CN112121063A - 外泌体在制备治疗间质性肺损伤和/或肺纤维化的药物中的应用 - Google Patents

外泌体在制备治疗间质性肺损伤和/或肺纤维化的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了外泌体在制备治疗间质性肺损伤和/或肺纤维化的药物中的应用，属于药物技术领域。本发明首次发现外泌体可以用于制备治疗间质性肺损伤和/或肺纤维化的药物，既开拓了外泌体新的应用领域，也开拓可新的治疗间质性肺损伤和肺纤维化药物，具有广阔的应用前景。

Description

外泌体在制备治疗间质性肺损伤和/或肺纤维化的药物中的 应用
技术领域
本发明涉及外泌体在制备治疗间质性肺损伤和/或肺纤维化的药物中的应用，属于药物技术领域。
背景技术
2019新型冠状病毒(2019-nCoV)引发病毒性肺炎，常见症状有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。虽然采用国家卫健委推出的诊疗方案，采用一些抗病毒药物可能具有一定效果，但目前对于新型冠状病毒所致疾病缺乏特异治疗方法。75％数量的2019-nCoV患者早期呈现多发小斑片影及间质改变，以肺外带明显。14％数量的2019-nCoV患者双肺出现多发磨玻璃影、浸润影。
2003年SARS患者出现肺部弥漫性的肺泡损害与气管上皮基底膜及肺泡壁透明样变，间质纤维化，从而引起肺的氧合障碍，表现低氧血症、呼吸衰竭。同时，激素是以往SARS和肺部衰竭的常用治疗药，但剂量大、用药时间长的激素使用造成SARS后的幸存者大多有肺纤维化和间质性肺病(Interstitial Lung Disease,ILD)。新型冠状病毒所导致的75％数量的病人在早期同样出现肺间质改变，因此间质性肺病成为新型冠状疾病治疗的一个重要方面。
间质性肺疾病(ILD)是一组肺异质性疾病，包括200多个以肺实质广泛纤维化和炎性异常为特征的肺实质病变。发病原因是肺泡上皮细胞的异常修复造成细胞外基质的大量分泌，进而造成肺组织结构和功能的不可逆损伤，形成肺纤维化。肺纤维化主要累及肺泡和肺间质的弥散性、致死性的肺部疾病，是所有ILD的终末期。肺纤维化是以成纤维细胞增殖及大量细胞外基质聚集并伴炎症损伤、组织结构破坏为特征的一大类肺疾病的终末期改变，也就是正常的肺泡组织被损坏后经过异常修复导致结构异常(疤痕形成)。绝大部分肺纤维化病人病因不明(特发性)，这组疾病称为特发性间质性肺炎(IIP)，是间质性肺病中一大类。而特发性间质性肺炎(IIP)中最常见的以肺纤维化病变为主要表现形式的疾病类型称为特发性肺纤维化(IPF)，是一种能导致肺功能进行性丧失的严重的间质性肺疾病。特发性肺纤维化发病率和死亡率逐年增加，诊断后的平均生存期仅2.8年，死亡率高于大多数肿瘤，被称为一种“类肿瘤疾病”。
诸多疾病包括慢性阻塞性支气管肺炎、肺气肿、风湿免疫性疾病、心血管药物、吸入风尘、病毒及病原体感染和遗传等都可能导致间质性肺病和肺纤维化。间质性肺病是目前临床治疗的一个难点，尚没有有效的治疗方案。根据现有的临床治疗指南，常用的药物包括糖皮质激素、免疫抑制剂、细胞毒性药物和抗弹力蛋白酶药物，但在临床上的有效率极低。
外泌体(exosome)是一种直径50nm-90nm的囊泡，可由多种不同的哺乳动物细胞分泌形成。外泌体包含其来源细胞的各种分子成分，包括蛋白质和RNA。尽管外泌体蛋白质组成随来源的细胞和组织而变化，但大多数外泌体均包含进化学保守的一类蛋白质分子。给定蛋白质大小和构型以及包装参数的某些假设，单个外泌体的蛋白质含量约为20,000个分子。外泌体也曾被报道可携带双链DNA。
外泌体可以通过膜囊泡运输将分子从一个细胞转移到另一个细胞，从而影响免疫系统，例如树突状细胞和B细胞，并且可能在介导对病原体和肿瘤的适应性免疫反应中发挥功能性作用。因此，积极研究外泌体可能在细胞间信号传导中发挥作用的科学家，通常假设其包装的RNA分子的传递可以介导生物学效应。例如，外泌体中的mRNA影响受体细胞中的蛋白质产生。但是，另一项研究表明，间充质干细胞(MSC)分泌的外泌体中的miRNA主要是成熟前的miRNA，而不是成熟的miRNA6。因为这项研究的作者在这些外泌体中未发现RNA诱导的沉默复合体相关蛋白，所以他们认为MSC外泌体中只有pre-miRNA而不是成熟的miRNA在受体细胞中具有生物活性。据报道，将多种miRNA加载到外泌体中涉及多种机制，包括miRNA序列中的特定基序，与位于外泌体的lncRNA的相互作用，与RBP的相互作用以及Ago的翻译后修饰。
