CN110042125A - 脂肪间充质干细胞转分化制备血管细胞的方法、血管细胞及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种脂肪间充质干细胞转分化制备血管细胞的方法、血管细胞及其应用。该脂肪间充质干细胞转分化制备血管细胞的方法，包括以下步骤：用携带ETV2转录因子的腺病毒感染脂肪间充质干细胞并培养，使得脂肪间充质干细胞发生重编程；及将重编程后的脂肪间充质干细胞置于血管细胞分化培养基中分化培养，得到血管细胞。上述方法能够将脂肪间充质干细胞直接转分化成血管细胞，且转分化的效率高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种脂肪间充质干细胞转分化制备血管细胞的方法、血管细胞及其应用。
背景技术
心脑血管疾病是心脏血管和脑血管疾病的统称，泛指由于高脂血症、血液黏稠、动脉粥样硬化、高血压等所导致的心脏、大脑及全身组织发生的缺血性或出血性疾病。心脑血管疾病严重威胁人类的健康，具有高患病率、高致残率和高死亡率的特点。虽然通过传统药物及外科手术等手段重建血液运输系统，能够在一定程度上缓解心脑血管疾病的临床症状，但是这种治疗方法需要长期服用药物或经受手术的痛苦，且不能从根本上治疗心脑血管疾病。
日本的Shinya Yamanaka于2006年首次公开通过Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4这4种转录因子导入小鼠成纤维细胞中，成纤维细胞经4种转录因子的诱导下进行基因的重新编排，得到一种与胚胎干细胞类似的细胞，命名为诱导性多能干细胞(iPS细胞，inducedpluripotent stem cells)。iPS细胞的发现将干细胞研的究和再生医学推向了一个全新的高度。通过iPS细胞治疗心脑血管疾病成为了研究的热门。
然而，传统的方法一般是通过将成纤维细胞重编程为iPS细胞，再诱导iPS细胞分化成血管内皮细胞，操作繁琐和复杂，同时由于成纤维细胞转换为iPS细胞的效率较低，限制了iPS细胞向血管内皮细胞的分化，进而使得由成纤维细胞向血管细胞转化的效率较低，不能满足实际需要。
发明内容
基于此，有必提供一种脂肪间充质干细胞转分化制备血管细胞的方法。该方法能够将脂肪间充质干细胞直接转分化成血管细胞，且转分化的效率高。
此外，提供一种血管细胞及其应用。
一种脂肪间充质干细胞转分化制备血管细胞的方法，包括以下步骤：
用携带ETV2转录因子的腺病毒感染脂肪间充质干细胞，并于36℃～38℃下培养3小时～4小时，使得所述脂肪间充质干细胞发生重编程，其中，所述携带ETV2转录因子的腺病毒的病毒滴度为180PFU～240PFU；及
将重编程后的所述脂肪间充质干细胞置于血管细胞分化培养基中分化培养，得到所述血管细胞。
上述脂肪间充质干细胞转分化制备血管细胞的方法，用携带ETV2转录因子的腺病毒感染脂肪间充质干细胞，由于腺病毒无薄膜结构，不会诱发宿主的免疫反应，因此通过腺病毒携带ETV2转录因子的安全性较高。同时，用携带ETV2转录因子的腺病毒感染脂肪间充质干细胞能够使脂肪间充质干细胞直接转分化成血管细胞，无需经过重编程为iPS细胞的过程，操作简单。
在其中一个实施例中，所述将重编程后的所述脂肪间充质干细胞置于血管细胞分化培养基中分化培养的操作中，所述血管细胞分化培养基含有质量百分含量为2％～5％的培养添加物，所述培养添加物包括胎牛血清、肝素、人源内皮细胞生长因子、抗坏血酸及两性霉素B，培养时间为72小时～96小时。
在其中一个实施例中，所述携带ETV2转录因子的腺病毒通过如下方法制备得到：
将ETV2转录因子插入质粒pShuttle-CMV内，得到pShuttle-CMV-ETV2质粒；
将所述pShuttle-CMV-ETV2质粒与pAdEasy-2质粒以摩尔比为1.5：1～2.5：1混合，并转入感受态细胞中，培养得到腺病毒重组质粒；及
用所述腺病毒重组质粒转染293A细胞，培养转染后的所述293A细胞并收集培养上清，得到所述携带ETV2转录因子的腺病毒。
在其中一个实施例中，所述将所述腺病毒重组质粒转染293A细胞，培养转染后的所述293A细胞并收集培养上清的操作具体如下：
将所述腺病毒重组质粒线性化，用线性化的所述腺病毒重组质粒转染所述293A细胞，培养转染后的所述293A细胞并收集培养上清，得到原代腺病毒；
用所述原代腺病毒转染所述293A细胞并培养，收集培养上清，得到二代腺病毒；及
用所述二代腺病毒转染所述293A细胞并培养，收集培养上清，得到所述携带ETV2转录因子的腺病毒。
