TW202041222A - 間質幹細胞在預防和治療情緒疾病上的醫藥用途 - Google Patents

Abstract

本發明涉及間質幹細胞的醫藥用途，特別是人類皮膚間質幹細胞在預防和治療情緒疾病上的醫藥用途。所述情緒疾病包括憂鬱症以及焦慮性疾患，尤其是重鬱症、輕性抑鬱症、雙極性疾患和持續型輕鬱症。

Description

間質幹細胞在預防和治療情緒疾病上的醫藥用途

本案涉及間質幹細胞的醫藥用途，特別是人類皮膚間質幹細胞在預防和治療情緒疾病上的醫藥用途。所述情緒疾病包括憂鬱症以及焦慮性疾患，尤其是重鬱症、輕性抑鬱症、雙極性疾患和持續型輕鬱症。

根據聯合國世界衛生組織發表的研究報告指出，如焦慮症、憂鬱症以及恐慌症等情緒疾病將會是本世紀影響全球人們健康的一個重大疾病。現今的生活型態與社會壓力容易導致情緒疾病的發生。曾有研究報告顯示，從1990到2010的20年期間，臺灣地區患有焦慮性和憂鬱性情緒疾病的人口約為246萬人。換句話說，臺灣地區每四到五個人中就有一人有情緒上的問題。

當面臨危險時，短暫的焦慮反應有助於人們遠離危險，這是一種正常的本能反應。倘若焦慮和恐懼情緒持續的時間過久，甚至愈趨嚴重，則會引起焦慮症的發生。許多的心理性疾病常伴隨焦慮症狀的發生，例如憂鬱症、廣泛性焦慮症、恐慌症、恐懼症、強迫症（OCD）以及創傷後壓力障礙症（PTSD）等。對這些情緒疾病的患者而言，負面情緒不只影響了他們的生活適應、與他人之間的社交互動、學習及工作等能力外，也影響了個人的健康，更會加重社會上醫療成本的支出。

目前臨床上用於治療情緒障礙疾病的藥物可分為兩大類。第一類以增進腦部丙胺基丁酸（GABA）的作用為主，例如苯并二氮卓類（Benzodiazepines ，BZDs）。這類藥物可活化GABA_A 型受體，幫助安眠以及舒緩焦慮，但長期服用會增加患者對藥物的依賴性以及耐藥性，甚至會有認知行為異常等副作用。第二類則是以促進血清素的作用為主，例如丁螺環酮（buspirone）以及血清素回收抑制劑（SSRIs）。這類藥物可增強腦部血清素持續作用的時間，但對病患仍會產生許多明顯的副作用，例如高血壓、嚴重噁心、嚴重失眠以及頭痛等。

因此，業界對於能夠有效治療情緒疾病且更安全、副作用更小的醫藥組成物，存在有殷切的需求。

間質幹細胞（mesenchymal stem cells；MSCs）屬於多功能（multipotent）幹細胞，具有細胞增生及多向分化的能力，可分化成軟骨細胞、脂肪細胞、硬骨細胞等。近年來，由於間質幹細胞具有修復以及替代受損神經元的功能，因此被積極應用於腦部創傷、中風以及神經退化性疾病治療的發展（Hosseiniet al .,Int J Stem Cells 8: 191-9；以及Yoo SWet al .,Exp Mol Med 40: 387-97）。此外，間質幹細胞也具有調節人體免疫功能以及降低細胞氧化壓力的特性，透過外泌微泡的作用，可調節體內免疫功能與氧化壓力失衡的狀態，達到疾病治療的效果。

本案發明人利用小鼠建立起一個情緒疾病的動物模式，進而發現，間質幹細胞，尤其是人類間質幹細胞，例如人類皮膚間質幹細胞，可以有效地改善這個動物模式。本案揭露內容顯示，間質幹細胞可以對憂鬱症和焦慮症等情緒疾病帶來有益的效果，可供用做為預防或治療這些疾病的替代性或補充性藥物。

因此，依據本發明的第一態樣，其提供一種間質幹細胞組成物在製造一供用於預防或治療個體的情緒疾病的醫藥品上的用途，其中，所述間質幹細胞組成物包含間質幹細胞以及一藥學可接受性載劑。