由于外泌体在细胞间分泌和运输中的天然作用，来自人类干细胞不同来源的外泌体可以起到对不同细胞的不同的治疗作用。它们是具有自体来源的天然生物制剂，可保持货物的完整性和稳定性。此外，外泌体膜含有某些蛋白质，该蛋白质与受体细胞表面的特定受体具有结合亲和力。因此，它们可以选择性地靶向感兴趣的细胞类型，并通过miRNA货物操纵分子成分，从而为个性化医学和基因治疗提供有利的治疗工具。另外，外泌体在细胞之间传递RNA，被认为是一种新颖而有效的控制细胞间信号传递的手段。
目前，尚未有关外泌体可用于制备治疗间质性肺损伤和肺纤维化药物的相关报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供外泌体在制备治疗间质性肺损伤和/或肺纤维化的药物中的应用。本发明首次发现外泌体可以用于制备治疗间质性肺损伤和/或肺纤维化的药物，既开拓了外泌体新的应用领域，也开拓可新的治疗间质性肺损伤和肺纤维化药物，具有广阔的应用前景。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：外泌体在制备治疗间质性肺损伤和/或肺纤维化的药物中的应用。
本发明的原理是：
本申请的发明人通过培养iPS、MSC和EPC三种细胞，收集这三种细胞的外泌体，应用这三种外泌体的混合物，采用雾化或静脉输注的方式，达到抗炎、修复肺上皮组织的作用，可以促进血管新生和募集周围的毛细血管，从而帮助患者重新建立新的血气交换单元，改善其血氧分压和氧饱和度，并能防治、阻止间质性肺病进一步进展为肺纤维化。因此，外泌体可以用于制备治疗间质性肺损伤和肺纤维化药物。相较于目前临床针对肺损伤和肺纤维化缺乏有效的治疗药物，本发明提出了新的治疗药物，具有重要的社会意义和医学价值。
本发明的外泌体在制备治疗间质性肺损伤和/或肺纤维化的药物中的应用的有益效果是：
本发明首次发现外泌体可以用于制备治疗间质性肺损伤和/或肺纤维化的药物，既开拓了外泌体新的应用领域，也开拓可新的治疗间质性肺损伤和肺纤维化药物，具有广阔的应用前景。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述外泌体的剂量为20μg/kg体重。
采用上述进一步的有益效果是：本发明经过试验证明，在治疗间质性肺损伤和/或肺纤维化的药物中采用上述剂量的外泌体，可以达到明显地治疗间质性肺损伤和/或肺纤维化的药效。
进一步，所述外泌体为iPS细胞的外泌体、MSC细胞的外泌体和EPC细胞的外泌体按质量比为1：1：1或1：2：1的混合物。
采用上述进一步的有益效果是：iPS细胞，英文全称为induced pluripotent stemcells，中文名称为诱导性多能性干细胞。
MSC细胞，英文全称为mesenchymal stem cells，中文名称为间充质干细胞。
EPC细胞，英文全称为endothelial progenitor cells，中文名称为内皮祖细胞。
更进一步，所述iPS细胞的外泌体的制备方法是：取iPS细胞，置于含5％体积的O2和5％体积的CO2、温度为37℃的培养箱中，分别在24h和48h换液，收集上清液，分离，得到iPS细胞的外泌体；所述MSC细胞的外泌体的制备方法是：取MSC细胞，置于含5％体积的O2和5％体积的CO2、温度为37℃的培养箱中，分别在24h和48h换液，收集上清液，分离，得到MSC细胞的外泌体；所述EPC细胞的外泌体的制备方法是：取EPC细胞，置于含5％体积的O2和5％体积的CO2、温度为37℃的培养箱中，分别在24h和48h换液，收集上清液，分离，得到EPC细胞的外泌体。
采用上述进一步的有益效果是：通过改变培养条件如低氧，活性氧调节信号通路epi64,Rab27a和抑制溶酶体酶活性(hydroxychoroquine)可以调控外泌的体的分泌。为提高细胞分泌外泌体的分泌量，采用缺氧或者溶酶体酶抑制剂来刺激。因此本发明采用上述培养条件来调控iPS细胞、MSC细胞和EPC细胞的外泌体的分泌。
更进一步，所述iPSC细胞的培养方法是：(1)采集外周血单核细胞，经培养扩增稳定后，进行质粒电转，将重编程组合质粒一同转入成纤维细胞或外周血单核细胞中，随后接种到培养板中，置于37℃、5％CO2培养箱内培养；(2)按照外周血单核细胞重编程培养流程进行培养操作，定期更换重编程完全培养基，至iPSC形成较大克隆开始挑取单克隆，转移至24孔板中逐代扩增，即得到iPSC细胞。
