WO2018026203A1 - 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 폐 섬유증 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 폐 섬유증 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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최지숙
염승호
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Definitions

  • the present invention is a composition for preventing or treating pulmonary fibrosis comprising exosomes extracted from adipose derived stem cells as an active ingredient, the use of the exosomes in the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of pulmonary fibrosis, and the exosomes It relates to a method of treating pulmonary fibrosis comprising administering to a subject a pharmaceutical composition comprising as an active ingredient.
  • Pulmonary fibrosis refers to a disease that causes severe structural variation of lung tissue by inducing tissue fibrosis by infiltrating chronic inflammatory cells into the alveolar wall in the lung tissue. As fibrosis progresses, the lung tissue hardens and the alveolar walls become thick, which reduces the oxygen supply to the blood and thus causes difficulty breathing. Current techniques do not provide a cure for complete recovery of fibrotic lung tissue, with the exception of early detection and pulmonary transplantation, which usually leads to death three to five years after the onset of symptoms. It's a scary disease.
  • Treatments for early detection of pulmonary fibrosis include treatment with steroids such as steroids, azathioprine, cyclophosphamide, and antioxidants such as acetylcysteine.
  • steroids such as steroids, azathioprine, cyclophosphamide, and antioxidants such as acetylcysteine.
  • Therapeutic methods and therapeutic methods through administration of growth factors such as cytokines IFN- ⁇ .
  • Therapeutic methods using steroid drugs and antioxidants have been studied and reported continuously since 2000, but have not yet been proven to have obvious drug efficacy, resulting in systemic side effects or long-term resistance. It has been reported.
  • Treatment with growth factor has been gaining much attention in recent years, and is a relatively fundamental approach using 'interferon', which inhibits the production of TGF- ⁇ , a key factor in pulmonary fibrosis.
  • exosomes extracted from adipose derived stem cells include growth factors such as hepatocyte growth factor (HGF) and IL-10, which are involved in the treatment of lung fibrosis.
  • HGF hepatocyte growth factor
  • IL-10 hepatocyte growth factor
  • An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating pulmonary fibrosis comprising exosomes (exosome) extracted from adipose-derived stem cells as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a use of the exosomes in the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of pulmonary fibrosis.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for treating pulmonary fibrosis comprising administering to a subject a pharmaceutical composition comprising the exosome as an active ingredient.
  • the present invention is a composition for preventing or treating pulmonary fibrosis comprising exosomes extracted from adipose derived stem cells as an active ingredient, the exosomes in the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of pulmonary fibrosis It provides a method of treating pulmonary fibrosis comprising the use, and administering to the subject a pharmaceutical composition comprising the exosomes as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating pulmonary fibrosis, comprising exosomes extracted from adipose-derived stem cells as an active ingredient. .
  • stem cell means not only the ability of self-replicating, but also a variety of cells due to the characteristics of multi potency when given an appropriate signal as needed under the influence of the environment in which the cell is located. It is characterized by its ability to differentiate into fat, bone marrow, umbilical cord blood and placenta, and can be used to treat various cell damage diseases such as myocardial infarction, cerebral infarction, degenerative arthritis and fracture.
  • Stem cells of the present invention may be autologous or allogeneic stem cells, and may be derived from any type of animal, including humans and non-human mammals.
  • the term "adipose-derived stem cell” is a stem cell derived from adipose tissue, and the adipose tissue has a good condition for harvesting stem cells because it is easy to collect a large amount of tissue, and Derived stem cells show stable growth and proliferation in culture and are capable of differentiation into various cells when induced. These stem cells are reported to regenerate not only adipose tissue but also various tissues such as mesenchymal tissue regeneration such as cartilage, bone, nerve tissue, and vascular tissue, and liver cells, kidney, and cardiovascular regeneration.
  • the term “exosome” is a 40-120 nm nanovesicle that is secreted from cells.
  • the main histocompatibility complex (MHC) and heat shock protein are immunologically important proteins. Induces a strong anti-tumor immune response, and includes anti-inflammatory microRNA (microRNA) and microRNA (microRNA) that regulates the accumulation of collagen (collagen).
  • microRNA anti-inflammatory microRNA
  • microRNA microRNA
  • microRNA microRNA
  • collagen collagen
  • it is known to play various roles such as binding to other cells and tissues to deliver membrane components, proteins, RNA.
  • exosomes of the present invention are exosomes extracted from stem cells, but are not limited thereto, and may be extracted from adipose derived stem cells, umbilical cord derived stem cells, or bone marrow derived stem cells.
  • the exosomes extracted from the stem cells contain genes, proteins, growth factors related to cell proliferation, differentiation and regeneration of stem cells according to the characteristics of the stem cells, and may play an important role in tissue regeneration.
  • the exosomes containing the genetic information, proteins, growth factors of the cells from the adipose-derived stem cells of the present invention may have the basic characteristics of stem cells, tissue regeneration May contain important growth factors, bioactive protein and genetic information.
  • exosomes extracted from adipose derived stem cells include growth factors related to pulmonary fibrosis treatment, such as hepatocyte growth factor (HGF) and interleukin-10 (interleukin-10) ( 3B).
  • HGF hepatocyte growth factor
  • interleukin-10 interleukin-10
  • exosomes may be obtained using exosome extraction methods known in the art, but are not limited thereto, and may be obtained by an extraction method comprising the following steps:
  • the stem cells of step 1) may be, but are not limited to, adipose derived stem cells, umbilical cord derived stem cells, or bone marrow derived stem cells, for example, adipose derived stem cells.
  • the fat-derived stem cells may be human or animal-derived stem cells.
  • Stem cells in step 1) may be cultured under normal oxygen conditions (hymoxia conditions) or hypoxic conditions (hypoxic conditions).
  • the normal oxygen condition may be, but not limited to, a culture condition in which a normal oxygen concentration, that is, 21% oxygen (O 2 ) is supplied, or a hypoxic cell sensitizer Culture conditions may not be added to the culture medium.
  • the hypoxic cell sensitizer is a substance that induces a hypoxic condition, but is not limited thereto, such as cobalt chloride, desferrioxamine, and dimethyloxalyl glycine (dimethyloxalylglycine, DMOG). It may be selected from the group consisting of.
  • the hypoxic condition may be, but is not limited to, a culture condition in which hypoxic concentration, that is, 10% or less of oxygen (O 2 ) is supplied, or a cell culture is performed with a hypoxic cell sensitizer.
  • the culture conditions may be added to the medium.
  • the low oxygen concentration is not limited thereto, but may be 0.5 to 10% oxygen, 0.5 to 5%, and 0.5 to 2%.
  • the hypoxic cell sensitizer is as described above, in one embodiment of the present invention, 100 ⁇ M concentration of cobalt (II) chloride hexahydrate (Cobalt (II) chloride hexahydrate ( CoCl 2 ⁇ 6H 2 O) was added to induce hypoxic culture conditions (FIG. 5A).
  • the general culture medium may be any cell culture medium conventionally used in the art, but is not limited thereto, but Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) medium, minimal essential medium (MEM) medium, Or RPMI 1640 (Rosewell Park Memorial Institute 1640) medium.
  • DMEM Dulbecco's modified eagle medium
  • MEM minimal essential medium
  • RPMI 1640 Rosewell Park Memorial Institute 1640
  • accessory ingredients may be added to the cell culture medium as needed.
  • Such accessory ingredients include penicillin G (penicilli G) to prevent microbial contamination, including serum of fetal calf, horse or human.
  • Antibiotics such as streptomycin sulfate and gentamycin, antifungal agents such as amphotericin B and nystatin, and mixtures thereof. You can use more than one.
  • DMEM Dulbecco Modified Eagle Medium high glucose
  • FBS fetal bovine serum
  • penicillin / streptomycin penicillin / streptomycin
  • the present invention may be, but is not limited to, DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium high glucose) medium without serum, antibiotics, and phenol red added.
  • the stem derived from human fat using Dulbecco Modified Eagle Medium high glucose (DMEM) medium containing 10% FBS (fetal bovine serum) and 1% penicillin / streptomycin (FMEM) Incubate cells (passage 7 or 8), and serum-free, antibiotic-free, phenol red-free medium 24 hours before extracting exosomes from the stem cells. And incubated for 24 hours (Example 1).
  • DMEM Dulbecco Modified Eagle Medium high glucose
  • FBS fetal bovine serum
  • FMEM penicillin / streptomycin
  • the cell culture supernatant recovered in step 2) includes cell residues and exosomes secreted from stem cells, and the cell residues contained in the cell culture supernatant are removed by centrifugation in step 3). can do.
  • the exosomes contained in the cell culture supernatant recovered in step 2) can be finally separated and purified through a filtration step through centrifugation and introduction of a multi-filter system.
  • the centrifugation is not limited thereto, but may be performed at 250 to 500 g for 5 to 10 minutes, or at 300 g for 10 minutes.
  • the multi-filter system is a system for filtering stepwise using a filter of various pore sizes, including, but not limited to, a cell strainer having a 4 ⁇ m pore size, a filter having a 0.22 ⁇ m pore size, And a stepwise filtration system using a filter having a 500 kD molecular weight cut off (MWCO).
  • a cell strainer having a 4 ⁇ m pore size
  • a filter having a 0.22 ⁇ m pore size
  • MWCO molecular weight cut off
  • the cell culture supernatant recovered from the cultured human adipose derived stem cells are centrifuged at 300 xg for 10 minutes to remove cell debris, and cells having a 0.4 ⁇ m pore size. Residues larger than the pore size were removed using a cell strainer, and cell residues larger than the pore size were then removed using a filter having a 0.22 ⁇ m pore size. After removal of the cell residue, the recovered solution was added with a flow rate of 4 mL / min (min) to remove proteins through TFF (tangential flow filtration) using a filter having a 500 kD molecular weight cut off (TW) process. After that, the collected solution was sonicated, and the above-described TFF process was continuously repeated to finally separate and purify the exosomes (FIG. 2).
  • the exosome of the present invention obtained through the exosome extraction method may be an exosome extracted from adipose derived stem cells cultured under normal oxygen conditions (normoxia conditions) or hypoxic conditions (hypoxic conditions).
  • the exosomes may include growth factors related to pulmonary fibrosis treatment, such as hepatocyte growth factor (HGF) and interleukin-10, and thus include or exclude the exosomes as an active ingredient for preventing or treating pulmonary fibrosis. It can be used as a composition.
  • HGF hepatocyte growth factor
  • interleukin-10 interleukin-10
  • pulmonary fibrosis in the present invention is a disease characterized by diffuse fiber proliferation in the alveolar wall, the main symptom of respiratory distress during dry cough or labor. Narrowing refers to the late form of interstitial pneumonia, but broadly refers to the coexistence of narrowing pulmonary fibrosis and interstitial pneumonia. All interstitial pneumonia can cause pulmonary fibrosis. Interstitial pneumonia is a generic term for diseases that cause inflammation of the epilepsy of the lungs (nearly including alveolar septum, broadly epilepsy epilepsy, in the vicinity of the pleura, etc.) and include specific diseases such as infections, collagen diseases, radiation, drugs, and dust. Causes idiopathic interstitial pneumonia of unknown and unknown causes.
  • Idiopathic interstitial pneumonia is based on subthoracic pulmonary biopsy (VATS) or high resolution computed tomography (HRCT) findings, such as idiopathic pulmonary fibrosis: , Acute interstitial pneumonia (AIP), cryptogenic organizing pneumonia (COP), respiratory bronchiolitis associated interstitial lung disease (RB-ILD), exfoliative interstitial pneumonia (desquamative interstitial pneumonia: DIP), and lymphoid interstitial pneumonia (LIP).
  • VATS subthoracic pulmonary biopsy
  • HRCT high resolution computed tomography
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating pulmonary fibrosis according to the present invention is an effective substance for treating pulmonary fibrosis, which uses exosomes extracted from fat-derived stem cells cultured under specific culture conditions such as normal oxygen condition or hypoxic condition. It is different from the prior art in that respect.
  • the extracted, isolated and purified exosomes carry various genetic information, proteins, and growth factors for pulmonary fibrosis alleviation or treatment, and because they are cell-derived materials, have excellent biocompatibility and excellent absorption.
