JP6882450B2 - 脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソームを有効成分として含む肺線維症の予防または治療用の組成物 - Google Patents

Description

本発明は、脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソームを有効成分として含む肺線維症の予防または治療用の組成物、肺線維症の予防または治療のための医薬品の製造における前記エキソソームの用途、及び前記エキソソームを有効成分として含む薬学的組成物を対象体に投与する段階を含む肺線維症の治療方法に関する。

肺線維症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）とは、肺組織内の肺胞壁に晩成炎症細胞が侵透して組織の線維化を誘導することで肺組織のひどい構造的変異を起こす疾患を言う。線維化が進めば、肺組織が堅く固まって肺胞壁が厚くなり、血液による酸素供給量が減り、これによって、呼吸困難を惹起する。現在の技術では、線維化が進まれた肺組織を完全に復旧できる治療方法が無いため、早期に発見して治療する場合及び肺移植の場合を除いては、たいてい発病してから３〜５年くらいの後に死亡に至る恐ろしい疾患である。

早期に発見された肺線維症の治療方法には、ステロイド（ｓｔｅｒｏｉｄ）、アザチオプリン（ａｚａｔｈｉｏｐｒｉｎｅ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）のようなステロイド系薬物を用いる治療方法、アセチルシステイン（ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ）のような抗酸化剤を用いる治療方法及びサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）ＩＦＮ−γのような成長因子の投与による治療方法などが挙げられる。ステロイド係薬物及び抗酸化剤を用いる治療方法は、２０００年度から持続的に研究及び報告されてきたが、未だに明らかな薬物の効能として立証されたことが無い状態であり、長期間の投与時に全身副作用を招来するか、耐性が出来るような副作用を招来すると報告されたことがある。成長因子の投与による治療法は、最近多くの注目を浴びている療法として肺線維化に重要な因子として知られたＴＧＦ−βの生産を抑制する「インターフェロン」を用いた比較的に根本的な接近方式の治療法である。このような発病の原因を分析して治療する接近方式であることから、ステロイド系薬物及び抗酸化剤を用いた治療法に比べて副作用が少なく、効能が優秀であり、注射剤方式、エアロゾール方式のような多様な形態の治療法が報告されつつある。しかし、未だに肺線維症の正確な発病原因が知られていないため、インターフェロンのような単一成分による治療効能は一時的であり得、これは、一部の患者のみに効能が現われ得ることから、持続的な研究及び臨床試験が必要な実情である。

このような限界点を補完するために、多様な因子を生産及び調節できる幹細胞及び幹細胞培養液を用いて肺線維症を治療しようとする研究が報告されている（韓国登録特許第１０−０８３７１６７号、韓国公開特許第１０−２００９−０１２２４１５号）。しかし、幹細胞の最大の問題点は、体内生着率及び生存率が患者によって一定でなくて正確な効能が証明されず、また、幹細胞の癌細胞化の可能性を排除することができない。また、幹細胞から分泌された多様な成長因子を含む培養液は、成長因子のみならず、さまざまな細胞老廃物が含まれているため、潜在的な問題をもたらし得る。

このような背景下で、本発明者は、肺線維症治療剤を開発するための鋭意研究した結果、脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソームが、肺線維症の治療に係わる肝細胞成長因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ＨＧＦ）及びインターロイキン−１０（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０）のような成長因子を含んでおり、肺線維症誘導テスト動物モデルで肺線維症の治療効果に優れていることを確認することで、本発明を完成するに至った。

本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、脂肪由来幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）から抽出されたエキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）を有効成分として含む、肺線維症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）の予防または治療用の薬学的組成物を提供することを目的とする。

また、本発明は、肺線維症の予防または治療のための医薬品の製造における前記エキソソームの用途を提供することを他の目的とする。

また、本発明は、前記エキソソームを有効成分として含む薬学的組成物を対象体に投与する段階を含む肺線維症の治療方法を提供することを他の目的とする。

上記の課題を達成するため、本発明は、脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソームを有効成分として含む肺線維症の予防または治療用の組成物、肺線維症の予防または治療のための医薬品の製造における前記エキソソームの用途、及び前記エキソソームを有効成分として含む薬学的組成物を対象体に投与する段階を含む肺線維症の治療方法を提供する。
以下、本発明を具体的に説明する。

一様態として、本発明は、脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソームを有効成分として含む、肺線維症の予防または治療用の薬学的組成物を提供する。

本発明において、用語「幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）」とは、自己複製能力のみならず、細胞が位置する環境の影響を受けて必要に応じて適切な信号が与えられる場合、多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）の特性によってさまざまな細胞に分化できる特性があり、脂肪、骨髄、臍帯血及び胎盤などに含まれており、心筋梗塞、脳梗塞、退行性関節炎及び骨折などの多様な細胞損傷疾患の治療に活用できる細胞である。
本発明の幹細胞は、自己または同種由来の幹細胞であり得、ヒト及び非ヒト哺乳類を含む任意の類型の動物由来であり得る。

本発明において、用語「脂肪由来幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）」とは、脂肪組織から由来する幹細胞であって、脂肪組織は、多量の組織採取が容易であることから、幹細胞の収穫に良い条件を有し、脂肪由来幹細胞は、培養時に安定的な成長と増殖を示し、分化を誘導したときに多様な細胞への分化が可能である。これらの幹細胞は、脂肪組織のみならず、軟骨、骨、神経組織、血管組織などの間葉組織の再生および間細胞、腎臓、心血管再生などの多様な組織を再生するという報告がある。

本発明において、用語「エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）」とは、細胞から分泌される４０〜１２０ｎｍサイズのナノ小胞体であって、免疫学的に重要な主要組織適合遺伝子複合体（ｍａｉｎ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ，ＭＨＣ）及び熱ショックタンパク質（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ）を含んで強い抗腫瘍免疫反応を誘導し、抗炎症性のマイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）とコラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）の蓄積を調節するマイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）を含む。また、他の細胞及び組織に結合することで、膜の構成要素、タンパク質、ＲＮＡを伝達するなどの多様な役割を果たすと知られている。

本発明のエキソソームは、幹細胞から抽出されたエキソソームであり、これに制限されないが、脂肪由来幹細胞、臍帯由来幹細胞または骨髓由来幹細胞から抽出されたものであり得る。

前記幹細胞から抽出されたエキソソームは、幹細胞の特性によって、幹細胞の細胞増殖、分化、再生に係わる遺伝子、タンパク質、成長因子などを含有しているため、組織再生において重要な役割を果たすことができる。