采用上述更进一步的有益效果是：采用上述方法，可以得到iPSC细胞。
更进一步，所述MSC细胞的培养方法是：取健康新生儿的新鲜脐带，用PBS将脐带冲洗干净，剔去血管，剥出华氏胶组织，将剩余组织充分剪碎至1mm3大小，加入α-MEM培养液，于37℃、5％CO2培养箱中培养，待细胞长满后，用质量百分数为0.25％的胰蛋白酶消化传代；加PBS调整细胞浓度至1×106/mL，即得到MSC细胞。
采用上述更进一步的有益效果是：采用上述方法，可以得到MSC细胞。
更进一步，所述α-MEM培养液中含10％FBS、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素。
更进一步，所述EPC细胞的制备方法是：(1)取iPSC，接种于基底膜基质预处理后的细胞培养板中，置于37℃、5％CO2培养箱中，静置过夜；(2)iPSC铺种一天后，更换中胚层诱导培养基，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育，维持3天不换液直至侧板中胚层细胞形成；(3)更换EPC细胞诱导培养基，将细胞培养板放回37℃、5％CO2培养箱中，孵育24h后重复换液操作，再将细胞培养板放回37℃、5％CO2培养箱中，再孵育24h，即得到EPC细胞。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述方法，可以得到EPC细胞。
进一步，所述药物为包括外泌体和药物可接受的载体或赋形剂。
采用上述进一步的有益效果是：外泌体可以和药物可接受的载体或赋形剂一起，制成药物，用于治疗间质性肺损伤和肺纤维化。
更进一步，所述药物为外用制剂、口服制剂和或注射制剂中的任意一种。
采用上述更进一步的有益效果是：外泌体可以制成多种剂型的药物，适用于多种给药途径，如外用制剂、口服制剂或注射制剂，注射给药可以为皮内、皮下、肌内、局部或静脉内给药。
更进一步，所述外用制剂为喷雾剂或气雾剂。
采用上述更进一步的有益效果是：因为是肺部支气管及间质的病变，雾化吸入方式可以使外泌体直接到达支气管和肺泡组织。(1)雾化吸入作用的靶组织、靶器官大多集中在呼吸道及肺部，这与给药部位完全吻合；(2)相比于静脉给药避免了疼痛，作用部位药物浓度高，静脉给药8h后肺内药物含量不及全身含量的1％，而雾化吸入的药物70％能直接分布到呼吸道黏膜及分泌物中，近45％药物能到达肺泡及深层组织中迅速发挥作用，其起效时间与静脉给药几乎相同；(3)不良反应大大降低，临床上未见有中药注射剂雾化吸入不良反应的报道，可见安全性较高。
更进一步，所述口服制剂为颗粒剂、胶囊剂、片剂和囊泡剂中的任意一种。
附图说明
图1为本发明的原理图。
图2为本发明实施例4的western blot分析CD31外泌体蛋白。
图3为本发明实施例4的western blot分析CD63外泌体蛋白。
图4为本发明实施例4的western blot分析CD81外泌体蛋白。
图5为本发明实施例4中，电镜下分离的ECs胞外囊泡(30nm-100nm)。
图6为本发明实施例4中，降解试验的示意图。
图7为本发明实施例4中，不同处理的EC-CM培养后5HTT蛋白水平。
图8为经不同处理的EC-CM培养后5-HTT蛋白水平的半定量结果。**P<0.01(n＝3)。
图9为正常动物组肺泡的显微镜图之一，比例尺为200μm。
图10为正常动物组肺泡的显微镜图之二，比例尺为200μm。
图11为正常动物组肺泡的显微镜图之三，比例尺为200μm。
图12为肺纤维化模型组的肺泡显微镜图之一，比例尺为200μm。
图13为肺纤维化模型组的肺泡显微镜图之二，比例尺为200μm。
图14为肺纤维化模型组的肺泡显微镜图之三，比例尺为200μm。
图15为外泌体治疗组在治疗7天，一天一次后的肺泡显微镜图之一，比例尺为200μm。
图16为外泌体治疗组在治疗7天，一天一次后的的肺泡显微镜图之二，比例尺为200μm。
图17为外泌体治疗组在治疗7天，一天一次后的的肺泡显微镜图之三，比例尺为200μm。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明的流程图，如图1所示。
实施例1：iPSC细胞的制备
