JP2022542953A

JP2022542953A - 線維化、炎症、及び／又は老化疾患に対する治療薬

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Publication number: JP2022542953A
Application number: JP2022506095A
Authority: JP
Inventors: 孝広落谷
Original assignee: 上▲海▼▲聖▼特佳健康科技▲発▼展有限公司; 特▲リン▼妥有限公司; 孝広落谷
Priority date: 2019-07-31
Filing date: 2019-07-31
Publication date: 2022-10-07
Also published as: US20220273725A1; WO2021016727A1; EP4006144A1; CN114269358A; EP4006144A4

Abstract

本発明は、肺線維症等の線維化疾患、炎症疾患、及び／又は老化疾患に対して、治療効果を奏する治療剤及び予防剤を提供することを課題とする。本発明者らは、エクソソームに注目して肺線維症等の線維化疾患、炎症疾患、及び老化疾患の病態及び治療方法について検討を重ねた結果、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）由来のエクソソームに、上記疾患に対する優れた治療効果及び／又は予防効果が存在することを見出した。よって、本発明は、線維化疾患、炎症疾患、及び老化疾患の少なくとも１つの疾患の治療剤又は予防剤であって、間葉系幹細胞由来のエクソソームを含む、前記治療剤又は予防剤、並びに該治療及び／又は予防剤を含む医薬組成物に関する。

Description

本発明は、線維化疾患、炎症疾患、及び老化疾患の少なくとも１つの疾患の治療剤及び予防剤、並びに該治療剤又は予防剤を用いた治療方法又は予防方法に関する。

組織の線維化とは、器官又は組織の修復又は治癒過程において生ずる、線維結合組織の過剰な形成である。このような組織の線維化は、様々な臓器において生じる得、線維化疾患としては、例えば肺線維症及び肝硬変などが知られている。線維化疾患の患者は、国内で数十万人にのぼるが、未だ有効な治療法は存在しない。

肺線維症は、代表的な線維化疾患の一種であり、炎症疾患又は老化疾患の一種であるということもできる。肺線維症の中でも、原因の特定できない特発性肺線維症（ＩＰＦ）は、診断後の平均寿命が３～５年と予後が極めて悪い。日本におけるＩＰＦの発症頻度は、１０万人当たり約２０人である。肺線維症の治療法としては、ピルフェニドンやニンテダニブといった抗線維化薬や、ステロイド、免疫抑制剤等が用いられているが（非特許文献１～２）、効果は限定的である。

慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ：ｃｈｒｏｎｉｃｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅｐｕｌｍｏｎａｒｙｄｉｓｅａｓｅ）とは、従来、慢性気管支炎や肺気腫と呼ばれてきた病気の総称である。タバコ煙を主とする有害物質を長期に吸入曝露することで生じた肺の炎症性疾患であり、喫煙習慣を背景に中高年に発症する生活習慣病の一種である。４０歳以上の人口の８．６％、約５３０万人のＣＯＰＤ患者が存在すると推定されており（ＮＩＣＥｓｔｕｄｙ）、大多数が未診断、未治療の状態であると考えられている。全体では死亡原因の９位、男性では７位を占めており、ＷＨＯの統計では２０２０年には世界の死亡原因の第３位に浮上するとされる重要な疾患である。

ＣＯＰＤの最大の原因は喫煙であり、喫煙者の１５～２０％がＣＯＰＤを発症すると考えられている。タバコの煙を吸入することで肺の中の気管支に炎症がおき、せきやたんが出たり、気管支が細くなったりすることによって空気の流れが低下する。また、気管支が枝分かれした奥にあるぶどうの房状の小さな袋である肺胞（はいほう）が破壊されて、肺気腫という状態になると、酸素の取り込みや二酸化炭素を排出する機能が低下する。ＣＯＰＤではこれらの変化が併存していると考えられており、治療によっても元に戻ることはない。

ＩＰＦ（特発性肺線維症）も原因不明な間質性肺炎（特発性間質性肺炎）の１種で、特発性間質性肺炎のなかで最も頻度が高い病気であることが知られている。ＩＰＦの発症率は女性よりも男性に多く、加齢とともに増加する。ＩＰＦは間質の線維化が徐々に悪化して、肺がんの原因にもなることが知られている。

