KR100954138B1 - 지방조직 유래 줄기세포를 함유하는 알레르기 비염 또는천식 예방 및 치료제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 지방조직 유래 줄기세포(adipose tissue-derived stem cells, ADSCs)를 함유하는 알레르기 비염 또는 천식 예방 및 치료제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 알레르기 비염 및 천식 마우스를 이용한 동물실험에서 혈관에 주사한 지방조직 유래 줄기세포가 호산구성 염증을 억제하고 알레르기 증상을 호전시키며, 항원 특이적인 T 헬퍼 세포 유형 2(T helper cell type 2, Th2) 면역반응을 감소시킴으로써 면역 조절에 중요한 역할을 하여 알레르기 비염 또는 천식 예방 및 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

면역억제(Immunosuppression), 지방조직(Adipose tissue), 줄기세포(Stem cells), 알레르기 비염(Allergic rhinitis), 천식(Asthma)

Description

지방조직 유래 줄기세포를 함유하는 알레르기 비염 또는 천식 예방 및 치료제{An agent comprising adipose tissue―derived stem cells as effective ingredient for prevention and treatment of allergic rhinitis or asthma}

본 발명은 지방조직 유래 줄기세포를 함유하는 알레르기 비염 또는 천식 예방 및 치료제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명의 지방조직 유래 줄기세포는 호산구성 염증을 억제하고 알레르기 증상을 호전시키며, 항원 특이적인 Th2 면역반응을 감소시킴으로써 알레르기 비염 또는 천식 예방 및 치료제로 사용될 수 있음에 관한 것이다.

알레르기 비염은 가장 흔한 알레르기 질환이며 천식 및 부비동염과 연관이 있다(Settipane RA, et al., Clin Allergy Immunol 19:23-34, 2007; Blaiss MS. Allergy Asthma Proc 28:145-52, 2007). 알레르기 비염은 점차 증가하고 있으며 생활의 질에 영향을 주고 생산능력의 감소와 치료비 부담의 증가로 인해 사회 경제적으로 문제가 되고 있으나 뚜렷한 치료법은 아직 없다. 약물요법은 알레르기 비 염의 기본적인 치료지만 약제 중단 시 재발이 흔하고 심각한 부작용을 일으킬 수 있으며, 면역요법은 유일하게 변형된 면역체계를 원상회복시키는 근본치료가 될 수 있지만 수년간의 치료가 필요하고 과민반응과 비용이 문제가 될 수 있다(Wheeler AW, et al., Expert Rev Vaccines 5:27-31, 2006).

천식은 환자의 유전적인 요인과 환경적인 요인의 상호작용에 의해 발생하는 복합유전질환이다. 환경적인 요인의 대표적인 예로 원인 알레르겐의 노출에 의한 알레르기반응이 중요하며, 최근 들어 우리나라 국민의 생활양식의 서구화로 인해 원인 알레르겐의 증가함에 따라 기관지천식의 유병률이 지속적으로 증가하고 있다(Kim YK, et al. Clin Exp Allergy. 32:1706-12, 2002). 천식은 호흡곤란, 기침 등의 증상을 유발하여 삶의 질을 떨어뜨리고 학습, 일 및 작업에 대한 능률을 떨어뜨리며, 생산성의 감소를 유발하여 사회경제적으로 중요한 문제가 되고 있다. 최근 면역학 및 분자유전학의 발전에 따라 기관지천식의 병태생리에 대한 이해와 이에 따른 새로운 치료제의 개발에도 불구하고 기관지천식으로 인한 유병률은 증가하고 있는 실정이다. 특히, 기존의 치료약제로 사용되는 스테로이드제 또는 기관지확장제는 질병의 근본적인 치유가 아닌 증상의 조절 및 예방을 위한 약제로 평생 사용해야 하고 이로 인해 개인 및 사회의 경제적 부담은 상당하다.

골수에서 유래한 중간엽 줄기세포(Mesenchymal stem cells, MSCs)는 생체 내(in vivo) 및 생체 외(in vitro)에서 중간엽 계통의 여러 가지 세포, 즉 골, 연 골, 지방조직 또는 근육으로 분화할 수 있다(Prockop DJ. Science 276:71-4, 1997; Pittenger MF, et al. Science 284:143-7, 1999). MSCs는 여러 문헌에서 골형성 부전증, 심근 경색, 폐 손상 및 뇌 경색 등 손상된 조직의 재생에 유용하다고 보고된 바 있으며, 현재 여러 연구들에서 MSCs의 분화능 및 재생능을 이용하여 치료제로 사용하려는 시도가 이루어지고 있다(Horwitz EM, et al. Blood 97:1227-31, 2001; Shake JG, et al. Ann Thorac Surg 73:1919-26, 2002; Rojas M, et al. Am J Respir Cell Mol Biol 33:145-52, 2005; Li Y, et al. Neurology 59:514-23, 2002). MSCs는 분화능을 가질 뿐만 아니라 면역억제효과도 가지고 있는데, 동종간의 이식(allogeneic transplantation)에서 이식편대숙주병(graft-versus-host disease)의 발생과 중증도를 감소시킨다고 보고되었다(Le Blanc K, et al. Lancet 363:1439-41, 2004). 또한, MSCs는 T세포, B세포 및 NK세포(natural killer cell)의 기능을 억제하고 수상돌기세포(dendritic cells)의 기능에도 영향을 줄 수 있다(Di Nicola M, et al. Blood 99:3838-43, 2002; Jiang XX, et al. Blood 105:4120-6, 2005; Corcione A, et al. Blood 107:367-72, 2006).