具体的に、本発明の脂肪由来幹細胞から細胞の遺伝情報、タンパク質、成長因子を含んでいるエキソソームを抽出することができ、前記抽出されたエキソソームは、幹細胞の基本的な特性を有することができ、組織再生に必要な重要な成長因子、生体活性タンパク質及び遺伝子情報などを含むことができる。

本発明の一実施例において、脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソームが肝細胞成長因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ＨＧＦ）及びインターロイキン−１０（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０）などの肺線維症の治療に係わる成長因子を含んでいることを確認した（図３のＢ）。

前記エキソソームは、当業界に知られたエキソソームの抽出方法を用いて得ることができ、これに制限されないが、下記の段階を含む抽出方法によって得することもできる：
１）幹細胞を通常の培養培地に培養した後、無血清及び無抗生剤の培地で継代培養する段階；
２）前記細胞培養上澄液を回収する段階；
３）前記回収した細胞培養上澄液を遠心分離して細胞残余物を除去する段階；
４）前記細胞残余物が除去された細胞培養上澄液を、多重フィルターシステムを介してろ過して分離・精製したエキソソームを得る段階。
具体的に、前記段階１）の幹細胞は、これに制限されないが、脂肪由来幹細胞、臍帯由来幹細胞または骨髓由来幹細胞であり得、例えば、脂肪由来幹細胞であり得る。
前記脂肪由来幹細胞は、人体または動物由来の幹細胞であり得る。
前記段階１）において、幹細胞は、これに制限されないが、正常酸素条件（ｎｏｒｍｏｘｉａ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）または低酸素条件（ｈｙｐｏｘｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）下で培養され得る。

前記正常酸素条件は、これに制限されないが、正常酸素濃度、即ち、２１％の酸素（Ｏ_２）が供給される培養条件であり得、または、低酸素細胞感作剤（ｈｙｐｏｘｉｃ ｃｅｌｌ ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ）を細胞培養培地に添加しない培養条件であり得る。

前記低酸素細胞感作剤は、低酸素状態（ｈｙｐｏｘｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）を誘導する物質であって、これに制限されないが、塩化コバルト（ｃｏｂａｌｔ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、デスフェリオキサミン（ｄｅｓｆｅｒｒｉｏｘａｍｉｎｅ）及びジメチルオキサリルグリシン（ｄｉｍｅｔｈｙｌｏｘａｌｙｌｇｌｙｃｉｎｅ，ＤＭＯＧ）から構成された群より選択されたものであり得る。

前記低酸素条件は、これに制限されないが、低酸素濃度、即ち、１０％以下の酸素（Ｏ_２）が供給される培養条件であり得、または低酸素細胞感作剤を細胞培養培地に添加した培養条件であり得る。

前記低酸素濃度は、これに制限されないが、酸素が０．５〜１０％であってもよく、０．５〜５％であってもよく、０．５〜２％であってもよい。

前記低酸素細胞感作剤は、前述のようであり、本発明の一実施例において、脂肪由来幹細胞の培養のための培地組成物に、１００μＭ濃度の塩化コバルト（ＩＩ）６水和物（Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｈｅｘａｈｙｄｒａｔｅ（ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ））を添加して低酸素培養条件を誘導した（図５のＡ）。

前記段階１）における培養培地は、当業界で通常使用する細胞培養用の培地であれば、いずれも使用可能であり、これに制限されないが、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ）培地、ＭＥＭ（ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ）培地、またはＲＰＭＩ １６４０（Ｒｏｓｅｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ １６４０）培地であり得る。

また、前記細胞培養培地には、必要に応じて一つ以上の補助成分を添加することができるが、このような補助成分には、ウシ胎児、馬またはヒトなどの血清のみならず、微生物の汚染を阻むためのペニシリンＧ（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉ Ｇ）、硫酸ストレプトマイシン（ｓｔｅｒｐｔｏｍｙｃｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ）及びゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ）などの抗生剤、アンフォテリシンＢ（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ）及びナイスタチン（ｎｙｓｔａｔｉｎ） などの抗真菌剤（ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｇｅｎｔ）及びこれらの混合物からなる群より選択された成分のうちいずれか一つ以上を用い得る。
具体的に、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）及び １％ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）が含まれているＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ）培地であり得る。また、これに制限されないが、血清（ｓｅｒｕｍ）、抗生剤（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）及びフェノールレッド（ｐｈｅｎｏｌ ｒｅｄ）が添加されていないＤＭＥＭ培地であり得る。

本発明の一実施例において、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンが含まれているＤＭＥＭ培地を用いて、ヒト脂肪由来幹細胞（ｐａｓｓａｇｅ７または８）を培養し、前記幹細胞からのエキソソーム抽出２４時間前、無血清（ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ）、無抗生剤（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ｆｒｅｅ）、無フェノールレッド（ｐｈｅｎｏｌ ｒｅｄ−ｆｒｅｅ）の培地に変えて、２４時間培養した（実施例１）。
前記段階２）で回収した細胞培養上澄液には、細胞残余物及び幹細胞から分泌したエキソソームが含まれており、前記段階３）で遠心分離することで細胞培養上澄液に含まれている細胞残余物を除去することができる。

前記段階２）で回収した細胞培養上澄液に含まれているエキソソームは、遠心分離及び多重フィルターシステムの導入によるろ過段階を経て、最終的に分離及び精製され得る。
前記遠心分離は、これに制限されないが、２５０〜５００ｘｇで５〜１０分間行ってもよく、または３００ｘｇで１０分間行ってもよい。

前記多重フィルターシステムは、多様なポアサイズのフィルターを用いて段階的にろ過するシステムであって、これに制限されないが、０．４μｍのポアサイズを有するセルストレーナー （ｃｅｌｌ ｓｔｒａｉｎｅｒ）、０．２２μｍのポアサイズを有するフィルター（ｆｉｌｔｅｒ）、及び５００ｋＤ ＭＷＣＯ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔ ｏｆｆ）を有するフィルターを用いて段階的にろ過するシステムであり得る。
本発明の一実施例において、培養したヒト脂肪由来幹細胞から回収した細胞培養上澄液を、３００ｘｇで１０分間遠心分離して細胞残余物（ｃｅｌｌ ｄｅｂｒｉｓ）を除去し、０．４μｍのポアサイズを有するセルストレーナーを用いてポアサイズ以上の残余物を除去し、その後、０．２２μｍのポアサイズを有するフィルターを用いてポアサイズ以上の細胞残余物を除去した。細胞残余物の除去後に回収した溶液を、４ｍＬ／分（ｍｉｎ）の流速を加え、５００ｋＤ ＭＷＣＯを有するフィルターを用いたタンジェンシャルフローろ過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ，ＴＦＦ）過程を通じてタンパク質を除去し、ＴＦＦ過程後に回収した溶液をソニケーション（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）し、前記ＴＦＦ過程を連続反復して最終的にエキソソームを分離・精製して得た（図２）。