依據本發明的第二態樣，其提供一種治療個體的情緒疾病的方法，所述方法包括向所述個體施用有效量的間質幹細胞組成物；其中，所述間質幹細胞組成物包含間質幹細胞以及一藥學可接受性載劑。

在一個較佳具體例中，所述間質幹細胞是皮膚間質幹細胞。 在另一個較佳具體例中，所述間質幹細胞來自於人類。在一個更佳具體例中，所述間質幹細胞是人類皮膚間質幹細胞。

在一個較佳具體例中，所述情緒疾病選自於由重鬱症（major depressive disorder）、輕性抑鬱症（minor depression）、雙極性疾患（bipolar disorder）、持續型輕鬱症（dysthymia）、持續性輕躁症（cyclothymia）、經期前症候群（pre-menstrual syndrome）、經期前情緒障礙症（premenstrual dysphoric disorder）、廣泛性焦慮症（generalized anxiety disorder）、恐懼症（phobias，包括社交恐懼症（social phobia）、幽閉恐懼症（claustrophobia）和廣場恐懼症（agoraphobia）等特定物件恐慌症、恐慌性障礙（panic disorder）、強迫症（obsessive compulsive disorder）和創傷後壓力障礙症（post- traumatic stress disorder））、暴食症（bulimia）、厭食症（anorexia）、青少年憂鬱症（adolescent depression）和拔毛癖（trichotillomania）所組成的群組。在一個更佳具體例中，所述情緒疾病選自於由重鬱症、輕性抑鬱症、雙極性疾患和持續型輕鬱症所組成的群組。

在一個較佳具體例中，所述個體是人。

在一個較佳具體例中，所述間質幹細胞組成物被製備成無菌液體溶液或懸浮液的注射劑形式。

除非另有說明，本案說明書和申請專利範圍中使用的以下術語具有以下定義。應注意的是，在本案說明書和申請專利範圍中使用的不定冠詞“一個”或“一種”旨在表示一個或多於一個，例如“至少一個”、“至少兩個”或“至少三個”，且並不僅僅指單一的一個。另外，申請專利範圍中使用的術語“包括”、“包含”和“具有”是開放式用語，並且不排除未提及的要素。除非另有說明，術語“或”通常涵蓋“和/或”。在整個說明書和申請專利範圍中使用的術語“約”用於描述和表示不會實質上影響本發明的性質的微小變化。

在本案說明書中，術語“間質幹細胞”或簡稱“MSCs”是指源自於成體基質組織的多能幹細胞（multipotent stem cells），這些成體基質組織包括但不限於骨髓、臍帶、羊膜、羊水、脂肪組織、牙髓腔、骨骼肌和皮膚。MSCs具有自我更新的能力，且具有分化成間質細胞譜系的細胞的能力。本案使用的MSC可以從人類、大鼠、小鼠、綿羊、牛、豬、狗、貓、馬和非人類靈長類動物（例如猴、大猩猩和黑猩猩）中收集。在一較佳具體例中，所述MSCs來自於人。在較佳的具體例中，本案所使用的MSCs是由皮膚單離出來，即皮膚間質幹細胞（SMSCs）。相較於其他MSCs，SMSCs具有來源充沛，取材方便，分離細胞的數量和純度高，以及多次繼代後仍保有幹細胞特性的優勢。在更佳的具體例中，所述皮膚間質幹細胞是人類皮膚間質幹細胞。