これらの呼吸器官は、歩行時や階段昇降など、身体を動かした時に息切れを感じる労作時呼吸困難や慢性のせきやたんが特徴的な症状である。一部の患者では、喘鳴や発作性呼吸困難などぜんそくの様な症状を合併する場合もある。

ＣＯＰＤに対する管理の目標は、（１）症状および生活の質の改善、（２）運動能と身体活動性の向上および維持、（３）増悪の予防、（４）疾患の進行抑制、（５）全身併存症および肺合併症の予防と治療、（６）生命予後の改善にある。喫煙を続けると呼吸機能の悪化が加速するため、禁煙が治療の基本となる。増悪をさけるためには、インフルエンザワクチンや肺炎球菌ワクチンの接種が勧められる。薬物療法の中心は気管支拡張薬（抗コリン薬・β２刺激薬・テオフィリン薬）である。効果や副作用の面から吸入薬が推奨されており、主として長時間気管支を拡張する吸入抗コリン薬や吸入β２刺激薬が使用されている。気流閉塞が重症で増悪を繰り返す場合は、吸入ステロイド薬が使用される。長時間作用性β２刺激薬と吸入用ステロイドの配合薬も有用であることが報告されている。非薬物療法では呼吸リハビリテーション（口すぼめ呼吸や腹式呼吸などの呼吸訓練・運動療法・栄養療法など）が中心となる。低酸素血症が進行してしまった場合には在宅酸素療法が導入される。さらに呼吸不全が進行した場合は、小型の人工呼吸器とマスクを用いて呼吸を助ける換気補助療法が行われることもある。症例によっては過膨張した肺を切除する外科手術（肺容量減少術）も行われる。

しかし、現在に至るまでＣＯＰＤやＩＰＦの治療は極めて困難であり、完全に治る（治癒する）ことが難しい病気と考えられている。そのため、各種治療法は病気の進行を抑えることが目標となっている。したがって、今後増え続ける呼吸器疾患に対する新たな治療方法の開発が望まれている。

Azuma A, et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2005, 171, 1040～1047. Richeldi L et al., N. Engl. J. Med., 2011, 22, 365(12), 1079～87.

一実施形態において、本発明は、肺線維症等の線維化疾患、炎症疾患、及び／又は老化疾患の治療及び／又は予防剤を提供することを課題とする。

本発明者らは、肺線維症等の線維化疾患、炎症疾患、及び老化疾患の病態及び治療方法について検討を重ねた結果、喫煙刺激を受けた気道上皮細胞からのエクソソームがＣＯＰＤやＩＰＦなどの呼吸器疾患の病態の一因となりうることを世界に先駆けて示してきた。そこで、更にエクソソームに注目した実験を行ったところ、間葉系幹細胞（以下、「ＭＳＣ」という）由来のエクソソームに、上記疾患に対する優れた治療効果及び／又は予防効果が存在することを見出した。特に、本発明者ら、ヒトＭＳＣのエクソソームを経気道的に吸入することで、これらの呼吸器疾患、さらには喘息までをも治療することが可能であることを見出し、本発明を完成させた。

よって、本発明は、以下の発明に関する。
（１）線維化疾患、炎症疾患、及び老化疾患の少なくとも１つの疾患の治療剤又は予防剤であって、ＭＳＣ由来のエクソソームを含む、前記治療及び／又は予防剤。
（２）前記ＭＳＣが、骨髄、脂肪組織、臍帯、または末梢血から単離された細胞である、（１）に記載の治療剤又は予防剤。
（３）前記ＭＳＣが、多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞を含む）から単離された細胞である、（１）に記載の治療剤又は予防剤。
（４）前記ＭＳＣが、ヒト細胞である、（１）～（３）のいずれか１項に記載の治療剤又は予防剤。
（５）前記疾患の疾患部位が肺である、請求項（１）～（４）のいずれか１項に記載の治療剤又は予防剤。
（６）前記疾患が、肺線維症、ＣＯＰＤ、気管支喘息、ＡＲＤＳ（急性呼吸窮迫症候群）、肺高血圧症、放射性肺臓炎、肺サルコイドーシス、膠原病に伴う肺胞出血又は間質性肺炎からなる群から選択される、（５）に記載の治療剤又は予防剤。
（７）吸入剤である、（１）～（６）のいずれか１項に記載の治療剤又は予防剤。
（８）気管内投与又は経肺投与されるための、（１）～（７）のいずれか１項に記載の治療剤又は予防剤。

