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詹小舒
罗东章
李东升
陈志胜
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Abstract

本发明提供了一种犬MSC外泌体制剂及其制备方法。制备方法包括步骤：无外泌体胎牛血清的制备和犬MSC来源外泌体的分离。该制备方法制得的犬MSC外泌体制剂，其提取到的外泌体体积小，容易在体内循环，易于到达损伤组织；并且直接使用外泌体能保证其在体内剂量稳定，一定程度上保证了治疗效果且外泌体无任何毒副作用，为临床大规模使用奠定了基础。可用于以犬为实验模型，开发一种治疗皮肤损伤的犬MSC外泌体制剂，能以伤口周围注射或者直接敷于创面的方式对犬的皮肤伤口进行修复，抑制炎症发生，加速愈合并减少瘢痕形成。

Description

一种犬MSC外泌体制剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种可用于治疗犬皮肤损伤的犬MSC外泌体制剂，以及其制备方法。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSC)是由中胚层发育而来，存在于机体各个组织中的成体干细胞，其具有自我更新和多向分化的能力。治疗作为一种新兴的疑难疾病治疗手段，近年来在宠物临床甚至是人类临床上掀起了一阵研究热潮。许多研究结果表明其在多种疾病治疗上具有出人预料的效果，但人们一直将其效果归功于MSC到达损伤组织后快速增殖并分化为受损细胞，逐渐替代了原本受损组织。后来的研究中发现，使用MSC来源的外泌体治疗组织损伤具有与MSC直接治疗相同的效果，人们才意识到其对损伤的修复作用主要归因于MSC的旁分泌作用，而外泌体作为旁分泌的主要作用成分，其分离提取及应用具有重要临床意义。皮肤损伤作为最常见的损伤类型，有多种致病因素如烧伤烫伤、机械损伤，特别是战争时有发生、车祸接连不断的今天，皮肤损伤的修复显得尤为重要，而当前处理方法容易继发感染，伤口愈合时间长，且愈后多形成疤痕，无毛囊再生，影响美观。
已有多项研究证明MSC来源外泌体具有抑制炎症、促进皮肤细胞增殖和血管再生、减少肌成纤维细胞积累的作用。
发明内容
为了克服上述技术的缺点和不足，本发明提供一种间充质干细胞来源的外泌体制剂的制备和使用方法，该制剂能加速伤口愈合，抑制炎症的发生。
为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：
一种犬MSC外泌体制剂的制备方法，包括步骤：
1)无外泌体胎牛血清的制备：
用0.22um的滤膜过滤胎牛血清，滤液置于超高速离心管中，4℃，120000g超高速离心90min，收集上清液；
2)犬MSC来源外泌体的分离：
用10％无外泌体胎牛血清、1％双抗、1％L-谷氨酰胺和88％DMEM基础培养基配制完全培养基，以制得的完全培养基传代培养MSC，取第3-5代收集上清在4℃，300g离心10min除去死细胞；收集上清后在4℃，16500g离心20min除去细胞碎片；收集上清后用0.22um的滤膜过滤；收集上清后在4℃，120000g超高速离心90min；去上清后，用生理盐水重悬沉淀，再次以4℃，120000g超高速离心90min；去上清后，用生理盐水重悬沉淀，收集悬液即为犬MSC外泌体制剂。
其中，步骤1)收集的上清液还需于超净工作台中用0.22um的滤膜过滤除菌。
进一步，制得的犬MSC外泌体制剂保存于-80℃冰箱中。
本发明的有益效果是：
A.提取到的外泌体体积小，容易在体内循环，易于到达损伤组织；
B.直接使用外泌体能保证其在体内剂量稳定，一定程度上保证了治疗效果且外泌体无任何毒副作用，为临床大规模使用奠定了基础。
附图说明
图1是犬MSC外泌体制剂的电镜扫描图；
图2是愈伤组织的模型组与犬MSC外泌体制剂组的1～4周切面对比图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1、犬UC-MSC的制备
1)犬UC-MSC的原代培养
取新生犬脐带组织，在超净工作台中剔除膜组织和血管组织，剩余的胶质组织清洗干净后用无菌解剖剪剪至1mm2大小，然后将组织转移至15mL离心管中，加入0.1mg/mL的Ⅰ型胶原酶，拧紧瓶盖置于37℃水浴锅中消化4h，待组织块基本消化完毕后用100目细胞筛过滤，滤液离心1200rpm，5min，弃上清，沉淀用DMEM完全培养基(88％DMEM基础培养基+1％双抗溶液+1％L-谷氨酰胺)重悬，将悬液接种至细胞培养皿中，然后置于37℃、5％CO2培养箱中培养；
2)犬UC-MSC的传代培养
细胞培养至24h时，弃去原培养液，用1×PBS清洗两次后换用新鲜培养基，以后每隔2-3天换液一次。每天观察细胞生长状况，直至细胞铺满培养皿的80％时，用0.25％胰蛋白酶进行消化和传代；
3)犬UC-MSC生长曲线的制作
分别取第2、5、8代UC-MSC，用胰酶消化后，调整细胞密度为1×104/mL，每孔0.5mL细胞悬液接种至明胶包被的24孔板中，每天同一时间取3孔细胞进行消化后计数求得平均值，连续计数8天，未被消化的孔每隔2-3天进行换液一次，计数完毕以细胞生长天数为横坐标，细胞密度为纵坐标绘制生长曲线；
4)犬UC-MSC的鉴定
4-1)取生长良好的P3代犬UC-MSC，用胰酶消化后接种于明胶包被的24孔板中，将细胞培养过夜或待细胞贴壁，取出进行免疫荧光鉴定其细胞表面蛋白CD34、CD44、CD90的表达情况；
4-2)取生长良好P3代犬UC-MSC，用胰酶消化后接种于明胶包被的12孔板中，然后根据MSC成骨、成脂诱导分化培养基的使用说明对细胞进行成骨和成脂诱导分化，待分化完成后分别进行茜素红和油红O染色。
实施例2、犬UC-MSC来源外泌体制剂的制备
1)犬UC-MSC来源外泌体的分离
1-1)无外泌体胎牛血清的制备
用0.22um的滤膜将胎牛血清过滤除去大于220nm的微粒后收集滤液，置于超高速离心管中，4℃，120000g超高速离心90min，小心收集上清，再于超净工作台中用0.22um的滤膜过滤除菌后备用；
1-2)犬UC-MSC来源外泌体的分离
用含10％无外泌体胎牛血清、1％双抗、1％L-谷氨酰胺和88％DMEM基础培养基配制成的完全培养基培养P3-P5代UC-MSC，收集上清在4℃，300g离心10min除去死细胞；收集上清后在4℃，16500g离心20min除去细胞碎片；收集上清后用0.22um的滤膜过滤除去大于220nm的微粒；收集上清后在4℃，120000g超高速离心90min；去上清后，用生理盐水重悬沉淀，重复前一步骤，4℃，120000g超高速离心90min；去上清后，用生理盐水重悬沉淀，收集次外泌体悬液，保存于-80℃冰箱中备用；
2)犬UC-MSC来源外泌体浓度测定
使用BCA试剂盒，按照使用说明操作，最后在酶标仪上选择波长562nm测OD值，然后根据制得的标准曲线计算外泌体样品中蛋白浓度；
3)犬UC-MSC来源外泌体的鉴定
3-1)透视电镜鉴定外泌体形态
将外泌体样品溶液滴于碳支持膜上静置15min后用滤纸吸走周围液体，再往膜上滴加3％磷钨酸溶液，静置10min后用滤纸吸走周围水分后自然晾干。使用透视电镜HitachiTEM System观察外泌体形态，采集照片如图1所示；
3-2)Western Blot鉴定外泌体表面蛋白CD9和CD81表达情况。
实施例3、犬UC-MSC来源外泌体制剂对犬皮肤损伤治疗试验
1)犬皮肤损伤模型的建立
取品种、年龄、及生长状况相同的健康小狗12只，随机分成两组，每组6个重复。犬麻醉后进行局部脱毛、消毒、铺巾，无菌操作下在犬背正中、肩胛骨以下做4×4cm的正方形皮肤全层损伤模型，手术全过程由同一个实验员操作，避免太大误差。
2)犬UC-MSC来源外泌体制剂的局部注射治疗
伤口模型建立后，随即在伤口周围分4个点进行皮下注射药物，每个点距离切口1cm，入针方向朝着伤口，避免针尖穿透皮层。治疗组皮下注射1ml含300ug/ml外泌体的溶液，模型组则皮下注射1ml的生理盐水。注射完毕后伤口敷上3M Tegaderm Film敷料，将实验犬移出手术室，观察是否出现异常，直至其完全清醒。
3)伤口评估及治疗效果评价
治疗后每天观察伤口情况，测量体温；于造模前和治疗第3、8、15天分别采血做血常规检查；于第7、14、21天分别绘出未愈合伤口范围，并计算面积，求得伤口愈合率；于第2、3、4周分别取下皮肤创面组织固定后制作组织切片，观察伤口愈合情况；记录伤口完全愈合的天数。
结果显示：局部注射MSC来源外泌体后对其注射部位进行观察，注射部位都无红肿热痛等不良反应，吃喝精神状态均正常。通过观察外泌体组和模型组的创面可知，在第3天时，模型组出现了较为严重的炎症反应而外泌体组则伤口干爽，这一点在白细胞数量的变化中也可体现。如图2所示通过比较外泌体组和模型组的创面面积可知，在治疗1-2周时，外泌体组的创面面积较模型组小，外泌体组的平均完全愈合时间为21天，而模型组为24天。