由於MSCs會隨著繼代次數增加而逐漸失去活力，所以通常使用第1至10代的MSCs，較佳為使用第2至6代的MSCs。

MSCs可以通過本領域已知的方法從各種來源收集，通常是從組織中單離出幹細胞。隨後在適當的培養基中將MSCs培育一段時間，再收集上清液而得。舉例而言，在收集SMSCs的具體例中，首先通過外科手術由提供者的皮膚獲取皮膚組織，接著使用膠原蛋白酶消化組織，將離心後所沉澱出來的細胞團利用磷酸鹽緩衝液進行清洗，再將細胞置入培養基中培養並且去除其他細胞以收集SMSCs。在較佳的具體例中，MSCs的收集還可以包括利用表面抗原標誌物的差異從細胞培養物中單離出MSCs。單離方法的非限制性實例包括磁性細胞分選（MACS）、螢光啟動細胞分選（FACS）和流式細胞術分選（FCS）。所收集到細胞中如果有超過95%以上的細胞具有CD90、CD73和CD105這三種細胞表面標記，就可以確認它們是人類皮膚間質幹細胞。隨後將所收集到的MSCs培養於適當的培養基中，歷時至少3小時，較佳為3至120小時，更佳為24至96小時，例如72至96小時。

上文所稱“培養基”是指任何含有用於支持人類或動物細胞的活體外培養的液體培養基。在一較佳的具體例中，所述培養基是含有無機鹽類、胺基酸和維生素等基本營養成份的基礎培養基。適用於本發明的基礎培養基的例子包括不限於伊格爾基礎培養基（Basal Medium Eagles；BME）、最低基礎培養基（Minimum Essential Medium；MEM）、達伯克氏改良伊格爾培養基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium；DMEM）、營養混合培養基F-10（HAM's F-10）和營養混合培養基F-12（HAM's F-12），或它們的組合。這些培養基都可以容易地製得或由市面購得。在一更佳的具體例中，所述培養基為DMEM。

如果需要，培養基中可以加入血液組分，例如血清、血漿和富含血小板的血漿（platelet-rich plasma），以支持所培養的細胞的生長。在一較佳具體例中，所述培養基補充有血清，例如補充有血清的DMEM。此處所稱“血清”意指來自於人類或動物的血液的液態製劑，其中血球、纖維蛋白原（fibrinogen）和纖維蛋白（fibrin）皆被移除，用於提供細胞生長所需養料，尤其是指由生活於非疫區的人類或動物所衍生而來的血清製劑，其包括但不限於人血清、胎牛血清（FBS）、小牛血清、成牛血清或是其他動物的血清，例如來自於馬和駱駝的血清製劑。血清在培養基中的用量依據所述培養基的總體積為基準是位於約0.5至20體積%的範圍。視需要，細胞培養基中可以進一步補充其他組分，例如維生素、蛋白質和糖、生長因子（例如FGF和EGF）、抗生素（例如青黴素、鏈黴素和四環素）、殺真菌劑、激素、抗氧化劑等。細胞培養基及培養方法的詳細內容可參見Methods For Preparation of Media, Supplements and Substrate For Serum-Free Animal Cell Culture Alan R. Liss, 紐約 (1984)和Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures, John Wiley & Sons Ltd., Chichester, 英國英格蘭1996。

術語“培養”是指在有利於MSCs生長和存活的活體外條件下維持MSCs。培養MSCs的手段屬於本案所涉技術領域的常規例行手段。本案通過標準方法使用無菌處理和操作來培養MSC。一般來說，培養的最適溫度約為35至37^o C。在一較佳具體例中，細胞是在二氧化碳培養箱內進行培養。所述二氧化碳培養箱通常設定於恆溫（例如37°C）、穩定的CO₂ 水準（例如5%）、恆定的酸鹼度（例如pH 7.2-7.4）和較高的相對飽和濕度（例如95%），以模擬細胞在生物體內的生長環境。

