KR101721054B1

KR101721054B1 - 지방조직유래 줄기세포 배양액을 함유하는 염증질환 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101721054B1
Application number: KR1020150108248A
Authority: KR
Inventors: 노환중; 조규섭; 박혜경; 유학선; 문수진; 박미경
Original assignee: 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2015-04-17
Filing date: 2015-07-30
Publication date: 2017-03-30
Also published as: KR20160123943A

Abstract

본 발명은 지방조직 유래 줄기세포 배양액 (adipose tissue-derived stem cells cultured supernatant, ADSCs sup)을 유효성분으로 포함하는 알레르기성 호흡기 염증질환 예방 및 치료제를 제공하는 것이다. 본 발명에 따른 지방조직 유래 줄기세포 배양액을 알레르기성 호흡기 염증 반응을 유도한 마우스 모델에 처리 시, 기도저항성 및 폐 조직의 염증세포 침윤 정도를 감소시키며, 또한 Th2 면역반응을 감소시키며 그 동시에 Treg 면역 세포의 활성을 증가시킴에 따라 알레르기성 호흡기 염증 반응을 치료하는 효과가 뛰어나므로, 의약분야에서 알레르기성 호흡기 질환을 예방 및 치료하는 데에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

지방조직유래 줄기세포 배양액을 함유하는 염증질환 예방 또는 치료용 조성물 {Compositions for preventing or treating inflammation disease containing culture media of adipose tissue-derived stem cells}

본 발명은 지방조직유래 줄기세포 배양액을 함유하는 염증질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 면역조절 효과와 항염증 효과를 통해 염증질환의 치료에 사용하기 위한, 지방조직유래 줄기세포 배양액을 유효성분으로 함유하는 염증질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

천식, 비염 등 알레르기성 호흡기 염증질환은 점차 증가하는 추세이며 특히 환경적인 요인의 대표적인 예로 원인 알러젠(allergen)에 대한 반복적인 노출에 의한 알레르기 반응이 보통이며, 최근 들어 우리나라 국민의 생활양식의 서구화로 인해 원인 알러젠의 종류가 증가함에 따라 기관지 질환 유병률이 지속적으로 증가하고 있다 (Kim YK, et al., Clin Exp Allergy. 32:1706-12, 2002). 이러한 호흡기 염증질환은 호흡곤란, 기침 등의 증상을 유발하여 삶의 질을 떨어뜨리고 학습, 일 및 작업에 대한 능률을 떨어뜨리며, 생산성의 감소를 유발하여 사회경제적으로 중요한 문제가 되고 있다. 최근 면역학 및 분자유전학의 발전에 따라 기관지 천식의 병태생리에 대한 이해와 이에 따른 새로운 치료제의 개발에도 불구하고 기관지천식으로 인한 유병률은 증가하고 있는 실정이다. 특히, 기존의 치료 약제로 사용되는 스테로이드제 또는 기관지 확장제는 질병의 근본적인 치유가 아닌 증상의 조절 및 예방을 위한 약제로 평생 사용해야 하고 이로 인해 개인 및 사회의 경제적 부담은 상당하다. 약물요법은 기본적인 치료이지만 약제 중단 시 재발이 흔하고 심각한 부작용을 일으킬 수 있으며, 면역요법은 유일하게 변형된 면역체계를 원상회복시키는 근본치료가 될 수 있지만 수년간의 치료가 필요하고 과민반응과 비용이 문제가 될 수 있다 (Wheeler AW, et al., Expert Rev Vaccines 5:27-31, 2006).