本発明により、線維化疾患、炎症疾患、及び／又は老化疾患の治療及び／又は予防剤が提供され得る。

ｉｎｖｉｔｒｏにおける筋繊維芽細胞分化抑制試験の実験方法及び結果を表すグラフである。表は、左から順に、ＴＧＦβ（２ｎｇ／ｍＬ）、ＴＧＦβ（２ｎｇ／ｍＬ）＋ＭＳＣ由来エクソソーム（１０μｇ／ｍＬ）、ＴＧＦβ（２ｎｇ／ｍＬ）＋ピルフェニドン（ＰＦＤ）（１０μｇ／ｍＬ）を添加した場合の、アルファＳＭＡの発現量（ｍＲＮＡ）を定量した結果を表す。実施例３の動物モデルを用いた治療効果の評価の投与スケジュールを示す。実施例３の動物実験の結果を示すグラフである。左から右にかけて、ブレオマイシン及びエクソソーム非投与群、ブレオマイシン投与及びエクソソーム非投与群、ブレオマイシン投与及びエクソソーム投与群を示す。縦軸は、Ｍａｓｓｏｎｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色による肺線維化スコアを示す。

１．疾患の治療及び／又は予防剤
一実施形態において、本発明は、線維化疾患、炎症疾患、及び老化疾患の少なくとも1つの疾患の治療及び／又は予防剤であって、ＭＳＣ由来のエクソソームを含む、前記治療及び／又は予防剤に関する。

本明細書において、「線維化疾患」とは、器官又は組織の修復又は治癒過程等において生じ得る、線維結合組織の過剰な形成を伴う疾患を意味する。線維化疾患は、瘢痕組織の異常沈着に起因する疾患、又はこれを伴う疾患であり得、多様な組織で起こり得る。限定するものではないが、線維化疾患の例として、肺線維症、肺高血圧症、肝硬変、心筋症、虚血性心疾患、弁膜症、心内膜心筋線維症、心筋線維化、動脈硬化、腎線維症、腎硬化症、糸球体硬化症、強皮症、後腹膜線維症、及び子宮線維症が挙げられる。

本明細書において、「炎症疾患」とは、持続性又は一過性の炎症状態を呈し、且つその炎症を軽減することによって症状が改善され得る疾患を意味する。限定するものではないが、炎症疾患の例として、ＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）、気管支喘息、ＡＲＤＳ（急性呼吸窮迫症候群）、放射性肺臓炎、肺サルコイドーシス、ウイルス性肝炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性胆管炎、原発性硬化性胆管炎、肝細胞癌、クローン病、潰瘍性大腸炎、急性膵炎、慢性膵炎、自己免疫性膵炎、大動脈炎、バセドウ病、橋本病、糖尿病、腎炎、膠原病（例えば、関節リウマチ、ＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）、血管炎、シェーグレン症候群、関節炎、サルコイドーシス）、皮膚筋炎、及び乾癬が挙げられる。

本明細書において、「老化疾患」とは加齢に起因し組織や個体における恒常性維持機能の低下に伴って生じる疾患を意味する。老化の代表的な表現型が細胞老化であり、この老化した細胞の集積や分泌する様々なメディエーターが慢性炎症の惹起、さらには線維化等の構造変化と機能障害に関与する。限定するものではないが、老化疾患の例として、アルツハイマー病、認知症、パーキンソン病、脊髄小脳変性症、及び多系統萎縮症が挙げられる。

なお、上記疾患の分類は相互排他的なものではなく、１つの疾患が複数の分類に属し得る。例えば、原発性硬化性胆管炎及び肝細胞癌は、炎症疾患の１種であると同時に、線維化疾患の１種であるということもできる。