培養完成後，可以藉由離心或過濾等慣用手段來加工MSCs培養物，以去除水性部分，隨後以胰蛋白酶使MSCs脫離附著的表面，從而收穫細胞。

如本說明書所公開的，MSCs，特別是SMSCs，例如來自於人類皮膚組織的SMSCs，具有治療或預防情緒疾病的效果。本案所使用的術語“情緒疾病”泛指未接受藥物治療下發生持續至少兩周的異常情緒浮動，其範圍意欲涵蓋情緒低落或興趣喪失，情緒過度高漲甚至狂躁（mania），以及在情緒低落和高漲之間週期循環，較佳為藉由美國精神醫學會所頒行的精神疾病診斷與統計手冊（The Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders）第四版修訂版或第五版（簡稱DSM-IV-TR和DSM-5）所定義及/或依據其所載方法進行診斷來確定的疾患。在較佳具體例中，術語“情緒疾病”包括顯現出一般性的心情不佳、輕度憂鬱乃至於重度憂鬱症狀等臨床症候的憂鬱症，以及焦慮性疾患（anxiety disorders）。如本案所屬技術領域中具有通常知識者所熟知，焦慮性疾患和憂鬱症在臨床症狀上多所重疊，而且在用藥上許多抗憂鬱藥物也有抗焦慮效果。在較佳具體例中，所述“情緒疾病”包括但不限於重鬱症（major depressive disorder）、輕性抑鬱症（minor depression）、雙極性疾患（bipolar disorder）、持續型輕鬱症（dysthymia）、持續性輕躁症（cyclothymia）、經期前症候群（pre-menstrual syndrome）、經期前情緒障礙症（premenstrual dysphoric disorder）、廣泛性焦慮症（generalized anxiety disorder）、恐懼症（phobias，包括社交恐懼症（social phobia）、幽閉恐懼症（claustrophobia）和廣場恐懼症（agoraphobia）等特定物件恐慌症、恐慌性障礙（panic disorder）、強迫症（obsessive compulsive disorder）和創傷後壓力障礙症（post- traumatic stress disorder））、暴食症（bulimia）、厭食症（anorexia）、青少年憂鬱症（adolescent depression）和拔毛癖（trichotillomania）。在一個更佳具體例中，所述情緒疾病選自於由重鬱症、輕性抑鬱症、雙極性疾患和持續型輕鬱症所組成的群組。

脂多醣（lipopolysaccharide；以下簡稱LPS）是革蘭氏陰性細菌外膜的主要組成部分，也是一種細菌內毒素。實驗證實，注射LPS可引起小鼠產生焦慮以及憂鬱的行為（請參見Ming Z.et al .,Neurosci Lett 590: 96-100；以及Sulakhiya K.et al .,Neurosci Lett 611: 106-11）。本案藉由將MSCs給予這個慣用於模擬情緒疾病的動物模式，再使小鼠接受尾部懸吊試驗（TST）和強迫游泳測試（FST），從而評估MSCs對於情緒疾病的醫療效果。

所述尾部懸吊試驗（TST）是一種廣泛使用的情緒行為試驗，其將小鼠尾巴吊起而呈倒掛狀態懸於半空中，小鼠將會依據其本能在懸吊初期極力掙扎扭動，直至其感到無助時便會放棄不再掙扎。計算小鼠掙扎扭動的時間和不再扭動的時間。小鼠變得無助而不再掙扎扭動的時間愈長，代表其憂鬱絕望、自我放棄的程度愈高。所述強迫游泳測試（FST）由Porsolt 等人在1977 年提出，是另一種廣泛使用的情緒行為試驗，其將小鼠放置在盛水的圓柱桶裡 , 小鼠會試圖爬壁掙脫 , 努力無效後會放棄掙扎，漂浮在水面上靜止不動。受試小鼠漂浮靜止不動的時間越長，表示其越憂鬱絕望。

下文實施例2記載的尾部懸吊試驗和實施例5記載的強迫游泳測試，它們的實驗結果一致性地顯示出，被給予MSCs的小鼠，相較於沒有給予MSCs的對照組小鼠，在受測期間不掙扎扭動的時間顯著地比較短，代表由LPS所引起的類憂鬱行為顯著地被MSCs所抑制。實施例3顯示，接受LPS注射來誘發情緒疾病的組別中，只有給予MSC的小鼠在血漿中所測得的前發炎性細胞激素IL-6的濃度低於可偵測值。這指出給予MSC可以抑制前發炎性細胞激素的形成。實施例4進一步顯示，給予MSC的小鼠的海馬迴中，腦源性神經滋養因子（brain-derived neurotrophy factor，BDNF）濃度有提升的情形。