在其中一个实施例中，所述用所述腺病毒重组质粒转染293A细胞的操作之前，预先培养所述293A细胞至汇合度为60％～70％。
在其中一个实施例中，所述用携带ETV2转录因子的腺病毒感染脂肪间充质干细胞的操作之前，还包括将所述脂肪间充质干细胞培养至汇合度为30％～40％。
在其中一个实施例中，所述脂肪间充质干细胞为人脂肪间充质干细胞，所述血管细胞为血管内皮细胞。
一种血管细胞，通过上述实施例任一项所述的脂肪间充质干细胞转分化制备血管细胞的方法制备得到。
如上述实施例所述的血管细胞在制备医用功能材料中的应用。
一种治疗血管疾病的药物，包括上述实施例所述的血管细胞。
附图说明
图1为不同浓度的携带ETV2转录因子的腺病毒感染293T细胞的荧光5X视野对比图；
图2为未感染的ASC细胞与ADV-ETV2感染的ASC细胞的明场10X视野对比图；
图3为未感染的ASC细胞与ADV-ETV2感染的ASC细胞的FACS分析的对比图；
图4为ADV-ETV2感染的ASC细胞转分化成的类血管内皮细胞中血管相关基因表达水平的示意图；
图5为缺血小鼠模型的多普勒血流灌注成像图；
图6为图5所示的缺血小鼠模型的A区域和B区域的血流灌注量的对比图；
图7为给缺血小鼠模型分别注射PBS、ADSC、ADSC-Mcherry及ADSC-ETV2后的多普勒血流灌注成像图；
图8为图7所示的小鼠右侧后肢的多普勒血流灌注成像图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
一实施方式的脂肪间充质干细胞转分化制备血管细胞的方法包括如下操作S110～S120：
S110、用携带ETV2转录因子的腺病毒感染脂肪间充质干细胞，并于36℃～38℃下培养3小时～4小时，使得脂肪间充质干细胞发生重编程，其中，携带ETV2转录因子的腺病毒的病毒滴度为180PFU～240PFU。
利用携带ETV2转录因子的腺病毒感染脂肪间充质干细胞，使脂肪间充质干细胞被诱导而进行重编程，进而具有转分化的能力。
在其中一个实施方式中，脂肪间充质干细胞为人的脂肪间充质干细胞。
其中，ETV2转录因子即ETS变体基因2，是ETS转录因子家族成员之一，是一种含有EST结构域的转录因子。
在本实施方式中，ETV2转录因子的序列参见ENSEMBL数据库，序列号为ENST00000402764。
在其中一个实施方式中，S110包括如下操作S111～S112：
S111、制备携带ETV2转录因子的腺病毒。
由于腺病毒无薄膜结构，不会诱发宿主的免疫反应，因此通过腺病毒携带ETV2转录因子的安全性较高。
具体地，将ETV2转录因子插入质粒pShuttle-CMV内，得到pShuttle-CMV-ETV2质粒；将pShuttle-CMV-ETV2质粒与pAdEasy-2质粒以摩尔比为1.5：1～2.5：1混合，并转入感受态细胞中，培养得到腺病毒重组质粒；用腺病毒重组质粒转染293A细胞，培养转染后的293A细胞并收集培养上清，得到携带ETV2转录因子的腺病毒。
在其中一个实施方式中，pShuttle-CMV-ETV2质粒与pAdEasy-2质粒的摩尔比为2：1。
在其中一个实施方式中，用腺病毒重组质粒转染293A细胞，培养转染后的293A细胞并收集培养上清的步骤包括以下操作S1111～S1113。
S1111、将腺病毒重组质粒线性化，用线性化的腺病毒重组质粒转染293A细胞，培养转染后的293A细胞并收集培养上清，得到原代腺病毒。
在其中一个实施方式中，用腺病毒重组质粒转染293A细胞的操作之前，预先培养293A细胞至汇合度为60％～70％。具体地，汇合度是指细胞在瓶中增殖时，出现在细胞间的粘连和排列状态汇合程度，汇合度为60％～70％有利于目的基因的转染。
在其中一个实施方式中，用线性化的腺病毒重组质粒转染293A细胞的操作中，还包括按照每1μg线性化的腺病毒重组质粒添加2μL～3μL的转染剂的量，将线性化的腺病毒重组质粒与转染剂混合后，转染293A细胞。其中，转染剂例如可以为FuGene 6(Promega)。
在其中一个实施方式中，培养转染后的293A细胞并收集培养上清的操作中，将转染后的293A细胞培养至出现CPE现象后收集培养上清。其中，CPE现象为致细胞病变效应，即贴壁、扁平的生长状态的细胞出现变圆、漂浮及细胞核明显变大等现象。
S1112、用原代腺病毒转染293A细胞并培养，收集培养上清，得到二代腺病毒。
在其中一个实施方式中，用原代腺病毒转染293A细胞的操作之前，预先培养293A细胞至汇合度为60％～70％。
在其中一个实施方式中，用原代腺病毒转染293A细胞并培养，收集培养上清的操作中，当至少一半转染后的293A细胞出现CPE现象时，收集培养上清。