지방조직 유래 줄기세포(adipose tissue-derived stem cells, ADSCs)는 골수에서 유래한 중간엽 줄기세포와 유사한 표현형을 보이며(Lee RH, et al. Cell Physiol Biochem 14:311-24, 2004), 여러 가지 세포로 분화가 가능하고 생체 외에서 면역억제 효과를 보인다고 알려져 있다(Puissant B, et al. Br J Haematol 129:118-29, 2005). 또한, ADSCs는 동종 간의 면역 반응에 의해 유도된 수상돌기세포 및 T세포에서 사이토카인의 분비를 변화시키고, 생체 외에서 활성화된 T세포 및 B세포에 면역억제효과를 보인다고 알려져 있다(Aggarwal S, et al., Blood 105;1815-22, 2005). 이전의 연구는 ADSCs가 미토겐(mitogen)에 반응하여 혼합 림프구 반응(mixed lymphocyte reaction) 및 림프구 증식 반응을 억제하여 면역억제효과를 보인다고 하였다(Puissant B, et al., Br J Haematol 129:118-29, 2005). 또한, ADSCs는 동종 간의 면역 반응에 의해 유도된 수상돌기세포 및 T세포에서 사이토카인의 분비를 변화시키고, 생체 외에서 활성화된 T세포 및 B세포에 면역억제효과를 보인다고 알려져 있다(Aggarwal S, et al., Blood 105:1815-22, 2005).

줄기세포는 자가 재생과 여러 가지 세포로 분화가 가능한 능력을 가지고 있다. ADSCs도 자가 재생 능력을 보이며, 중간엽에서 발생하는 연골세포(chondrocytes), 지방세포(adipocytes), 조골세포(osteoblasts), 근세포(myocytes) 또는 내피세포(endothelial cells) 등 여러 가지 세포로 분화가 가능하다(Gimble JM, et al., Circ Res 100:1249-60, 2007; Seo MJ, et al., Biochem Biophys Res Commun 328:258-64, 2005). 이전의 연구는 ADSCs가 미토겐(mitogen)에 반응하여 혼합 림프구 반응(mixed lymphocyte reaction)과 림프구 증식 반응을 억제하여 면역억제효과를 보인다고 하였다(Puissant B, et al., Br J Haematol 129:118-29, 2005). ADSCs는 골수에서 유래한 중간엽 줄기세포와 동일하게 손상된 조직의 재생과 면역억제효과를 보이면서 골수에서 유래한 중간엽 줄기세포에 비해 풍부한 양을 쉽게 얻을 수 있기 때문에 많은 장점을 가지고 있다. ADSC는 골수 유래 중간엽 줄기세포(Bone-Marrow derived mesenchymal Stem Cells, BMSC)와 유사한 마커 발현을 보이고, CD29, CD44, CD90, CD105양성, HLA-DR 및 c-kit 발현에 음성을 보인다. 적절한 조건에서 ADSC 및 BMSC 모두 조골세포(osteoblast), 지질세포(adipocyte), 연골 계통(chondrogeic lineages)으로 분화가 가능하나, ADSC가 BMSC에 비해 증식능을 유지하는 것이 더 우수하고, 마이크로어레이에서 다른 유전자의 발현을 보인다(Lee RH, et al., Cell Physiol Biochem 14:311-24;2004).

알레르기 질환의 면역학적 발생기전은 주로 “hygiene hypothesis(위생가설, Th1/Th2 반응의 불균형)”로 설명하고 있다. 정상적으로 Th1 반응과 Th2 반응은 서로 길항작용을 하면서 균형을 유지하고 있지만, 기관지천식을 포함하는 알레르기 질환이 발생하기 위해서는 Th1 반응이 감소되고, Th2 반응이 항진되는 면역체계의 불균형이 발생하는 것이 핵심적인 요인이라고 설명하고 있다(Mosmann TR, et al., J Immunol . 136:2348-57.1986). 알레르기 비염과 천식과 같은 알레르기 질환에서는 IL-4, IL-5, IL-13에 의한 비정상적인 Th2 면역반응으로 호산구성 염증을 초래한다. 호산구 염증에서 Th1과 Th2 사이토카인은 서로 길항작용을 하며, 선택적인 Th2 반응의 억제가 알레르기 염증을 억제하는데 중요하다고 할 수 있다(Wilson MS, et al., J Exp Med 202:1199-212, 2005; Park Y, et al. J Allergy Clin Immunol 108:570-6, 2001).

Th1 세포와 Th2 세포로의 분화를 결정하는 인자로는 항원제시세포와 T 세포와의 상호작용, 노출된 항원의 양, 사이토카인의 분비 양상 등 여러 요인이 있는 데, 이 중 사이토카인은 Th1/Th2 반응을 결정하는 핵심적인 역할을 담당한다. Th2 반응을 증가시키는 대표적인 사이토카인은 IL-4가 있으며, Th1 반응을 증가시키는 사이토카인으로는 IL-12가 알려져 있다. 천식에서 Th2 세포 매개에 의한 염증이 증가된다는 것은 여러 연구에서 밝혀졌는데, 천식 환자의 기관지폐포 세척액에서 Th2 세포에서 분비되는 IL-3, 4, 5의 mRNA가 정상인보다 증가되어있으며(Robinson DS, et al., N Engl J Med 326:298-304, 1992), IL-5의 농도도 다른 폐질환에 비해 높았다(Walker C, et al., Am J Respir Crit Care Med 150:1038-48, 1994). 호산구는 IL-3, 5, GM-CSF에 의해 조절되어 생산되며, 기도상피세포의 손상에 관여하며 기도과민성을 증가시키며 비만세포의 탈과립화를 유발하여 천식 발병에 중요한 역할을 한다. 또한 호산구에서 분비되는 류코트리엔(leukotriene)은 기도수축, 혈관투과성을 증가시킨다.