골수유래 중간엽 줄기세포(Mesenchymal stem cells, MSCs)는 생체 내(in vivo) 및 생체 외(in vitro)에서 중간엽 계통의 여러 가지 세포, 즉 골, 연골, 지방조직 또는 근육으로 분화할 수 있다 (Prockop DJ. Science 276:71-4, 1997; Pittenger MF, et al., Science 284:143-7, 1999). MSCs는 여러 문헌에서 골형성 부전증, 심근경색, 폐 손상 및 뇌경색 등 손상된 조직의 재생에 유용하다고 보고된 바 있으며, 현재까지 여러 연구들에서 MSCs의 분화능 및 재생능을 이용하여 치료제로 사용하려는 시도가 이루어지고 있다 (Horwitz EM, et al., Blood 97:1227-31, 2001; Shake JG, et al., Ann Thorac Surg 73:1919-26, 2002; Rojas M, et al., Am J Respir Cell Mol Biol 33:145-52, 2005; Li Y, et al., Neurology 59:514-23, 2002). MSCs는 분화증 및 재생능 뿐만 아니라 면역억제효과 역시 지니고 있어 동종간의 이식에서 이식편대숙주병의 발생과 중증도를 감소시킨다고 보고되었다 (Le Blanc K, et al., Lancet 363:1439-41, 2004). 또한, MSCs는 T세포, B세포 및 NK세포(natural killer cell)의 기능을 억제하고 수상돌기세포의 기능에도 영향을 줄 수 있다 (Di Nicola M, et al., Blood 99:3838-43, 2002; Jiang XX, et al., Blood 105:4120-6, 2005; Corcione A, et al., Blood 107:367-72, 2006).

지방조직유래 줄기세포(adipose tissue-derived stem cells, ADSCs)는 MSCs와 유사한 표현형을 보이며 (Lee RH, et al., Cell Physiol Biochem 14:311-24, 2004), 여러 가지 세포로 분화가 가능하고 생체 외에서 면역억제 효과를 보인다고 알려져 있다 (Puissant B, et al., Br J Haematol 129:118-29, 2005). 또한, ADSCs 역시 동종 간의 면역반응에 의해 유도된 수상돌기세포 및 T세포에서 사이토카인의 분비를 변화시키고, 생체 외에서 활성화된 T세포 및 B세포에 면역억제효과를 보인다고 알려져 있다 (Aggarwal S, et al., Blood 105;1815-22, 2005). 이전의 연구는 ADSCs가 미토겐(mitogen)에 반응하여 혼합 림프구 반응 및 림프구 증식 반응을 억제하여 면역억제효과를 보인다고 하였다 (Puissant B, et al., Br J Haematol 129:118-29, 2005).

알레르기 질환의 면역학적 발생기전은 주로 "hygiene hypothesis(위생가설, Th1/Th2 반응의 불균형)"로 설명하고 있다. 정상적으로 Th1 반응과 Th2 반응은 서로 길항작용을 하면서 균형을 유지하고 있지만, 기관지 천식을 포함하는 알레르기 질환이 발생하기 위해서는 Th1 반응이 감소되고, Th2 반응이 항진되는 면역체계의 불균형이 발생하는 것이 핵심적인 요인이라고 설명하고 있다 (Mosmann TR, et al., J Immunol. 136:2348-57.1986). 천식에서 Th2 세포 매개에 의한 염증이 증가된다는 것은 여러 연구에서 밝혀졌는데, 천식 환자의 기관지 폐포 세척액에서 Th2 세포에서 분비되는 IL-3, 4, 5의 발현 정도가 정상인 보다 증가되어 있으며 (Robinson DS, et al., N Engl J Med 326:298-304, 1992; Walker C, et al., Am J Respir Crit Care Med 150:1038-48, 1994), 또한 알레르기성 호흡기 질환에서 호산구는 IL-3, 5, GM-CSF에 의해 조절되어 생산되며, 기도상피세포의 손상에 관여하며 기도과민성을 증가시키며 비만세포의 탈과립화를 유발하여 천식 발병에 중요한 역할을 한다.

현재까지 알레르기 비염과 천식이 Th2 세포에 의한 염증성 질환임이 알려진 후 스테로이드 등의 항염증제가 약물치료의 중심이 되고 있다. 하지만, 근본적인 치료를 위해서는 기존의 항염증제나 기관지 확장제로는 부족하며 알러젠에 대한 면역반응과 면역세포에서 분비되는 사이토카인에 의한 만성염증을 조절하는 새로운 치료제가 필요하다. 또한 알레르기성 호흡기 염증 질환 마우스모델에서 ADSCs를 정맥주사를 통하여 체내로 주입한 후 기도세척액과 폐 조직 주변 임파구 내에서 Th2 면역반응이 감소되며 이때 Th1 및 Treg 면역반응이 증가되는 현상을 확인하였으며, 특히 눈에 띄게 폐 조직 내 염증세포 침윤 및 점액 분비 정도가 낮아지는 것을 확인하였다 (Kyu-Sup Cho, et al., Mediators of Inflammation, Article ID 436476, 12 pages, 2014).

