CN110403958A - 干细胞活性肽雾化吸入法治疗肺纤维化及雾化剂的备制 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种干细胞活性肽雾化吸入法治疗肺纤维化的方法及雾化剂备制。其中主要涉及高浓度的干细胞活性肽的提取及其备制和病人雾化吸入的方法。干细胞在培养过程中会分泌多种细胞因子，包括干细胞活性因子(stem cell factot，SCF)、干细胞外泌体(MSC‑exo)、干细胞再生肽(Stem cell peptide)。这些细胞因子能够深入肺组织内膜基底层，促进组织细胞分化、血管新生、肉芽组织生长，促使受损组织结构再生修复，减少疤痕结缔组织的产生，减少创面组织的细菌感染及炎症反应。本发明采用人胚胎肺干细胞进行扩增、培养、鉴定、纯化、提取，制成冻干制剂。用雾化吸入的方法治疗因不同因素所致的肺纤维化，适用于肺纤维化修复及治疗。

Description

干细胞活性肽雾化吸入法治疗肺纤维化及雾化剂的备制

技术领域

本发明涉及到细胞工程学和医疗治疗学。涉及到应用于治疗肺纤维化的干细胞再生肽的方法及其制剂的备制。具体涉及到应用人胚胎肺干细胞进行扩增、培养、鉴定、纯化、提取，制成冻干制剂。用雾化吸入的方法治疗因不同因素所致的肺纤维化。

背景技术

干细胞具有分化成为体内所有类型细胞的能力，在再生医学治疗、体外疾病模拟、药物筛选等方面具有广阔的应用前景。干细胞技术在近些年取得了突飞猛进的发展，特别是诱导多能性干细胞的出现使干细胞领域经历了一场巨大的变革。干细胞和干细胞再生因子的研究给很多疾病的修复和改善带来了希望。1962年Cohen首次发现了表皮生长因子(Epidermal growth factor，EGF)一类体内活性物质。由于他在EGF上的特殊贡献，1989年获得了诺贝尔医学与生理奖。近年来的一些研究发现hEGF具有较多的生物效应，基于这些活性因子的生物特性，hEGF已应用于医学临床领域，除了烧伤、烫伤、胃肠道的修复以外，还主要用于促进表皮、神经等器官细胞的修复和再生，广泛用于术后皮肤伤口的愈合、激光的伤口愈合、皮肤溃疡的愈合。特别是诱导多能性干细胞的出现使干细胞领域经历了一场巨大的变革。

2014年中国医学科学院池颖等成功的进行了胎儿肺部组织来源的间充质干细胞(FL-MSCs)转变成为诱导多能干细胞(iPS细胞)研究。使用Yamanaka四因子体系对FL-MSCs进行诱导，形成类似人胚胎干细胞(human embryonic stem cells，hES细胞)的克隆，采用核型分析、STR检测分析以及畸胎瘤形成实验初步验证获得的克隆为iPS。

多能干细胞(iPSCs)的活性肽体系中含有多种大量的活性成分，如：干细胞生长因子(SCF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、内皮细胞生长因子(VEGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、细胞集落刺激因子、白细胞介素(IL)、胶原蛋白、透明质酸等80余种活性物质。研究证明干细胞分泌的活性肽大多能够很好的与细胞膜融合，从而将内部的活性物质运输到靶向细胞的内部发挥作用。目前，已经有将间充质干细胞应用于肺损伤及肺纤维化修复的报道，但是由于活性细胞的存活时间短，保存、运输条件要求苛刻，效应也就有限。

中国农业科学院生物技术研究所赵宏，刘昱辉研究证实，hEGF是由53个氨基酸组成的小肽，分子量为6045Da，等电点p1为4.6，对热稳定，耐受胰蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶。hEGF在-20℃中能保持长期稳定；在中性pH条件下100℃煮沸30min仍保持稳定，但在100℃0.1mol/L NaOH或0.2mol/L HCI中失活。这为干细胞再生肽的备制提供了条件依据。

发明内容

本发明涉及的一种使用干细胞活性肽雾化吸入法治疗肺纤维化及雾化剂的备制，FL-MSCs转变成iPS的活性肽用于治疗肺纤维化的方法。其方法主要采用人胚胎肺干细胞进行扩增、培养、鉴定、纯化、提取，制成冻干制剂。使用时生理盐水按要求溶解、稀释，用雾化吸入的方法治疗因不同因素所致的肺纤维化，适用于肺纤维化修复及治疗。

为了实现上述发明内容，本发明实现的技术方案是采用FL-MSCs转变成iPS的活性肽雾化吸入治疗肺纤维化。为治疗肺纤维化提供一种安全、有效、使用方便的雾化剂。其雾化剂的备制步骤：

(1)从细胞库中获取胎儿肺部组织来源的间充质干细胞(FL-MSCs)转变成为诱导多能干细胞(iPS细胞)。

(2)所获得的FL-MSCs 2～3d换液1次，当细胞生长至80％融合时使用0.25％胰酶进行消化，然后使用FBS终止反应，离心并收集。将细胞加完全培养基1∶3的比例接种到T75培养瓶中，即为第2代细胞，此后按以上方法进行细胞扩增。