S1113、用二代腺病毒转染293A细胞并培养，收集培养上清，得到携带ETV2转录因子的腺病毒。
在其中一个实施方式中，用二代腺病毒转染293A细胞的操作之前，预先培养293A细胞至汇合度为60％～70％。
在其中一个实施方式中，用二代腺病毒转染293A细胞并培养，收集培养上清的操作中，当至少一半转染后的293A细胞出现CPE现象时，收集培养上清。
S112、用的携带ETV2转录因子的腺病毒感染脂肪间充质干细胞，并于36℃～38℃下培养3小时～4小时，使得脂肪间充质干细胞发生重编程，其中，携带ETV2转录因子的腺病毒的病毒滴度为180PFU～240PFU。
在其中一个实施方式中，用携带ETV2转录因子的腺病毒感染脂肪间充质干细胞的操作之前，还包括将脂肪间充质干细胞培养至汇合度为30％～40％。
在其中一个实施方式中，用携带ETV2转录因子的腺病毒感染脂肪间充质干细胞的操作中，还包括将携带ETV2转录因子的腺病毒加入含有10％的胎牛血清的DMEM培养基中，得到感染培养基。
在其中一个实施方式中，感染培养基中还含有感染助剂，其中，每mL感染培养基中含有8μg～10μg感染助剂。其中，感染助剂例如可以为ADV-HR。
S120、将重编程后的脂肪间充质干细胞置于血管细胞分化培养基中分化培养，得到血管细胞。
在其中一个实施方式中，血管细胞为血管内皮细胞。
在其中一个实施方式中，血管细胞分化培养基含有质量百分含量为2％～5％的培养添加物，所述培养添加物包括胎牛血清、肝素、人源内皮细胞生长因子、抗坏血酸及两性霉素B。
在其中一个实施方式中，分化培养时间为72小时～96小时。
上述脂肪间充质干细胞转分化制备血管细胞的方法至少具有如下优点：
(1)用携带ETV2转录因子的腺病毒感染脂肪间充质干细胞，由于腺病毒无薄膜结构，不会诱发宿主的免疫反应，因此通过腺病毒携带ETV2转录因子的安全性较高。
(2)用携带ETV2转录因子的腺病毒感染脂肪间充质干细胞，能够使脂肪间充质干细胞直接转分化成血管细胞，特别是分化为血管内皮细胞，无需经过重编程为iPS细胞的过程，操作简单，转分化效率高。
一实施方式的血管细胞通过脂肪间充质干细胞转分化制备血管细胞的方法制备得到。
具体地，血管细胞为血管内皮细胞。
一实施方式的血管细胞在制备医用功能材料中的应用。
具体地，医用功能材料为人造血管。
一实施方式的治疗血管疾病的药物，包括上述的血管细胞。
在其中一个实施方式，血管疾病为缺血性血管疾病。
上述治疗血管疾病的药物能够用于治疗或缓解脑血管疾病、心血管疾病、肢体血管疾病、外周血管疾病或缺血性肌坏死。
以下为具体实施例部分。
以下实施例中，如无特别说明，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如参见萨姆布鲁克、EF弗里奇、T曼尼阿蒂斯等(金冬雁，黎孟枫等译)所著的分子克隆实验指南[M](北京：科学出版社，1992)中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。
以下实施例中，如无特别说明，DMEM培养基(#19217008，CORNING)包括4.5g/L的D-葡萄糖、4.0mM的L-谷氨酰胺及110mg/L的丙酮酸钠。293A细胞完全培养基包括DMEM培养基及10％的胎牛血清。ASC细胞完全培养基包括MSCM培养基(#7501，ScienCell)及5％的胎牛血清。内皮细胞分化培养基包括EBM-2基础培养液(CC-3171,LONZA)、细胞因子添加物(CC-4175,LONZA)，其中，细胞因子添加物与EBM-2基础培养液的质量比为5：95，细胞因子添加物包括胎牛血清、肝素、人源内皮细胞生长因子、抗坏血酸及两性霉素B。
实施例1
腺病毒重组质粒的构建
用Stbl3感受态细胞分别扩增pShuttle-CMV-ETV2质粒、pAdEasy-2质粒(addgene，Plasmid#16401)，并按照TIANGEN公司无内毒素质粒大提取试剂盒使用说明分别提取pShuttle-CMV-ETV2质粒、pAdEasy-2质粒，用NEB公司的PacI酶切pShuttle-CMV-ETV2质粒，电泳鉴定，回收线性pShuttle-CMV-ETV2质粒。其中，pShuttle-CMV-ETV2质粒为将ETV2转录因子插入质粒pShuttle-CMV(addgene，Plasmid#16403)内得到的。