이에 본 발명에서는 마우스 지방조직에서 중간엽 줄기세포 배양액을 알레르기성 호흡기 염증 질환 마우스 모델에 비강 내 투여법을 통하여 상기 줄기세포가 면역조절 및 항염증 효과가 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

KR

10-2014-0075469

A

따라서 본 발명의 목적은, 면역조절 및 항염증 효과를 갖는 지방조직유래 줄기세포 배양액을 유효성분으로 함유하는 염증질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 지방조직유래 줄기세포 배양액을 유효성분으로 함유하는 염증질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 지방조직유래 줄기세포 배양액은 지방조직으로부터 분리된 줄기세포를 배양 배지에서 배양한 후 줄기세포를 제거한 배양액인 것이 바람직하다. 줄기세포의 배양액에 포함된 줄기세포 자체는 인체 투여 시 외부항원으로 인식되어 면역반응을 일으키거나 투여된 줄기세포가 종양으로 발전할 가능성이 있기 때문에, 이러한 부작용들을 고려한다면 줄기세포가 포함되지 않은 배양액이 좋다.

본 발명에 있어서, 상기 염증질환은 염증을 주 병변으로 하는 질병을 총칭하는 질환이며, 상기 염증은 일반적으로 외부 물질 또는 해로운 자극에 의한 숙주 침입에 대해 신체 조직의 국소화 된 보호 반응이다. 염증의 원인은 박테리아, 바이러스 및 기생충과 같은 감염성 원인; 화상 또는 방사선 조사와 같은 물리적 원인; 독소, 약물 또는 산업적 제제와 같은 화학약품; 알레르기 및 자가면역 반응과 같은 면역적 반응, 또는 산화성 스트레스와 연관된 상태일 수 있다. 또한 염증은 통증, 적화현상, 부기, 열 및 감염된 영역의 궁극적인 기능 손실을 그 특징으로 한다. 이들 증상은 면역계의 세포사이에서 일어나는 일련의 복잡한 상호작용의 결과이다. 세포의 반응으로 인해 결과적으로 여러 그룹의 염증 매개자의 상호작용 네트워크가 생성된다: 단백질(예를 들면, 사이토카인, 효소(예를 들면 프로테아제, 퍼옥시다제), 주요 염기성 단백질, 점착 분자(ICAM, VCAM), 지질 매개자(예를 들면, 에이코사노이드, 프로스타글란딘, 류코트라이엔, 혈소판 활성화 인자(PAF)), 반응성 산소종(예를 들면, 하이드로퍼옥사이드, 슈퍼옥사이드 음이온 O^2-, 산화질소(NO) 등). 그러나, 염증의 이들 매개자중 대부분은 또한 정상적인 세포 활성의 조절자이다. 따라서 염증 반응의 결핍으로 인해 숙주가 제어되지 않으면서 손상(즉, 감염)되고, 따라서 만성 염증으로 인해 부분적으로는 상기 언급된 매개자중 여럿이 과다 생성됨으로써 매개되는 염증성 질환이 야기된다.

특히, 면역세포들 사이의 상호작용 중에서 염증세포 침윤, 점액 분비 이상, Th1과 Th2 면역세포의 불균형, 면역글로불린의 증가, 염증성 케모카인의 증가 등의 반응은 알레르기성 호흡기 염증질환에서 주로 나타나는데, 본 발명의 지방조직유래 줄기세포 배양액은 이러한 반응을 조절하는데 효과적이므로, 바람직하게는 본 발명의 조성물은 알레르기성 호흡기 염증질환의 예방 또는 치료에 적용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 알레르기성 천식 또는 비염에 적용할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은, 임상 투여 시에 흡입, 분무 및 주사 등과 같은 비강 내 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 치료제는 실제 임상 투여 시에 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제와 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween), 카카오지, 라우린지, 글리세롤 및 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 비강 내 투여 시 주사제, 분무제, 흡입제 및 비강 투여용 조성물 등을 이용할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 약학 조성물을 실시하는데 있어서, 투여될 치료제의 양에 영향을 미치는 인자들로는, 이에 한정되는 것은 아니지만 투여 방식, 투여 빈도, 치료가 진행 중인 특정 질병, 질병의 심각성, 질병의 병력, 개체가 다른 치료제와 함께 협력 치료법이 진행 중인 지의 여부, 및 치료가 진행 중인 개체의 연령, 키, 체중, 건강, 및 신체 조건을 포함한다. 일반적으로 치료가 진행 중인 환자의 체중이 증가할수록 이 제제를 더 많은 양으로 투약하는 것이 바람직하다.