기존의 많은 연구들은 ADSC가 골수 유래 중간엽 줄기세포(Bone-Marrow derived mesenchymal Stem Cells, BMSC)와 유사한 표현형을 가지고 분화능이 있다는 것을 보여주어 BMSC를 대체할 소스가 된다는 것을 보여주고 있으며, BMSC와 비교하였을 때의 가장 큰 장점은 접근성이 용이하여 쉽게 얻을 수 있으며, 양적으로 풍부하다는 것입니다.

최근 알레르기 비염과 천식이 Th2 세포에 의한 염증성 질환임이 알려진 후 스테로이드 등의 항염증제가 약물치료의 중심이 되고 있다. 하지만, 근본적인 치료를 위해서는 기존의 항염증제나 기관지확장제로는 부족하며 알레르겐에 대한 면역반응과 면역세포에서 분비되는 사이토카인에 의한 만성염증을 조절하는 새로운 치료제가 필요하다고 하겠다. ADSCs가 이식편대숙주병(Graft versus Host Disease, GVHD) 모델에서 면역억제효과를 보여 발생과 중증도를 감소시킨다는 보고는 있지만, Th2 면역반응에 의한 알레르기 질환에서 이를 규명한 연구는 아직 발표된 적이 없다.

이에 본 연구에서는 마우스 지방조직에서 중간엽 줄기세포를 분리하여 배양한 후, 이를 알레르기 비염과 천식의 마우스 모델에 정맥으로 주사하여 상기 줄기세포가 면역조절 효과와 항염증 효과가 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 지방조직 유래 줄기세포(adipose tissue-derived stem cells, ADSCs)를 함유하는 알레르기 비염 또는 천식 예방 및 치료제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 지방조직 유래 줄기세포(adipose tissue-derived stem cells, ADSCs)를 함유하는 알레르기 비염 예방 및 치료제를 제공한다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 지방조직 유래 줄기세포을 알레르기 비염에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 알레르기 비염 치료방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 지방조직 유래 줄기세포을 알레르기 비염에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 알레르기 비염 예방방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 지방조직 유래 줄기세포를 함유하는 알레르기 천식 예방 및 치료제를 제공한다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 지방조직 유래 줄기세포을 알레르기 천식에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 알레르기 천식 치료방법을 제공 한다.

아울러, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 지방조직 유래 줄기세포을 알레르기 천식에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 알레르기 천식 예방방법을 제공한다.

본 발명의 지방조직 유래 줄기세포는 비강 점막 및 폐에 정착하여 호산구의 침윤을 억제하고 알레르기 증상을 호전시키며, 항원에 특이적인 Th2 반응을 억제하여 면역 조절에 중요한 역할을 함으로써 알레르기 비염 또는 천식 예방 및 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 지방조직 유래 줄기세포(adipose tissue-derived stem cells, ADSCs)를 함유하는 알레르기 비염 예방 및 치료제를 제공한다.

본 발명자들은 ADSCs의 알레르기 비염 및 천식에 대한 영향을 알아보기 위해, 마우스의 복부 지방에서 지방조직을 채취하여 ADSCs를 세포의 잔해로부터 분리한 후 배양하였고, 유세포 측정법 및 다분화능 평가 실험을 통해서 확인한 후, 난알부민(ovalbumin, OVA)을 이용하여 감작시키는 방식으로 알레르기 비염 및 천식 마우스 모델을 제조하였다(Wilson MS, et al., J Exp Med 202: 1199-212, 2005; Park Y, et al. J Allergy Clin Immunol 108: 570-6, 2001).

본 발명자들은 지방조직 유래 줄기세포가 비강 점막과 폐에 정착되는지 알아보기 위해, 알레르기 비염 및 천식 마우스에서 형광 표지자를 부착한 ADSCs를 정맥으로 투여한 후 OVA로 감작 및 분무하였다. 비강 점막과 폐를 각각 채취한 후 형광현미경으로 관찰한 결과, ADSCs가 항원을 투여하지 않은 대조군에 비해 알레르기 비염 및 천식 유발군의 비강 점막과 폐에서 더 많이 발견되었다. 따라서 알레르기 비염 및 천식 마우스에서 정맥으로 투여한 ADSCs가 비강 점막과 폐에 정착하고(도 5 참조), 알레르겐(allergen)에 대한 면역반응이 비강점막에서 ADSCs의 증폭을 초래하는 중요한 환경을 제공한다는 것을 알 수 있다(Gimble JM, et al., Circ Res 100: 1249-60, 2007).

본 발명자들은 ADSCs가 알레르기 비염의 증상에 대하여 미치는 영향을 알아보기 위해, 알레르기 비염 및 천식 마우스에서 OVA로 분무하는 중 재채기와 코를 비비는 동작의 숫자를 기록하여 비교하였다. 상기 결과, 재채기와 코를 비비는 동작을 합한 증상 점수의 평균은 항원을 투여하지 않은 대조군에 비해 알레르기 비염 및 천식 유발군에서 의미있게 증가하였고, 상기 알레르기 비염 및 천식 유발군에 비해 ADSCs이 투여된 알레르기 비염 및 천식 유발군에서 유의하게 감소하였다(도 6 참조). 따라서 본 발명의 ADSCs는 알레르기 비염의 증상을 감소시킬 수 있음을 알 수 있다.