  • exosomes extracted from adipose derived stem cells contain growth factors related to pulmonary fibrosis treatment such as hepatocyte growth factor (HGF) and interleukin-10 (interleukin-10)
  • FIG. 3B confirms that collagen synthesis is inhibited by exosomes extracted from the adipose derived stem cells in fibrosis-induced lung fibroblasts, which accumulate in tissue during fibrosis and destroy normal structure resulting in impaired function. (B of FIG. 4).
  • bleomycin-induced pulmonary fibrosis C57BL / 6J mice were administered Normoxia-Exo and Hypoxia-Exo extracted from adipose derived stem cells cultured under normoxia and hypoxic conditions, respectively.
  • the lung tissue was extracted and subjected to trichrome staining, it was confirmed that the stained collagen region was significantly reduced to a level similar to that of normal lung tissue as compared with the negative control group (PBS administration group) and the positive control group (fat-derived stem cell administration group).
  • the negative control group PBS administration group
  • the positive control group fat-derived stem cell administration group
  • the collagen region stained to a level substantially similar to that of normal lung tissue was significantly reduced compared to the administration of Normoxia-Exo, including the negative control and positive control (Fig. 7 to Fig. 7). 9).
  • exosomes (Normoxia-Exo) obtained from adipose derived stem cells cultured under normal oxygen conditions and exosomes (Hypoxia-Exo) obtained from adipose derived stem cells cultured under hypoxic conditions improved lung fibrosis or It was confirmed that there is a therapeutic effect, in particular, the exosomes (Hypoxia-Exo) obtained from adipose derived stem cells cultured under hypoxic conditions was found to be remarkably excellent in the treatment effect of lung fibrosis.
  • composition comprising an exosome extracted from adipose derived stem cells according to the present invention as an active ingredient can be usefully used as a pharmaceutical composition for preventing or treating pulmonary fibrosis.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating pulmonary fibrosis according to the present invention may include exosomes extracted from a pharmaceutically effective amount of adipose derived stem cells alone or may include one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients or diluents. have.
  • a pharmaceutically effective amount herein means an amount sufficient to prevent, ameliorate and treat the symptoms of pulmonary fibrosis.
  • the pharmaceutically effective amount of exosomes extracted from adipose derived stem cells according to the present invention may be 5 ⁇ 10 8 to 5 ⁇ 10 10 particles / day / kg body weight, and may be 5 ⁇ 10 9 particles / day / kg body weight. have. However, the pharmaceutically effective amount may be appropriately changed depending on the degree of pulmonary fibrosis symptoms, the age, weight, health condition, sex, route of administration and duration of treatment of the patient.
  • the term "pharmaceutically acceptable” refers to a composition which, when administered physiologically and humanly, does not normally cause an allergic reaction such as gastrointestinal disorders, dizziness or the like.
  • carriers, excipients and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, Polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers and preservatives may be further included.
  • composition of the present invention can be administered in the form of a unit dosage form suitable for administration in the body of the patient according to a conventional method in the pharmaceutical field, the formulation develops the alveoli by one or several administrations. Effective dosages that may be employed.
  • Formulations suitable for this purpose include parenteral injectables such as injectable ampoules, injectables such as infusion bags, sprays such as aerosol preparations and the like.
  • the injection ampoule may be mixed with the injection solution immediately before use, and physiological saline, glucose, mannitol, and Ringer's solution may be used as the injection solution.
  • the infusion bag may also be made of polyvinyl chloride or polyethylene, and may include Baxter, Becton-Dickinson, Medcep, National Hospital Products, or Terumo.
  • An injection bag of a cinnamon yarn can be illustrated.
  • one or more pharmaceutically acceptable inert carriers such as preservatives, analgesic agents, solubilizers or stabilizers in the case of injections, etc. It may further include a base, excipients, lubricants or preservatives.
  • composition or the pharmaceutical preparation of the present invention may be administered to mammals such as rats, mice, livestock, humans, etc. by various routes, such as parenteral, oral, and the administration method may be any method commonly used in the art. It can be administered by.
  • the present invention may be administered by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural or intracerebroventricular injection and the like.
  • exosomes extracted from adipose derived stem cells may be administered intravenously (intravenous injection), or administered into a subject's lungs or organs (topical administration), It can be administered by inhalation.
  • exosomes can be administered using a nebulizer, it can be administered using an endotracheal tube.
  • the present invention provides an injection for preventing or treating pulmonary fibrosis, comprising an exosome extracted from adipose derived stem cells as an active ingredient.
  • the injection may further comprise phosphate-buffered saline (PBS). That is, the injection may be used by supporting exosomes extracted from adipose derived stem cells in phosphate buffered saline.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • the injection may comprise a hydrogel instead of phosphate buffered saline.
  • the hydrogel may be any one or more selected from the group consisting of hyaluronic acid, gelatin, alginate, chitosan, fibrin, elastin, collagen, and methyl cellulose, and specifically, may be hyaluronic acid hydrogel, but is not limited thereto.
  • the injection may be one containing exosomes in a concentration of 5 ⁇ 10 8 particles / kg to 5 ⁇ 10 10 particles / kg, may be included in a concentration of 5 ⁇ 10 9 particles / kg, but is not limited thereto.
  • the injection may be administered by injection into a site of injury, such as a lung of a mammal such as a mouse, a mouse, a livestock, or a human, and may be administered intravenously.
  • a site of injury such as a lung of a mammal such as a mouse, a mouse, a livestock, or a human
  • the present invention provides the use of exosomes extracted from adipose derived stem cells in the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of pulmonary fibrosis.
  • exosomes extracted from the adipose-derived stem cells are as described above, and can be used as an active ingredient in a pharmaceutical composition for preventing or treating pulmonary fibrosis and is also as described above.
  • the present invention provides a method for treating pulmonary fibrosis using a pharmaceutical composition comprising an exosome extracted from adipose derived stem cells as an active ingredient.
  • the method comprises administering the pharmaceutical composition to a subject in various ways as described above.
  • Preferred dosages may vary depending on the condition and weight of the subject, the extent of the disease, the form of the drug, the route and duration of administration, which may be appropriately selected by one of skill in the art and the subject may develop or develop pulmonary fibrosis.
  • the subject can be administered to the subject through intravenous therapy, inhalation administration, topical administration, etc., and can be delivered directly to the lung by inhalation and topical administration, as well as circulating along the blood vessel during intravenous injection Since the exosomes naturally accumulate in the lungs, pulmonary fibrosis can be efficiently treated by the simple method as described above without complicated treatment.
  • Exosomes extracted from adipose derived stem cells according to the present invention include growth factors such as hepatocyte growth factor (HGF) and IL-10, which are involved in the treatment of pulmonary fibrosis, and significantly reduce the fibrosis area in pulmonary fibrosis-induced experimental animal models. It may be useful for preventing or treating pulmonary fibrosis.
  • the treatment of pulmonary fibrosis using exosomes according to the present invention is less likely to cause side effects caused by steroid-based drugs and antioxidants that have been used to treat pulmonary fibrosis, and can be administered by injection, inhalation, or the like without surgical treatment.
  • exosomes can be delivered to the lungs, making it easy and economical to treat pulmonary fibrosis.
  • exosomes extracted from human adipose-derived stem cells (HASCs) and their applications according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 is a schematic diagram of a method for extracting exosomes from stem cells of various origins according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 is derived from human adipose-derived stem cells (HASC), human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (UC-MSC) and human bone marrow derived according to an embodiment of the present invention
  • the road showing the results of the characterization of each exosome extracted from human bone marrow-derived mesenchymal stem cell (BM-MSC), (A) the various identified by using a nanoparticle tracking analysis (nanoparticle tracking analysis) Exosome concentration extracted from stem cells derived, and
  • B is a diagram showing the expression level of hepatocyte growth factor (HGF) and IL-10 (interleukin-10) in each of the exosomes through ELISA analysis.
  • HGF hepatocyte growth factor
  • IL-10 interleukin-10
  • Figure 4 is a human adipose-derived stem cell (HASC), human umbilical cord-derived mesenchymal stem using fibrotic-induced lung fibroblasts according to an embodiment of the present invention cell, UC-MSC) and human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BM-MSCs).
  • HASC human adipose-derived stem cell
  • UC-MSC human umbilical cord-derived mesenchymal stem using fibrotic-induced lung fibroblasts according to an embodiment of the present invention cell
  • BM-MSCs human bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of the characterization of Normoxia Exosomes and Hypoxia Exosomes extracted from human adipose derived stem cells cultured under normal oxygen (normoxia) and hypoxia (hypoxia) conditions according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 Schematic diagram showing the culture conditions and steps for extracting exosomes from human adipose-derived stem cells, DMEM (high glucose) containing 10% FBS and 1% antibiotics (antibiotics) for Normoxia Exosomes extraction
  • DMEM high glucose
  • antibiotics antibiotics
  • Normoxia Exosomes extraction For the extraction of Hypoxia Exosomes, human adipose-derived stem cells were cultured using a culture medium in which 100 ⁇ M of cobalt chloride (II) hexahydrate (CoCl 2 ⁇ 6H 2 O) was added to the general culture medium. After culturing for 24 hours, exosomes are extracted by replacing with serum-free medium.
  • II cobalt chloride
  • Figure 6 is a diagram showing the effect of treating pulmonary fibrosis of exosomes extracted from adipose derived stem cells according to an embodiment of the present invention.
  • A Bleomycin-induced pulmonary fibrosis C57BL / 6J mouse model construction and schematic diagram showing the administration schedule of Normoxia Exosomes and Hypoxia Exosomes extracted from human adipose derived stem cells
  • B Bleo Mycin-induced pulmonary fibrosis C57BL / 6J mice were treated with Normoxia Exosomes and Hypoxia Exosomes extracted from human adipose-derived stem cells three times daily at two-day intervals. It is a photograph.
  • HASCs is a positive control
  • N administration of human fat-derived stem cells at a concentration of 1 ⁇ 10 6 cells / 100 ul
  • the PBS human fat-derived stem cells (HASCs), Normoxia Exosomes and Hypoxia Exosomes were administered to the bleomycin-induced pulmonary fibrosis C57BL / 6J mice in total three times intravenously every two days.
  • HASCs human fat-derived stem cells
  • Hypoxia Exosomes were administered to the bleomycin-induced pulmonary fibrosis C57BL / 6J mice in total three times intravenously every two days.
  • FIG. 7 is a bleomycin-induced pulmonary fibrosis of Normoxia Exosomes and Hypoxia Exosomes extracted from human adipose-derived stem cells, showing the results of treating pulmonary fibrosis of exosomes extracted from adipose derived stem cells according to an embodiment of the present invention
  • C57BL / 6J mice were injected intravenously three times at two-day intervals, and the lungs of mice were extracted on day 1, followed by trichrome staining. Magnification: x10).
  • HASCs is a positive control
  • N administration of human fat-derived stem cells at a concentration of 1 ⁇ 10 6 cells / 100 ul
  • FIG. 8 is a bleomycin-induced pulmonary fibrosis of Normoxia Exosomes and Hypoxia Exosomes extracted from human adipose-derived stem cells, showing the results of treating pulmonary fibrosis of exosomes extracted from adipose derived stem cells according to an embodiment of the present invention.
  • C57BL / 6J mice were injected intravenously three times at two-day intervals, and then lungs of mice were extracted on day 1, followed by trichrome staining. (Microscope magnification: x40).
  • the scale bar is 100 ⁇ m.
  • FIG. 9 is a bleomycin-induced pulmonary fibrosis of Normoxia Exosomes and Hypoxia Exosomes extracted from human adipose-derived stem cells, showing the effect of pulmonary fibrosis treatment of exosomes extracted from adipose derived stem cells according to an embodiment of the present invention
  • C57BL / 6J mice were injected intravenously three times at two-day intervals, and the lungs of mice were extracted on day 1, followed by trichrome staining, and stained collagen areas, that is, fibrotic areas. ,%) Quantified.
  • HASCs is a positive control
  • N administration of human fat-derived stem cells at a concentration of 1 ⁇ 10 6 cells / 100 ul
  • Stem cells have different characteristics according to the tissues and culture conditions derived from them. Accordingly, exosomes extracted from stem cells having different characteristics also have different internal components (Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends; G Raposo et al. , J. Cell Biol . , 2013, Vol. 200, No. 4, p. 373-383). In other words, the type of cells extracting the exosomes is a very important factor in determining the characteristics of the exosomes.