前記エキソソーム抽出方法によって得られた本発明のエキソソームは、正常酸素条件または低酸素条件下で培養された脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソームであり得る。

前記エキソソームは、ＨＧＦ及びインターロイキン−１０などの肺線維症の治療に係わる成長因子を含むことができ、これによって、前記エキソソームを有効成分として含めて肺線維症の予防または治療用の組成物として用いることができる。

本発明において、用語「肺線維症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）」とは、肺胞壁にびまん性線維増殖を特徴とする、乾性せき、労動時における呼吸困難を主な症状とする疾患である。狭い意味では、間質性肺炎の末期の形態を示すが、広い意味では、狭い意味の肺線維症と間質性肺炎との併存状態を意味する。全ての間質性肺炎が肺線維症の原因となり得る。間質性肺炎は、肺の間質（狭い意味では肺胞隔壁、広い意味では小葉間間質、胸膜の近傍などを含む。）に炎症を起こす疾患の総称であり、感染、膠原病、放射線、薬剤、粉塵などの特定の原因によるものと、原因不明の特発性間質性肺炎を含む。特発性間質性肺炎は、胸腔鏡下肺生検（ＶＡＴＳ）や高分解能ＣＴ（ＨＲＣＴ）所見などに基づき、特発性肺線維症（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｆｉｂｒｏｓｉｓ：ＩＰＦ）、非特異性間質性肺炎（ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ：ＮＳＩＰ）、急性間質性肺炎（ａｃｕｔｅ ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ：ＡＩＰ）、特発性器質化肺炎（ｃｒｙｐｔｏｇｅｎｉｃ ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ：ＣＯＰ）、呼吸細気管支炎関連間質性肺炎（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｉｔｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｌｕｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ：ＲＢ−ＩＬＤ）、剥離性間質性肺炎（ｄｅｓｑｕａｍａｔｉｖｅ ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ：ＤＩＰ）、リンパ球性間質性肺炎（ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ：ＬＩＰ）などに分けられる。

本発明による肺線維症の予防または治療用の薬学的組成物は、効果的な肺線維症の治療のための効能物質として、正常酸素条件または低酸素条件のような特定の培養条件下で培養された脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソームを用いるという点で従来技術とは差別性を有する。

前記抽出、分離・精製されたエキソソームには肺線維症の緩和または治療のための多様な遺伝情報、タンパク質及び成長因子が担持されており、細胞由来物質であることから、生体適合性に優れており、吸収率も優秀である。

したがって、現在の肺線維症の治療に用いられている治療薬物が誘発し得る問題点や、最近研究されている幹細胞培養液を用いた治療で発生し得る幹細胞の癌細胞化または細胞老廃物による副作用なども最小化することができる。

本発明の一実施例において、脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソームに ＨＧＦ及びインターロイキン−１０などの肺線維症の治療に係わる成長因子が含まれていることを確認しており（図３のＢ）、線維症が誘導された肺線維芽細胞において、前記脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソームによって線維化過程で組織に蓄積されて正常構造を破壊して機能の障害をもたらすコラーゲンの合成が阻害されることを確認した（図４のＢ）。

また、ブレオマイシン誘導肺線維症Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、正常酸素条件及び低酸素条件下で培養された脂肪由来幹細胞から各々抽出されたＮｏｒｍｏｘｉａ−Ｅｘｏ及びＨｙｐｏｘｉａ−Ｅｘｏを投与した後、肺組織を摘出してトリクロム染色（ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）を行った結果、陰性対照群（ＰＢＳ投与群）及び陽性対照群（脂肪由来幹細胞投与群）に比べて、染色されたコラーゲン領域が正常肺組織に類似な水準に有意味に減少したことを確認しており、特に、Ｈｙｐｏｘｉａ−Ｅｘｏを投与した場合、陰性対照群及び陽性対照群を始めてＮｏｒｍｏｘｉａ−Ｅｘｏを投与した場合に比べても、正常肺組織にほとんど類似な水準に、染色されたコラーゲン領域が大幅減少したことを確認した（図７〜図９）。

前記結果から、正常酸素条件下で培養された脂肪由来幹細胞から得たエキソソーム（Ｎｏｒｍｏｘｉａ−Ｅｘｏ）及び低酸素条件下で培養された脂肪由来幹細胞から得たエキソソーム（Ｈｙｐｏｘｉａ−Ｅｘｏ）のいずれも肺線維症の改善または治療効果を奏することを確認しており、特に、低酸素条件下で培養された脂肪由来幹細胞から得たエキソソームの肺線維症の治療効果が遥かに優れていることが分かった。

したがって、本発明による脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソームを有効成分として含む組成物を肺線維症の予防または治療用の薬学的組成物として有用に用いることができる。

本発明による肺線維症の予防または治療用の薬学的組成物は、薬学的に有効な量の脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソームを単独で含むか、または一つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含み得る。前記薬学的に有効な量とは、肺線維症の症状を予防、改善及び治療するのに十分な量を意味する。

本発明による脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソームの薬学的に有効な量は、５×１０^８〜５×１０^１０パーチクル／日／体重ｋｇであり得、５×１０^９パーチクル／日／体重ｋｇであり得る。しかし、前記薬学的に有効な量は、肺線維症の症状の程度、患者の年齢、体重、健康状態、性別、投与経路及び治療期間などによって適切に変化し得る。

また、前記「薬学的に許容される」とは、生理学的に許容されてヒトに投与されるとき、通常的に、胃腸障害、めまいのようなアレルギー反応またはこれの類似反応を起こさない組成物を意味する。前記担体、賦形剤及び希釈剤の例には、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、でん粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレート及び鉱物油を挙げることができる。また、充填剤、抗凝集剤、滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤及び防腐剤などをさらに含み得る。

また、本発明の組成物は、薬学的分野における通常の方法によって患者の身体内への投与に適した単位投与型の製剤に剤形化して投与してもよく、前記製剤は、１回または数回の投与によって肺胞を発達させることができる効果的な投与量を含む。このような目的に相応する剤形は、非経口投与製剤として、注射用アンプルのような注射剤、注入バックのような注入剤及びエアロゾール製剤のような噴霧剤などが望ましい。前記注射アンプルは、使用直前に注射液と混合調剤することができ、注射液としては、生理食塩水、ブドウ糖、マンニトール、リンゲル液などを用い得る。また、注入バックは、塩化ポリビニルまたはポリエチレン材質のものを用い得、バクスター（Ｂａｘｔｅｒ）、ベクトンーディキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、メドセップ（Ｍｅｄｃｅｐ）、ナショナルホスピタルプロダクツ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、またはテルモ（Ｔｅｒｕｍｏ）社の注入バックが挙げられる。