본 발명자들은 ADSCs가 비강 점막 및 기관지의 호산구성 염증에 미치는 영향 을 알아보기 위해, 알레르기 비염 및 천식 마우스에서 채취한 비강 점막과 폐 조직 절편을 고정 및 염색 후 광학현미경하에서 관찰하였다. 상기 결과, 항원을 투여하지 않은 대조군에서는 비강점막에 염증세포의 침윤이 전혀 관찰되지 않았으나, 알레르기 비염 및 천식 유발군의 점막에서는 염증세포 특히 호산구의 침윤이 증가하였고, 상기 호산구의 침윤은 ADSCs 투여에 의해 감소되었고(도 7 및 도 8 참조), 폐 조직에서도 소기관지와 혈관주위의 염증세포, 특히 호산구의 침윤이 ADSCs를 투여한 경우, 현저히 감소되었음을 확인할 수 있었다(도 9 참조). 호흡기에서 알레르기 염증의 조직학적 변화는 점액선(mucous gland)의 증가와 호산구의 침윤이 특징이라고 할 수 있다(Wilson MS, et al., J Exp Med 202:1199-212, 2005). 따라서 ADSCs가 알레르기 비염 및 천식에서 비강점막의 호산구 염증을 억제한다는 것을 의미한다고 할 수 있다.

본 발명자들은 ADSCs가 기도의 염증에 미치는 영향을 알아보기 위해, 알레르기 비염 및 천식 마우스에서 기관지폐포세척술을 시행하였다. 기관지폐포세척액의 총세포수 및 대식세포의 수가 OVA 항원을 투여한 천식 유발군에 비해 ADSCs를 투여한 천식 유발군에서 감소되어 있었으며, 특히 호산구의 수가 유의하게 감소되었다(도 10 참조). 기관지폐포세척액내의 사이토카인 농도를 측정하였을 때, ADSCs를 투여한 천식 유발군에서 ADSCs를 투여하지 않은 천식 유발군에 비해 IL-4, IL-5의 농도가 감소되어 ADSCs를 정맥으로 주사하여 투여하였을 때, 표적기관인 기도의 Th2 면역반응이 감소됨을 알 수 있었다(도 11 참조).

본 발명자들은 ADSCs가 T 헬퍼 세포 유형 2(T helper cell type 2, Th2) 면 역반응에 미치는 영향을 알아보기 위해, 알레르기 비염 및 천식 마우스에서 OVA 분무 후 흉곽을 절개하고 좌심실을 천자하여 혈청을 얻은 후, Th2 면역반응과 관계된 OVA 특이 IgE, IgG1 항체와 Th1 면역반응과 관계된 OVA 특이 IgG2 항체를 ELISA 방법을 사용하여 측정하였다. 상기 결과, 항원을 투여하지 않은 대조군에 비해 OVA 항원을 투여한 알레르기 비염 및 천식 유발군의 OVA 특이 IgE, IgG1 및 IgG2a 항체농도는 유의하게 증가하였다. 또한, ADSCs이 투여된 알레르기 비염 및 천식 유발군에서 OVA 특이 IgE 농도는 유의하게 감소하고, IgG2a 농도는 유의하게 증가하였으나 IgG1 농도는 의미있는 차이를 보이지 않았다. 따라서 비강 점막에 의해 정착된 ADSCs가 Th2 면역반응을 억제한다는 것을 알 수 있다(도 12 참조).

본 발명자들은 ADSCs가 T 헬퍼 세포 유형 2(T helper cell type 2, Th2) 면역반응에 미치는 영향을 알아보기 위해, 알레르기 비염 및 천식 마우스에서 OVA 분무 후 비장 세포의 부유물을 배양하여 비장 상층액에서 IL-4, IL-5, IL-10 및 IFN-γ 농도를 ELISA 방법으로 측정하였다. 상기 결과, 비장의 상층액에서 IL-4 및 IL-5의 농도는 항원을 투여하지 않은 대조군에 비해 OVA 항원을 투여한 알레르기 비염 및 천식 유발군에서 유의하게 증가하였으므로 비강점막과 폐에서 알레르기 염증은 Th2 사이토카인에 의해 잘 유발된다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, ADSCs이 투여된 알레르기 비염 및 천식 유발군에서 유의하게 감소하였고 IFN-γ 농도는 알레르기 비염 및 천식 유발군에 비해 ADSCs이 투여된 알레르기 비염 및 천식 유발군에서 유의하게 증가하였으나 IL-10의 농도는 의미있는 차이를 보이지 않았다. 따라서 ADSCs가 Th2 면역반응을 Th1 면역반응으로 전환시키는 것을 의미한다고 할 수 있다(도 13 참조).

본 발명의 치료제는 ADSCs에 약학적으로 허용가능한 염을 첨가할 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 염은 유리산(free acid)에 의해 형성된 부가염이 유용하다. 적합한 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산 및 인산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 구연산(citric acid), 초산, 젖산, 주석산(tartariac acid), 말레인산, 푸마르산(fumaric acid), 포름산, 프로피온산(propionic acid), 옥살산, 트리플루오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산 또는 아스파르트산 등을 사용할 수 있다. 나아가, 약학적으로 허용가능한 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 조제될 수 있는 모든 염, 수화물 및 용매화물을 모두 포함할 수 있다.