본 발명의 지방조직 유래 줄기세포 배양액은 비강 점막 및 폐에 침투하여 호산구와 같은 면역세포의 침윤을 억제하고 알레르기 증상을 호전시키며, 기도세척액 및 폐 조직 주변 임파구 내 Th2 면역반응을 억제하여 다양한 면역 조절을 함으로써 알레르기성 호흡기 염증 질환 예방 및 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 아무것도 배양하지 않은 배지와 마우스의 지방조직유래 줄기세포 배양액 내 존재하는 단백질의 차이를 확인한 도이다.
도 2은 알레르기성 호흡기 염증 마우스 모델의 제조과정 및 지방조직 유래 줄기세포 배양액을 비강 내 투여한 모식도이다.
도 3은 알레르기성 지방조직유래 줄기세포를 투여하였을 때 다른 조직으로의 이동을 확인한 도이다.
도 4는 알레르기성 호흡기 염증 마우스에서 지방조직유래 줄기세포 배양액이 기도저항성(가) 및 기도세척액 내 염증세포의 침윤 정도(나)에 미치는 영향을 평가한 도이다.
도 5는 알레르기성 호흡기 염증 마우스에서 지방조직유래 줄기세포 배양액이 폐 조직 병리학적 소견에 미치는 영향을 평가한 도이다.
도 6은 알레르기성 호흡기 염증 마우스에서 지방조직유래 세포 배양액이 폐 조직 주변 임파구 내 Th1, Th2 면역세포 수를 분석한 도이다.
도 7은 알레르기성 호흡기 염증 마우스에서 지방조직유래 세포 배양액이 폐 조직 주변 임파구 내 Treg 면역세포 수를 분석한 도이다.
도 8은 알레르기성 호흡기 염증 마우스에서 지방조직유래 줄기세포 배양액이 전체 면역 글로블린(가) 및 항원 특이적인 면역 글로블린(나)의 발현을 분석한 도이다.
도 9는 세포배양 시스템 내에서 알러젠에 의한 염증 반응에서 지방조직 유래 줄기세포 배양액이 항염증 반응에 미치는 영향을 평가한 도이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 지방조직 유래 줄기세포 배양액 (adipose tissue-derived stem cells cultured supernatant, ADSCs sup)을 포함하는 알레르기성 호흡기 염증 질환 예방 및 치료제를 제공한다.

실시예 1. 지방조직유래 줄기세포의 분리 및 배양

지방조직유래 줄기세포(ADSCs)의 알레르기 비염 및 천식에 대한 영향을 알아보기 위해, 마우스의 복부 지방에서 지방조직을 채취하여 ADSCs를 세포의 잔해로부터 분리하여 배양하였다. 그 후 지방조직유래 줄기세포 배양액(ADSCs sup)과 아무것도 배양하지 않은 배지(con sup)에 발현되어 있는 단백질 정도를 확인하였다.

구체적으로, 8주령 마우스에서 지방조직을 얻어 PBS로 지방조직을 세척하여 잘게 자른 후 자른 조직과 동량의 0.075%의 타입 I 콜라게나제(collagenase)를 처리하였다. 처리된 조직을 잘 섞은 후 1200 x g 속도로 10분간 원심분리 하여 부유물은 버리고 가라앉은 세포를 획득하였다. 100㎛ 나이론 메쉬(nylon mesh)에 걸려서 부유물을 제거하고 배지에 접종하여 48시간 동안 37℃, 5% CO₂ 환경에서 10% 소 태아혈청이 포함된 alpha-MEM세포 배양액에 현탁하여 배양하였다. 이후 배양중인 세포에 다시 PBS로 세척하여 남아있는 적혈구 세포를 제거하고 지방유래 중간엽 줄기세포만을 배양하였다.