将线性pShuttle-CMV-ETV2质粒和pAdEasy-2质粒以摩尔比为2：1混合，转入BJ5183E.coli感受态细胞中，使其进行胞内重组得到含有腺病毒重组质粒的菌液。并将该菌液涂布于卡那霉素抗性的LB培养皿中37℃倒置培养12小时，挑取白色、直径小的菌落转接到卡那霉素抗性的LB培养基中过夜培养。按照无内毒素质粒小提取试剂盒(Tiangen，DP118)使用说明提取并纯化腺病毒重组质粒，并通过基因序列测序检测阳性腺病毒重组质粒。将阳性腺病毒重组质粒在Stbl3感受态细胞中扩增，并使用无内毒素质粒大提试剂盒(Tiangen，DP117)使用说明提取阳性腺病毒重组质粒，将提取的腺病毒重组质粒分装并于-20℃保存。
实施例2
制备携带ETV2转录因子的腺病毒(即ADV-ETV2)
1)用NEB公司的Pac I酶切腺病毒重组质粒，再将酶切后的腺病毒重组质粒经过酚-氯仿抽提脱盐、乙醇沉淀回收，得到线性化的腺病毒重组质粒，并用无菌水溶解得到浓度不低于500ng/uL的线性化腺病毒重组质粒溶液。
2)接种293A细胞至35mm培养皿中，于37℃，5％CO2培养箱中培养至汇合度为60％。以每35mm培养皿中加入5ug线性化腺病毒重组质粒的量为基准，并按照每1ug线性化的腺病毒重组质粒添加3uL的转染剂的量，将线性化的腺病毒重组质粒及转染剂(FuGene 6(Promega))混合并作用15分钟，形成转染DNA复合体后，转染293A细胞，并于37℃、5％CO2培养，当293A细胞出现CPE现象时，1000rpm、5min离心收集沉淀(即细胞)，用少量上清液培养基重悬沉淀，并于液氮和37℃下重复冻融多次(5～10次)，12000rpm、4℃离心10min，收集上清，500μL/管分装，于-80℃保存，得到原代腺病毒。
3)接种293A细胞至100mm培养皿中，于37℃、5％CO2培养箱中培养，至汇合度为60％～70％时，吸去培养皿中的培养基，加入0.5mL的原代腺病毒和0.5mL的DMEM培养基，混匀，于37℃、5％CO2培养2h后，添加9mL的含5％FBS的DMEM培养基，继续培养至一半以上的转染后的293A细胞出现CPE现象(约为48h～72h)，培养结束后，1000rpm、5min离心收集沉淀(即细胞)，再加入1mL的病毒保存液并重悬，在液氮和37℃下重复冻融多次(5～10次)，12000rpm、4℃离心10min，收取上清，500uL/管分装，于-80℃保存，得到二代腺病毒。
4)用二代腺病毒感染293A细胞按照步骤3)的操作处理，得到含有携带ETV2转录因子的腺病毒的溶液。
5)在30mL的高速离心管中，加入15mL的1.40g/mL的CsCl的TE溶液(即1mL的Tris-EDTA缓冲液中溶解1.40g的CsCl)，再沿管壁缓慢加入15mL的含有携带ETV2转录因子的腺病毒的溶液，并于25000rpm、4℃离心2h，用一次性注射器抽取中间层(即白色带)，即为携带ETV2转录因子的腺病毒的浓缩液。将携带ETV2转录因子的腺病毒的浓缩液放入透析袋并置于生理盐水中，4℃搅拌12h，期间更换三次生理盐水，将透析后的携带ETV2转录因子的腺病毒的浓缩液加入等体积的2×腺病毒冻存buffer(10mM pH8.0的Tris、100mM的NaCl、0.1％的BSA及20％的glycerol)，得到携带ETV2转录因子的腺病毒(即ADV-ETV2)，分装，于-80℃保存。
对携带ETV2转录因子的腺病毒的病毒滴度的测定
1、空斑法
1)Day-1：将293T细胞接种至48孔细胞培养板，2×104个细胞/孔，体积为300μL，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
2)Day0：将携带ETV2转录因子的腺病毒进行连续8个10倍的梯度稀释。操作具体为：准备8个无菌的1.5mL的离心管，每管中加入90μL的293A细胞完全培养基，取11μL的含有携带ETV2转录因子的腺病毒加入到第一管中并混匀，再取11μL第一管混合也中加入到第二管中，继续相同的操作直到最后一管。
3)选取所需的培养孔，每个培养孔中吸去300μL的培养基，并加入100μL、一个稀释梯度的腺病毒溶液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养2h后，补加200uL的培养基，每个病毒浓度梯度设置三个重复孔。
4)置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h后，将一层0.5％的琼脂铺在细胞表面上，待琼脂凝固后加入300uL的培养基，培养过程中适当更换培养基以维持细胞正常生长。
5)Day10～20：观察细胞培养孔内空斑形成情况，拍摄相应病毒浓度的培养孔的照片，并统计空斑个数。
病毒滴度的计算：
根据相应病毒浓度的培养孔中空斑的情况，统计最后两个能观察到空斑的培养孔内的空斑个数。