본 발명의 치료제는 임상 투여 시에 흡입, 분무 및 주사 등과 같은 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 치료제는 실제 임상 투여 시에 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제와 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로 는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤 및 젤라틴 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 치료제는 비경구 투여시 주사제, 분무제, 흡입제 및 비강 투여용 조성물 등을 이용할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 방법을 실시하는데 있어서, 투여될 치료제의 양에 영향을 미치는 인자들로는, 이에 한정되는 것은 아니지만 투여 방식, 투여 빈도, 치료가 진행 중인 특정 질병, 질병의 심각성, 질병의 병력, 개체가 다른 치료제와 함께 협력 치료법이 진행중인 지의 여부, 및 치료가 진행중인 개체의 연령, 키, 체중, 건강, 및 신체 조건을 포함한다. 일반적으로 치료가 진행중인 환자의 체중이 증가할수록 이 제제를 더 많은 양으로 투약하는 것이 바람직하다.

본 발명의 치료제는 환자에게서 면역반응을 자극하기에 효과적인 양으로 투여할 수 있다. 예를 들어, 인간에게 일 회 내지 수회로 투여될 수 있고, 투여량은 세포 수가 2×10³ 개/kg ~ 2×10⁹개/kg인 것이 바람직하고, 2×10⁵ 개/kg ~ 2×10⁷ 개/kg인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 알레르기 비염 및 천식 마우스 모델의 제조

<1-1> 동물의 준비

8주령의 암컷 BALB/c 마우스를 효창사이언스(Daegu, Korea)에서 구입하여 통상적인 실험환경에서 사육하였다. 동물 실험에 관한 연구 계획은 부산대학교병원의 동물 윤리 심의 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)에 의해 승인받았다.

<1-2> 알레르기 비염 및 천식 유발

마우스는 난알부민(ovalbumin, OVA, Sigma, St. Louis, MO)과 수산화 알루미늄(aluminum hydroxide)(Alum, Pierce Chemical Co., Rockford, IL)을 이용하여 감작시켰다. 실험 제 1일 및 14일에 1 mg의 수산화 알루미늄(aluminum hydroxide)에 녹인 OVA 25 μg(전체 용량 200 μl)을 마우스의 복강 내로 주사하여 감작시켰다(Wilson MS, et al., J Exp Med 202: 1199-212, 2005; Park Y, et al. J Allergy Clin Immunol 108: 570-6, 2001). 21 ~ 23일째 초음파 분무기(NE-U12, Omron, Japan)를 이용하여 인신완충식염수(phosphate-buffered saline, PBS)에 녹인 5% 난알부민을 실험동물의 코에 분무하여 알레르기 비염 및 천식 마우스 모델을 제작하였다(도 1 참조).

< 실시예 2> ADSCs 의 제조

<2-1> ADSCs 의 분리 및 배양

지방조직은 마우스의 복부 지방에서 채취하였다. ADSCs를 분리하기 위하여, 지방조직을 동일한 양의 PBS로 씻은 후 37℃에서 30분간 0.075% 콜라게나제 유형 Ⅰ(collagenase type I)(Sigma, St. Louis, MO)을 처리한 후 10% 우태혈청(fetal bovine serum, FBS)을 포함하는 α-MEM(α-modified Eagle's medium)으로 중화하고 1200rpm에서 10분간 원심분리하였다. 세포의 잔해를 제거하기 위해 침전물을 100 ㎛ 나일론 망사에 통과시키고 조건 배지(α-MEM, 10% FBS, 100 unit/ml의 페니실린(penicillin), 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신(streptomycin))하에 37℃/5% CO₂ 환경에서 하루 밤 동안 배양하였다. 배양 후 남아 있는 부착되지 않은 적혈구를 제거하기 위해 PBS로 씻은 후 조건 배지 하에 37℃/5% CO₂ 환경에서 1주일 정도 배양 한 후 단층의 유착된 세포가 합쳐지면 세포를 0.05% 트립신(trypsin)(Sigma, St. Louis, MO)으로 처리하고 10% FBS가 포함된 α-MEM 배지에 띄운 후 2,000 cells/㎠ 의 농도로 2차 배양하였다.

<2-2> ADSCs 의 확인

배양한 세포의 표현형을 평가하기 위해 anti-CD44, anti-CD105, anti-CD34 및 anti-CD31 항체로 염색한 후 FACScan argon laser cytometer(Becton Dickson, San Jose, CA)을 이용하여 발현을 분석하였다. 그 결과, 배양세포의 표현형은 CD44는 99.46%, CD105는 98.03%, CD34는 1.90% 및 CD31은 4.99%가 발현됨을 확인하였다(도 2 참조). 따라서, 상기 배양세포가 ADSCs임을 알 수 있었다.

또한, ADSCs의 다분화능 평가 실험을 위해, 지방세포로의 분화는 ADSC를 adipogenic Medium (10% FBS, 1 uM dexamethasone, 100 ug/mL 3-isobutyl-1-methylxanthine, 5 ug/mL insulin, and 60 uM indomethacin in α-MEM) 배지에 1 ~ 2주간 배양한 후 Oil Red O 염색을 시행하여 세포내지질의 축적을 관찰하였고, 골세포로의 분화는 ADSC를 골원성 배양(osteogenic Medium)(10% FBS, 0.1mM dexamethasone, 10 uM β-glycerophosphate, and 50 ㎍/mL ascorbic acid in α-MEM)에서 2 ~ 3주간 배양한 후 알리자린 레드(alizarin red) 염색을 시행하여 세포외기질의 석회화를 관찰함으로써 평가하였다. 그 결과, ADSCs는 각각 2주 또는 3주 후 지방세포 또는 골세포로의 분화를 확인하였다(도 3 및 도 4 참조).