如本案所屬技術領域中具有通常知識者所知悉，下視丘-腦垂腺-腎上腺軸（Hypothalamic-pituitary-adrenocortical axis；簡稱HPA軸）是人體內負責處理壓力反應的重要構造。當人們長期處於高度壓力之下時，會引起HPA軸出現失衡現象，導致大量的促腎上腺皮質激素釋放激素（CRF）被釋放於腦脊髓液中，會引起焦慮-憂鬱行為的產生。此外，壓力也會引起多種促進發炎的細胞激素，例如IL-1β、IL-6、IL-4、IL-10，以及發炎因子C-反應蛋白（CRP）與腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的分泌，不但會使罹患焦慮以及憂鬱症的風險提高，甚至還會造成情緒疾病更加惡化，以及抑制服用抗憂鬱藥物後的療效。臨床報告更指出，焦慮症病患的血液檢體中，IL-6以及TNF-α等發炎因子有顯著性的升高（Vogelzangset al .,Transl Psychiatry. 2016; 6(5):e825）。

此外，海馬迴中BDNF的濃度，也與憂鬱症症狀的嚴重程度有關（Caviedes Aet al .,Curr Pharm Des. 2017; 23(21): 3154-3163）。

雖然不希望被任何理論所拘束，但我們推測，當LPS進入小鼠的血液循環系統後，會引起動物全身廣泛性的發炎反應，造成免疫細胞產生大量的發炎因子，例如細胞激素IL-6。小神經膠質細胞（microglia）是在神經系統中負責免疫功能的細胞。當LPS進入中樞系統後，會誘發小神經膠質細胞產生大量的發炎因子，進一步加劇神經發炎反應的發展與傷害，而神經發炎現象是引起焦慮症和憂鬱症的一個重要因素。另一方面，海馬迴中BDNF的濃度，與憂鬱症症狀的嚴重程度有關。綜合看來，給予MSC能夠改善LPS所誘導出來的焦慮與憂鬱表現，可能的作用機轉是透過抑制發炎因子以及提升腦部BDNF的濃度。

因此，本案涵蓋了MSC用於治療或預防個體的情緒疾病的醫學用途，以及治療或預防個體的情緒疾病的方法，該方法包括向個體施用有效量的MSC。

本文所用的術語“個體”意在涵蓋人類或非人類脊椎動物，例如非人類哺乳動物。非人類哺乳動物包括家畜、伴侶動物、實驗動物和非人類靈長類動物。非人類個體還包括但不限於馬、牛、豬、山羊、狗、貓、小鼠、大鼠、豚鼠、沙鼠、倉鼠、水貂和兔。應理解的是，較佳的個體是人，尤其是患有或有風險患有情緒疾病的人類患者。

本說明書所稱“治療”意指將本案說明書所述情緒疾病或是它們的一或多種症狀的進展予以逆轉、緩和、延遲發作或抑制。在一些具體例中，治療可以在發展出一或多種症狀後再施行。治療亦可於症狀解除後持續施行，以延遲其復發。術語“預防”包括減少所述情緒疾病的發生或是降低情緒疾病發生時的嚴重性。在一些具體例中，預防是在無症狀下施行。例如，預防可在症狀發作前施行至易染病個體（例如根據個體的疾病歷史及/或根據遺傳或其他感病性因素）。

MSCs可以搭配一藥學可接受性載劑共同調配，而製作成適合給予個體的間質幹細胞組成物。本案所稱“藥學可接受性載劑”意指被使用做為承載MSCs的載體的惰性物質，其對於施用的部位不具有毒性、刺激性、熱原性、抗原性及溶血性，而且無實質的藥理活性，也不會妨礙所述MSCs的有益效果的發揮。這些藥學或化妝品可接受性載劑均為本案所屬技術領域中具有通常知識者所熟悉（請參見Remington: The Science and Practice of Pharmacy , Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995)；Hoover, John E.,Remington’s Pharmaceutical Sciences , Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975；Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds.,Pharmaceutical Dosage Forms , Marcel Decker, New York, N.Y., 1980；以及Pharmaceutical Dosage Fo rmsand Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 1999)）。一般來說，藥學可接受性載劑的用量是依據組成物的總重量為基準為約1%至約99.9%，較佳為約50%至約99%。藥學可接受性載劑的適用種類視組成物的形式而定。