携带ETV2转录因子的腺病毒的病毒滴度计算公式如下：
其中，X1表示倒数第一个观察到空斑的培养孔中空斑的平均数，X2表示倒数第二个观察到空斑的培养孔中空斑的平均数，V(x2)表示病毒量(μL)。
2、荧光法(适用于带荧光基因的pShuttle-CMV-ETV2)
1)Day-1：将293T细胞接种至96孔细胞培养板，5×103个细胞/孔，体积为100μL，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
2)Day0：将含有携带ETV2转录因子的腺病毒进行连续8个10倍的梯度稀释。操作具体为：准备8个无菌的1.5mL的离心管，每管中加入90μlL的293A细胞完全培养基，取11μL的含有携带ETV2转录因子的腺病毒加入到第一管中并混匀，再取11μL第一管混合也中加入到第二管中，继续相同的操作直到最后一管。
3)选取所需的培养孔，每个培养孔中吸去90μL的培养基，并加入90μL一个梯度的稀释后的腺病毒溶液，置于37℃，5％CO2培养箱中培养，培养过程中适当更换培养基以维持细胞正常生长，每个病毒浓度梯度设置三个重复孔。
4)置于37℃、5％CO2培养箱中培养48h后，加入100uL的新鲜293A细胞完全培养基，继续培养24h，用150μL的新鲜293A细胞完全培养基更换原始的培养基。
5)置于37℃、5％CO2培养箱中培养至96h后，观察荧光表达情况，拍摄相应病毒浓度的培养孔的照片(详见图1)，并统计带有荧光的细胞个数。
病毒滴度的计算：
根据相应病毒浓度的培养孔的荧光图片中GFP(绿色荧光蛋白)表达情况，并统计稀释至10-5μL的病毒液的培养孔及稀释至10-6μL的病毒液的培养孔的内有荧光的细胞个数。比如在加入稀释至10-5μL的病毒液的培养孔中观察到3个带有荧光的细胞，说明该孔中至少有3个病毒颗粒感染了293T细胞，在加入稀释至10-6μL的病毒液的培养孔中观察到1个带有荧光的细胞，说明该孔中至少有1个病毒颗粒感染了293T细胞。
携带ETV2转录因子的腺病毒的病毒滴度计算公式如下：
其中，T1表示稀释至10-5μL的病毒液的培养孔中细胞个数的平均数，T2表示稀释至10-6μL的病毒液的培养孔中细胞个数的平均数，V(T2)表示病毒量(mL)。
通过荧光法测定，实施例2的携带ETV2转录因子的腺病毒的病毒滴度为6.5×109PFUs/mL。
实施例3
脂肪间充质干细胞转分化制备血管细胞(即内皮细胞)
1、接种细胞
Day-1：将间充质干细胞(ASC细胞)接种至12孔板的12个孔中，3.5×104个细胞/孔，置于37℃、5.0％CO2培养箱中培养。
实验共分两组，每组两个平行对照，各组设置如下表1所示。
表1：分组情况
其中，“阴性对照”表示未进行病毒感染，“ADV-ETV2”表示携带ETV2转录因子的腺病毒。
2、病毒感染
1)Day0：消化12孔板中的ASC细胞，计细胞数。将ASC细胞完全培养基放入37℃水浴中加热，加入ADV-HR(山东维真生物科技有限公司)，得到含有10μg/mL的ADV-HR完全培养基，向含有10μg/mL的ADV-HR完全培养基加入携带ETV2转录因子的腺病毒，得到腺病毒感染培养基，其中，腺病毒感染培养基中的腺病毒滴度为180FPU/cell。弃去每个孔中的培养基，在第二组每孔中加入400μL的腺病毒感染培养基，置于37℃、5.0％CO2培养箱中培养3h，移除相应的感染培养基，加入37℃、10mL的内皮细胞分化培养基，继续培养。此后需要每天更换新鲜的内皮细胞分化培养基。每天在显微镜下观察病毒感染后的ASC细胞的形态变化。其中，ASC细胞从病毒感染起至开始转分化所用的时间与ASC细胞从病毒感染起至转分化完成所用的时间详见表2，ADV-ETV2感染后的第三天的ASC细胞形态如图2所示。
表2表示的是ASC细胞从病毒感染起至开始转分化所用的时间与ASC细胞从病毒感染起至完全转分化所用的时间。
表2
| 感染类型 | 开始转分化的时间(天) | 完成转分化所用的时间(天) |
| ADV-ETV2感染(1) | 2 | 3 |
| ADV-ETV2感染(2) | 2 | 3 |
从表2可以看出，ADV-ETV2感染后的第二天，ASC细胞的形态开始转变，并于感染后的第三天，光学显微镜下，ASC细胞形态几乎完全转分化成内皮细胞。从图2也可以看出，ADV-ETV2感染后的第三天，能够在普通光学显微镜下观察到ASC细胞的形态开始发生转变，ASC细胞向内皮细胞状变化。
实施例4
由脂肪间充质干细胞转分化成血管细胞(即内皮细胞)的FACS鉴定
1)按照实施例3的操作，用ADV-ETV2感染脂肪间充质干细胞，病毒感染后的第四天，弃去内皮细胞分化培养基，用PBS缓冲液漂洗2次。