이러한 과정으로 획득한 세포는 동일한 배지에서 동일한 조건으로 10⁶ cells/cm²가 될 때까지 배양하였고, 이후 획득한 10⁶ cells/cm²의 세포를 10⁵ cells/cm²로 나누어 심은 후 10⁶ cells/cm²가 될 때까지 배양하면서 세포수를 늘려나갔다. 획득한 10⁶ cells/cm²의 세포를 10⁵ cells/cm²로 나누어 심은 후 다시 10⁶ cells/cm²로 세포수를 늘려가는 과정에 필요한 10% 소 태아혈청이 포함된 alpha-MEM세포 배양액을 모두 수거한 후 -20℃에 보관하였다. 획득한 con sup 혹은 ADSCs sup을 동결건조법으로 농축하여 탈염 컬럼(desalting column)을 이용하여 물질 내 염을 제거하여 브래드퍼드법(bradford method)로 샘플의 단백질 농도를 측정한 후 실험에 이용하였다.

도 1은 아무것도 배양하지 않은 배지와 마우스의 지방조직유래 줄기세포 배양액 내 존재하는 단백질의 차이를 확인한 도이다. 도 1에서와 같이, con sup과 비교하여 ADSCs sup에서 더 많은 단백질이 존재함을 확인하였다. 따라서 ADSCs 배양 시 세포로부터 여러 단백질이 분비되었음을 알 수 있다.

실시예 2. 지방조직유래 줄기세포 배양액의 안정성 실험

지방조직유래 줄기세포를 정맥주사를 통하여 투여할 경우 기도세척액과 폐 조직 주변 임파구 내에서 Th2 면역 반응이 감소되고, Th1 및 Treg 면역반응이 증가하며, 폐 조직 내 염증세포 침윤 및 점액 분비 정도가 낮아지는 등 지방조직유래 줄기세포의 투여로 염증성 질환에 효과가 있음이 확인되었다(kyu-sup Cho et al., Mediators of Inflammation, Article ID 436476, 12 pages, 2014). 그러나, 줄기세포 자체는 인체 투여 시 외부항원으로 인식되어 면역반응을 일으키거나 종양으로 발전할 가능성이 있다. 이에 지방조직유래 줄기세포의 위험성을 확인하기 위하여 다음과 같이 줄기세포를 정맥주사 한 후 이동을 살펴보았다.

우선, 난알부민(ovalbumin; OVA)을 이용하여 알레르기성 호흡기 염증 마우스 모델을 제조하였고, 지방조직 유래 줄기세포 배양액을 비강 내 투여하는 방식으로 실험을 진행하였다. 알레르기성 호흡기 염증모델을 제조하는 단계는 감작(sensitization)과 면역(challenge) 단계로 구분된다. 구체적으로 실험 시작일 및 시작 후 1, 7 및 8일 후 모든 실험군의 마우스에 75μg의 난알부민과 2mg 알룸(alum)을 복강 내로 처리하였다(감작단계). 다음으로 실험 시작 14, 15, 21 및 22일 후 대조군 마우스에는 PBS를, 이외의 모든 실험군에는 마우스 당 50μg의 OVA를 비강내로 처리하였고 (면역단계), 배양액을 처리하는 군에는 실험 시작 후 12, 13, 19 및 20일 후 마우스 당 1x10⁶/100ul의 지방유래 줄기세포를 꼬리정맥 주사법으로 처리하였다.

그 결과, 도 3과 같이 줄기세포를 정맥 주사로 주입하였을 경우 타겟 조직인 폐 조직 이외에 신장과 같은 다른 조직에서도 줄기세포가 확인되었다. 즉, 줄기세포를 주입할 경우 면역반응을 일으키거나 종양으로 발전할 가능성이 있고, 상기와 같이 정맥주사로 줄기세포를 주입할 경우 타겟 조직 이외에도 이동할 수 있으므로 줄기세포를 직접 치료에 사용하는 것은 바람직하지 않다. 따라서 치료에 사용하고자 할 경우 줄기세포를 직접적으로 포함하고 있지 않은 줄기세포 배양액을 사용하여야 한다(이하 실시예 참조).