前記薬学的製剤には、前記有効成分に加え、一つまたはそれ以上の薬学的に許容可能な通常の不活性担体、例えば、注射剤の場合は、保存剤、無痛化剤、可溶化剤または安定化剤などを、局所投与用の製剤の場合は、基剤（ｂａｓｅ）、賦形剤、滑剤または保存剤などをさらに含み得る。

このように製造された本発明の組成物または薬学的製剤は、マウス、ネズミ、家畜、ヒトなどの哺乳動物に、非経口、経口などの多様な経路で投与でき、投与方法は、当業界で通常使用する全ての方式によって投与可能である。これに制限されないが、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜または脳室内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）注射などによって投与され得る。

具体的に、投与方法はこれに制限されないが、脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソームを静脈内に投与（静脈注射；Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）するか、対象体の肺または気管内に投与（局所投与；Ｔｏｐｉｃａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）するか、吸入（ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ）によって投与され得る。また、前記エキソソームは、ネブライザー（ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ）を用いて投与され得、気管内チューブを用いて投与され得る。

他の一つの様態として、本発明は、脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソームを有効成分として含む、肺線維症の予防または治療用の注射剤を提供する。
前記注射剤は、リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ，ＰＢＳ）をさらに含み得る。即ち、前記注射剤は、リン酸緩衝生理食塩水に脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソームを担持して用いることができる。
前記注射剤は、リン酸緩衝生理食塩水の代わりにハイドロゲルを含み得る。
前記ハイドロゲルは、ヒアルロン酸、ゼラチン、アルジネート、キトサン、フィブリン、エラスチン、コラーゲン及びメチルセルロースから構成された群より選択されたいずれか一つ以上であり得、具体的にヒアルロン酸ハイドロゲルであり得るが、これに限定されない。

前記注射剤は、エキソソームが５×１０^８パーチクル／ｋｇ〜５×１０^１０パーチクル／ｋｇの濃度で含まれたものであり得、５×１０^９パーチクル／ｋｇの濃度で含まれたものであり得るが、これに限定されない。

前記注射剤は、マウス、ネズミ、家畜、ヒトなどの哺乳動物の肺などの損傷部位に注射することで投与することができ、静脈投与することができる。

また、他の一つの様態として、本発明は、肺線維症の予防または治療のための医薬の製造において脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソームの用途を提供する。

前記脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソームについては、前述のようであり、これを肺線維症の予防または治療用の薬学的組成物に有効成分として含めて用いることができることも、前述のようである。

また他の一つの様態として、本発明は、脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソームを有効成分として含む薬学的組成物を用いて肺線維症を治療する方法を提供する。

前記方法は、前記薬学的組成物を前述のような多様な方法で対象体に投与する段階を含む。望ましい投与量は、対象体の状態及び体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路及び期間によって変わり得、これは、当業者によって適切に選択され得、前記対象体は、肺線維症が発病した、または発病し得るヒトを含む全ての動物を意味する。

具体的に、静脈注射療法、吸入投与方式、局所投与方式などによって対象体に投与することができ、吸入及び局所投与方式で直接的に肺にエキソソームを伝達することができるだけでなく、静脈注射時に血管に沿って循環していたエキソソームが自然に肺に蓄積されるため、複雑な治療過程なく前記のような簡単な方法で効率的に肺線維症を治療することができる。

他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。

本発明による脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソームは、肺線維症治療に係わるＨＧＦ及びＩＬ−１０のような成長因子を含み、肺線維症誘導テスト動物モデルにおいて線維化領域を大幅減少させることができるので、肺線維症の予防または治療に有用に用いることができる。また、本発明によるエキソソームを用いた肺線維症の治療は、既存の肺線維症の治療に用いられていたステロイド系薬物及び抗酸化剤によって誘発する副作用発生の憂慮が少なく、手術治療なく、注射投与方式、吸入投与方式などによって自然に肺にエキソソームを伝達することができるので、簡便かつ経済的に肺線維症を治療することができる。