2)用Trypsin-EDTA消化液(含有0.25％的Trypsin即胰蛋白酶及0.02％的EDTA)消化细胞5min。
3)用ASC细胞完全培养基终止消化，并以300g的离心速度离心收集细胞。
4)用500μL的4℃预冷的Flow buffer(PBS+1％BSA)重新悬浮细胞，以300g的离心速度离心收集细胞，并将收集的细胞重新悬浮于200μL的4℃预冷的Flow buffer，得到ADV-ETV2腺病毒感染的脂肪间充质干细胞悬浮液。
5)取四组1.5mL的离心管，每组三个离心管，各组编号为1#、2#、3#及4#，在1#和2#的离心管中均加入100μL等浓度的ADV-ETV2感染的脂肪间充质干细胞悬浮液，在3#和4#的离心管中均加入100μL的与其他管等浓度的未感染的脂肪间充质干细胞，并向1#和3#的离心管中均加入1μL的标记内皮细胞的荧光抗体anti-CD144(VE-CADHERIN，Alexafluor647)，向2#和4#的离心管中均加入1μL的PBS，将各组离心管置于冰上，避光孵育20min。
6)向各管中加入500μL的4℃预冷的Flow buffer，并以300g的离心速度离心收集细胞。再次加入500μL的4℃预冷的Flow buffer，置于冰上静置5min。静置结束后，以300g的离心速度离心收集细胞，再用500μL的4℃预冷的Flow buffer重悬，得到细胞悬液。将各管的细胞悬液移到流式管中，并在流式细胞仪进行分析。实验结果详见表3，且表3中表示三个离心管测定的平均值，1#和3#的细胞悬液的FACS鉴定的结果如图3所示。
表3表示的是每组离心管中ASC细胞中表达的anti-CD144的细胞的占比(％)。
表3
由表3可以看出，ADV-ETV2感染的ASC细胞中40％的细胞表达anti-CD144，表明ADV-ETV2感染的ASC细胞中40％的细胞转分化为内皮细胞，说明用携带ETV2转录因子的腺病毒感染脂肪间充质干细胞转分化成血管细胞的转分化率高。
实施例5
由脂肪间充质干细胞转分化成血管细胞(即内皮细胞)的QPCR鉴定
1)按照实施例3的操作，用ADV-ETV2感染脂肪间充质干细胞，感染后的第四天，弃去血管细胞分化培养基，用PBS缓冲液漂洗2次。
2)用Trypsin-EDTA消化液(含有0.25％的Trypsin即胰蛋白酶及0.02％的EDTA)消化细胞5min。
3)用ASC细胞完全培养基终止消化，并以300g的离心速度离心收集细胞。
4)按照DNA-free TM RNA Isolation for RT-PCR试剂盒(life，AM1914)的使用说明提取收集的细胞的RNA。
5)按照TAKALA逆转录试剂盒(RR047A)的使用说明将提取的RNA反转录成cDNA。
6)按照TAKALA荧光实时定量PCR试剂盒(RR420A)的使用说明对反转录得到的cDNA中进行定量分析，得到CDH5、Tal1、Kdr、Erg1、LMO2、Fli1、CD31、CD34、CD43及ETV2的表达量。测定结果详见图4。
实验结果表明，经携带ETV2转录因子的腺病毒转染后，脂肪间充质细胞转分化成的细胞中，上述与血管相关的基因均有表达，且表达均处于较高水平。
实施例6
脂肪间充质干细胞转分化成的血管细胞的性能测定
1、后肢缺血小鼠模型的构建
1)将雄性20g的BALBc/Nu小鼠进行深度麻醉后，置于小鼠手术台上，腹部向上，固定四肢。用70％的医用酒精对小鼠进行腹部和后肢擦拭消毒。
2)使用眼科剪在小鼠右侧的后肢内侧大腿处剪出一个长为5mm、开口平行于股静脉的创口，并分离创口处的皮下脂肪和筋膜组织，使股静脉和股动脉暴露。
3)用眼科镊挑出股总动脉，使用10号缝合线将股总动脉远端和近端均结扎，结扎间距为5mm。剪断和分离两个结扎间的动脉，并用8号缝合线缝合受伤创口。用多普勒血流灌注仪扫描确定后肢血流缺血情况。结果详见图5和图6。
从图5可以看出，小鼠左侧的后肢所在的A区域中有红色区域，说明此区域的血流灌注量较高，而小鼠右侧的后肢所在的B区域呈黑色，说明此区域出现明显的缺血症状。从图6中也可以看出，A区域的血流灌注量明显高于B区域的。综上，成功构建后肢缺血小鼠模型。
2、脂肪间充质干细胞转分化成的血管细胞修复后肢缺血小鼠模型的缺血后肢
1)按照实施例3的操作，用携带ETV2转录因子的腺病毒感染脂肪间充质干细胞，感染后的第3天后，以5×105cells/只的注射量计算，消化并收集转分化后形成的内皮细胞。同时，将未携带ETV2转录因子的腺病毒感染脂肪间充质干细胞进行同样的处理得到阴性腺病毒感染细胞。