실시예 3. 알레르기성 호흡기 염증 모델의 제조

난알부민(ovalbumin, OVA)을 이용하여 알레르기성 호흡기 염증 마우스 모델을 제조하였으며, 지방조직 유래 줄기세포 배양액을 비강 내 투여하는 방식으로 실험을 진행하였다. 알레르기성 호흡기 염증모델을 제조하는 단계는 감작(sensitization)과 면역(challenge) 단계로 구분된다. 구체적으로 실험 시작일 및 시작 후 1, 7, 8일 후 모든 실험군의 마우스에 75μg의 난알부민과 2mg 알룸(alum)을 복강 내로 처리하였다 (감작단계). 다음으로 실험 시작 14, 15, 21, 22일 후 대조군 마우스에는 PBS를, 이외의 모든 실험군에는 마우스 당 50μg의 OVA를 비강내로 처리하였고 (면역단계), 배양액을 처리하는 군에는 실험 시작 후 12,13,19,20일 후 마우스 당 10μg의 con sup 또는 ADSCs sup을 비강내로 처리하였다.

실시예 4. 알레르기성 호흡기 염증에 대한 효과

ADSCs sup이 알레르기성 호흡기 염증 증상에 대하여 미치는 영향을 알아보기 위해, 다음과 같이 기도저항성 및 기도세척액 내 염증세포 침윤 정도를 비교해 보았다.

실험 시작 후 23일에 각 실험군의 마우스를 0, 12.5, 25, 50g/ml 농도의 메타콜린(methacholine)을 네뷰라이져(nebulizer)법으로 10분간 노출시킨 후, 3분 동안 각 마우스의 호흡량을 관찰 및 평균화하여 기도저항성을 수치화하였다. 기도저항성 측정 24시간 후 마우스를 희생하여 기도를 통해 생리 식염수를 0.8ml 넣어 폐를 세척한 후 세척액을 모아 세척액 내 면역세포를 슬라이드에 부착하였다. 부착한 세포를 디프 퀵 염색법(Diff Quick stain method)으로 염색 후 현미경 하에서 각 군의 기도세척액 내 대식세포, 호중구, 호산구 및 림프구와 같은 면역세포의 변화를 비교하였다.

그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이, 기도저항성(가) 및 기도세척액 내 전체 염증세포 수 특히, 호산구 수(나)가 알레르기성 호흡기 염증을 유도한 군에 비해 ADSCs sup을 투여한 군에서 유의하게 감소하였다.

실시예 5. 폐 염증세포 침윤 및 점액 분비에 미치는 영향

ADSCs sup이 폐 조직 내 염증세포 침윤 정도와 점액 분비 정도에 미치는 영향을 알아보기 위해, 각 군의 마우스에서 채취한 폐 조직을 10% 포르말린에 고정하여 각 조직 절편을 실험 목적에 따라 두 가지 방법으로 염색하였다. 우선 조직 내 면역세포의 침윤정도 및 염증반응에 의한 상피세포의 증식 정도를 확인하기 위하여 헤모톡실린 및 이오신 염색(Hematoxylin and eosin stain (H&E))하였고, 폐 조직 내 뮤신 분비 정도를 확인하기 위하여 과옥소산시프염색법(Periodic acid-Schiff (PAS) stain method)으로 염색하여 현미경으로 관찰하였다.

그 결과 도 5에서와같이, 폐 조직에서 염증세포침윤이 ADSCs sup을 비강 내 투여하였을 때, 현저히 감소 되었음을 확인할 수 있었다. 또한, 폐포 주변의 점액 분비 정도가 ADSCs sup을 처리하였을 때 눈에 띄게 감소 되었음을 확인할 수 있었다.

실시예 6. T세포 활성에 미치는 영향

ADSCs sup이 T세포의 활성에 미치는 영향을 확인하기 위해, 각 군의 마우스에서 폐 조직 주변 임파구를 획득하여 면역세포를 분리하여 특정 항체를 이용하여 염색한 후 FACS analysis(유세포 측정법)을 통해 분석하였다. 그 결과, ADSCs sup을 처리한 군에서 알레르기성 호흡기 염증이 유도된 OVA 군과 con sup을 처리한 군에 비해, 알레르기성 호흡기 염증반응 유도와 관계 된 IL-4⁺(Th2) 세포의 군집이 감소되는 것을 관찰할 수 있으며, 반면 IFN-γ(Th1) 세포의 군집이 증가됨을 확인할 수 있었다.