采集供者外周血单核细胞，电转目的质粒组合对其进行重编程，经过单克隆扩增即可得到大量自体iPSC细胞。具体培养方法是：
步骤1：采集外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，经培养扩增稳定后，进行质粒电转，将重编程组合质粒一同转入成纤维细胞或外周血单核细胞中，随后接种到培养板中，置于37℃、5％CO2培养箱内培养。
步骤2：按照外周血单核细胞重编程培养流程进行培养操作，7天更换重编程完全培养基，至iPSC形成较大克隆开始挑取单克隆(即显微镜下清晰可见)，转移至24孔板中逐代扩增，即得到iPSC细胞。
步骤3：对得到的iPSC克隆进行核型检测，干性marker分析，以及细菌、真菌、支原体、内毒素检测，所有方面均无误的可确定为合格iPSC。
步骤4：细胞质量的检测
步骤4.1：形态鉴定
采用倒置显微镜检验重编程所得iPS细胞形态是否符合其形态学特征，低倍镜下观察iPS细胞克隆的数量和大小，高倍镜下观察iPS细胞克隆的细节特征。合格iPS细胞集落边界明显，边界光滑折光度高，集落内细胞全部致密化，细胞界限消失，核质比高，细胞质不可见，核仁明显。
步骤4.2：iPSC干性鉴定
通过免疫荧光及流式细胞术检测相关干性标记基因的表达，如干细胞多能性调节基因4(octamer-binding transcription factor 4,Oct4)、胚胎干细胞关键蛋白(Nanogfragment,Nanog)、阶段特异性胚胎抗原4(Stage Spesific Embryonic Antigen 4,SSEA4)。
步骤4.3：核型分析，确保诱导得到的iPSC具有健康核型，没有产生致病突变。
三个胚层的分化能力检测：将iPS细胞与Matrigel混合种植于裸鼠皮下，观察其畸胎瘤的形成，以及畸胎瘤是否具备典型的三胚层结构。
实施例2：EPC的制备与鉴定
采用多重诱导因子组合诱导iPSC-GFP分化形成iEPC-GFP，使用初代或次代iEPC直接进行细胞移植等功能性实验，或对初代iEPC进行冻存备用以降低培养过程中的突变风险。
步骤1：取制备好鉴定无误的iPSC，按2000-20000个/mL的密度接种于基底膜基质(Matrigel)预处理后的细胞培养板，将细胞板放入37℃、5％CO2细胞培养箱，静置过夜。
步骤2：iPSC铺种一天后，更换中胚层诱导培养基，之后于37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育，维持3天不换液直至侧板中胚层细胞形成。
步骤3：在侧板中胚层细胞形成后，更换内皮祖细胞诱导培养基，将培养板放回37℃、5％CO2细胞培养箱，孵育24h后重复换液操作，将培养板放回37℃、5％CO2细胞培养箱，再孵育24h，EPC诱导即形成，定为初代细胞。
步骤4：微生物检测确定无误后，取细胞悬液进行流式检测，鉴定iEPC诱导纯度。
步骤5：收获细胞，同时留取细胞悬液冻存。
步骤6：细胞质量的检测：
步骤6.1：诱导内皮祖细胞的鉴定：初代或次代细胞与荧光标记的激酶插入区受体(kinase insert domain containing receptor,KDR)、分化抗体群31(cluster ofdifferentiation31,CD31)、CD14、CD45、CD144、CD34、CD133抗体作用后用流式细胞仪或荧光共聚焦显微镜进行检测分析。
步骤6.2：检查是否有不表达CD34单核细胞残留，若有，再进行一轮筛选。
步骤6.3：检测iEPC增殖、分化能力：分别用扩增培养基及成熟内皮分化培养基检测内皮祖细胞的增殖和分化能力。
步骤6.4：核型分析，确保诱导内皮祖细胞具有健康的核型，没有产生致病突变。
实施例3：脐带来源MSC细胞的培养与鉴定
从手术室取得新鲜健康新生儿脐带，用PBS将脐带冲洗干净，用剪刀镊子剔去血管，剥出里面的华氏胶组织，将所得组织充分剪碎至1mm3大小，加入α-MEM培养液，于37℃、5％CO2培养箱中培养，培养液中含10％FBS、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素，待细胞长满后，用0.25％胰蛋白酶消化传代。
将原代细胞消化下来后，加PBS调整细胞浓度至1×106/mL，取200μL细胞悬液按组合方案分别加入5μL荧光标记的单抗(CD29-FITC、CD34-FITC，CD44-FITC、CD45-CY5、CD105-PE和CD106-PE)混匀，室温下避光孵育20min，于流式细胞仪中检测。