本発明の治療及び／又は予防剤は、ＭＳＣ由来のエクソソームを含むか、ＭＳＣ由来のエクソソームからなるか、又は実質的にＭＳＣ由来のエクソソームからなる。ここで、「間葉系幹細胞（ＭＳＣ）由来」とは、ＭＳＣから得られるエクソソームを意味する。

本明細書において、「エクソソーム」とは、様々な細胞から放出される直径約２０～２００ｎｍの細胞外小胞を指す。エクソソームは、細胞間通信、抗原提示、タンパク質並びにｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ等の核酸の輸送をはじめとする様々な機能を有し得ることが知られている。

エクソソームの調製は、任意の公知の方法を使用して行うことができる。例えば、ＭＳＣを培地で培養し、培養上清からエクソソームを回収することができる。培養条件（温度及び期間等）は、適宜選択することができ、例えば、培養温度は約２０℃～約４０℃、約３０℃～約４０℃、約３５℃～約３９℃、約３６℃～約３８℃又は約３７℃とすることができる。培養期間は、例えば６ｈ～７日、１２ｈ～４日、１日～３日、又は約２日であってよい。ＣＯ₂の存在下で培養を行ってもよく、この場合ＣＯ₂濃度は約２％～約１０％、約４％～約６％、又は約５％であってよい。また、培養に用いる培地は、用いる細胞種に応じて選択することができる。用い得る培地として、市販の培地（例えば、ＢＥＧＭ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＢＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＡｄｖａｎｃｅｄＲＰＭＩ１６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、α－ＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＭａｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培地、ｍＴｅＳＲ１培地又はこれらの混合物）又は調製した培地が挙げられる。培地には、各種添加物（例えば、血清又は血清代替物、非必須アミノ酸、ペニシリン及びストレプトマイシン等の抗生物質）を加えることもできる。培地は、血清等の他の成分由来のエクソソームを含まないことが好ましい。

培養液中からエクソソームを回収する方法は、任意の公知の方法を用いて行うことができる。例えば、超遠心分離法（例えば、ＴｈｅｒｙＣ．，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．（２００６）Ｃｈａｐｔｅｒ３：Ｕｎｉｔ３．２２．）、ポリマー沈殿法、免疫沈降法、ＦＡＣＳ法、限外濾過法、ゲル濾過法、ＨＰＬＣ法、及び抗体やレクチンを利用してビーズ等の担体に吸着させる方法が挙げられる。また、市販のエクソソーム単離用キット用いて、エクソソームを回収してもよい。

上記回収方法のうち、超遠心分離法は、エクソソームの単離に最も一般的に利用されている標準的な方法である。超遠心分離法における遠心力は、例えば５００００×ｇ以上、１０００００×ｇ以上、又は１５０００００×ｇ以上であってよく、また３０００００×ｇ以下、２５００００×ｇ以下、又は２０００００×ｇ以下であってよい。遠心時間は、限定しないが、例えば、３０分～１２０分、６０分～９０分、又は７０分～８０分間とすることができる。また、遠心分離前に、必要に応じて、フィルター濾過及び／又はより低い遠心力での遠心分離を行うことにより、夾雑物を除去又は低減してもよい。

エクソソームが回収されたこと、又はエクソソームの物性の確認は、公知の方法に従って行うことができ、例えば電子顕微鏡により視覚的に確認してもよく、又はＮＴＡ（ＮａｎｏＴｒａｃｋｉｎｇＡｎａｌｙｓｉｓ）技術を用いてエクソソームの粒子径および粒子数を計測してもよい。或いは、エクソソームのマーカーとなり得るタンパク質及び／又は遺伝子の発現を確認することにより、エクソソームの存在を確認することもできる。