(3)取第3代FL-MSCs以1×104/孔的密度接种到共聚焦培养皿中，培养48h后吸弃上清。然后将细胞进行固定、破膜，并分别加入角蛋白以及c-Myc、Oct4、Nanog和Nestin四个干性相关因子的一抗于4℃下避光孵育过夜，第二天加入带有荧光标记的二抗室温避光孵育。四个加入干细胞因子抗体的小皿中加入rhodamine phalloidin室温避光孵育20min。最后加入DAPI室温避光孵育5min，每孔加入2％多聚甲醛1mL，使用共聚焦显微镜进行观察检测。

(4)FL-MSCs表型的流式检测；

(5)FL-MSCs的分化能力检测；

(6)克隆形成；

(7)FL-iPS和FL-MSCs的染色体分析、对照STR检测，收集沉淀后以1mL固定液重悬，然后进行滴片和染色步骤，并进行显微镜观察分析。

(8)第二批次细胞融合度达90％-95％，收取细胞培养上清，3000-4500g条件下离心5-8min除去沉淀，取离心后上清备用；

(9)取培养的第三批次细胞，当细胞融合度达到70％-80％，以生理盐水清洗第三批次细胞2次，用步骤(8)中细胞培养上清液进行培养12-24小时后，细胞融合度达90％-95％，收取细胞培养上清液，3000-4500g条件下离心5-8min除去沉淀，取离心后上清液备制成为冻干粉剂；

(10)上清液以0.22um滤膜过滤，提取其中的干细胞再生肽，以20-40ml的生理盐水重悬分离获得的活性肽制备冻干粉，放于4℃冰箱中保存，备用。

上述的制备方法制得的含FL-iPS治疗肺纤维化雾化剂，用于治疗多种因素所致的肺纤维化。其步骤：

(1)使用一次性氧气雾化吸入器(neblizer)包括盛接FL-MSCs储盛灌、吸入管口、雾化吸入含嘴：

(2)取吸氧装置一套，湿化瓶不加水，链接一次性氧气雾化吸入器；

(3)以无菌注射器抽取无菌生理盐水10ml稀释于1g/支装FL-MSCs安瓶，注入FL-MSCs储盛灌内；

(4)雾化器FL-MSCs储盛灌与吸入管旋紧链接，下端与氧气装置链接；

(5)雾化吸入含嘴与雾化器吸入管口一端相连。

(6)调节氧气装置，检查雾化状态，选择合适浓度，病人雾化吸入。

本发明在医学上应用意义主要是第一次把胎儿肺部组织来源的间充质干细胞(FL-MSCs)转变成为诱导多能干细胞(iPS细胞)的再生肽，进行包括培养、鉴定、纯化、提取，制成冻干制剂。用雾化吸入的方法治疗因不同因素所致的肺纤维化。使用高浓度的iPS活性因子直接通过氧气雾化器吸入肺部，直接作用于肺部组织，可促进肺内膜组织分化、血管新生建立、肉芽组织生长，促进损伤组织结构再生修复，减少肺组织纤维化，改善肺部内环境，调节免疫微环境，减少肺部感染机会和炎性机会。

Claims (3)

1.一种干细胞活性肽雾化吸入法治疗肺纤维化及雾化剂的备制，应用于治疗肺纤维化的干细胞再生肽(tem cell peptide)(又称干细胞活性因子Stem cell factor SCF)及其制剂的备制。具体涉及到应用人胚胎肺干细胞进行扩增、培养、鉴定、纯化、提取，制成冻干制剂。用雾化吸入的方法治疗因不同因素所致的肺纤维化。

本干细胞再生肽的培养、提取、雾化剂备制包括以下步骤：

(1)从细胞库中获取胎儿肺部组织来源的间充质干细胞(FL-MSCs)转变成为诱导多能干细胞(iPS细胞)。

(2)所获得的FL-MSCs每隔2～3d换液1次，当细胞生长至80％融合时使用0.25％胰酶进行消化，然后使用FBS终止反应，离心并收集。将细胞加完全培养基1∶3的比例接种到T75培养瓶中，即为第2代细胞，此后按以上方法进行细胞扩增。

(3)取第3代FL-MSCs以1×10 4/孔的密度接种到共聚焦培养皿中，培养48h后吸弃上清。然后将细胞进行固定、破膜，并分别加入角蛋白以及c-Myc、Oct4、Nanog和Nestin四个干性相关因子的一抗于4℃下避光孵育过夜，第二天加入带有荧光标记的二抗室温避光孵育。四个加入干细胞因子抗体的小皿中加入rhodamine phalloidin室温避光孵育20min。最后加入DAPI室温避光孵育5min，每孔加入2％多聚甲醛1mL，使用共聚焦显微镜进行观察检测。