实施例4：EPC、iPS和MSC外泌体鉴定
外泌体的验证包括：电镜、颗粒大小统计(NAT)、外泌体通用膜蛋白的western验证(CD63和TSG101)以及外泌体RNA高通量测序。通过这些方法高效提取和纯化外泌体，同时通过验证得到外泌体的大小，纯度和有效作用物质，为进一步临床研究做好制备质控环节。
western blot分析外泌体蛋白，如图2所示。western blot分析CD63外泌体蛋白，如图3所示。western blot分析CD81外泌体蛋白，如图4所示。电镜下分离的ECs胞外囊泡(30nm-100nm)，如图5所示。降解试验的示意图，如图6所示。不同处理的EC-CM培养后5HTT蛋白水平，如图7所示。经不同处理的EC-CM培养后5-HTT蛋白水平的半定量结果，如图8所示。
实施例5：MTT法检测细胞增殖
细胞接种、培养细胞使用与酶标仪匹配的96孔培养板,测定细胞增殖每孔体积200μl含约2000个细胞,应根据所用的细胞类型、增殖速度进行调节,注意设置3个重复孔和无细胞培养基对照,37℃培养细胞至合适的时间,然后给予特定的药物或物理因素刺激。
加MTT药物处理结束后,一般每孔200μl培养基加入20μl MT(5mg/ml),37℃培养箱内继续孵育4h,血清浓度尽量不高于5％,最好在加MTT(5mg/ml)前换成无血清的培养基。
呈色、比色：如果是贴壁细胞,小心吸出培养上清液,每孔加入100μl DMSO,使结晶物充分溶解,选择波长测定,对悬浮生长的细胞,需离心1000r/min,5min,然后弃去孔内上清再加100μl DM-SO,或者直接加入100μl SDS裂解液更为方便,在酶标仪上测定各孔数值,记录结果,以时间为横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
实施例6：Transwell检测细胞的迁移能力
常规消化细胞，用无胎牛血清的细胞培养基洗细胞3次，配制细胞悬液，调整浓度为5×105细胞/ml，于Transwell小室的上室中加入不同的细胞悬液200μl，每组设3个复孔；下室加入600μl含50ml/L胎牛血清的DMEM培养基，37℃，5％CO2培养箱中孵育20-24h。滤膜上的微孔允许肿瘤细胞穿越，迁移的细胞可黏附于膜下层，取出Transwell小室，用PBS洗2遍，棉拭子擦去膜上面未迁移的细胞，计数并比较穿过膜的细胞数，可在一定程度上反应肿瘤细胞的迁移能力。
细胞显色：95％乙醇固定Transwell小室上的聚碳酸酯滤膜30min，PBS冲洗2次，每次3min；苏木精染色5.5min，自来水冲洗1-2min；1％盐酸酒精分化数秒钟，自来水冲洗1-2min；伊红染色80s，自来水冲洗1-2min；梯度乙醇脱水：70％乙醇10s，80％乙醇10s，90％乙醇1min，95％乙醇1min，无水乙醇15min。
细胞计数：将滤膜撕下来，有细胞的一面向上放在载玻片上，加盖玻片，中性树脂封片；在400倍高倍镜下记数，每张片子随机记录5个视野的迁移细胞数，将5个数值加起来表示迁移细胞数。
实施例7：利用Tunel检测肺泡上皮细胞的凋亡
培养的细胞的预处理：将约5×107个/ml细胞于4％中性甲醛室温中固定10min。在载玻片上滴加50-100μl细胞悬液并使之干燥。用PBS洗两次，每次5min。色缸中加入含2％过氧化氢的PBS，于室温反应5min。用PBS洗两次，每次5min。用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体，立即在切片上加2滴TdT酶缓冲液，置室温1-5min。用滤纸小心吸去切片周围的多余液体，立即在切片上滴加54μl TdT酶反应液，置湿盒中于37℃反应1h(注意：阴性染色对照，加不含TdT酶的反应液)。
染色：组织切片用PBS洗3次，每次5min后，直接在切片上滴加两滴过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，于湿盒中室温反应30min。
洗脱：用PBS洗4次，每次5min。在玻片上直接滴加新鲜配制的0.05％DAB溶液，室温显色3-6min。用蒸馏水洗4次，前3次每次1min，最后1次5min。于室温用甲基绿进行复染10min。用蒸馏水洗3次，前两次将载玻片提起放下10次，最后1次静置30s。依同样方法再用100％正丁醇洗三次。用二甲苯脱水3次，每次2min，封片、干燥后，在光学显微镜下观察并记录实验结果。