< 실시예 3> 알레르기 비염 및 천식 마우스에 ADSCs 의 투여

37℃ 환경에서 5분간 Try-EDTA로 ADSCs를 배양한 후 ADSCs를 PBS로 씻은 후 세포에 형광 표지자(Cell Tracker^TMCM-Dil) 2μM을 부착하고 다시 37℃ 환경에서 5분간 배양한 후 4℃에서 15분간 추가로 더 배양하였다. 지방조직 유래 줄기세포의 효과를 알기 위해 OVA를 분무하기 3일 전부터 매일 2×10⁶ cells/ml의 줄기세포를 꼬리 정맥에 주사하였다(도 1 참조). 본 실험은 각 그룹당 5마리씩 크게 하기와 같이 3 그룹으로 구분하였다. 대조군은 PBS로 감작하고 코에 분무하였지만 ADSCs를 투여한 그룹이고, OVA군은 OVA로 감작하고 코에 분무하여 알레르기 비염 및 천식을 만든 후 PBS를 투여한 그룹이며, OVA+ADSCs군은 OVA로 감작하고 코에 분무하여 알레르기 비염 및 천식을 만든 후 ADSCs를 투여한 그룹이다.

< 실험예 1> ADSCs 의 비강 점막과 폐에 정착에 대한 확인

OVA로 2번 감작한 후 OVA를 분무하기 전에 형광 표지자(Cell Tracker^TMCM-Dil(레드), Moleculer Proves, USA)를 부착한 ADSCs를 정맥으로 투여하였다. 마지막 OVA 분무 후 48시간에 케타민 하이드로클로라이드(ketamine hydrochloride)(1mg/kg) 및 자일라진(xylazine)(0.5 mg/kg)을 복강 내 주사하여 마우스를 희생하였다. 비강 점막과 폐를 채취한 후 -20°C에서 7 μm의 두께로 자른 후 형광현미경으로 비강 점막과 폐를 관찰하였다.

그 결과, 면역 형광염색에서 붉은 색의 형광표지자 양성의 ADSCs가 대조군에 비해 OVA군의 비강 점막과 폐에서 더 많이 발견되었다. 따라서 알레르기 비염 및 천식 마우스에서 정맥으로 투여한 ADSCs가 비강 점막과 폐에 정착됨을 알 수 있다(도 5 참조).

< 실험예 2> 알레르기 비염 증상의 측정

OVA로 분무하는 중 마지막 15분간 마우스의 재채기와 코를 비비는 동작의 숫자를 실험 과정을 모르는 3명의 관찰자에 의해 기록하여 각 군별로 서로 비교하였다. 측정치는 unpaired t test를 이용하여 통계분석을 실시하였고, 그 결과는 SPSS software package version 12.0(SPSS Inc., Chicago, IL)을 이용하였으며, p<0.05를 통계학적으로 의미있다고 하였다. 이하, 실험예의 통계학적 분석은 상기 방법과 동일하게 실시하였다.

그 결과, 재채기와 코를 비비는 동작을 합한 증상 점수의 평균은 대조군에 비해 OVA군에서 의미있게 증가되었고(p<0.001), OVA군에 비해 OVA+ADSCs군에서 유의하게 감소되었다(p=0.009)(도 6 참조).

<실험예 3> 기관지폐포세척액내 사이토카인 농도 측정

OVA 유발 48시간 후 케타민과 xylazine을 마우스 복강 내로 투여하여 마취하였다. 마우스를 해부대에 고정시킨 후, 흉부를 절개하고 기관을 노출시켜 카테터를 삽입한 뒤 결찰하였다. 무균성 생리식염수로 0.75씩 2회 주입하여 기관지폐포세척을 시행하였는데, 개흉한 부위로 폐가 팽창되는 것을 관찰하며 과팽창되지 않도록 하고 부드럽게 세척하며 얻어지는 기관지폐포세척액의 부피는 약 1.5 ml이 되도록 2회 세척하였다. 기관지폐포세척액을 섭씨 4도에서 1000 rpm으로 5분간 원심분리한 뒤 상층액은 사이토카인의 측정을 위해 분리한 뒤, FBS-IMDM 2 ml 을 넣어서 부유시키고 세포수를 측정한 다음 사이토스핀(cytospin)을 시행하여 슬라이드에 도말하고 Diff Quick 염색을 시행하여 광학현미경 1000배 시야에서 최소한 300개 이상의 염증세포를 관찰하여 호산구, 대식세포, 중성구 및 림프구로 분류하여 세포의 분율을 평가하였다. 기관지폐포세척액의 상층액에서 IL-4, IL-5 및 TGF-β의 농도를 ELISA법을 이용하여 측정하였다.

그 결과, 기관지폐포세척액내 세포수는 OVA군에 비해 ADSCs 치료군에서 유의하게 감소되었으며, 특히 호산구수가 현저히 감소되었다(p< 0.05)(도 10 참조). 기관지폐포세척액내의 IL-4, IL-5 및 TGF-β의 농도는 OVA군에 비해 ADSC 치료군(OVA+ADSCs)에서 유의하게 감소되었다(각각 p=0.018, p=0.012 및 p=0.039)(도 11 참조).