本明細書において、エクソソームの由来となり得るＭＳＣとしては、例えば骨髄、脂肪組織、臍帯血、臍帯、骨髄、胎盤、又は末梢血から、単離することにより得ることができる。ＭＳＣはプラスチックへの接着性があり、シャーレ上で比較的容易に増殖することから、この性質を利用して単離することができる。例えば、新鮮骨髄をシャーレ上に播種し、数日培養することでシャーレの底に繊維芽細胞様の形態のＭＳＣが出現し始める。５～２０日間培養することにより、シャーレを覆い尽くすようにＭＳＣが増殖する。得られた細胞から更にＦＡＣＳ等により，ＣＤ３４（－）、ＣＤ４５（－）、ＣＤ１０５（＋）、ＣＤ２９（＋）の細胞を分取してもよい。あるいは、ＭＳＣに特異的とされる、Ｓｔｒｏ－１、ＣＤ２７１、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ１４６、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ３４９ＳＳＥＡ－３、ＳＵＳＤ２、Ｓｔｒｏ－４、ＰＤＧＦＲ－α、Ｓｃａ－１、及びｅｃｔｏ－５’－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ（ＣＤ７３）などの間葉系細胞に発現しているマーカーを１種類以上利用して、ＦＡＣＳ等により単離することができる。

あるいは、ＭＳＣはより分化能の高い細胞、例えば、多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞を含む）から分化誘導することにより、得ることもできる。例えば、ＧＳＫ３β阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤、及びインスリン存在下で多能性幹細胞を培養することにより、ＭＳＣを誘導することができることが報告されている（ＦｕｋｕｔａＭらＰＬｏＳＯＮＥ９（１２）：ｅ１１２２９１．）。あるいは、ＭＳＣは、市販品として入手可能である（ＴａｋａｒａＢｉｏＩｎｃ．日本；ＣＯＳＭＯＢＩＯｃｏ．，ｌｔｄ．、日本など）。

本明細書において、細胞は、初代培養細胞、継代培養細胞、及び凍結細胞のいずれであってもよい。細胞の由来となる生物種は限定されず、例えば本発明の治療剤又は予防剤が投与されるのと同一の生物種であってよく、限定されるものではないが、哺乳動物、例えばヒト及びチンパンジー等の霊長類、ラット及びマウス等の実験動物、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、及びヤギ等の家畜動物、並びにイヌ及びネコ等の愛玩動物が挙げられ、例えばヒト又はマウス、好ましくはヒトである。

本明細書において、「治療」とは、既に症状を有する患者における疾患又はこれに伴う症状の完全若しくは部分的な治癒、軽減、又は進行の防止を含む。本明細書において、「予防」とは、疾患に罹患する可能性を有する患者における発症の抑制又は発症率の低減を含む。

本発明の治療剤又は予防剤に含まれるエクソソームの量（例えば治療及び／又は予防有効量）は、当業者であれば、被験体の性別、体重、年齢、並びに疾患等の経過及び症状等の種々の要因を考慮して適宜定めることができる。例えば、本発明の組成物に含まれるエクソソームの量は、限定するものではないが、例えば組成物が投与される被験体の体重１ｋｇ当たり、例えば約０．０００１～１００．０ｍｇ、約０．００１～１０ｍｇ、約０．０１～１．０ｍｇ又は約０．０５～２．０ｍｇであってよい。

本発明の組成物は、上記エクソソーム、又は治療及び／又は予防剤に加えて、他の成分、薬学的に許容可能な担体等の担体、例えば滅菌水、生理食塩水、緩衝剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、乳化剤、界面活性剤、安定化剤、滑沢剤、希釈剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、及び香料等を含んでもよい。本発明の組成物は、常法により製剤化され得る。製剤化は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（ＭｅｒｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．）に記載の方法を参照することができる。

投与形態は特に制限されず、必要に応じ適宜選択されるが、一般には錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤、及びエリキシル剤等の経口剤、又は注射剤、点滴剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、噴霧剤、貼付剤、及び軟膏剤等の非経口剤として投与され得る。

本発明の組成物の投与経路は限定しないが、例えば吸入、噴霧投与用、注射、点滴注入、経口、経皮、経鼻、経局所、経膣、又は経直腸により投与されてもよい。また、本発明の組成物は、吸入、噴霧投与、静脈注射、点滴注入、経口、経皮、気管内、経肺、経鼻、経局所、経膣、又は経直腸投与用に製剤化されているものであってよい。投与経路は適用疾患によって適宜選択することができ、例えば肺疾患であれば吸入又は噴霧投与とすることができる。