实施例8：利用Elisa法检测肺泡内皮细胞促纤维化因子的释放
包被：用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1-10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3min(简称洗涤，下同)。
加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1h。然后洗涤(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5-1h，洗涤。
加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃显色10-30min。
终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
实施例9：利用Western blot检测成纤维细胞和肌成纤维胶原蛋白的表达
收集蛋白样品可以使用适当的裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。
电泳样品处理，在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白。
上样与电泳:冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。
转膜:通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA，转膜时间为30-60min。也可以在15-20mA转膜过夜。
封闭:转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗1-2min，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。用微型台式真空泵(EVAC06/EVAC07)或滴管等吸尽洗涤液，加入Western封闭液(P0023B)，在摇床上缓慢摇动,室温封闭60min。对于一些背景较高的抗体，可以4℃封闭过夜。
一抗孵育:参考一抗的说明书，按照适当比例用Western一抗稀释液(P0023A)稀释一抗。用微型台式真空泵或滴管等吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育1h。如果一抗孵育1h效果不佳，可以4℃缓慢摇动孵育过夜。或更据抗体的说明选择适当的孵育温度和时间。
二抗孵育:参考二抗的说明书，按照适当比例用Western二抗稀释液(P0023D)稀释辣根蛋白检测参考相关说明书，使用BeyoECL Plus(P0018)等ECL类试剂来检测蛋白。
实施例10：RNAseq的方式全面评估外泌体处理后肺泡上皮细胞的功能的变化
提取总RNA后，用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，对于原核生物，用试剂盒去除rRNA，向得到的mRNA中加入Fragmentation Buffer使其片断成为短片段，再以片断后的mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成cDNA第一链，并加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymeraseI合成cDNA第二链，经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱经末端修复、加碱基A，加测序接头，再经琼脂糖凝胶电泳回收目的大小片段，并进行PCR扩增，从而完成整个文库制备工作，构建好的文库用Illumina HiSeq2000进行测序。本实施例得出的结论是：纤维化的基因表达下调。
实施例11：动物试验
设置正常动物组、肺纤维化模型组和外泌体治疗组。
正常动物组：免疫正常组，不做任何处理。由图9-图12可以看出，肺泡周围单层细胞围绕，便于换气。
肺纤维化模型组：免疫正常小鼠，采用气管滴注博来霉素法建模，建模后2周处死取材。由图13-图14可以看出，肺泡周围都是多层的纤维化细胞，不便于换气。