本発明の一実施例によってヒト脂肪由来幹細胞（ｈｕｍａｎ ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ＨＡＳＣｓ）から抽出されたエキソソーム及びこの応用に関わる模式図である。 本発明の一実施例によって多様な由来の幹細胞からエキソソームを抽出する方法に関わる模式図である。 本発明の一実施例によって、ヒト脂肪由来幹細胞（ＨＡＳＣ）、 ヒト臍帯由来幹細胞 （ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ＵＣ−ＭＳＣ）及びヒト骨髓由来幹細胞（ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ＢＭ−ＭＳＣ）から抽出された各エキソソームの特性分析の結果を示した図であり、（Ａ）ナノ粒子追跡分析法 （ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｔｒａｃｋｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ）を用いて確認した前記多様な由来の幹細胞から抽出したエキソソームの濃度、及び（Ｂ）ＥＬＩＳＡ分析による前記各々のエキソソーム内のＨＧＦとＩＬ−１０の発現程度を示した図である。 図４は、本発明の一実施例によって線維症が誘導された線維芽細胞を用いてヒト脂肪由来幹細胞（ＨＡＳＣ）、ヒト臍帯由来幹細胞（ＵＣ−ＭＳＣ）及びヒト骨髓由来幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）から抽出された各エキソソームのコラーゲン合成阻害能を分析した結果を示した図であり、（Ａ）線維症の誘導のための肺線維芽細胞の低酸素条件及びエキソソーム処理条件に関わる模式図、及び（Ｂ）ＨＡＳＣ、ＵＣ−ＭＳＣ、ＢＭ−ＭＳＣから抽出された各エキソソームを線維症が誘導された肺線維芽細胞に処理してから２４時間後に培養培地を修得して、ＥＬＩＳＡ分析によってＣＯＬ１Ａ１（ｈｕｍａｎ ｐｒｏ−ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ Ｉ ａｌｐｈａ １）の発現程度を示した図である。ここで、ＧＭは、成長培地（Ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉｕｍ）を用いた陽性対照群であり、ＢＭは、無血清基本培地（ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ ｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ）を用いた陰性対照群である。 本発明の一実施例によって正常酸素（ｎｏｒｍｏｘｉａ）及び低酸素（ｈｙｐｏｘｉａ）条件の下で培養されたヒト脂肪由来幹細胞から各々抽出されたＮｏｒｍｏｘｉａ Ｅｘｏｓｏｍｅｓ及びＨｙｐｏｘｉａ Ｅｘｏｓｏｍｅｓの特性分析の結果を示した図である。（Ａ）ヒト脂肪由来幹細胞からのエキソソームの抽出のための培養条件及び段階を概略的に示した模式図であり、Ｎｏｒｍｏｘｉａ Ｅｘｏｓｏｍｅｓ抽出のためには１０％ＦＢＳ及び１％抗生剤（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）が含まれている通常のＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ）培養培地を用い、Ｈｙｐｏｘｉａ Ｅｘｏｓｏｍｅｓ抽出のためには、前記通常の培養培地に１００μＭの塩化コバルト（ＩＩ）６水和物（ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ）が添加された培養培地を用いて、ヒト脂肪由来幹細胞を各々２４時間培養した後、無血清（ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ）培地に替えてエキソソームを抽出する。（Ｂ）Ｎｏｒｍｏｘｉａ Ｅｘｏｓｏｍｅｓ及びＨｙｐｏｘｉａ Ｅｘｏｓｏｍｅｓの構造及び模様を撮影した透過電子顕微鏡（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）写真、及び（Ｃ）ナノ粒子追跡分析を用いて確認した前記Ｎｏｒｍｏｘｉａ Ｅｘｏｓｏｍｅｓ及びＨｙｐｏｘｉａ Ｅｘｏｓｏｍｅｓの濃度を示した図である。 本発明の一実施例によって脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソームの肺線維症の治療効果の結果を示した図である。（Ａ）ブレオマイシン誘導肺線維症Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ ｉｎｄｕｃｅｄ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ ｍｏｕｓｅ）モデル構築及びヒト脂肪由来幹細胞から抽出したＮｏｒｍｏｘｉａ Ｅｘｏｓｏｍｅｓ及びＨｙｐｏｘｉａ Ｅｘｏｓｏｍｅｓの投与日程を概略的に示した図であり、（Ｂ）ブレオマイシン誘導肺線維症Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにヒト脂肪由来幹細胞から抽出されたＮｏｒｍｏｘｉａ Ｅｘｏｓｏｍｅｓ及びＨｙｐｏｘｉａ Ｅｘｏｓｏｍｅｓを各々一日おきで総３回、静脈に注射で投与した後、１日目になる日にマウスの肺を摘出して撮影した写真である。ここで、ＰＢＳは、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ）を投与した陰性対照群（Ｎ＝３）であり、ＨＡＳＣｓは、ヒト脂肪由来幹細胞を１×１０^６個細胞／１００μｌの濃度で投与した陽性対照群（Ｎ＝３）である。また、Ｎｏｒｍｏｘｉａ−Ｅｘｏ及びＨｙｐｏｘｉａ−Ｅｘｏは、Ｎｏｒｍｏｘｉａ Ｅｘｏｓｏｍｅｓ及びＨｙｐｏｘｉａ Ｅｘｏｓｏｍｅｓを各々１×１０^８パーチクル／１００μｌの濃度で投与した実験群（Ｎ＝３）である。この際、前記ＰＢＳ、ヒト脂肪由来幹細胞（ＨＡＳＣｓ）、Ｎｏｒｍｏｘｉａ Ｅｘｏｓｏｍｅｓ及びＨｙｐｏｘｉａ Ｅｘｏｓｏｍｅｓは、各々ブレオマイシン誘導肺線維症Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに一日おきで総３回、静脈に注射で投与した。 本発明の一実施例によって脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソームの肺線維症の治療効果の結果を示した図であり、ヒト脂肪由来幹細胞から抽出されたＮｏｒｍｏｘｉａ Ｅｘｏｓｏｍｅｓ及びＨｙｐｏｘｉａ Ｅｘｏｓｏｍｅｓをブレオマイシン誘導肺線維症Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに一日おきで総３回、静脈に注射で投与した後、１日目になる日にマウスの肺を摘出してトリクロム染色を行い、その染色結果を撮影して示した顕微鏡写真（顕微鏡倍率：×１０）であり。ここで、ＰＢＳは、ＰＢＳを投与した陰性対照群（Ｎ＝３）であり、ＨＡＳＣｓは、ヒト脂肪由来幹細胞を１×１０^６個細胞／１００μｌの濃度で投与した陽性対照群（Ｎ＝３）である。また、Ｎｏｒｍｏｘｉａ−Ｅｘｏ及びＨｙｐｏｘｉａ−Ｅｘｏは、Ｎｏｒｍｏｘｉａ Ｅｘｏｓｏｍｅｓ及びＨｙｐｏｘｉａ Ｅｘｏｓｏｍｅｓを各々１×１０^８パーチクル／１００μｌの濃度で投与した実験群（Ｎ＝３）である。 本発明の一実施例によって脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソームの肺線維症の治療効果の結果を示した図であり、ヒト脂肪由来幹細胞から抽出されたＮｏｒｍｏｘｉａ Ｅｘｏｓｏｍｅｓ及びＨｙｐｏｘｉａ Ｅｘｏｓｏｍｅｓをブレオマイシン誘導肺線維症Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに一日おきで総３回、静脈に注射で投与した後、１日目になる日にマウスの肺を摘出してトリクロム染色を行い、その染色結果を高配率で撮影して示した顕微鏡写真（顕微鏡倍率：×４０）である。ここで、スケールバー（Ｓｃａｌｅ ｂａｒ）は １００μｍである。 本発明の一実施例によって脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソームの肺線維症の治療効果の結果を示した図であり、ヒト脂肪由来幹細胞から抽出されたＮｏｒｍｏｘｉａ Ｅｘｏｓｏｍｅｓ及びＨｙｐｏｘｉａ Ｅｘｏｓｏｍｅｓをブレオマイシン誘導肺線維症Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに一日おきで総３回、静脈に注射で投与した後、１日目になる日にマウスの肺を摘出してトリクロム染色を行い、染色されたコラーゲン領域、即ち、線維領域（ｆｉｂｒｏｔｉｃ ａｒｅａ，％）を定量化して示したグラフである。ここで、ＰＢＳは、ＰＢＳを投与した陰性対照群（Ｎ＝３）であり、ＨＡＳＣｓは、ヒト脂肪由来幹細胞を１×１０^６個細胞／１００μｌの濃度で投与した陽性対照群（Ｎ＝３）である。また、Ｎｏｒｍｏｘｉａ−Ｅｘｏ及びＨｙｐｏｘｉａ−Ｅｘｏは、Ｎｏｒｍｏｘｉａ Ｅｘｏｓｏｍｅｓ及びＨｙｐｏｘｉａ Ｅｘｏｓｏｍｅｓを各々１×１０^８パーチクル／１００μｌの濃度で投与した実験群（Ｎ＝３）である。

以下、実施例によって本発明の構成及び効果をより詳しく説明する。これらの実施例は、ひたすら本発明を例示するだけで、本発明の範囲はこれらの実施例によって限定されない。

