤ３４が発現することも確認された（図８Ｅ）。さらに、ＥＴＶＥＣを移植した後肢虚血部位における血流の回復を調べるために、上記［レーザードップラー画像解析］の項目に記載の方法にしたがって解析を行った。その結果、コントロールのＰＢＳ溶液やＨＡＦｓ細胞を後肢虚血部位に移植した場合と比べ、ＥＴＶＥＣを後肢虚血部位に移植することにより有意に血流を回復することが示された（図８Ｃ及びＤ）。
以上の結果は、ＥＴＶＥＣを虚血障害等により組織が変性（損傷）した部位に移植すると、ＥＴＶＥＣから機能的な血管構造が形成され、その結果、組織変性（損傷）を予防又は改善できることを示している。

本発明によれば、線維芽細胞からｉＰＳＣを経由せずに血管内皮細胞を製造することができるため、比較的短期間で簡便かつ多量に、しかも低コストで血管内皮細胞を製造することができる。また、本発明の血管内皮細胞の製造方法では、多能性の状態の細胞を用いず、また、がん原遺伝子としても知られるｃ−Ｍｙｃ遺伝子も用いないため、ＥＳＣやｉＰＳＣを用いる場合に懸念される発がん性の問題もない。また、本発明の製造方法により製造された血管内皮細胞は、生体内で機能的な血管構造を形成し、また、虚血部位の血流を有意に回復し得るなど、生体内で機能を発揮することができる。

Claims (12)

1. 工程（Ｐ）：以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかのポリヌクレオチドからなるＥＴＶ２遺伝子、又は以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのタンパク質からなるＥＴＶ２タンパク質を線維芽細胞に導入する工程；及び
   工程（Ｑ）：前記ＥＴＶ２遺伝子又は前記ＥＴＶ２タンパク質が導入された線維芽細胞を血管内皮細胞増殖用培地で培養する工程；
   を有することを特徴とする、血管内皮細胞の製造方法；
   （ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＥＴＶ２活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＥＴＶ２活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ｄ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
   （ｅ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＥＴＶ２活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ｆ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＥＴＶ２活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
   （Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＥＴＶ２活性を有するタンパク質；
   （Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＥＴＶ２活性を有するタンパク質。
2. さらに、以下の工程（Ｒ）を有することを特徴とする請求項１に記載の血管内皮細胞の製造方法；
   工程（Ｒ）：工程（Ｑ）で培養して得られる細胞から血管内皮細胞を分取する工程。
3. 工程（Ｒ）において、工程（Ｑ）で培養して得られる細胞から血管内皮細胞を分取する方法が、工程（Ｑ）で得られる細胞から血管内皮細胞マーカー陽性細胞を分取する方法であることを特徴とする請求項２に記載の血管内皮細胞の製造方法。
4. 血管内皮細胞マーカーがＣＤ３１であることを特徴とする請求項３に記載の血管内皮細胞の製造方法。
5. さらに、以下の工程（Ｓ）を有することを特徴とする請求項２〜４のいずれかに記載の血管内皮細胞の製造方法；
   工程（Ｓ）：工程（Ｒ）で分取した血管内皮細胞を、血管内皮細胞増殖用培地で培養する工程。
6. ＥＴＶ２遺伝子の線維芽細胞への導入が、前記ＥＴＶ２遺伝子を発現し得る発現ベクターを前記線維芽細胞へ導入することによりなされることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の血管内皮細胞の製造方法。
7. ＥＴＶ２遺伝子を発現し得る発現ベクターが、ＥＴＶ２遺伝子を発現し得るレンチウイルスベクターであることを特徴とする請求項６に記載の血管内皮細胞の製造方法。
8. 血管内皮細胞増殖用培地が、少なくとも血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及び塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含むことを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の血管内皮細胞の製造方法。
9. ＥＴＶ２遺伝子がヒトＥＴＶ２遺伝子であり、ＥＴＶ２タンパク質がヒトＥＴＶ２タンパク質であり、線維芽細胞がヒト線維芽細胞であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の血管内皮細胞の製造方法。
10. 線維芽細胞が、皮膚線維芽細胞であることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の血管内皮細胞の製造方法。
11. 請求項１〜１０のいずれかに記載の血管内皮細胞の製造方法により製造される血管内皮細胞。
12. 請求項１〜１０のいずれかに記載の血管内皮細胞の製造方法により製造される血管内皮細胞を含有する血管新生促進剤。