外泌体治疗组：免疫正常小鼠，采用气管滴注博来霉素法建模，建模后1周，进行连续6天的雾化治疗，每天一次，每次2mg外泌体，所述外泌体为iPS细胞的外泌体、MSC细胞的外泌体和EPC细胞的外泌体按质量比为1：1：1或1：2：1的混合物。由图15-图17可以看出，经过外泌体治疗后，肺泡周围又出现单层细胞围绕，利于换气。
综上，本发明首次发现外泌体可以用于制备治疗间质性肺损伤和/或肺纤维化的药物，既开拓了外泌体新的应用领域，也开拓可新的治疗间质性肺损伤和肺纤维化药物，具有广阔的应用前景。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.外泌体在制备治疗间质性肺损伤和/或肺纤维化的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述外泌体的剂量为20μg/kg体重。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述外泌体为iPS细胞的外泌体、MSC细胞的外泌体和EPC细胞的外泌体按质量比为1：1：1或1：2：1的混合物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述iPS细胞的外泌体的制备方法是：取iPS细胞，置于含5％体积的O2和5％体积的CO2、温度为37℃的培养箱中，分别在24h和48h换液，收集上清液，分离，得到iPS细胞的外泌体；所述MSC细胞的外泌体的制备方法是：取MSC细胞，置于含5％体积的O2和5％体积的CO2、温度为37℃的培养箱中，分别在24h和48h换液，收集上清液，分离，得到MSC细胞的外泌体；所述EPC细胞的外泌体的制备方法是：取EPC细胞，置于含5％体积的O2和5％体积的CO2、温度为37℃的培养箱中，分别在24h和48h换液，收集上清液，分离，得到EPC细胞的外泌体。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述iPSC细胞的培养方法是：(1)采集外周血单核细胞，经培养扩增稳定后，进行质粒电转，将重编程组合质粒一同转入成纤维细胞或外周血单核细胞中，随后接种到培养板中，置于37℃、5％CO2培养箱内培养；(2)按照外周血单核细胞重编程培养流程进行培养操作，定期更换重编程完全培养基，至iPSC形成较大克隆开始挑取单克隆，转移至24孔板中逐代扩增，即得到iPSC细胞。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述MSC细胞的培养方法是：取健康新生儿的新鲜脐带，用PBS将脐带冲洗干净，剔去血管，剥出华氏胶组织，将剩余组织充分剪碎至1mm3大小，加入α-MEM培养液，于37℃、5％CO2培养箱中培养，待细胞长满后，用质量百分数为0.25％的胰蛋白酶消化传代；加PBS调整细胞浓度至1×106/mL，即得到MSC细胞。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述EPC细胞的制备方法是：(1)取iPSC，接种于基底膜基质预处理后的细胞培养板中，置于37℃、5％CO2培养箱中，静置过夜；(2)iPSC铺种一天后，更换中胚层诱导培养基，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育，维持3天不换液直至侧板中胚层细胞形成；(3)更换EPC细胞诱导培养基，将细胞培养板放回37℃、5％CO2培养箱中，孵育24h后重复换液操作，再将细胞培养板放回37℃、5％CO2培养箱中，再孵育24h，即得到EPC细胞。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物包括外泌体和药物可接受的载体或赋形剂。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为外用制剂、口服制剂和注射制剂中的任意一种。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述外用制剂为喷雾剂或气雾剂；所述口服制剂为颗粒剂、胶囊剂、片剂和囊泡剂中的任意一种。
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