그 결과 도 6에서와같이, 아무것도 처리하지 않은 대조군(PBS)에 비해 OVA 감작을 이용한 알레르기성 호흡기 염증 반응을 유도한 군에서 Th2 면역 세포 수가 눈에 띄게 증가됨을 확인하였다. 그러나 ADSCs sup을 처리하였을 때, Th2 세포 수가 유의하게 감소되었으며, Th1 세포의 활성이 증가됨을 확인할 수 있었다.

실시예 7. Treg 세포 활성에 미치는 영향

ADSCs sup이 Treg 세포 활성에 미치는 영향을 확인하기 위해, 각 군의 마우스에서 폐 조직 주변 임파구를 획득하여 면역세포를 분리하여 특정 항체로 세포를 염색한 후 유세포 측정법을 통해 분석하였다.

도 7은 알레르기성 호흡기 염증 마우스에서 지방조직유래 세포 배양액이 폐 조직 주변 임파구 내 조절 T 세포 수를 분석한 도이다. 각 군의 마우스의 폐 조직 주변 임파구를 획득하고, 조절 T 세포의 마커 (CD4, CD25, Foxp3)에 대한 특정 항체를 이용하여 세포를 염색 한 후 유세포 측정법을 이용하여 확인해 본 결과, ADSCs sup을 처리한 군에서 CD4⁺CD25^-Foxp3⁺ 혹은 CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺를 발현하고 있는 세포의 수가 OVA 혹은 con sup을 처리한 군에 비해 눈에 띄게 증가됨을 확인할 수 있었다.

실시예 8. 면역글로블린 활성에 미치는 영향

ADSCs sup이 면역글로블린 활성에 미치는 영향을 확인하기 위해, 각 군의 마우스에서 혈액을 획득한 후 혈청을 분리하여 Th2 면역반응과 관계된 면역 글로블린-E, G1 항체와 Th1 면역반응과 관계된 면역 글로블린-G2 항체를 ELISA 방법을 사용하여 측정하였다.

도 8은 알레르기성 호흡기 염증 마우스에서 지방조직유래 줄기세포 배양액이 전체 면역 글로블린(가) 및 항원 특이적인 면역 글로블린(나)의 발현을 분석한 도이다. 도 8에서와 같이, 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비해 OVA 항원을 투여한 알레르기성 호흡기 염증 반응 유도군의 전체 및 OVA 특이 면역 글로블린-E 와 G1 항체농도는 유의하게 증가하였다. 이때, ADSCs sup을 처리한 군에서 전체 및 OVA 특이 면역 글로블린-E 와 G1의 농도는 유의하게 감소하고, 면역 글로블린-G2a 농도는 유의하지는 않았지만 증가되는 것을 확인하였다.

실시예 9. 염증성 및 항염증성 케모카인에 미치는 영향

본 발명자들은 세포 수준에서 ADSCs sup의 능력을 확인하기 위해, MLE(mouse lung epithelial)12 세포에 Aspergillus 항원(Asp)만 처리한 군과 ADSCs sup을 전 처리한 후 Asp를 처리한 군에서 염증성 및 항염증성 케모카인의 발현 정도를 실시간 PCR(real-time PCR)을 통하여 비교하였다.

도 9는 세포배양 시스템 내에서 알러젠에 의한 염증 반응에서 지방조직 유래 줄기세포 배양액이 항염증 반응에 미치는 영향을 평가한 도이다. 도 9에서와 같이, 아무것도 처리하지 않은 군에 비해 Asp를 처리한 군에서 eotaxin, IL-25, MDC, TARC와 같은 염증성 케모카인의 발현 정도가 유의하게 증가되었으며, 이때 ADSCs sup을 전처리한 군에서 그 정도가 유의하게 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 TGF-beta와 IL-10과 같은 항염증성 사이토카인의 발현 정도 역시 ADSCs sup을 처리하였을 때 유의하게 증가됨을 확인할 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

지방조직으로부터 분리된 줄기세포를 배양 배지에서 배양한 후 줄기세포를 제거한 배양액을 유효성분으로 하는 알레르기성 호흡기 염증질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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제 1 항에 있어서, 상기 알레르기성 호흡기 염증질환은 알레르기성 천식 또는 비염인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.