〔実施例１：多様な由来の幹細胞からのエキソソームの抽出〕
幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）は、由来した組織及び培養条件によって異なる特性を示し、これによって、相異なる特性を示す幹細胞から抽出されたエキソソームも、内部構成成分に差異を有する（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ： Ｅｘｏｓｏｍｅｓ， ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ， ａｎｄ ｆｒｉｅｎｄｓ； Ｇ Ｒａｐｏｓｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ２０１３， Ｖｏｌ．２００， Ｎｏ．４， ｐ．３７３〜３８３）。即ち、エキソソームを抽出する細胞の種類は、そのエキソソームの特性を決定する非常に重要な要素となる。

そこで、肺線維症に有効な治療効果を示すエキソソームを抽出するために、多様な由来の幹細胞からエキソソームを抽出した。

具体的に、ヒト脂肪由来幹細胞（ＨＡＳＣ）、ヒト臍帯由来幹細胞（ＵＣ−ＭＳＣ）及びヒト骨髓由来幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）を各々培養する過程で前記幹細胞からエキソソームを各々抽出した。

前記各々の幹細胞は、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンが含まれている通常のＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ；Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ＃：１１９９５０６５）培養培地を用いて培養した。

各々の幹細胞からのエキソソーム抽出２４時間前、無血清、無抗生剤、無フェノールレッドである培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ＃：３１０５３０２８）に替えて２４時間培養した後、細胞培養上澄液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を回収した。回収した細胞培養上澄液は、３００ｘｇで１０分間遠心分離して細胞残余物を除去し、０．４μｍのポアサイズを有するセルストレーナーを用いてポアサイズ以上の残余物を除去した。以後、０．２２μｍのポアサイズを有するフィルターを用いてポアサイズ以上の細胞残余物を除去した。ろ過後に回収した溶液を４ｍＬ／分（ｍｉｎ）の流速を加えて５００ｋＤ ＭＷＣＯを有するフィルターを用いたＴＦＦ過程を通じてタンパク質を除去した。回収した溶液をソニケーション過程を経た後、ＴＦＦ過程を連続反復して最終的にエキソソームを得た（図２）。

上澄液を回収した後、さらに通常の培養培地を前記各々の幹細胞に添加して培養し、このような過程は、パッセージ（ｐａｓｓａｇｅ）７または８まで継代培養（ｓｕｂ−ｃｕｌｔｕｒｅ）を行った。

〔実施例２：多様な由来の幹細胞から抽出されたエキソソームの特性分析〕
前記実施例１から得た多様な由来の幹細胞から抽出された各々のエキソソームの特性を分析した。

先ず、ヒト脂肪由来幹細胞から抽出したエキソソーム（ＨＡＳＣ−Ｅｘｏ）、ヒト臍帯由来幹細胞から抽出したエキソソーム（ＵＣ−ＭＳＣ−Ｅｘｏ）及びヒト骨髓由来幹細胞から抽出したエキソソーム（ＢＭ−ＭＳＣ−Ｅｘｏ）各々の濃度は、ナノ粒子追跡分析によって確認した。

ナノ粒子追跡分析を用いて各々のエキソソームの濃度を確認した結果、ヒト脂肪由来幹細胞エキソソーム（ＨＡＳＣ−Ｅｘｏ）の濃度は２．２５×１０^９パーチクル／ｍＬであり、ヒト臍帯由来幹細胞エキソソーム（ＵＣ−ＭＳＣ−Ｅｘｏ）の濃度は１．３８×１０^９パーチクル／ｍＬであり、ヒト骨髓由来幹細胞エキソソーム（ＢＭ−ＭＳＣ−Ｅｘｏ）の濃度は１．８１×１０^９パーチクル／ｍＬであった（図３のＡ）。

また、前記ヒト脂肪由来、ヒト臍帯由来及びヒト骨髓由来の各々の幹細胞から抽出されたエキソソームの特性を比較するために、酵素免疫測定法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ）を用いて、肺線維症の緩和に助けになると知られたＨＧＦ及びＩＬ−１０の発現程度を確認した。

具体的に、前記多様な由来の幹細胞から抽出された７×１０^７パーチクル／２００μｌ濃度の各々のエキソソームとＲＩＰＡバッファー（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ）とを１：１の割合で各々混合して、ＨＧＦ ＥＬＩＳＡキット（ａｂｃａｍ，ａｂ１００５３４）及びＩＬ−１０ ＥＬＩＳＡキット（ａｂｃａｍ，ａｂ１００５４９）を用いてエキソソーム内のＨＧＦ及びＩＬ−１０の発現程度を確認した。

ＥＬＩＳＡによってＨＧＦ及びＩＬ−１０の発現程度を確認した結果、ヒト脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソーム（ＨＡＳＣ−Ｅｘｏ）においてＨＧＦが最も高く発現されており、ヒト臍帯由来幹細胞から抽出されたエキソソーム（ＵＣ−ＭＳＣ−Ｅｘｏ）とは有意味な差異を示した。一方、ヒト骨髓由来幹細胞から抽出されたエキソソーム（ＢＭ−ＭＳＣ−Ｅｘｏ）とは有意味な差異なく類似水準に発現されることを確認した。一方、ＩＬ−１０の場合、前記多様な由来の幹細胞から抽出されたエキソソームのいずれにおいても類似水準に発現された（図３のＢ）。

〔実施例３：線維症が誘導された肺線維芽細胞を用いたエキソソームのコラーゲン合成阻害能の評価〕
多くの臓器は、組織損傷後、炎症と治癒過程を経るようになり、損傷の小さな場合は正常の構造及び機能を維持するが、継続的な損傷があれば、治癒過程で組織が線維化（ｆｉｂｒｏｓｉｓ）するようになる。この線維化過程は、コラーゲン、フィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）などの細胞外基質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ，ＥＣＭ）が組織に蓄積されることで正常構造を破壊して機能の障害をもたらす（Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ａｎｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｖｏｌ．５４，Ｎｏ．２，ｐ．１−１２，Ｆｅｂ，２００３）。

そこで、前記実施例１で得たヒト脂肪由来、ヒト臍帯由来及びヒト骨髓由来の各々の幹細胞から抽出されたエキソソームが肺線維症に有効な治療効果を示すかを確認するために、肺線維芽細胞（ｌｕｎｇ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを構築し、前記多様な由来の幹細胞から抽出された各エキソソームのコラーゲン合成阻害能を評価した。