2)用4℃的PBS对收集的内皮细胞进行漂洗，于300g离心收集细胞，再50uL、4℃的PBS重悬细胞，即为内皮细胞注射液(ADSC-ETV2)。同时，将阴性腺病毒感染细胞进行同样的处理，得到阴性腺病毒感染细胞注射液(ADSC-Mcherry)。
3)将后肢缺血小鼠模型分成四组，给四组小鼠分别注射37℃的内皮细胞注射液(ADSC-ETV2)、37℃的PBS(PBS)、37℃的阴性腺病毒感染细胞注射液(ADSC-Mcherry)及37℃的脂肪间充质干细胞(ADSC)，注射体积为50uL，注射方式为：用微量注射器将50uL的相应注射液分成5次，在后肢缺血小鼠模型的缺血区域中的5个注射点进行肌肉注射，各注射点的间距为1mm；另一组不进行注射，正常培养。
4)将注射后的四组小鼠均转移到洁净、恒温的饲养笼内饲养，饲养2周，用多普勒血流灌注仪扫描确认各组小鼠的后肢血流情况。实验结果详见图7和图8。
从图7可以看出，注射当天，四组小鼠的右侧后肢呈黑色，说明四组小鼠的右侧后肢处于缺血状态，饲养2周后，注射PBS、ADSC-Mcherry及ADSC的三组小鼠的右侧后肢仍然呈黑色，且这三组小鼠的右侧后肢由于缺血而出现明显的残缺，说明PBS、ADSC-Mcherry及ADSC对小鼠的缺血症状无作用，而注射ADSC-ETV2的小鼠的右侧后肢浅蓝色，且局部呈现绿色和红色，同时，该组小鼠的右侧后肢仍然健全，小鼠的缺血症状基本完全恢复，说明ADSC-ETV2能够修复小鼠截断的动脉，使得缺血的右侧后肢恢复供血。
请一并参阅图6和图8，从图8可以看出，注射当天，四组小鼠的右侧后肢的血流灌注值均处于较低水平，饲养2周后，由于创口恢复各组小鼠的右侧后肢的血流灌注值均有一定程度的增加，但是，注射ADSC-ETV2的小鼠的右侧后肢的血流灌注值增加最多，与图6的缺血小鼠模型健全的左侧后肢的血流灌注值基本相当，同样也说明注射ADSC-ETV2的小鼠的右侧后肢的缺血症状基本完全恢复。
综上，携带ETV2转录因子的腺病毒感染脂肪间充质干细胞转分化形成的血管细胞能够修复小鼠截断的动脉，使得缺血的右侧后肢恢复供血，治疗因血管断裂而形成的缺血病症。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种脂肪间充质干细胞转分化制备血管细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
用携带ETV2转录因子的腺病毒感染脂肪间充质干细胞，并于36℃～38℃下培养3小时～4小时，使得所述脂肪间充质干细胞发生重编程，其中，所述携带ETV2转录因子的腺病毒的病毒滴度为180PFU～240PFU；及
将重编程后的所述脂肪间充质干细胞置于血管细胞分化培养基中分化培养，得到所述血管细胞。
2.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞转分化制备血管细胞的方法，其特征在于，所述将重编程后的所述脂肪间充质干细胞置于血管细胞分化培养基中分化培养的操作中，所述血管细胞分化培养基含有质量百分含量为2％～5％的培养添加物，所述培养添加物包括胎牛血清、肝素、人源内皮细胞生长因子、抗坏血酸及两性霉素B，培养时间为72小时～96小时。
3.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞转分化制备血管细胞的方法，其特征在于，所述携带ETV2转录因子的腺病毒通过如下方法制备得到：
将ETV2转录因子插入质粒pShuttle-CMV内，得到pShuttle-CMV-ETV2质粒；
将所述pShuttle-CMV-ETV2质粒与pAdEasy-2质粒以摩尔比为1.5：1～2.5：1混合，并转入感受态细胞中，培养得到腺病毒重组质粒；及
用所述腺病毒重组质粒转染293A细胞，培养转染后的所述293A细胞并收集培养上清，得到所述携带ETV2转录因子的腺病毒。
4.根据权利要求3所述的脂肪间充质干细胞转分化制备血管细胞的方法，其特征在于，所述将所述腺病毒重组质粒转染293A细胞，培养转染后的所述293A细胞并收集培养上清的操作具体如下：
将所述腺病毒重组质粒线性化，用线性化的所述腺病毒重组质粒转染所述293A细胞，培养转染后的所述293A细胞并收集培养上清，得到原代腺病毒；
用所述原代腺病毒转染所述293A细胞并培养，收集培养上清，得到二代腺病毒；及
用所述二代腺病毒转染所述293A细胞并培养，收集培养上清，得到所述携带ETV2转录因子的腺病毒。
5.根据权利要求3所述的脂肪间充质干细胞转分化制备血管细胞的方法，其特征在于，所述用所述腺病毒重组质粒转染293A细胞的操作之前，预先培养所述293A细胞至汇合度为60％～70％。