  • exosomes showing an effective therapeutic effect on pulmonary fibrosis
  • exosomes were extracted from stem cells of various origins.
  • HASC human adipose-derived stem cells
  • UC-MSC human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells
  • BM-MSC human bone marrow-derived stem cells
  • Each of the stem cells is a DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium high glucose; Gibco, Cat #: 11995065) general culture medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin / streptomycin (FBS) And cultured using.
  • DMEM Dulbecco Modified Eagle Medium high glucose
  • FBS fetal bovine serum
  • FBS penicillin / streptomycin
  • the recovered solution was added with a flow rate of 4 mL / min (min) to remove proteins through a tangential flow filtration (TFF) process using a filter having a 500 kD molecular weight cut off (MWCO).
  • TFF tangential flow filtration
  • MWCO molecular weight cut off
  • Example 2 Characterization of exosomes extracted from stem cells of various origin
  • exosomes extracted from human adipose derived stem cells
  • exosomes UC-MSC-Exo
  • exosomes extracted from human bone marrow derived stem cells BM-MSC-Exo
  • the concentration of human fat-derived stem cell exosomes was 2.25 ⁇ 10 9 particles / mL
  • human umbilical cord-derived stem cell exosomes UC
  • -MSC-Exo was 1.38 ⁇ 10 9 particles / mL
  • the concentration of human bone marrow-derived stem cell exosomes was 1.81 ⁇ 10 9 particles / mL (A in Fig. 3).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • HGF human adipose derived stem cells
  • exosomes UC extracted from human umbilical cord stem cells
  • BM-MSC-Exo human bone marrow-derived stem cells
  • ECM extracellular matrix
  • Example 1 in order to confirm whether the exosomes extracted from the stem cells derived from human adipose, human umbilical cord, and human bone marrow obtained in Example 1 exhibit an effective therapeutic effect on pulmonary fibrosis, lung fiber An in vitro model was constructed using lung fibroblasts, and the collagen synthesis inhibitory ability of each of the exosomes extracted from the stem cells of various origins was evaluated.
  • primary human lung fibroblasts are fibroblast basal medium containing Fibroblast Growth Kit-Low serum (ATCC, PCS-201-041).
  • Medium ATCC, PCS-201-030 was used to passage up to passage (passage 6).
  • Cobalt (II) chloride hexahydrate (CoCl 2 ⁇ 6H 2 ), which induces hypoxic conditions in cultured cells to induce fibrosis and is known as a fibrotic sensitizer of lung interstitial
  • the medium composition was replaced by adding O) to the culture medium at a concentration of 100 ⁇ M Exosome (HASC-Exo) extracted from human adipose derived stem cells and exosomes extracted from human umbilical cord derived stem cells (UC-).
  • MSC-Exo MSC-Exo
  • BM-MSC-Exo exosomes extracted from human bone marrow-derived stem cells, respectively, 1 ⁇ 10 8 particles / mL or The medium was treated at a concentration of 5 ⁇ 10 8 particles / mL. After 24 hours, the culture medium was extracted and the expression level of COL1A1 (collagen type I, alpha 1) was confirmed using an ELISA kit. At this time, growth medium (Growth medium, GM) and serum-free basal medium (serum-free basal medium, BM) were used as a positive control and a negative control, respectively.
  • growth medium Crowth medium, GM
  • serum-free basal medium serum-free basal medium
  • exosomes As a result of evaluating collagen synthesis inhibitory ability of each of the exosomes extracted from the stem cells of the various derived by ELISA, exosomes (UC-MSC-Exo) and human bone marrow-derived stem cells extracted from human umbilical cord derived stem cells It was confirmed that the expression of COL IA1 was significantly decreased in the group treated with exosomes (HASC-Exo) extracted from human adipose derived stem cells compared to the group treated with exosomes (BM-MSC-Exo).
  • exosomes extracted from human adipose stem cells derived from human umbilical cord stem cells, UC-MSC-Exo and exosomes extracted from human bone marrow derived stem cells (BM- MSC-Exo) it was confirmed that the collagen synthesis inhibitory ability (Fig. 4).
  • exosomes (HASC-Exo) extracted from human adipose-derived stem cells were compared to collagen synthesis compared to exosomes (UC-MSC-Exo and BM-MSC-Exo) of other stem cells. Since the inhibitory ability is excellent, it could be inferred that the exosome (HASC-Exo) of the adipose derived stem cells can be usefully used for the treatment of pulmonary fibrosis.
  • Example 4 normal oxygen ( normoxia ) And low oxygen ( hypoxia Extraction of Exosomes from Human Adipose Stem Cells under Conditions
  • exosomes (HASC-Exo) extracted from human adipose derived stem cells are fibrotic-induced lungs compared to exosomes (UC-MSC-Exo and BM-MSC-Exo) of other stem cells. It was confirmed that the collagen synthesis inhibitory ability in the fibroblasts more excellent, it can be seen that the exosomes of adipose-derived stem cells can be useful for the treatment of pulmonary fibrosis.
  • the human adipose-derived stem cells were passaged and propagated up to passage 7, followed by normal or hypoxic condition. Cultured under) to extract an exosome (normoxia exosome or hypoxia exosome).
  • human adipose-derived stem cells are DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium high glucose; Gibco, Cat #: 11995065) containing 10% FBS (fetal bovine serum) and 1% penicillin / streptomycin.
  • the culture medium was used for passage up to passage 7.
  • cobalt (II) chloride hexahydrate (CoCl 2Co 6H 2 O), which is known as a substance for inducing hypoxic conditions in cultured cells, is used.
  • the cobalt chloride (II) hexahydrate was added to the culture medium at a concentration of 100 ⁇ M to replace the medium composition and incubated for 1 day (A in Fig. 5). No cobalt (II) hexahydrate was added.
  • Serum-free, antibiotic-free and phenol red-free 24 hours before extracting exosomes from human adipose derived stem cells cultured under normal oxygen or hypoxic conditions The culture was replaced with a medium (Gibco, Cat #: 31053028) for 24 hours, and then cell culture supernatants were recovered.
  • the recovered cell culture supernatant was obtained by separating and purifying exosomes using a multi-filter system as in Example 1 above.
  • the concentration of exosomes extracted from human fat-derived stem cells cultured under normal oxygen or hypoxic conditions was confirmed by nanoparticle tracking analysis, and exo extracted from human fat-derived stem cells cultured under normal oxygen conditions.
  • the concentration of normoxia exosomes was 2.25 ⁇ 10 9 particles / mL
  • the concentration of hypoxia exosomes extracted from human adipose-derived stem cells cultured under hypoxic conditions was 2.45 ⁇ 10 9 particles / mL (see FIG. 5).
  • C the extracted exosomes were confirmed to have the shape of round nanoparticles (Fig. 5B).
  • Example 5 extracted from adipose derived stem cells Exosome Pulmonary Fibrosis Treatment Efficacy Assessment
  • Exosomes obtained in Example 4 that is, exosomes (Normoxia-Exo) obtained from adipose derived stem cells cultured under normal oxygen conditions and exosomes obtained from adipose derived stem cells cultured under hypoxic conditions (Hypoxia- In order to confirm the effect of pulmonary fibrosis treatment of Exo), a lung fibrosis animal model was constructed, and the exosomes were administered to the constructed lung fibrosis animal model to evaluate pulmonary fibrosis treatment efficacy.
  • pulmonary fibrosis animal models induce pulmonary fibrosis by bleomycin by injecting bleomycin, a pulmonary fibrosis-inducing substance, directly into the lungs of C57BL / 6J mice according to intratracheal intrachracheal instillation (IT).
  • a mouse animal model (bleomycin induced C57BL / 6J mouse; 9 weeks old, male, central experimental animal) was constructed.
  • the constructed bleomycin-induced pulmonary fibrosis C57BL / 6J mice were administered with intravenous Normoxia-Exo and Hypoxia-Exo by intravenous injection (IV injetion), respectively.
  • IV injetion intravenous injection
  • the group administered with PBS Phosphate-Buffered Saline
  • HASCs human adipose-derived stem cells
  • the human adipose-derived stem cells were prepared to have a concentration of 1 ⁇ 10 6 cells / 100 ⁇ l in PBS, and Normoxia-Exo and Hypoxia-Exo were each 1 ⁇ 10 8 particles / 100 in PBS. It was prepared by injection by dispersing at a concentration of ⁇ l (concentration corresponding to 5 ⁇ 10 9 particles / kg).
  • Normoxia-Exo and Hypoxia-Exo prepared as above were administered to bleomycin-induced pulmonary fibrosis C57BL / 6J mice, respectively, 2 days apart, 1 day, 3 days, 5 days, and a total of 3 intravenous injections.
  • human fat-derived stem cells (HASCs) prepared at a concentration of 1 ⁇ 10 6 cells / 100 ⁇ l as a negative control PBS and a positive control group were also separated by a total of 3 at 2 days, respectively, like Normoxia-Exo and Hypoxia-Exo. Administered by iv intravenous injection (FIG. 6A).
  • the experimental groups administered Normoxia-Exo and Hypoxia-Exo extracted from adipose stem cells cultured under normal and hypoxic conditions were negative control group (PBS administration group) and positive control group (PBS group).
  • PBS administration group negative control group
  • PBS group positive control group
  • the stained collagen region was significantly reduced to a level similar to that of normal lung tissue.
  • exosomes obtained from adipose derived stem cells cultured under normal oxygen conditions and exosomes (Hypoxia-Exo) obtained from adipose derived stem cells cultured under hypoxic conditions improved lung fibrosis or It was confirmed that there was a therapeutic effect.
  • the effect of treating pulmonary fibrosis of exosomes (Hypoxia-Exo) obtained from adipose derived stem cells cultured under hypoxic conditions was remarkably excellent.

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Abstract

본 발명은 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 폐 섬유증 예방 또는 치료용 조성물, 폐 섬유증 예방 또는 치료를 위한 의약품의 제조에 있어서의 상기 엑소좀의 용도, 및 상기 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 폐 섬유증 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀은 폐 섬유증 치료에 관련된 HGF(hepatocyte growth factor) 및 IL-10과 같은 성장인자를 포함하며, 폐 섬유증 유도 실험동물 모델에서 섬유화 영역을 현저히 감소시킬 수 있으므로 폐 섬유증 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 엑소좀을 이용한 폐 섬유증 치료는 기존 폐 섬유증 치료에 사용되던 스테로이드계 약물 및 항산화제에 의해 유발되는 부작용 발생 우려가 적고, 수술 치료 없이 주사 투여 방식, 흡입 투여 방식 등을 통해 자연적으로 폐에 엑소좀을 전달할 수 있으므로, 간편하고 경제적으로 폐 섬유증을 치료할 수 있다.

Description

지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 폐 섬유증 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 폐 섬유증 예방 또는 치료용 조성물, 폐 섬유증 예방 또는 치료를 위한 의약품의 제조에 있어서의 상기 엑소좀의 용도, 및 상기 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 폐 섬유증 치료 방법에 관한 것이다.
폐 섬유증(pulmonary fibrosis)이란 폐 조직 내 폐포 벽에 만성염증 세포들이 침투하면서 조직 섬유화를 유도함으로써 폐 조직의 심한 구조적 변이를 일으키는 질환을 말한다. 섬유화가 진행되면 폐 조직이 단단하게 굳고 폐포 벽이 두꺼워져 혈액에 의한 산소 공급량이 줄어들고, 이에 따라 호흡의 어려움을 겪게 된다. 현재 기술로는 섬유화가 진행된 폐 조직을 완전히 복구할 수 있는 치료 방법이 없어, 조기 발견하여 치료하는 경우 및 폐 이식의 경우를 제외하면 대개 증상이 발병 한 후, 3~5년 정도 후에 사망에 이르는 무서운 질환이다.