具体的に、初代ヒト肺線維芽細胞（Ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ｌｕｎｇ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ；Ｎｏｒｍａｌ，ＡＴＣＣ，ＰＣＳ−２０１−０１３）は、Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈキット−Ｌｏｗ ｓｅｒｕｍ（ＡＴＣＣ，ＰＣＳ−２０１−０４１）が添加された線維芽細胞基本培地（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ；ＡＴＣＣ，ＰＣＳ−２０１−０３０）を用いてパッセージ６まで継代培養した。

継代培養後、線維症を誘導するために、培養細胞において低酸素状態を誘導し、肺間質の線維化増感物質として知られている塩化コバルト（ＩＩ）６水和物（Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｈｅｘａｈｙｄｒａｔｅ（ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ））を培養培地に１００μＭの濃度で添加して培地組成物を交替した。前記培地組成物にヒト脂肪由来幹細胞から抽出したエキソソーム（ＨＡＳＣ−Ｅｘｏ）、ヒト臍帯由来幹細胞から抽出したエキソソーム（ＵＣ−ＭＳＣ−Ｅｘｏ） 及びヒト骨髓由来幹細胞から抽出したエキソソーム（ＢＭ−ＭＳＣ−Ｅｘｏ）を各々、１×１０^８パーチクル／ｍＬまたは５×１０^８パーチクル／ｍＬの濃度で培地に処理した。２４時間後、培養培地を抽出してＥＬＩＳＡキットを用いてＣＯＬ１Ａ１（ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ Ｉ，ａｌｐｈａ １）の発現程度を確認した。この際、成長培地（ＧＭ）及び無血清基本培地（ＢＭ）を各々陽性対照群及び陰性対照群として用いた。

ＥＬＩＳＡを用いて前記多様な由来の幹細胞から抽出された各エキソソームのコラーゲン合成阻害能を評価した結果、ヒト臍帯由来幹細胞から抽出したエキソソーム（ＵＣ−ＭＳＣ−Ｅｘｏ）及びヒト骨髓由来幹細胞から抽出したエキソソーム（ＢＭ−ＭＳＣ−Ｅｘｏ）を処理した群に比べ、ヒト脂肪由来幹細胞から抽出したエキソソーム（ＨＡＳＣ−Ｅｘｏ）を処理した群でＣＯＬＩＡ１の発現が有意味に減少することを確認した。

したがって、前記結果から、ヒト脂肪由来幹細胞から抽出したエキソソーム（ＨＡＳＣ−Ｅｘｏ）が、ヒト臍帯由来幹細胞から抽出したエキソソーム（ＵＣ−ＭＳＣ−Ｅｘｏ）及びヒト骨髓由来幹細胞から抽出したエキソソーム（ＢＭ−ＭＳＣ−Ｅｘｏ）よりもコラーゲン合成阻害能が優秀であることを確認した（図４）。

そこで、線維症が誘導された肺線維芽細胞において、ヒト脂肪由来幹細胞から抽出したエキソソーム（ＨＡＳＣ−Ｅｘｏ）が、他の由来の幹細胞のエキソソーム（ＵＣ−ＭＳＣ−Ｅｘｏ及びＢＭ−ＭＳＣ−Ｅｘｏ）に比べてコラーゲン合成阻害能が優秀であることから、前記脂肪由来幹細胞のエキソソーム（ＨＡＳＣ−Ｅｘｏ）を肺線維症の治療に有用に使用可能であることを類推することができた。

〔実施例４：正常酸素（ｎｏｒｍｏｘｉａ）及び低酸素（ｈｙｐｏｘｉａ）条件下におけるヒト脂肪由来幹細胞からのエキソソームの抽出〕
幹細胞を用いた通常の実験は、常に正常酸素分圧（酸素２１％）下で行われる。しかし、ｉｎ ｖｉｖｏ環境、即ち、幹細胞が実際に身体内で作用するときは、酸素分圧が非常に低いと知られている（Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ．，２００２；３０：６７−７３）。

一方、前記実施例３において、ヒト脂肪由来幹細胞から抽出したエキソソーム（ＨＡＳＣ−Ｅｘｏ）が、他の由来の幹細胞のエキソソーム（ＵＣ−ＭＳＣ−Ｅｘｏ及びＢＭ−ＭＳＣ−Ｅｘｏ）に比べ、線維症が誘導された肺線維芽細胞におけるコラーゲン合成阻害能にさらに優れていることを確認しており、これによって脂肪由来幹細胞のエキソソームを肺線維症の治療に有用に使用可能であることが分かった。

そこで、前記結果に基づき、肺線維症の治療に有効なエキソソームを抽出するために、ヒト脂肪由来幹細胞をパッセージ７まで継代培養して増殖させた後、正常酸素条件または低酸素条件下で培養してエキソソーム（ｎｏｒｍｏｘｉａ ｅｘｏｓｏｍｅまたはｈｙｐｏｘｉａ ｅｘｏｓｏｍｅ）を抽出した。

具体的に、ヒト脂肪由来幹細胞は、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンが含まれている通常のＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ；Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ＃：１１９９５０６５）培養培地を用いてパッセージ７まで継代培養した。その後、低酸素培養条件を誘導するために、培養細胞において低酸素状態を誘導する物質として知られている塩化コバルト（ＩＩ）６水和物（Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｈｅｘａｈｙｄｒａｔｅ（ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ））を用い、前記塩化コバルト（ＩＩ）６水和物を培養培地に１００μＭの濃度で添加して培地組成物を交替し、１日間培養した（図５のＡ）。一方、正常酸素培養条件のためには、培養培地に塩化コバルト（ＩＩ）６水和物を添加しなかった。

前記正常酸素条件または低酸素条件下で培養されたヒト脂肪由来幹細胞からのエキソソーム抽出２４時間前、無血清、無抗生剤、無フェノールレッドの培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ＃：３１０５３０２８）に替えて２４時間培養してから、細胞培養上澄液を回収した。回収した細胞培養上澄液は、前記実施例 １のように多重フィルターシステムを用いてエキソソームを分離及び精製することで得た。

前記正常酸素条件または低酸素条件下で培養されたヒト脂肪由来幹細胞から抽出したエキソソームの濃度を、ナノ粒子追跡分析によって確認した結果、正常酸素条件下で培養したヒト脂肪由来幹細胞から抽出したエキソソーム（ｎｏｒｍｏｘｉａ ｅｘｏｓｏｍｅ）の濃度は、２．２５×１０^９パーチクル／ｍＬであり、低酸素条件下で培養したヒト脂肪由来幹細胞から抽出したエキソソーム（ｈｙｐｏｘｉａ ｅｘｏｓｏｍｅ）の濃度は、２．４５×１０^９パーチクル／ｍＬであった（図５のＣ）。また、前記抽出されたエキソソームの形態は、丸いナノ粒子の形態を有していることを確認した（図５のＢ）。