<실험예 4> 조직학적 검사 및 비강 점막에서 호산구 측정

마우스를 희생한 후 채취한 비강 점막을 10% 중화된 포르말린에 담근 후 실온에서 24시간 동안 조직고정을 하고 파라핀 블록을 제작하였다. 4 μm로 조직 절편을 만들어 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin) 염색을 하여 400배 광학현미경하에서 관찰하였다. 호산구의 측정은 실험 과정을 모르는 두 명의 관찰자가 임의로 선정한 5군데 시야에서 한 시야 전체에 침윤된 모든 호산구의 수를 측정하여 각 군별로 서로 비교하였다.

그 결과, 대조군에서는 비강점막에 염증세포의 침윤이 전혀 관찰되지 않았으며, OVA 항원을 투여한 알레르기 비염 및 천식 마우스의 비강 점막에서는 염증세포 특히 호산구의 침윤이 증가하였다. 호산구의 침윤은 OVA군에 비해 OVA+ADSCs군에서 유의하게 감소되었으며(p=0.01), ADSCs 투여는 비강 점막의 알레르기 염증의 발생을 억제하였다(도 7 및 도 8 참조).

<실험예 5> 기도 병리조직 검사

기관지폐포세척이 끝나고 카테터를 통하여 10% 포르말린 용액을 넣은 다음 기관을 자르고 폐와 심장을 같이 제거한 후 이를 10% 포르말린이 들어 있는 통에 넣어 고정하였다. 이후 파라핀으로 포매(embedding)한 다음 3 mm의 두께로 절편을 만들어 헤마톡실린-에오신(hematoxylin-eosin)으로 염색하여 조직소견을 평가하였다. 그 결과, 기도조직검사에서 OVA군에 비해 OVA+ADSCs군에서 현저하게 혈관주위 및 기도주위의 염증이 감소되었다(도 9 참조).

< 실시예 6> 혈청 내 OVA 특이 IgE 및 IgG 측정

OVA 분무 후 48시간에 흉곽을 절개하고 좌심실을 천자하여 혈액 2 ~ 3 ml를 채취하고 원심분리를 통해 혈청을 얻었다. T 헬퍼 세포 유형 2(T helper cell type 2, Th2) 면역반응과 관계된 OVA 특이 IgE, IgG1 항체와 Th1 면역반응과 관계된 OVA 특이 IgG2 항체를 ELISA 방법을 사용하여 측정하였다. 96 웰 마이크로타이터 플레이트(well microtiter plate)(Nunc Maxisorb, Roskilde, Denmark)를 PBS(pH 9.8)로 녹인 100 μl/well OVA로 코팅(coating) 후 4°C에서 하룻밤 동안 유치(incubation)시키고 실온에서 1시간 동안 웰을 블로킹 완충용액(blocking buffer)(4% BSA in PBS)로 블로킹(blocking)시켰다. 단계적으로 희석된 각각의 혈청 100 μl/well을 각 웰에 넣은 다음 실온에서 2시간 동안 반응시키고 0.1% PBS-Tween 20 버퍼 용액으로 씻은 후 HRP-결합된 항 마우스 IgE(horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse IgE)(Pharmingen, Hamburg, Germany)(1:4000), IgG1(1:5000) 또는 IgG2a(1:5000)를 각 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. PBS-T로 씻고 모든 웰을 100 μl 테트라메틸 벤지딘(tetramethyl benzidine)(Sigma, St. Louis, MO)으로 추가 반응시킨 후 흡광도(absorbance) 450nm에서 ELISA 플레이트 리더기(plate reader)(Molecular Devices, Sunnyvale, California)로 측정하였다.

그 결과, OVA 항원을 투여한 OVA군의 OVA 특이 IgE, IgG1 및 IgG2a 항체농도는 항체가 거의 검출되지 않는 대조군에 비해 유의하게 증가하였다(각각 p=0.002, p<0.001). OVA 특이 IgE 농도는 OVA+ADSCs군에서 유의하게 감소하였으며(p=0.039), IgG2a 농도는 OVA+ADSCs군에서 유의하게 증가하였다(p=0.01). IgG1 농도는 OVA군과 OVA+ADSCs군 간에 유의한 차이를 보이지 않았다. Th2 면역반응의 우위를 의미하는 IgG1/IgG2a 비율은 OVA군에서 대조군에 비해 유의하게 증가하였다가(p<0.001), OVA+ADSCs군에서 의미있게 감소하였다(p<0.001). 따라서 ADSCs가 Th2 면역반응을 억제한다고 할 수 있다(도 12 참조).

< 실시예 7> 비장에서 사이토카인의 발현 분석

마지막 OVA 분무 후 48시간에 비장을 제거하고 3ml 배양 용액이 담겨 있는 접시로 옮긴 후 비장을 압박하여 잘게 부수었다. 적혈구가 없는 비장 세포의 부유물을 96 웰 컬쳐 플레이트(well culture plate)에 2×10⁵ cells/well의 농도로 투입한 후 100 ng/ml의 OVA와 함께 10% FBS, 2 mM 글루타민(glutamine), 1 mM 피루브산나트륨(sodium pyruvate)과 항생제가 첨가된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 48 시간 배양 후 비장 상층액에서 IL-4, IL-5, IL-10 및 IFN-γ 농도를 각각 sandwich ELISA(R&D system, Minneapolis, MN) 방법으로 측정하였다.