조기 발견된 폐 섬유증의 치료 방법으로는 스테로이드(steroid), 아자티오프린(azathioprine), 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide)와 같은 스테로이드계 약물을 이용한 치료 방법, 아세틸시스테인(acetylcysteine)과 같은 항산화제를 이용한 치료 방법 및 사이토카인(cytokine) IFN-γ와 같은 성장인자 투여를 통한 치료 방법 등이 있다. 스테로이드계 약물 및 항산화제를 이용한 치료 방법들은 2000년도부터 지속적으로 연구 및 보고된 것은 많으나 아직까지 뚜렷한 약물 효능으로 입증된 것이 없는 상태이며, 장기간 투여 시 전신 부작용을 초래하거나, 내성이 생기는 부작용들을 초래하는 것으로 보고된 바 있다. 성장인자 투여를 통한 치료법은 최근 들어 많은 이목을 받고 있는 치료법으로서 폐 섬유화에 중요한 인자로 알려진 TGF-β의 생산을 억제하는 '인터페론'을 이용한 비교적 근본적인 접근 방식의 치료법이다. 이러한 발병의 원인을 분석하여 치료하는 접근 방식 때문에 스테로이드계 약물 및 항산화제를 이용한 치료법에 비해 부작용이 적고, 효능이 우수하여 주사제 방식, 에어로졸 방식과 같은 다양한 형태의 치료법들이 보고되고 있다. 하지만 아직까지 폐 섬유증의 정확한 발병 원인이 알려져 있지 않기 때문에 인터페론과 같은 단일성분에 의한 치료 효능은 일시적일 수 있고, 이는 일부 환자들에 대해서만 효능이 나타날 수 있으므로 지속적인 연구 및 임상시험이 필요한 실정이다.
이러한 한계점을 보완하기 위해 다양한 인자들을 생산 및 조절할 수 있는 줄기세포 및 줄기세포 배양액을 이용하여 폐 섬유증을 치료하려는 연구들이 보고되었다(한국 등록특허 제10-0837167호, 한국 공개특허 제10-2009-0122415호). 하지만 줄기세포의 가장 큰 문제점은 체내 생착률 및 생존률이 환자에 따라 일정하지 않아 정확한 효능을 입증하지 못하고 또한 줄기세포의 암세포화에 대한 가능성을 배제할 수 없다. 또한 줄기세포로부터 분비된 다양한 성장인자를 포함한 배양액은 성장인자 뿐 아니라 여러 가지 세포 노폐물들이 포함되어 있으므로 잠정적인 문제들을 초래할 수 있다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 폐 섬유증 치료제를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀이 폐 섬유증 치료에 관련된 HGF(hepatocyte growth factor) 및 IL-10과 같은 성장인자를 포함하고 있으며, 폐 섬유증 유도 실험동물 모델에서 폐 섬유증 치료 효과가 우수함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 지방 유래 줄기세포(adipose-derived stem cell)로부터 추출된 엑소좀(exosome)을 유효성분으로 포함하는, 폐 섬유증(pulmonary fibrosis) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 폐 섬유증 예방 또는 치료를 위한 의약품의 제조에 있어서의 상기 엑소좀의 용도를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 폐 섬유증 치료 방법을 제공하기 위한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 폐 섬유증 예방 또는 치료용 조성물, 폐 섬유증 예방 또는 치료를 위한 의약품의 제조에 있어서의 상기 엑소좀의 용도, 및 상기 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 폐 섬유증 치료 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
하나의 양태로서, 본 발명은 지방 유래 줄기세포(adipose-derived stem cell)로부터 추출된 엑소좀(exosome)을 유효성분으로 포함하는, 폐 섬유증(pulmonary fibrosis) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 "줄기세포(stem cell)"란 자기 복제 능력뿐만 아니라, 세포가 위치하는 환경의 영향을 받아 필요에 따라 적절한 신호가 주어질 경우, 다중분화능(multi potency)의 특성에 의해 여러 가지 세포로 분화할 수 있는 특성이 있으며, 지방, 골수, 제대혈 및 태반 등에 포함되어 있으며, 심근경색, 뇌경색, 퇴행성 관절염 및 골절 등의 다양한 세포손상질환을 치료하는데 활용될 수 있는 세포이다.
본 발명의 줄기세포는 자가 또는 동종 유래 줄기세포일 수 있으며, 인간 및 비인간 포유류를 포함한 임의 유형의 동물 유래일 수 있다.
본 발명에서 용어 "지방 유래 줄기세포(adipose-derived stem cell)"란 지방조직에서 유래하는 줄기세포로, 지방조직은 많은 양의 조직 채취가 용이하여 줄기세포를 수확하는데 좋은 조건을 가지고 있으며, 지방 유래 줄기세포는 배양 시 안정적인 성장과 증식을 보여주고 분화를 유도하였을 때 다양한 세포로의 분화가 가능하다. 이들 줄기세포는 지방조직뿐만 아니라 연골, 골, 신경조직, 혈관조직 등 간엽조직 재생과 간 세포, 신장, 심혈관 재생 등 다양한 조직을 재생한다는 보고가 있다.
본 발명에서 용어 "엑소좀(exosome)"은 세포들로부터 분비되는 40~120nm 크기의 나노소포체로, 면역학적으로 중요한 단백질인 주조직적합체(main histocompatibility complex, MHC)와 열 충격 단백질(heat shock protein)을 포함하여 강력한 항종양 면역 반응을 유도하며, 항염증성의 마이크로 RNA(microRNA)와 콜라겐(collagen)의 축적을 조절하는 마이크로 RNA(microRNA)를 포함한다. 또한, 다른 세포 및 조직에 결합하여 막 구성요소, 단백질, RNA를 전달하는 등 다양한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 엑소좀은 줄기세포로부터 추출된 엑소좀으로, 이에 제한되지는 않으나, 지방 유래 줄기세포, 제대 유래 줄기세포 또는 골수 유래 줄기세포로부터 추출된 것일 수 있다.
상기 줄기세포로부터 추출된 엑소좀은 줄기세포의 특성에 따라 줄기세포의 세포증식, 분화, 재생과 관련된 유전자, 단백질, 성장인자 등을 함유하고 있어, 조직 재생에서 중요한 역할을 할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 지방 유래 줄기세포로부터 세포의 유전정보, 단백질, 성장인자를 함유하고 있는 엑소좀을 추출할 수 있으며, 상기 추출된 엑소좀은 줄기세포의 기본적인 특성을 가질 수 있고, 조직 재생에 필요한 중요한 성장인자, 생체 활성 단백질 및 유전자 정보 등을 함유할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀이 HGF(hepatocyte growth factor) 및 인터루킨-10(interleukin-10) 등 폐 섬유증 치료와 관련된 성장인자를 포함하고 있음을 확인하였다(도 3의 B).
상기 엑소좀은 당업계에 알려진 엑소좀 추출 방법을 이용하여 수득할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 하기의 단계를 포함하는 추출 방법에 의하여 수득할 수 있다:
1) 줄기세포를 일반 배양 배지에 배양한 다음 무혈청 및 무항생제 배지에서 계대 배양하는 단계;
2) 상기 세포 배양 상층액을 회수하는 단계;
3) 상기 회수한 세포 배양 상층액을 원심분리하여 세포 잔여물을 제거하는 단계; 및
4) 상기 세포 잔여물이 제거된 세포 배양 상층액을 다중필터시스템을 통해 여과하여 분리·정제된 엑소좀을 수득하는 단계.
구체적으로, 상기 단계 1)의 줄기세포는, 이에 제한되지는 않으나, 지방 유래 줄기세포, 제대 유래 줄기세포, 또는 골수 유래 줄기세포일 수 있고, 예를 들어 지방 유래 줄기세포일 수 있다.
상기 지방 유래 줄기세포는 인체 또는 동물 유래 줄기세포일 수 있다.
상기 단계 1)에서 줄기세포는, 이에 제한되지는 않으나, 정상 산소 조건(normoxia condition) 또는 저산소 조건(hypoxic condition) 하에서 배양될 수 있다.
상기 정상 산소 조건(normoxia condition)은, 이에 제한되지는 않으나, 정상 산소 농도, 즉 21%의 산소(O2)가 공급되는 배양 조건일 수 있으며, 또는 저산소 세포 감작제(hypoxic cell sensitizer)를 세포 배양 배지에 첨가하지 않은 배양 조건일 수 있다.
상기 저산소 세포 감작제는 저산소 상태(hypoxic condition)를 유도하는 물질로, 이에 제한되지는 않으나, 염화코발트(cobalt chloride), 데스페리옥사민(desferrioxamine), 및 디메틸록살릴 글리신(dimethyloxalylglycine, DMOG)으로 구성된 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
상기 저산소 조건(hypoxic condition)은, 이에 제한되지는 않으나, 저산소 농도, 즉 10% 이하의 산소(O2)가 공급되는 배양 조건일 수 있으며, 또는 저산소 세포 감작제(hypoxic cell sensitizer)를 세포 배양 배지에 첨가한 배양 조건일 수 있다.
상기 저산소 농도는, 이에 제한되지는 않으나, 산소가 0.5 내지 10% 일 수 있으며, 0.5 내지 5% 일 수 있으며, 0.5 내지 2% 일 수 있다.
상기 저산소 세포 감작제는 전술한 바와 같으며, 본 발명의 일실시예에 있어서, 지방 유래 줄기세포 배양을 위한 배지 조성물에 100 μM 농도의 염화코발트(Ⅱ) 6수화물(Cobalt(Ⅱ) chloride hexahydrate(CoCl2˙6H2O)을 첨가하여 저산소 배양 조건을 유도하였다(도 5의 A).
상기 단계 1)에서 일반 배양 배지는, 당업계에 통상적으로 사용되는 세포 배양용 배지는 모두 사용 가능하며, 이에 제한되지는 않으나, DMEM(Dulbecco's modified eagle medium) 배지, MEM(minimal essential medium) 배지, 또는 RPMI 1640(Rosewell Park Memorial Institute 1640) 배지일 수 있다.
또한, 상기 세포 배양 배지에는 필요에 따라 한 가지 이상의 보조성분을 첨가할 수 있는데, 이러한 보조성분으로는 태아 송아지, 말 또는 사람 등의 혈청을 비롯하여, 미생물의 오염을 막기 위한 페니실린 G(penicilli G), 스트렙토마이신 설페이트(sterptomycin sulfate) 및 젠타마이신(gentamycin) 등의 항생제, 암포테리신 B(amphotericin B) 및 니스타틴(nystatin) 등의 항진균제(antifungal agent) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 성분 중 하나 이상을 사용할 수 있다.
구체적으로, 10% FBS(fetal bovine serum) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)이 포함되어 있는 DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium high glucose) 배지일 수 있다. 또한, 이에 제한되지는 않으나, 혈청(serum), 항생제(antibiotics) 및 페놀레드(phenol red)가 첨가되지 않은 DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium high glucose) 배지일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 10% FBS(fetal bovine serum) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)이 포함되어 있는 DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium high glucose) 배지를 이용하여 인간 지방 유래 줄기세포(passage 7 또는 8)를 배양하고, 상기 줄기세포로부터 엑소좀을 추출하기 24시간 전에 무혈청(serum-free), 무항생제(antibiotic-free), 무페놀레드(phenol red-free)인 배지로 교체하여 24시간 동안 배양하였다(실시예 1).
상기 단계 2)에서 회수한 세포 배양 상층액에는 세포 잔여물 및 줄기세포로부터 분비된 엑소좀이 포함되어 있으며, 상기 단계 3)에서 원심분리함에 따라 세포 배양 상층액에 포함되어 있는 세포 잔여물을 제거할 수 있다.
상기 단계 2)에서 회수한 세포 배양 상층액에 포함되어 있는 엑소좀은 원심분리 및 다중필터시스템 도입을 통한 여과 단계를 거쳐 최종적으로 분리 및 정제될 수 있다.
상기 원심분리는, 이에 제한되지는 않으나, 250 내지 500 g에서 5 내지 10분간 수행하는 것일 수 있으며, 또는 300g에서 10분간 수행하는 것일 수 있다.