本発明の治療及び／又は予防剤又は組成物が投与され得る被験体としては、限定されるものではないが、哺乳動物、例えばヒト及びチンパンジー等の霊長類、ラット及びマウス等の実験動物、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、及びヤギ等の家畜動物、並びにイヌ及びネコ等の愛玩動物が挙げられ、例えばヒト又はマウス、好ましくはヒトである。

本明細書に記載のエクソソーム、治療及び／又は予防剤、又は組成物の投与量、投与間隔、及び投与期間は、当業者であれば、被験体の性別、体重、年齢、並びに疾患等の経過及び症状等の種々の要因を考慮して適宜定めることができる。例えば、エクソソーム、治療及び／又は予防剤、又は組成物の投与量は、例えば約０．０００１～１００．０ｍｇ／１ｋｇ体重、約０．００１～１０ｍｇ／１ｋｇ体重、約０．０１～１．０ｍｇ／１ｋｇ体重又は約０．０５～２．０ｍｇ／１ｋｇ体重であってよい。また、投与回数は、限定するものではないが、１日３回、１日２回、１日１回、２日に１回、３日に１回、１週間に１回、２週間に１回、１カ月に１回等であってよい。また、投与期間は、限定するものではないが、１日、２日、３日、１週間、２週間、１カ月、半年、一年、又はそれ以上であってよい。

一態様において、本発明は、本明細書に記載されたエクソソーム、又は、治療剤若しくは予防剤を対象に投与することを含む、線維化疾患、炎症疾患、及び老化疾患から選択される少なくとも１つの疾患の治療方法又は予防方法に関する。別の態様において、本発明は、線維化疾患、炎症疾患、及び老化疾患から選択される少なくとも1つの疾患の治療又は予防における使用のための、本明細書に記載のエクソソーム、又は、治療剤若しくは予防剤に関する。

以下に実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、これは本発明の範囲を限定するものではない。なお、本願明細書全体を通じて引用する文献は、参照によりその全体が本願明細書に組み込まれる。

（統計学的解析）
以下の実験はいずれも、少なくとも３回繰り返し、その結果を平均±ＳＥＭとして表した。解析は、３つの比較ではスチューデントｔ検定、３つ以上での比較はＡＮＯＶＡを用いた。Ｐｒｉｓｍｖｅｒｓｉｏｎ７（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を用い、ｐ値＜０．０５を統計学的有意差とした。

（実施例１）間葉系幹細胞からのエクソソームの回収
ヒトＭＳＣはＳＴＥＭＰＲＯＭＳＣＳＦＭ培地（ＴＨＥＲＭＯＦＩＳＨＥＲ社）によって培養し、必要な細胞数になった時点でサブコンフルエント状態に播種し直し同様の培地で４８時間培養し、合計２００ＭＬの培養液から培養上清を回収した。回収した培養上清を０．２２マイクロメータのフィルター（ＭＩＬＩＰＯＲＥ社）でろ過し、大きな粒子や細部破砕物を覗いた後、超遠心法（１００，０００ｘＧにて１時間遠心、ＢＥＣＫＭＡＮ社）によりＭＳＣから分泌されたエクソソームを回収、精製した。得られたエクソソームは、ナノパーティクル・トラッキングシステムであるナノサイト（ＮＡＮＯＳＩＧＨＴ社）によって、粒子系や粒子数を計測した。

（実施例２）ｉｎｖｉｔｒｏにおける筋繊維芽細胞分化抑制試験
患者の肺で生じるＣＯＰＤやＩＰＦのｉｎｖｉｔｒｏモデルとして、培養したヒト線維芽細胞にＴＧＦβを加えて、実験的に細胞の筋繊維芽細胞への分化を誘導した。ヒト初代肺線維芽細胞は、東京慈恵会医科大学附属病院内で肺切除組織から分離培養を行って得た。分離培養の方法は、既報の通りである（ＡｒａｙａＪ．ｅｔａｌ．，２００７，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１７，ｐｐ．３５５１～３５６２）。細胞は３７℃、５％ＣＯ₂にて、１０％の熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及びＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むＤＭＥＭ培地中で維持した。