6.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞转分化制备血管细胞的方法，其特征在于，所述用携带ETV2转录因子的腺病毒感染脂肪间充质干细胞的操作之前，还包括将所述脂肪间充质干细胞培养至汇合度为30％～40％。
7.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞转分化制备血管细胞的方法，其特征在于，所述脂肪间充质干细胞为人脂肪间充质干细胞，所述血管细胞为血管内皮细胞。
8.一种血管细胞，其特征在于，通过权利要求1～7任一项所述的脂肪间充质干细胞转分化制备血管细胞的方法制备得到。
9.如权利要求8所述的血管细胞在制备医用功能材料中的应用。
10.一种治疗血管疾病的药物，其特征在于，包括权利要求8所述的血管细胞。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108939092A (zh) * | 2017-05-19 | 2018-12-07 | 四川大学 | 肌肉细胞etv2基因表达促进剂在制备治疗肢端缺血性疾病的药物中的用途 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2015109833A (ja) * | 2013-11-08 | 2015-06-18 | 学校法人慶應義塾 | 線維芽細胞から血管内皮細胞を製造する方法 |
| WO2015133792A1 (ko) * | 2014-03-03 | 2015-09-11 | 국립대학법인 울산과학기술대학교 산학협력단 | 체세포로부터 혈관 전구 세포로의 직접교차분화 유도용 조성물 및 이의 용도 |
| KR20150104049A (ko) * | 2014-03-03 | 2015-09-14 | 국립대학법인 울산과학기술대학교 산학협력단 | 체세포로부터 혈관 전구 세포로의 직접교차분화 유도용 조성물 및 이의 용도 |
| CN106282238A (zh) * | 2015-06-08 | 2017-01-04 | 深圳市伊思科生物科技有限公司 | 细胞的转分化方法 |
| CN106609260A (zh) * | 2015-10-27 | 2017-05-03 | 南京医科大学附属南京儿童医院 | 提高脐带间充质干细分化为血管内皮细胞效率的一种方法 |
-
2018
- 2018-01-16 CN CN201810041594.9A patent/CN110042125A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2015109833A (ja) * | 2013-11-08 | 2015-06-18 | 学校法人慶應義塾 | 線維芽細胞から血管内皮細胞を製造する方法 |
| WO2015133792A1 (ko) * | 2014-03-03 | 2015-09-11 | 국립대학법인 울산과학기술대학교 산학협력단 | 체세포로부터 혈관 전구 세포로의 직접교차분화 유도용 조성물 및 이의 용도 |
| KR20150104049A (ko) * | 2014-03-03 | 2015-09-14 | 국립대학법인 울산과학기술대학교 산학협력단 | 체세포로부터 혈관 전구 세포로의 직접교차분화 유도용 조성물 및 이의 용도 |
| CN106282238A (zh) * | 2015-06-08 | 2017-01-04 | 深圳市伊思科生物科技有限公司 | 细胞的转分化方法 |
| CN106609260A (zh) * | 2015-10-27 | 2017-05-03 | 南京医科大学附属南京儿童医院 | 提高脐带间充质干细分化为血管内皮细胞效率的一种方法 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108939092A (zh) * | 2017-05-19 | 2018-12-07 | 四川大学 | 肌肉细胞etv2基因表达促进剂在制备治疗肢端缺血性疾病的药物中的用途 |
| CN108939092B (zh) * | 2017-05-19 | 2021-12-17 | 四川大学 | 肌肉细胞etv2基因表达促进剂在制备治疗肢端缺血性疾病的药物中的用途 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20190723 |