상기 다중필터시스템은 다양한 포어 크기의 필터를 이용하여 단계적으로 여과하는 시스템으로, 이에 제한되지는 않으나, 4 ㎛ 포어 크기를 갖는 셀 스트레이너(cell strainer), 0.22 ㎛ 포어 크기를 갖는 필터(filter), 및 500 kD MWCO(molecular weight cut off)를 갖는 필터를 이용하여 단계적으로 여과하는 시스템일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 배양한 인간 지방 유래 줄기세포로부터 회수한 세포 배양 상층액을 300 xg에서 10분간 원심분리하여 세포 잔여물(cell debris)을 제거하고, 0.4 ㎛ 포어 크기를 갖는 셀 스트레이너(cell strainer)를 이용하여 포어 크기 이상의 잔여물을 제거하였으며, 이후, 0.22 ㎛ 포어 크기를 갖는 필터(filter)를 이용하여 포어 크기 이상의 세포 잔여물을 제거하였다. 세포 잔여물 제거 후 회수한 용액을 4 mL/분(min)의 유속을 가하여 500 kD MWCO(molecular weight cut off)를 갖는 필터를 이용한 TFF(tangential flow filtration) 과정을 통해 단백질을 제거하였으며, TFF 과정 후 회수한 용액을 소니케이션(sonication)하고, 상기 TFF 과정을 연속 반복하여 최종적으로 엑소좀을 분리·정제하여 얻었다(도 2).
상기 엑소좀 추출 방법을 통해 수득된 본 발명의 엑소좀은 정상 산소 조건(normoxia condition) 또는 저산소 조건(hypoxic condition) 하에서 배양된 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀일 수 있다.
상기 엑소좀은 HGF(hepatocyte growth factor) 및 인터루킨-10(interleukin-10) 등 폐 섬유증 치료와 관련된 성장인자를 포함할 수 있으며, 이에 따라 상기 엑소좀을 유효성분으로 포함하여 폐 섬유증 예방 또는 치료용 조성물로 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어 "폐 섬유증(pulmonary fibrosis)"은 폐포 벽에 미만성 섬유 증식을 특징으로 하는, 건성 기침이나 노동 시, 호흡 곤란을 주증상으로 하는 질환이다. 협의로는 간질성 폐렴의 말기의 형태를 가리키지만, 광의로는 협의의 폐섬유증과 간질성 폐렴과의 병존상태를 의미한다. 모든 간질성 폐렴이 폐섬유증의 원인이 될 수 있다. 간질성 폐렴은, 폐의 간질(협의로는 폐포 격벽, 광의로는 소잎간간질, 흉막 근방 등을 포함한다)에 염증을 일으키는 질환의 총칭이며, 감염, 교원병, 방사선, 약제, 분진 등 특정의 원인에 의하는 것과 원인이 불명의 특발성 간질성 폐렴을 포함한다. 특발성 간질성 폐렴은, 흉강경하폐생검(VATS)이나 고 분해능 컴퓨터 단층 사진(HRCT) 소견 등에 기초를 두어, 특발성 폐섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis：IPF), 비특이성 간질성 폐렴(nonspecific interstitial pneumonia：NSIP), 급성 간질성 폐렴(acute interstitial pneumonia：AIP), 특발성 기질화 폐렴(cryptogenic organizing pneumonia：COP), 호흡계 기관지염 관련성 간질성 폐질환(respiratory bronchiolitis associated interstitial lung disease：RB-ILD), 박리성 간질성 폐렴(desquamative interstitial pneumonia：DIP), 임파구성 간질성 폐렴(lymphoid interstitial pneumonia：LIP) 등으로 분류된다.
본 발명에 따른 폐 섬유증 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 효과적인 폐 섬유증 치료를 위한 효능 물질로서, 정상 산소 조건 또는 저산소 조건과 같은 특정 배양 조건하에서 배양된 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 사용한다는 점에서 종래 기술들과 차별성이 있다.
상기 추출, 분리·정제된 엑소좀에는 폐 섬유증 완화 또는 치료를 위한 다양한 유전정보, 단백질 및 성장인자들이 담지되어 있으며, 세포 유래 물질이기 때문에 생체적합성이 뛰어나며, 흡수율 또한 우수하다.
따라서, 현재 폐 섬유증 치료에 사용되고 있는 치료 약물이 유발시킬 수 있는 문제점들이나, 최근 연구되고 있는 줄기세포 배양액을 이용한 치료에서 발생할 수 있는 줄기세포의 암세포화 또는 세포 노폐물에 의한 부작용 등도 최소화할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀에 HGF(hepatocyte growth factor) 및 인터루킨-10(interleukin-10) 등 폐 섬유증 치료와 관련된 성장인자가 포함되어 있음을 확인하였으며(도 3의 B), 섬유증이 유도된 폐 섬유아세포에서 상기 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀에 의해 섬유화 과정에 조직에 축적되어 정상 구조를 파괴하여 기능의 장애를 가져오는 콜라겐 합성이 저해됨을 확인하였다(도 4의 B).
또한, 블레오마이신-유도 폐 섬유증 C57BL/6J 마우스에 정상 산소 조건(normoxia condition) 및 저산소 조건(hypoxic condition) 하에 배양된 지방 유래 줄기세포로부터 각각 추출된 Normoxia-Exo 및 Hypoxia-Exo을 투여한 후, 폐 조직을 적출하여 트리크롬 염색을 수행해 본 결과, 음성 대조군(PBS 투여군) 및 양성 대조군(지방 유래 줄기세포 투여군)에 비해 염색된 콜라겐 영역이 정상 폐 조직과 유사한 수준으로 유의하게 감소한 것을 확인하였으며, 특히, Hypoxia-Exo을 투여한 경우, 음성 대조군 및 양성 대조군을 비롯하여 Normoxia-Exo을 투여한 경우에 비해서도 정상 폐 조직과 거의 유사한 수준으로 염색된 콜라겐 영역이 현저하게 감소한 것을 확인하였다(도 7 내지 도 9).
상기 결과를 통해, 정상 산소 조건하에 배양된 지방 유래 줄기세포로부터 수득한 엑소좀(Normoxia-Exo) 및 저산소 조건하에 배양된 지방 유래 줄기세포로부터 수득한 엑소좀(Hypoxia-Exo) 모두 폐 섬유증 개선 또는 치료 효과가 있음을 확인하였으며, 특히, 저산소 조건하에 배양된 지방 유래 줄기세포로부터 수득한 엑소좀(Hypoxia-Exo)의 폐 섬유증 치료 효과가 현저히 우수함을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명에 따른 지방 유래 줄기세포부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물을 폐 섬유증 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 폐 섬유증 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양의 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 폐 섬유증의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 의미한다.
본 발명에 따른 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀의 약학적으로 유효한 양은 5×108 내지 5×1010 particles/day/체중 kg일 수 있으며, 5×109 particles/day/체중 kg일 수 있다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 폐 섬유증 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료 기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
또한, 상기 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 의미한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제로 제형화시켜 투여할 수 있으며, 상기 제제는 1회 또는 수회 투여에 의해 폐포를 발달시킬 수 있는 효과적인 투여량을 포함한다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사용 앰플과 같은 주사제, 주입 백과 같은 주입제, 및 에어로졸 제제와 같은 분무제 등이 바람직하다. 상기 주사용 앰플은 사용 직전에 주사액과 혼합 조제할 수 있으며, 주사액으로는 생리 식염수, 포도당, 만니톨, 링거액 등을 사용할 수 있다. 또한, 주입 백은 염화폴리비닐 또는 폴리에틸렌 재질의 것을 사용할 수 있으며, 박스터(Baxter), 벡톤 디킨슨(Becton-Dickinson), 메드셉(Medcep), 내셔날 호스피탈 프로덕츠(National Hospital Products) 또는 테루모(Terumo)사의 주입 백을 예시할 수 있다.
상기 약학적 제제에는 상기 유효성분 외에 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용가능한 통상의 불활성 담체, 예를 들어, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등을, 국소 투여용 제제의 경우에는 기제 (base), 부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
이렇게 제조된 본 발명의 조성물 또는 약학적 제제는 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 비경구, 경구 등의 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 투여 방법은 당업계에서 통상적으로 사용하는 모든 방식에 의해 투여될 수 있다. 이에 제한되지는 않으나, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사 등에 의해 투여될 수 있다.
구체적으로, 투여 방법은 이에 제한되지는 않으나, 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 정맥 내로 투여(정맥주사; Intravenous injection)하거나, 대상체의 폐 또는 기관 내로 투여(국소 투여; Topical administration)하거나, 흡입(inhalation)에 의해 투여될 수 있다. 또한, 상기 엑소좀은 네블라이져(nebulizer)을 사용하여 투여될 수 있으며, 기관 내 튜브를 사용하여 투여될 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 폐 섬유증 예방 또는 치료용 주사제를 제공한다.
상기 주사제는 인산완충식염수(phosphate-buffered saline, PBS)를 더 포함할 수 있다. 즉, 상기 주사제는 인산완충식염수에 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 담지하여 사용할 수 있다.
상기 주사제는 인산완충식염수 대신 하이드로젤을 포함할 수 있다.
상기 하이드로젤은 히알루론산, 젤라틴, 알지네이트, 키토산, 피브린, 엘라스틴, 콜라겐 및 메틸셀룰로오즈로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있고, 구체적으로 히알루론산 하이드로젤일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 주사제는 엑소좀이 5×108 particles/㎏ 내지 5×1010 particles/㎏ 농도로 포함된 것일 수 있으며, 5×109 particles/㎏ 농도로 포함된 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 주사제는 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물의 폐 등의 손상 부위에 주사하여 투여할 수 있으며, 정맥 투여할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 폐 섬유증 예방 또는 치료를 위한 의약의 제조에 있어서 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀의 용도를 제공한다.
상기 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀에 대하여는 전술한 바와 같고, 이를 폐 섬유증 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 유효성분으로 포함하여 사용할 수 있음 또한 상기에서 설명한 바와 같다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 이용하여 폐 섬유증을 치료하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 상기 약학적 조성물을 전술한 바와 같은 다양한 방법으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다를 수 있으며, 이는 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 상기 대상체는 폐 섬유증이 발병하였거나 발병할 수 있는, 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다.