Claims (4)

1.一种犬MSC外泌体制剂的制备方法，包括步骤：
1)无外泌体胎牛血清的制备：
用0.22um的滤膜过滤胎牛血清，滤液置于超高速离心管中，4℃，120000g超高速离心90min，收集上清液；
2)犬MSC来源外泌体的分离：
用10％无外泌体胎牛血清、1％双抗、1％L-谷氨酰胺和88％DMEM基础培养基配制完全培养基，以制得的完全培养基传代培养犬MSC，取第3-5代收集上清在4℃，300g离心10min除去死细胞；收集上清后在4℃，16500g离心20min除去细胞碎片；收集上清后用0.22um的滤膜过滤；收集上清后在4℃，120000g超高速离心90min；去上清后，用生理盐水重悬沉淀，再次以4℃，120000g超高速离心90min；去上清后，用生理盐水重悬沉淀，收集悬液即为犬MSC外泌体制剂。
2.根据权利要求1所述的犬MSC外泌体制剂的制备方法，其特征在于，步骤1)收集的上清液还需于超净工作台中用0.22um的滤膜过滤除菌。
3.根据权利要求1所述的犬MSC外泌体制剂的制备方法，其特征在于，制得的犬MSC外泌体制剂保存于-80℃冰箱中。
4.根据权利要求1～3任一项所述的制备方法所获得的犬MSC外泌体制剂。
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