(4)FL-MSCs表型的流式检测：取第3代FL-MSCs以2×105/管的密度分装至流式检测管中，分别加入小鼠抗人单克隆抗体CD34-APC、CD44-APC、CD54-APC、CD90-APC；CD31-FITC、HLA-ABC-FITC、HLA-DR-FITC；CD14-PE、CD29-PE、CD45-PE、CD73-PE、CD105-PE、CD106-PE、CD133-PE、CD144-PE、CD166-PE以及小鼠IgG1同型对照抗体APC、FITC、PE各5μL。将加入抗体的细胞于4℃下孵育30min后再用1mLPBS重悬细胞，离心后取出上清，用400μL PBS重悬细胞，进行流式检测分析。

(5)FL-MSCs的分化能力检测：取第3代FL-MSCs以3×10 4/孔的密度接种于6孔板中进行培养，24h后加入成脂完全培养基(含有10％FBS、1μmol/L地塞米松、0.5mmol/L IBMX、10mg/L胰岛素和100μmol/L消炎痛的L-DMEM培养基)和成骨完全培养基(含有10％FBS、0.1μmol/L地塞米松、0.2mmol/L抗坏血酸磷酸盐和10mmol/Lβ-甘油磷酸的L-DMEM培养基)继续培养，每隔3d换液1次。当诱导培养到第21d的时候，成脂诱导分化的细胞进行油红O染色、成骨诱导分化的细胞进行Von kossa染色，观察诱导分化效果。

(6)克隆形成：取第3代FL-MSCs以1×105/孔的密度接种到6孔板中用完全培养基培6h，然后更换病毒感染培养基(含有抗生素因子慢病毒的MEMα培养基)并加入5μg/mL的硫酸鱼精蛋白。24h后吸弃上清，PBS清洗后加入新鲜的病毒感染培养基，培养72h后将细胞消化以2.5×105～5×105/皿的密度接种于预铺了MEF的100mm培养皿中，并加入病毒感染培养基培养48h将病毒感染培养基吸弃，更换为ES培养基，并加入10μmol/L的Y-27632。每天更换预热的新鲜hES培养基，直到出现类似ES的FL-iPS集落且细胞数达到50～150个挑取单克隆并传代，此克隆即为第一代FL-iPS。

(7)FL-iPS和FL-MSCs的染色体分析、对照STR检测第4代FL-iPS和FL-MSCs长到60％-80％融合时加入终0.4μg/mL的秋水仙碱培养6～12h，收集细胞分别加入10mL预热的0.075mol/L KCL于37℃低渗处理30min。加入2mL甲醇-冰醋酸固定，然后收集细胞沉淀，加入10mL固定液于4℃静置3 0min，再次收集沉淀重复以上步骤。收集沉淀后以1mL固定液重悬，然后进行滴片和染色步骤，并进行显微镜观察分析。

(8)第二批次细胞融合度达90％-95％，收取细胞培养上清，3000-4500g条件下离心5-8min除去沉淀，取离心后上清备用；

(9)取培养的第三批次细胞，当细胞融合度达到70％-80％，以生理盐水清洗第三批次细胞2次，用步骤(8)中细胞培养上清液进行培养12-24小时后，细胞融合度达90％-95％，收取细胞培养上清液，3000-4500g条件下离心5-8min除去沉淀，取离心后上清液备用；

(10)上清液以0.22um滤膜过滤，提取其中的干细胞活性肽，以20-40ml的生理盐水重悬分离获得的活性肽制备冻干粉，放于4℃冰箱中保存，备用。

2.根据权利要求1所述含胎儿肺部组织来源的间充质干细胞(FL-MSCs)转变成为诱导多能干细胞(iPS细胞)的活性肽，用公开的方法制成冻干粉：(1)将收取的FL-MSCs上清液以0.22um滤膜过滤，提取其中的干细胞活性肽，以20-40ml的生理盐水重悬分离获得的活性肽。

3.根据权利要求1所述含胎儿肺部组织来源的间充质干细胞(FL-MSCs)转变成为诱导多能干细胞(iPS细胞)的活性肽，采用氧气雾化吸入法治疗肺纤维化，一是增加病人肺内氧浓度，二是有利于将FL-MSCs深入肺组织内膜基底层，便于纤维病变肺组织修复。具体方法：

(1)使用一次性氧气雾化吸入器(neblizer)包括盛接FL-MSCs储盛灌、吸入管口、雾化吸入含嘴：

(2)取吸氧装置一套，湿化瓶不加水，链接一次性氧气雾化吸入器；

(3)以无菌注射器抽取无菌生理盐水10ml稀释于1g/支装FL-MSCs安瓶，注入FL-MSCs储盛灌内；

(4)雾化器FL-MSCs储盛灌与吸入管旋紧链接，下端与氧气装置链接；

(5)雾化吸入含嘴与雾化器吸入管口一端相连。

(6)调节氧气装置，检查雾化状态，选择合适浓度，病人雾化吸入。