구체적으로, 정맥주사요법, 흡입투여방식, 국소투여방식 등을 통해 대상체에 투여할 수 있으며, 흡입 및 국소 투여 방식으로 직접적으로 폐에 엑소좀을 전달할 수 있을 뿐만 아니라, 정맥주사 시 혈관을 따라 순환하던 엑소좀이 자연적으로 폐에 축적되기 때문에 복잡한 치료 과정 없이 상기와 같은 간단한 방법으로 효율적으로 폐 섬유증을 치료할 수 있다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에 따른 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀은 폐 섬유증 치료에 관련된 HGF(hepatocyte growth factor) 및 IL-10과 같은 성장인자를 포함하며, 폐 섬유증 유도 실험동물 모델에서 섬유화 영역을 현저히 감소시킬 수 있으므로 폐 섬유증 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 엑소좀을 이용한 폐 섬유증 치료는 기존 폐 섬유증 치료에 사용되던 스테로이드계 약물 및 항산화제에 의해 유발되는 부작용 발생 우려가 적고, 수술 치료 없이 주사 투여 방식, 흡입 투여 방식 등을 통해 자연적으로 폐에 엑소좀을 전달할 수 있으므로, 간편하고 경제적으로 폐 섬유증을 치료할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 인간 지방 유래 줄기세포(human adipose-derived stem cells, HASCs)로부터 추출된 엑소좀(exosome)과 이의 응용에 대한 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 다양한 유래의 줄기세포로부터 엑소좀을 추출하는 방법에 대한 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 인간 지방 유래 줄기세포(human adipose-derived stem cell, HASC), 인간 제대 유래 줄기세포(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cell, UC-MSC) 및 인간 골수 유래 줄기세포(human bone marrow-derived mesenchymal stem cell, BM-MSC)로부터 추출된 각 엑소좀의 특성 분석에 대한 결과를 나타낸 도로, (A) 나노입자추적분석기(nanoparticle tracking analysis)를 이용하여 확인한 상기 다양한 유래의 줄기세포로부터 추출한 엑소좀의 농도, 및 (B) ELISA 분석을 통한 상기 각각의 엑소좀 내 HGF(hepatocyte growth factor)와 IL-10(interleukin-10)의 발현 정도를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 섬유증이 유도된 폐 섬유아세포를 이용하여 인간 지방 유래 줄기세포(human adipose-derived stem cell, HASC), 인간 제대 유래 줄기세포(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cell, UC-MSC) 및 인간 골수 유래 줄기세포(human bone marrow-derived mesenchymal stem cell, BM-MSC)로부터 추출된 각 엑소좀의 콜라겐 합성 저해능을 분석한 결과를 나타낸 도로, (A) 섬유증을 유도하기 위한 폐 섬유아세포의 저산소 조건(hypoxia condition) 및 엑소좀 처리 조건에 대한 모식도, 및 (B) HASC, UC-MSC, BM-MSC로부터 추출된 각 엑소좀을 섬유증이 유도된 폐 섬유아세포에 처리한 후 24시간에 배양 배지를 수득하여 ELISA 분석을 통해 COL1A1(human pro-collagen type I alpha 1)의 발현 정도를 나타낸 도이다. 여기에서, GM은 성장 배지(Growth medium)를 사용한 양성 대조군이며, BM은 무혈청 기본 배지(serum-free basal medium)를 사용한 음성 대조군이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 정상 산소(normoxia) 및 저산소(hypoxia) 조건하에서 배양된 인간 지방 유래 줄기세포로부터 각각 추출된 Normoxia Exosomes 및 Hypoxia Exosomes의 특성 분석에 대한 결과를 나타낸 도이다. (A) 인간 지방 유래 줄기세포로부터 엑소좀 추출을 위한 배양 조건 및 단계를 개략적으로 나타낸 모식도로, Normoxia Exosomes 추출을 위해서는 10% FBS 및 1% 항생제(antibiotics)가 포함되어 있는 DMEM(high glucose) 일반 배양 배지를 사용하고, Hypoxia Exosomes 추출을 위해서는 상기 일반 배양 배지에 100 μM의 염화코발트(Ⅱ) 6수화물(CoCl2˙6H2O)이 첨가된 배양 배지를 사용하여, 인간 지방 유래 줄기세포를 각각 24시간 동안 배양한 후, 무혈청(serum-free) 배지로 교체하여 엑소좀을 추출한다. (B) Normoxia Exosomes 및 Hypoxia Exosomes의 구조 및 모양을 촬영한 투과전자현미경(transmission electron microscope) 사진, 및 (C) 나노입자추적분석기(nanoparticle tracking analysis)를 이용하여 확인한 상기 Normoxia Exosomes 및 Hypoxia Exosomes의 농도를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀의 폐 섬유증 치료 효과 결과를 나타낸 도이다. (A) 블레오마이신-유도 폐 섬유증 C57BL/6J 마우스(bleomycin induced C57BL/6J mouse) 모델 구축 및 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출한 Normoxia Exosomes 및 Hypoxia Exosomes의 투여 일정을 개략적으로 나타낸 도이며, (B) 블레오마이신-유도 폐 섬유증 C57BL/6J 마우스에 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 Normoxia Exosomes 및 Hypoxia Exosomes을 각각 2일 간격으로 총 3회 정맥주사로 투여한 후 1일째 되는 날 마우스의 폐를 적출하여 촬영한 사진이다. 여기에서, PBS는 PBS(phosphate buffer saline)를 투여한 음성 대조군(N=3)이고, HASCs는 인간 지방 유래 줄기세포를 1×106 개 cells/100㎕의 농도로 투여한 양성 대조군(N=3)이다. 또한, Normoxia-Exo 및 Hypoxia-Exo는 Normoxia Exosomes 및 Hypoxia Exosomes을 각각 1×108 particles/100㎕의 농도로 투여한 실험군(N=3)이다. 이때, 상기 PBS, 인간 지방 유래 줄기세포(HASCs), Normoxia Exosomes 및 Hypoxia Exosomes은 각각 블레오마이신-유도 폐 섬유증 C57BL/6J 마우스에 2일 간격으로 총 3회 정맥주사로 투여하였다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따라 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀의 폐 섬유증 치료 효과 결과를 나타낸 도로, 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 Normoxia Exosomes 및 Hypoxia Exosomes을 블레오마이신-유도 폐 섬유증 C57BL/6J 마우스에 2일 간격으로 총 3회 정맥주사로 투여한 후 1일째 되는 날 마우스의 폐를 적출하여 트리크롬 염색(trichrome staining)을 수행하고, 그 염색 결과를 촬영하여 나타낸 현미경 사진(현미경 배율: ×10)이다. 여기에서, PBS는 PBS(phosphate buffer saline)를 투여한 음성 대조군(N=3)이고, HASCs는 인간 지방 유래 줄기세포를 1×106 개 cells/100㎕의 농도로 투여한 양성 대조군(N=3)이다. 또한, Normoxia-Exo 및 Hypoxia-Exo는 Normoxia Exosomes 및 Hypoxia Exosomes을 각각 1×108 particles/100㎕의 농도로 투여한 실험군(N=3)이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따라 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀의 폐 섬유증 치료 효과 결과를 나타낸 도로, 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 Normoxia Exosomes 및 Hypoxia Exosomes을 블레오마이신-유도 폐 섬유증 C57BL/6J 마우스에 2일 간격으로 총 3회 정맥주사로 투여한 후 1일째 되는 날 마우스의 폐를 적출하여 트리크롬 염색(trichrome staining)을 수행하고, 그 염색 결과를 고배율로 촬영하여 나타낸 현미경 사진(현미경 배율: ×40)이다. 여기에서, 스케일바(Scale bar)는 100㎛이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따라 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀의 폐 섬유증 치료 효과 결과를 나타낸 도로, 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 Normoxia Exosomes 및 Hypoxia Exosomes을 블레오마이신-유도 폐 섬유증 C57BL/6J 마우스에 2일 간격으로 총 3회 정맥주사로 투여한 후 1일째 되는 날 마우스의 폐를 적출하여 트리크롬 염색(trichrome staining)을 수행하고, 염색된 콜라겐 영역 즉, 섬유증 영역(fibrotic area, %)을 정량화하여 나타낸 그래프이다. 여기에서, PBS는 PBS(phosphate buffer saline)를 투여한 음성 대조군(N=3)이고, HASCs는 인간 지방 유래 줄기세포를 1×106 개 cells/100㎕의 농도로 투여한 양성 대조군(N=3)이다. 또한, Normoxia-Exo 및 Hypoxia-Exo는 Normoxia Exosomes 및 Hypoxia Exosomes을 각각 1×108 particles/100㎕의 농도로 투여한 실험군(N=3)이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 다양한 유래의 줄기세포로부터 엑소좀의 추출
줄기세포(stem cell)는 유래 된 조직 및 배양 조건에 따라 다른 특성을 나타내며, 이에 따라 서로 다른 특성을 나타내는 줄기세포에서 추출된 엑소좀(exosome)은 내부 구성 성분 또한 차이점이 존재한다(Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends; G Raposo et al., J. Cell Biol ., 2013, Vol. 200, No.4, p.373-383). 즉, 엑소좀을 추출하는 세포의 종류는 그 엑소좀의 특성을 결정하는 매우 중요한 요소이다.
이에, 폐 섬유증(pulmonary fibrosis)에 유효한 치료 효과를 보이는 엑소좀을 추출하기 위하여, 다양한 유래의 줄기세포로부터 엑소좀을 추출하였다.
구체적으로, 인간 지방 유래 줄기세포(human adipose-derived stem cell, HASC), 인간 제대 유래 줄기세포(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cell, UC-MSC) 및 인간 골수 유래 줄기세포(human bone marrow-derived mesenchymal stem cell, BM-MSC)를 각각 배양하는 과정에서 상기 줄기세포로부터 엑소좀을 각각 추출하였다.
상기 각각의 줄기세포는 10% FBS(fetal bovine serum) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)이 포함되어 있는 DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium high glucose; Gibco, Cat#: 11995065) 일반 배양 배지를 이용하여 배양하였다.
각각의 줄기세포로부터 엑소좀을 추출하기 24시간 전에 무혈청(serum-free), 무항생제(antibiotic-free), 무페놀레드(phenol red-free)인 배지(Gibco, Cat#: 31053028)로 교체하여 24시간 동안 배양하였으며, 이후 세포 배양 상층액(supernatant)을 회수하였다. 회수한 세포 배양 상층액은 300 xg에서 10분간 원심분리하여 세포 잔여물(cell debris)을 제거하고, 0.4 ㎛ 포어 크기를 갖는 셀 스트레이너(cell strainer)를 이용하여 포어 크기 이상의 잔여물을 제거하였다. 이후, 0.22 ㎛ 포어 크기를 갖는 필터(filter)를 이용하여 포어 크기 이상의 세포 잔여물을 제거하였다. 여과 후 회수한 용액을 4 mL/분(min)의 유속을 가하여 500 kD MWCO(molecular weight cut off)를 갖는 필터를 이용한 TFF(tangential flow filtration) 과정을 통해 단백질을 제거하였다. 회수한 용액을 소니케이션(sonication) 과정을 거친 후 TFF 과정을 연속 반복하여 최종적으로 엑소좀을 수득하였다(도 2).
상층액을 회수한 이후 다시 일반 배양 배지를 상기 각각의 줄기세포에 첨가하여 배양하였고, 이러한 과정은 패시지(passage) 7 또는 8까지 계대 배양(sub-culture)을 진행하였다.
실시예 2: 다양한 유래의 줄기세포로부터 추출된 엑소좀의 특성 분석
상기 실시예 1에서 수득한 다양한 유래의 줄기세포부터 추출된 각각의 엑소좀의 특성을 분석하였다.
먼저, 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출한 엑소좀(HASC-Exo), 인간 제대 유래 줄기세포로부터 추출한 엑소좀(UC-MSC-Exo) 및 인간 골수 유래 줄기세포로부터 추출한 엑소좀(BM-MSC-Exo) 각각의 농도는 나노입자추적분석기(nanoparticle tracking analysis)를 통해 확인하였다.
나노입자추적분석기를 이용하여 각각의 엑소좀의 농도를 확인한 결과, 인간 지방 유래 줄기세포 엑소좀(HASC-Exo)의 농도는 2.25×109 particles/mL 이었고, 인간 제대 유래 줄기세포 엑소좀(UC-MSC-Exo)의 농도는 1.38×109 particles/mL 이었으며, 인간 골수 유래 줄기세포 엑소좀(BM-MSC-Exo)의 농도는 1.81×109 particles/mL 이었다(도 3의 A).
또한, 상기 인간 지방 유래, 인간 제대 유래, 및 인간 골수 유래의 각각의 줄기세포로부터 추출된 엑소좀의 특성을 비교하기 위하여, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 수행하였으며, 이를 통해 폐 섬유증 완화에 도움을 주는 것으로 알려진 HGF(hepatocyte growth factor) 및 IL-10(interleukin-10)의 발현 정도를 확인하였다.
구체적으로, 상기 다양한 유래의 줄기세포로부터 추출된 7×107 particles/200㎕ 농도의 각각의 엑소좀과 RIPA 버퍼(Radioimmunoprecipitation assay buffer)를 1:1의 비율로 각각 혼합하여 HGF ELISA kit(abcam, ab100534)와 IL-10 ELISA kit(abcam, ab100549)를 이용하여 엑소좀 내 HGF와 IL-10의 발현 정도를 확인하였다.
ELISA를 통해 HGF 및 IL-10의 발현 정도를 확인한 결과, 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(HASC-Exo)에서 HGF가 가장 높게 발현되었으며, 인간 제대 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(UC-MSC-Exo)과는 유의한 차이를 나타내었다. 반면, 인간 골수 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(BM-MSC-Exo)과는 유의한 차이 없이 유사한 수준으로 발현됨을 확인하였다. 한편, IL-10의 경우, 상기 다양한 유래의 줄기세포에서 추출된 엑소좀 모두에서 유사한 수준으로 발현되었다(도 3의 B).
실시예 3: 섬유증이 유도된 폐 섬유아세포를 이용한 엑소좀의 콜라겐 합성 저해능 평가
대부분의 장기는 조직 손상 후 염증과 치유 과정을 거치게 되는 데, 만약 손상이 작은 경우는 정상 구조와 기능을 유지하지만, 계속적인 손상이 있으면 치유 과정에서 조직이 섬유화(fibrosis)를 밟게 된다. 이 섬유화 과정은 콜라겐(collagen), 파이브로넥틴(fibronectin) 등의 세포외기질(extracellular matrix, ECM)이 조직에 축적되어 정상 구조를 파괴하여 기능의 장애를 가져온다(Tuberculosis and Respiratory Diseases, Vol.54, No.2, p.1-12, Feb, 2003).