線維芽細胞の培養開始から２４時間後に（Ａ）ＴＧＦβ（２ｎｇ／ｍＬ）、（Ｂ）ＴＧＦβ（２ｎｇ／ｍＬ）＋ＭＳＣ由来エクソソーム（１０μｇ／ｍＬ）、（Ｃ）ＴＧＦβ（２ｎｇ／ｍＬ）＋ピルフェニドン（ＰＤＦ）（１０μｇ／ｍＬ）を添加し、４８時間後にアルファＳＭＡの発現量（ｍＲＮＡ）を定量した。

その結果、ＭＳＣ由来エキソソーム（１０μｇ／ｍＬ）を添加することにより、アルファＳＭＡの発現量（ｍＲＮＡ）が減少し、線維化の程度が極めて優位に低下していた（図１）。その効果は、ＩＰＦの一般薬であるピルフェニドンよりも強かった。

（実施例３）動物モデルを用いた治療効果の評価

動物実験は、国立がん研究センター研究所の実験動物研究機関のガイドラインに従って実施した。８－１２週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、２．Ｕ／ｋｇのブレオマイシン（ＮｉｐｐｏｎＫａｙａｋｕＣｏ．、４２３４４００Ｄ４０３２）を５０μｌの生理食塩水に溶解し経気道的に投与した、肺線維化モデルマウスを作製して用いた。ＭＳＣから分泌されたエクソソーム１０μｇを、ブレオマイシン投与（Ｄａｙ０）の１週間後（Ｄａｙ７）及び更にその１週間後（Ｄａｙ１４）の２回、経気道投与した。２回目のエクソソームの投与の６日後（Ｄａｙ２０）にマウスを安楽死させ、Ｍａｓｓｏｎｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色により肺線維化スコアを測定した。エクソソーム非投与群、並びに、ブレオマイシン及びエクソソーム非投与群を対照とし、各群１０匹のマウスを使用した。投与スケジュールを図２に示す。

マウス肺を既報の通りにＭａｓｓｏｎｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色、並びにヘマトキシリン及びエオシン染色で評価した（ＫｏｂａｙａｓｈｉＫ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（２０１６）１９７（２），ｐｐ：５０４－１６）。また、Ｍａｓｓｏｎｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色の組織から、Ａｓｈｃｒｏｆｔ’ｓｍｅｔｈｏｄを用いてＡｓｈｃｒｏｆｔスコアを決定し、線維化を評価した。

結果を図３に示す。ＭＳＣ由来エクソソームの投与は、優位に肺の線維化を抑制した。

Claims

線維化疾患、炎症疾患、及び老化疾患の少なくとも１つの疾患の治療剤又は予防剤であって、間葉系幹細胞由来のエクソソームを含む、前記治療剤又は予防剤。
前記間葉系幹細胞が、骨髄、脂肪組織、臍帯、または末梢血から単離された細胞である、請求項１に記載の治療剤又は予防剤。
前記間葉系幹細胞が、多能性幹細胞、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞を含むから誘導された細胞である、請求項１に記載の治療剤又は予防剤。
前記間葉系幹細胞が、ヒト細胞である、請求項１～請求項３のいずれか１項に記載の治療剤又は予防剤。
前記疾患の疾患部位が肺である、請求項１～請求項４のいずれか１項に記載の治療剤又は予防剤。
前記疾患が、肺線維症、ＣＯＰＤ、気管支喘息、ＡＲＤＳ、急性呼吸窮迫症候群、肺高血圧症、放射性肺臓炎、肺サルコイドーシス、膠原病に伴う肺胞出血又は間質性肺炎からなる群から選択される、請求項５に記載の治療剤又は予防剤。
吸入剤である、請求項１～請求項６のいずれか１項に記載の治療剤又は予防剤。
気管内投与又は経肺投与されるための、請求項１～請求項７のいずれか１項に記載の治療剤又は予防剤。