〔実施例５：脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソームの肺線維症の治療効能の評価〕
前記実施例４から得たエキソソーム、即ち、正常酸素条件下で培養された脂肪由来幹細胞から得たエキソソーム（Ｎｏｒｍｏｘｉａ−Ｅｘｏ）及び低酸素条件下で培養された脂肪由来幹細胞から得たエキソソーム（Ｈｙｐｏｘｉａ−Ｅｘｏ）の肺線維症の治療効果を確認するために、肺線維症の動物モデルを構築し、構築した肺線維症の動物モデルに前記エキソソームを投与することで肺線維症の治療効能を評価した。

具体的に、肺線維症の動物モデルは、気管内点滴注入（ｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌ ｉｎｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ，ＩＴ）によって肺線維症誘発物質であるブレオマイシン溶液をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの肺の中に直接注入することでブレオマイシンによって肺線維症が誘発されたマウス動物モデル（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ ｉｎｄｕｃｅｄ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ ｍｏｕｓｅ；９週齢、ｍａｌｅ，中央実験動物（株））を構築した。前記構築されたブレオマイシン誘導肺線維症Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ ｉｎｄｕｃｅｄ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ ｍｏｕｓｅ）に、前記Ｎｏｒｍｏｘｉａ−Ｅｘｏ及びＨｙｐｏｘｉａ−Ｅｘｏを各々静脈注射（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，ＩＶ ｉｎｊｅｔｉｏｎ）で投与した。この際、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）を投与した群を陰性対照群にし、ヒト脂肪由来幹細胞（ＨＡＳＣｓ）を注射した群を陽性対照群にした。

より具体的に、前記ヒト脂肪由来幹細胞（ＨＡＳＣｓ）は、ＰＢＳに１×１０^６個細胞／１００μｌの濃度となるように準備し、Ｎｏｒｍｏｘｉａ−Ｅｘｏ及びＨｙｐｏｘｉａ−Ｅｘｏ各々は、ＰＢＳに１×１０^８パーチクル／１００μｌの濃度（５×１０^９パーチクル／ｋｇにあたる濃度）で分散させて注射剤に製造した。

前記のように準備したＮｏｒｍｏｘｉａ−Ｅｘｏ及びＨｙｐｏｘｉａ−Ｅｘｏを各々ブレオマイシン誘導肺線維症Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに各々一日おきで、１日目、３日目、５日目の総３回、静脈注射で投与した。この際、陰性対照群であるＰＢＳ及び陽性対照群としての前記１×１０^６個細胞／１００μｌの濃度で準備したヒト脂肪由来幹細胞（ＨＡＳＣｓ）も、Ｎｏｒｍｏｘｉａ−Ｅｘｏ及びＨｙｐｏｘｉａ−Ｅｘｏと同様に各々一日おきで総３回、静脈注射で投与した（図６のＡ）。

実験６日目、即ち、静脈注射で、前記ＰＢＳ、ＨＡＳＣｓ、Ｎｏｒｍｏｘｉａ−Ｅｘｏ及びＨｙｐｏｘｉａ−Ｅｘｏを各々総３回投与したすぐ翌日、肺線維症の治療効果を確認するために肺組織を摘出した（図６のＢ）。

肺組織を摘出した後、トリクロム染色を行い、青色に染色されたコラーゲン領域を定量化して肺の線維化程度を確認した（図７〜図９）。

その結果、正常酸素条件及び低酸素条件下で培養された脂肪由来幹細胞から各々抽出されたＮｏｒｍｏｘｉａ−Ｅｘｏ及びＨｙｐｏｘｉａ−Ｅｘｏを投与した実験群は、陰性対照群（ＰＢＳ投与群）及び陽性対照群（ヒト脂肪由来幹細胞（ＨＡＳＣｓ）投与群）に比べ、染色されたコラーゲン領域が正常肺組織（ｎｏｒｍａｌ ｌｕｎｇ ｔｉｓｓｕｅ）に類似な水準に有意味に減少したことを確認した。

特に、低酸素条件下で培養された脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソーム（Ｈｙｐｏｘｉａ−Ｅｘｏ）を投与した実験群の場合、陰性対照群及び陽性対照君を始めてＮｏｒｍｏｘｉａ−Ｅｘｏを投与した実験郡に比べても正常肺組織にほぼ類似な水準に、染色されたコラーゲン領域が大幅減少したことを確認した（図７〜図９）。

前記結果から、正常酸素条件下で培養された脂肪由来幹細胞から得たエキソソーム（Ｎｏｒｍｏｘｉａ−Ｅｘｏ）及び低酸素条件下で培養された脂肪由来幹細胞から得たエキソソーム（Ｈｙｐｏｘｉａ−Ｅｘｏ）のいずれも、肺線維症の改善または治療の効果を奏することを確認した。特に、低酸素条件下で培養された脂肪由来幹細胞から得たエキソソーム（Ｈｙｐｏｘｉａ−Ｅｘｏ）の肺線維症の治療効果が遥かに優秀であることが分かった。

Claims (9)

1. 脂肪由来幹細胞からエキソソームを得る段階と、前記得られたエキソソームを有効成分として含有させる段階と、含むことを特徴とする肺線維症の予防または治療用の薬学的組成物の製造方法。
2. 前記エキソソームが、正常酸素条件下で培養された脂肪由来幹細胞から抽出されたものであることを特徴とする請求項１に記載の肺線維症の予防または治療用の薬学的組成物の製造方法。
3. 前記エキソソームが、低酸素条件下で培養された脂肪由来幹細胞から抽出されたものであることを特徴とする請求項１に記載の肺線維症の予防または治療用の薬学的組成物の製造方法。
4. 前記低酸素条件は、０．５〜１０％の酸素または低酸素細胞感作剤によって誘導されることを特徴とする請求項３に記載の肺線維症の予防または治療用の薬学的組成物の製造方法。
5. 脂肪由来幹細胞から由来のエキソソームを有効成分として含むことを特徴とする肺線維症の予防または治療用の薬学的組成物。
6. 前記エキソソームが、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）及びインターロイキン−１０を含んでいることを特徴とする請求項５に記載の肺線維症の予防または治療用の薬学的組成物。
7. 前記薬学的組成物が、気管内投与または吸入投与用であることを特徴とする請求項５に記載の肺線維症の予防または治療用の薬学的組成物。
8. 前記薬学的組成物が、注射剤であることを特徴とする請求項５に記載の肺線維症の予防または治療用の薬学的組成物。
9. 前記注射剤は、エキソソームが５×１０^８パーチクル／ｋｇ〜５×１０^１０パーチクル／ｋｇの濃度で含まれるものであることを特徴とする請求項８に記載の肺線維症の予防または治療用の薬学的組成物。

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