이에, 상기 실시예 1에서 수득한 인간 지방 유래, 인간 제대 유래, 및 인간 골수 유래의 각각의 줄기세포로부터 추출된 엑소좀이 폐 섬유증(pulmonary fibrosis)에 유효한 치료 효과를 보이는지 확인하기 위하여, 폐 섬유아세포(lung fibroblast)를 이용한 in vitro 모델을 구축하고, 상기 다양한 유래의 줄기세포로부터 추출된 각 엑소좀의 콜라겐 합성 저해능을 평가하였다.
구체적으로, 초대 인간 폐 섬유아세포(Primary human lung fibroblast; Normal, ATCC, PCS-201-013)는 Fibroblast Growth Kit-Low serum(ATCC, PCS-201-041)가 첨가된 섬유아세포 기본 배지(fibroblast Basal Medium; ATCC, PCS-201-030)를 이용하여 패시지(passage) 6까지 계대 배양하였다.
계대 배양 후, 섬유증을 유도하기 위하여 배양 세포에서 저산소 상태(hypoxic condition)를 유도하고, 폐간질의 섬유화 감작 물질로 알려져 있는 염화코발트(Ⅱ) 6수화물(Cobalt(Ⅱ) chloride hexahydrate(CoCl2˙6H2O)을 배양 배지에 100 μM의 농도로 첨가하여 배지 조성물을 교체하였다. 상기 배지 조성물에 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출한 엑소좀(HASC-Exo), 인간 제대 유래 줄기세포로부터 추출한 엑소좀(UC-MSC-Exo) 및 인간 골수 유래 줄기세포로부터 추출한 엑소좀(BM-MSC-Exo)을 각각 1×108 particles/mL 또는 5×108 particles/mL 농도로 배지에 처리하였다. 24시간 후 배양 배지를 추출하여 ELISA kit를 이용하여 COL1A1(collagen type Ⅰ, alpha 1)의 발현 정도를 확인하였다. 이때, 성장 배지(Growth medium, GM) 및 무혈청 기본 배지(serum-free basal medium, BM)를 각각 양성 대조군 및 음성 대조군으로 사용하였다.
ELISA를 수행하여 상기 다양한 유래의 줄기세포로부터 추출된 각 엑소좀의 콜라겐 합성 저해능을 평가해 본 결과, 인간 제대 유래 줄기세포로부터 추출한 엑소좀(UC-MSC-Exo) 및 인간 골수 유래 줄기세포로부터 추출한 엑소좀(BM-MSC-Exo)을 처리한 군에 비해 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출한 엑소좀(HASC-Exo)을 처리한 군에서 COLⅠA1의 발현이 유의적으로 감소함을 확인하였다.
따라서, 상기 결과를 통하여 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출한 엑소좀(HASC-Exo)이 인간 제대 유래 줄기세포로부터 추출한 엑소좀(UC-MSC-Exo) 및 인간 골수 유래 줄기세포로부터 추출한 엑소좀(BM-MSC-Exo)보다 콜라겐 합성 저해능이 우수한 것을 확인하였다(도 4).
이에, 섬유증이 유도된 폐 섬유아세포에서 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출한 엑소좀(HASC-Exo)이 다른 유래의 줄기세포의 엑소좀(UC-MSC-Exo 및 BM-MSC-Exo)에 비해 콜라겐 합성 저해능이 우수하므로, 상기 지방 유래 줄기세포의 엑소좀(HASC-Exo)을 폐 섬유증 치료에 유용하게 사용할 수 있음을 유추할 수 있었다.
실시예 4: 정상 산소( normoxia ) 및 저산소( hypoxia ) 조건하에서의 인간 지방 유래 줄기세포로부터 엑소좀의 추출
줄기세포를 이용한 통상적인 실험은 항상 정상 산소분압(산소 21%) 하에서 이루어진다. 하지만, in vivo 환경 즉, 줄기세포가 실제 신체 내에서 작용할 때는 산소분압이 매우 낮은 것으로 알려져 있다(Exp Hematol., 2002; 30:67-73).
한편, 상기 실시예 3에서 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출한 엑소좀(HASC-Exo)이 다른 유래의 줄기세포의 엑소좀(UC-MSC-Exo 및 BM-MSC-Exo)에 비해 섬유증이 유도된 폐 섬유아세포에서 콜라겐 합성 저해능이 더 우수함을 확인하였고, 이에 지방 유래 줄기세포의 엑소좀을 폐 섬유증 치료에 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
이에, 상기 결과를 토대로 폐 섬유증 치료에 유효한 엑소좀을 추출하기 위해, 인간 지방 유래 줄기세포를 패시지(passage) 7까지 계대 배양하여 증식시킨 후, 정상 산소 조건(normoxia condition) 또는 저산소 조건(hypoxic condition) 하에서 배양하여 엑소좀(normoxia exosome 또는 hypoxia exosome)을 추출하였다.
구체적으로, 인간 지방 유래 줄기세포는 10% FBS(fetal bovine serum) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)이 포함되어 있는 DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium high glucose; Gibco, Cat#: 11995065) 일반 배양 배지를 이용하여 패시지(passage) 7까지 계대 배양하였다. 이후, 저산소 배양 조건을 유도하기 위해, 배양 세포에서 저산소 상태(hypoxic condition)를 유도하는 물질로 알려져 있는 염화코발트(Ⅱ) 6수화물(Cobalt(Ⅱ) chloride hexahydrate(CoCl2˙6H2O)을 사용하였으며, 상기 염화코발트(Ⅱ) 6수화물을 배양 배지에 100 μM 의 농도로 첨가하여 배지 조성물을 교체하고 1일 동안 배양하였다(도 5의 A). 한편, 정상 산소 배양 조건을 위해서는 배양 배지에 염화코발트(Ⅱ) 6수화물을 첨가하지 않았다.
상기 정상 산소 조건 또는 저산소 조건하에 배양된 인간 지방 유래 줄기세포에서 엑소좀을 추출하기 24시간 전에 무혈청(serum-free), 무항생제(antibiotic-free), 무페놀레드(phenol red-free)인 배지(Gibco, Cat#: 31053028)로 교체하여 24시간 동안 배양하였으며, 이후 세포 배양 상층액을 회수하였다. 회수한 세포 배양 상층액은 상기 실시예 1에서와 같이 다중필터시스템을 이용하여 엑소좀을 분리 및 정제하여 수득하였다.
상기 정상 산소 조건 또는 저산소 조건하에 배양된 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출한 엑소좀의 농도를 나노입자추적분석기(nanoparticle tracking analysis)를 통해 확인한 결과, 정상 산소 조건하에서 배양한 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출한 엑소좀(normoxia exosome)의 농도는 2.25×109 particles/mL 이었으며, 저산소 조건하에서 배양한 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출한 엑소좀(hypoxia exosome)의 농도는 2.45×109 particles/mL 이었다(도 5의 C). 또한, 상기 추출된 엑소좀의 모양은 둥근 나노 입자의 형태를 지니고 있음을 확인하였다(도 5의 B).
실시예 5: 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀의 폐 섬유증 치료 효능 평가
상기 실시예 4에서 수득한 엑소좀, 즉, 정상 산소 조건하에 배양된 지방 유래 줄기세포로부터 수득한 엑소좀(Normoxia-Exo) 및 저산소 조건하에 배양된 지방 유래 줄기세포로부터 수득한 엑소좀(Hypoxia-Exo)의 폐 섬유증(pulmonary fibrosis) 치료 효과를 확인하기 위하여, 폐 섬유증 동물 모델을 구축하고, 구축한 폐 섬유증 동물 모델에 상기 엑소좀을 투여하여 폐 섬유증 치료 효능을 평가하였다.
구체적으로, 폐 섬유증 동물 모델은 기관내 점적 주입법(intratracheal instillation, IT)에 따라 폐 섬유증 유발 물질인 블레오마이신(bleomycin) 용액을 C57BL/6J 마우스의 폐 속에 직접 주입하여 블레오마이신에 의해 폐 섬유증이 유발된 마우스 동물 모델(bleomycin induced C57BL/6J mouse; 9주령, male, 중앙실험동물)을 구축하였다. 상기 구축된 블레오마이신-유도 폐 섬유증 C57BL/6J 마우스(bleomycin induced C57BL/6J mouse)에 상기 Normoxia-Exo 및 Hypoxia-Exo을 각각 정맥주사(intravenous injection, IV injetion)로 투여하였다. 이때, PBS(Phosphate-Buffered Saline)를 투여한 군을 음성 대조군으로 하였으며, 인간 지방 유래 줄기세포(human adipose-derived stem cell, HASCs)를 주사한 군을 양성 대조군으로 사용하였다.
더 구체적으로, 상기 인간 지방 유래 줄기세포(HASCs)는 PBS에 1×106개 cells/100㎕의 농도가 되도록 준비하였으며, Normoxia-Exo 및 Hypoxia-Exo 각각은 PBS에 1×108 particles/100㎕의 농도(5×109 particles/kg에 해당하는 농도)로 분산시켜 주사제로 제조하였다.
상기와 같이 준비한 Normoxia-Exo 및 Hypoxia-Exo을 각각 블레오마이신-유도 폐 섬유증 C57BL/6J 마우스에 각각 2일 간격으로, 1일째, 3일째, 5일째, 총 3회 정맥주사로 투여하였다. 이때, 음성 대조군인 PBS와 양성 대조군으로서 상기 1×106개 cells/100㎕의 농도로 준비해 둔 인간 지방 유래 줄기세포(HASCs)도 Normoxia-Exo 및 Hypoxia-Exo과 마찬가지로 각각 2일 간격으로 총 3회 정맥주사로 투여하였다(도 6의 A).
실험 6일째, 즉 정맥주사로 상기 PBS, HASCs, Normoxia-Exo 및 Hypoxia-Exo을 각각 총 3회 투여한 바로 다음 날, 폐 섬유증 치료 효과를 확인하기 위하여 폐 조직을 적출하였다(도 6의 B).
폐 조직을 적출한 후, 트리크롬 염색(Trichrome staining)을 수행하였으며, 푸른색(blue color)으로 염색된 콜라겐 영역을 정량화하여 폐의 섬유화 정도를 확인하였다(도 7 내지 도 9).
그 결과, 정상 산소 조건(normoxia condition) 및 저산소 조건(hypoxic condition) 하에 배양된 지방 유래 줄기세포로부터 각각 추출된 Normoxia-Exo 및 Hypoxia-Exo을 투여한 실험군은 음성 대조군(PBS 투여군) 및 양성 대조군(인간 지방 유래 줄기세포(HASCs) 투여군)에 비해 염색된 콜라겐 영역이 정상 폐 조직(normal lung tissue)과 유사한 수준으로 유의하게 감소한 것을 확인하였다.
특히, 저산소 조건(hypoxic condition) 하에 배양된 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(Hypoxia-Exo)을 투여한 실험군의 경우, 음성 대조군 및 양성 대조군을 비롯하여 Normoxia-Exo을 투여한 실험군에 비해서도 정상 폐 조직(normal lung tissue)과 거의 유사한 수준으로 염색된 콜라겐 영역이 현저하게 감소한 것을 확인하였다(도 7 내지 도 9).
상기 결과를 통해, 정상 산소 조건하에 배양된 지방 유래 줄기세포로부터 수득한 엑소좀(Normoxia-Exo) 및 저산소 조건하에 배양된 지방 유래 줄기세포로부터 수득한 엑소좀(Hypoxia-Exo) 모두 폐 섬유증 개선 또는 치료 효과가 있음을 확인하였다. 특히, 저산소 조건하에 배양된 지방 유래 줄기세포로부터 수득한 엑소좀(Hypoxia-Exo)의 폐 섬유증 치료 효과가 현저히 우수함을 알 수 있었다.