그 결과, 비장의 상층액에서 IL-4 및 IL-5의 농도는 OVA군에서 대조군에 비해 유의하게 증가하였으며(각각 p=0.02, p=0.042), OVA+ADSCs군에서 의미있게 감소하였다(각각 p=0.03, p=0.046). 반대로 IFN-γ 농도는 OVA+ADSCs군에서 OVA군에 비해 의미있게 증가하였다(p=0.004). IL-10의 농도는 OVA+ADSCs군과 OVA군간에 의미있는 차이를 보이지 않았다. 따라서 ADSCs가 Th2 면역반응을 Th1 면역반응으로 전환시키는 것을 의미한다고 할 수 있다(도 13 참조).

도 1은 알레르기 비염 및 천식 마우스 모델의 제조과정을 나타내는 그림이고,

도 2는 지방조직 유래 줄기세포의 표현형을 평가하기 위해, 유세포측정법을 이용하여 발현을 분석한 결과를 나타내는 그래프이고,

도 3은 지방조직 유래 줄기세포의 지방세포로의 분화를 나타내는 그림이고,

도 4는 지방조직 유래 줄기세포의 골세포로의 분화를 나타내는 그림이고,

도 5는 알레르기 비염 및 천식 마우스의 비강 점막 및 폐에 정착된 지방조직 유래 줄기세포를 형광현미경(배율×200)으로 관찰한 결과를 나타내는 그림이고:

A: 알레르기 비염 및 천식 유발군의 비강 점막;

B: 대조군의 비강 점막;

C: 알레르기 비염 및 천식 유발군의 폐조직; 및

D: 대조군의 폐조직,

도 6은 알레르기 비염 및 천식 마우스에서 지방조직 유래 줄기세포가 알레르기 비염 증상에 미치는 영향을 나타내는 그래프이고(* P<0.001, † P=0.009),

도 7은 알레르기 비염 및 천식 마우스의 비강 점막에서 지방조직 유래 줄기세포의 영향에 대한 조직학적 분석을 위해 광학현미경(배율×400)으로 관찰한 결과를 나타내는 그림이고:

A: 대조군;

B: 알레르기 비염 및 천식 유발군; 및

C: 지방조직 유래 줄기세포를 투여한 알레르기 비염 및 천식 유발군,

도 8은 알레르기 비염 및 천식 마우스에서 지방조직 유래 줄기세포가 비강 점막의 호산구성 염증에 미치는 양향을 나타내는 그래프이고(* P=0.04, † P=0.01),

도 9는 알레르기 비염 및 천식 마우스에서 지방조직 유래 줄기세포가 기도염증에 미치는 영향을 평가하기 위해, 폐의 조직학적 분석을 위해 광학현미경(배율×200)으로 관찰한 결과를 나타내는 그림이고,

도 10은 알레르기 비염 및 천식 마우스에서 지방조직 유래 줄기세포가 기도염증에 미치는 영향을 평가하기 위해, 기관지폐포세척액내 염증세포를 나타내는 그래프이고(* p< 0.05),

도 11은 알레르기 비염 및 천식 마우스에서 지방조직 유래 줄기세포가 기도염증에 기관지폐포세척액내 사이토카인농도에 미치는 영향을 나타내는 그래프이고(* p< 0.05),

도 12는 알레르기 비염 및 천식 마우스에서 지방조직 유래 줄기세포가 혈청 항원 특이적 항체 유형들에 미치는 영향을 나타내는 그래프이고(* P=0.002, † P=0.039, ‡ P<0.001, § P=0.039, ∥ P=0.01, ¶ P<0.001, ** P<0.001),

도 13은 알레르기 비염 및 천식 마우스에서 지방조직 유래 줄기세포가 비장 상층액 사이토카인에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다(* P=0.02, † P=0.03, ‡ P=0.042, § P=0.046, ∥ P=0.006, ¶ P=0.004).

Claims (16)

1. 지방조직 유래 줄기세포(adipose tissue-derived stem cells, ADSCs)를 함유하는 알레르기 비염 예방 및 치료제.
2. 제 1항에 있어서, 지방조직 유래 줄기세포는 비강 점막에 정착되는 것을 특징으로 하는 알레르기 비염 예방 및 치료제.
3. 제 1항에 있어서, 지방조직 유래 줄기세포는 호산구성 염증을 억제하는 것을 특징으로 하는 알레르기 비염 예방 및 치료제.
4. 제 1항에 있어서, 지방조직 유래 줄기세포는 Th2(T helper cell type 2) 면역반응을 감소시키는 것을 특징으로 하는 알레르기 비염 예방 및 치료제.
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 지방조직 유래 줄기세포를 함유하는 알레르기 천식 예방 및 치료제.
10. 제 9항에 있어서, 지방조직 유래 줄기세포는 폐에 정착되는 것을 특징으로 하는 알레르기 천식 예방 및 치료제.
11. 제 9항에 있어서, 지방조직 유래 줄기세포는 호산구성 염증을 억제하는 것을 특징으로 하는 알레르기 천식 예방 및 치료제.
12. 제 9항에 있어서, 지방조직 유래 줄기세포는 Th2(T helper cell type 2) 면역반응을 감소시키는 것을 특징으로 하는 알레르기 천식 예방 및 치료제.
13. 삭제
14. 삭제
15. 삭제
16. 삭제

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