Claims (24)

  1. 지방 유래 줄기세포(adipose-derived stem cell)로부터 추출된 엑소좀(exosome)을 유효성분으로 포함하는, 폐 섬유증(pulmonary fibrosis) 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 엑소좀은 정상 산소 조건(normoxia condition) 하에서 배양된 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 것인 폐 섬유증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 엑소좀은 저산소 조건(hypoxic condition) 하에서 배양된 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 것인 폐 섬유증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 저산소 조건은 0.5 내지 10%의 산소 또는 저산소 세포 감작제(hypoxic cell sensitizer)에 의해 유도되는 것인 폐 섬유증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 엑소좀은 HGF(hepatocyte growth factor) 및 인터루킨-10(interleukin-10)을 함유하고 있는 것인 폐 섬유증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 기관 내 투여 또는 흡입 투여용인 폐 섬유증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 주사제인 폐 섬유증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 주사제는 엑소좀이 5×108 particles/㎏ 내지 5×1010 particles/㎏ 농도로 포함되는 것인 폐 섬유증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 폐 섬유증(pulmonary fibrosis) 예방 또는 치료용 의약의 제조에 있어서의 지방 유래 줄기세포(adipose-derived stem cell)로부터 추출된 엑소좀(exosome)의 용도.
  10. 제9항에 있어서, 상기 엑소좀은 정상 산소 조건(normoxia condition) 하에서 배양된 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 것인 용도.
  11. 제9항에 있어서, 상기 엑소좀은 저산소 조건(hypoxic condition) 하에서 배양된 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 것인 용도.
  12. 제11항에 있어서, 상기 저산소 조건은 0.5 내지 10%의 산소 또는 저산소 세포 감작제(hypoxic cell sensitizer)에 의해 유도되는 것인 용도.
  13. 제9항에 있어서, 상기 엑소좀은 HGF(hepatocyte growth factor) 및 인터루킨-10(interleukin-10)을 함유하고 있는 것인 용도.
  14. 제9항에 있어서, 상기 의약은 기관 내 투여 또는 흡입 투여용인 용도.
  15. 제9항에 있어서, 상기 의약은 주사제인 용도.
  16. 제15항에 있어서, 상기 주사제는 엑소좀이 5×108 particles/㎏ 내지 5×1010 particles/㎏ 농도로 포함되는 것인 용도.
  17. 지방 유래 줄기세포(adipose-derived stem cell)로부터 추출된 엑소좀(exosome)을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 폐 섬유증(pulmonary fibrosis) 치료 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 엑소좀은 정상 산소 조건(normoxia condition) 하에서 배양된 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 것인 폐 섬유증 치료 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 엑소좀은 저산소 조건(hypoxic condition) 하에서 배양된 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 것인 폐 섬유증 치료 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 저산소 조건은 0.5 내지 10%의 산소 또는 저산소 세포 감작제(hypoxic cell sensitizer)에 의해 유도되는 것인 폐 섬유증 치료 방법.
  21. 제17항에 있어서, 상기 엑소좀은 HGF(hepatocyte growth factor) 및 인터루킨-10(interleukin-10)을 함유하고 있는 것인 폐 섬유증 치료 방법.
  22. 제17항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 기관 내 투여 또는 흡입 투여용인 폐 섬유증 치료 방법.
  23. 제17항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 주사제인 폐 섬유증 치료 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 주사제는 엑소좀이 5×108 particles/㎏ 내지 5×1010 particles/㎏ 농도로 포함되는 것인 폐 섬유증 치료 방법.
PCT/KR2017/008383 2016-08-05 2017-08-03 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 폐 섬유증 예방 또는 치료용 조성물 WO2018026203A1 (ko)

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US16/321,810 US20210283183A1 (en) 2016-08-05 2017-08-03 Composition for preventing or treating pulmonary fibrosis containing exosome isolated from adipose-derived stem cell as active ingredient
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112121063A (zh) * 2020-09-01 2020-12-25 北京诺德观呈医疗科技有限公司 外泌体在制备治疗间质性肺损伤和/或肺纤维化的药物中的应用
JP2021520790A (ja) * 2018-04-10 2021-08-26 ブレインストーム セル セラペウティクス リミテッド 細胞型特異的エキソソームおよびそれらの使用
JP2022539228A (ja) * 2019-07-02 2022-09-07 インダストリー－ユニバーシティー コーペレイション ファンデーション ハンヤン ユニバーシティー エリカ キャンパス 植物エクソソームの大量生産方法
EP4006144A4 (en) * 2019-07-31 2023-04-05 Shanghai Santeja H & M Tech. Development Inc THERAPEUTIC MEDICINE FOR FIBROSIS, INFLAMMATION AND/OR AGE-RELATED DISEASES

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180057546A (ko) 2016-11-21 2018-05-30 성균관대학교산학협력단 지방줄기세포유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 간 섬유증 예방 또는 치료용 조성물
KR102159914B1 (ko) * 2019-07-30 2020-09-24 주식회사 엑소코바이오 새로운 엑소좀의 생산방법 및 이의 응용
CN110564682B (zh) * 2019-09-30 2021-04-02 陕西中鸿科瑞再生医学研究院有限公司 一种大规模生产人脂肪间充质干细胞外泌体的方法
CN111363720A (zh) * 2020-03-28 2020-07-03 海门生原干细胞科技有限公司 一种治疗脑缺血的骨髓间充质干细胞及其制备方法和应用
KR102193175B1 (ko) * 2020-04-07 2020-12-18 주식회사 엑소스템텍 통증조절인자를 함유한 줄기세포유래 엑소좀 및 그 용도
KR20210130578A (ko) 2020-04-22 2021-11-01 주식회사 아바테라퓨틱스 폐섬유증 치료 또는 예방을 위한 세포 치료제 조성물
CN114703130A (zh) * 2022-03-28 2022-07-05 宁夏医科大学总医院 一种自体干细胞与卵泡液复合外泌体的制备方法及其应用
CN115025246B (zh) * 2022-06-23 2024-04-30 陕西中鸿科瑞再生医学研究院有限公司 一种双重靶向血管修复的多功能囊泡及其制备方法与应用
CN116077426B (zh) * 2023-04-10 2023-06-27 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） 能够注射和缓释小分子化合物的外泌体靶向载药系统

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100837167B1 (ko) 2006-02-01 2008-06-11 사회복지법인 삼성생명공익재단 제대혈로부터 분리 또는 증식된 세포를 포함하는 발달성,만성 폐질환 치료용 조성물
KR20090122415A (ko) 2007-03-22 2009-11-30 오시리스 쎄라퓨틱스, 인크. 중간엽 줄기 세포 및 그에 대한 용도
KR20140024310A (ko) * 2011-03-11 2014-02-28 칠드런'즈 메디컬 센터 코포레이션 중간엽 줄기 세포 엑소솜에 관련된 방법 및 조성물
CN104666344A (zh) * 2015-02-28 2015-06-03 广州医科大学附属第一医院 间充质干细胞外泌体在制备治疗肺纤维化的药物制剂中的应用
WO2015088288A1 (ko) * 2013-12-12 2015-06-18 사회복지법인 삼성생명공익재단 트롬빈을 이용한 줄기세포 유래 엑소좀의 생성 촉진 방법
US20150190429A1 (en) * 2012-07-18 2015-07-09 Universitaet Duisburg-Essen Use of Preparations Comprising Exosomes Derived From Mesenchymal Stem Cells (MSCs) in the Prevention and Therapy of Inflammatory Conditions

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2927175T3 (es) * 2013-02-12 2022-11-03 Reneuron Ltd Método de producción de micropartículas
GB201317887D0 (en) * 2013-10-09 2013-11-20 Reneuron Ltd Product
KR20170005854A (ko) * 2014-05-18 2017-01-16 칠드런'즈 메디컬 센터 코포레이션 엑소솜과 관련된 방법 및 조성물
US20170232276A1 (en) * 2014-09-30 2017-08-17 Primegen Biotech, Llc Treatment of fibrosis using deep tissue heating and stem cell therapy
WO2016072821A1 (ko) * 2014-11-07 2016-05-12 한양대학교 에리카산학협력단 줄기세포 유래 엑소좀을 함유하는 지방세포 분화유도, 지방조직 재생, 피부 미백 또는 주름개선용 조성물
CN111773173B (zh) * 2014-11-07 2024-03-22 胞外体干细胞株式会社 用于成脂分化诱导、脂肪组织再生、皮肤美白或改善皱纹的包含干细胞来源外泌体的组合物
EP3223830A4 (en) * 2014-11-24 2018-06-06 Cytostormrx LLC Encapsulated stem cells for the treatment of inflammatory disease
WO2016083500A1 (en) * 2014-11-27 2016-06-02 Med Cell Europe Ag Secretomes and method for producing secretomes
EP3227434A4 (en) * 2014-12-03 2018-07-11 Capricor, Inc. Processes for producing exosomes in reduced oxygen culture conditions
CN105296419A (zh) * 2015-11-30 2016-02-03 华中科技大学同济医学院附属协和医院 促进皮肤创伤愈合的脂肪干细胞分泌的多因子载体exosome的制备及应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100837167B1 (ko) 2006-02-01 2008-06-11 사회복지법인 삼성생명공익재단 제대혈로부터 분리 또는 증식된 세포를 포함하는 발달성,만성 폐질환 치료용 조성물
KR20090122415A (ko) 2007-03-22 2009-11-30 오시리스 쎄라퓨틱스, 인크. 중간엽 줄기 세포 및 그에 대한 용도
KR20140024310A (ko) * 2011-03-11 2014-02-28 칠드런'즈 메디컬 센터 코포레이션 중간엽 줄기 세포 엑소솜에 관련된 방법 및 조성물
US20150190429A1 (en) * 2012-07-18 2015-07-09 Universitaet Duisburg-Essen Use of Preparations Comprising Exosomes Derived From Mesenchymal Stem Cells (MSCs) in the Prevention and Therapy of Inflammatory Conditions
WO2015088288A1 (ko) * 2013-12-12 2015-06-18 사회복지법인 삼성생명공익재단 트롬빈을 이용한 줄기세포 유래 엑소좀의 생성 촉진 방법
CN104666344A (zh) * 2015-02-28 2015-06-03 广州医科大学附属第一医院 间充质干细胞外泌体在制备治疗肺纤维化的药物制剂中的应用

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EXP HEMATOL., vol. 30, 2002, pages 67 - 73
G RAPOSO ET AL., J. CELL BIOL., vol. 200, no. 4, 2013, pages 373 - 383
JIANG, H. ET AL.: "Effect of Transplanted Adipose-derived Stem Cells in Mice Exhibiting Idiopathic Pulmonary Fibrosis", MOLECULAR MEDICINE REPORTS, vol. 12, no. 4, 2015, pages 5933 - 5938, XP055582892, DOI: 10.3892/mmr.2015.4178 *
REDDY, M. ET AL.: "Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells Attenuate Early Stage of Bleomycin Induced Pulmonary Fibrosis: Comparison with Pirfenidone", INTERNATIONAL JOURNAL OF STEM CELIS, vol. 9, no. 2, 30 November 2016 (2016-11-30), pages 192 - 206, XP05558289 *
See also references of EP3494977A4
TUBERCULOSIS AND RESPIRATORY DISEASES, vol. 54, no. 2, February 2003 (2003-02-01), pages 1 - 12

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2021520790A (ja) * 2018-04-10 2021-08-26 ブレインストーム セル セラペウティクス リミテッド 細胞型特異的エキソソームおよびそれらの使用
JP2022539228A (ja) * 2019-07-02 2022-09-07 インダストリー－ユニバーシティー コーペレイション ファンデーション ハンヤン ユニバーシティー エリカ キャンパス 植物エクソソームの大量生産方法
JP7274712B2 (ja) 2019-07-02 2023-05-17 インダストリー－ユニバーシティー コーペレイション ファンデーション ハンヤン ユニバーシティー エリカ キャンパス 植物エクソソームの大量生産方法
EP4006144A4 (en) * 2019-07-31 2023-04-05 Shanghai Santeja H & M Tech. Development Inc THERAPEUTIC MEDICINE FOR FIBROSIS, INFLAMMATION AND/OR AGE-RELATED DISEASES
CN112121063A (zh) * 2020-09-01 2020-12-25 北京诺德观呈医疗科技有限公司 外泌体在制备治疗间质性肺损伤和/或肺纤维化的药物中的应用

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