MSCs可以通過任何合適的途徑施用給個體。在一個較佳的具體例中，間質幹細胞組成物被製備成注射劑，其呈現無菌的液體溶液或懸浮液的形式，以將MSCs經由靜脈、動脈或脊髓液等位置導入個體體內。在這個具體例中，較佳為所述藥學可接受性載劑與個體的血液等滲。合適的藥學可接受性載劑包括但不限於水、生理食鹽水、平衡鹽溶液（例如磷酸鹽緩衝生理鹽水（PBS）、漢克氏平衡鹽溶液（HBSS））、植物油、右旋糖、甘油、乙醇、潤濕劑、乳化劑和pH緩衝劑。在一些具體例中，可能需要用防腐劑（例如硫柳汞或疊氮化鈉）配製組成物，以利於長期儲存。載劑還可以含有其它藥學上可接受的賦形劑，用於改變或維持組成物的pH值、滲量、粘度、透明度、顏色、無菌性、穩定性、溶解速率或氣味。

根據本發明，術語“施用”包括通過任何合適的途徑將處在合適的組成物中的MSCs分配、遞送或給予給個體，以將所述間質幹細胞組成物或其代謝物組（metabolome）傳輸至個體中的所需要的位置，從而使所述組成物或其代謝物組與目標細胞或組織接觸。在一個具體例中，間質幹細胞組成物在情緒疾病發作之前、期間和/或之後施用給個體。在一個具體例中，可以將一種或多種治療劑與間質幹細胞組成物一起施用給個體。間質幹細胞組成物可以在施用所述一種或多種治療劑之前（例如0.5小時、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、18小時、24小時、36小時、2天、3天、4天、5天、 6天、7天或更長時間）、同時或之後（例如0.5小時、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、18小時、24小時、36小時、2天、3天 、4天、5天、6天、7天或更長時間）施用。間質幹細胞組成物和所述治療劑可以通過不同的方案（例如不同的計畫）、不同的施用途徑或不同的劑量來施用。

間質幹細胞組成物以治療有效量施用給個體，以引發研究人員、獸醫、醫生或其他臨床醫師所尋求的在細胞、組織、系統、動物或人類中的生物學或藥物回應，並較佳為穩定、改善或緩解個體中疾病狀況的一種或多種症狀，例如穩定、改善或緩解神經炎症、反射亢進、肌肉虛弱、顫搐、言語問題、呼吸問題、吞咽困難、記憶喪失、意識錯亂、定向障礙、書寫困難、憂鬱、焦慮、恐懼、回避社交、情緒波動、攻擊性、睡眠習慣改變、失眠、震顫、運動遲緩、肌肉僵硬、平衡受損、面部不自主運動、四肢麻木或虛弱、疲勞、眩暈、以及頭痛。因此，術語“有效量”是指當向個體施用有效量的組成物時，產生觀察到上述任何一個症狀減輕的藥效的間質幹細胞組成物的量。儘管有效量通常通過將它們與不存在有本文公開的間質幹細胞組成物時觀察到的效果（即，對照組）相比較的效果來確定，但實際劑量根據所選擇的特定施用途徑來計算。可以根據所選擇的特定施用途徑來計算實際劑量。相關領域中具有通常知識者會常規地進一步細化確定適當的施用劑量所需的計算。因此，當施用給人類個體時，較佳為每天、每週或一周兩次以1×10⁴ 個細胞/kg體重/天至1×10⁷ 個細胞/kg體重/天的用量，例如以5×10⁵ 個細胞/kg體重/天至5×10⁶ 個細胞/kg體重/天的用量施用所述間質幹細胞組成物。

在較佳的具體例中，所述間質幹細胞組成物用於自體細胞治療，也就是預先由一個體取得間質幹細胞，於體外培養後再植回同一個體。如本案所屬技術領域中具有通常知識者所知悉，自體免疫療法副作用相對較少，安全性較高，也不容易發生過敏和排斥的現象。

在另一具體例中，所述組成物主要由MSCs及前述藥學可接受性載劑所組成。此處所稱“主要由…所組成”意指所記載的成分組合中不排除另外含有實質上不會影響前述組成物的性質和功能的其他未記載組成分。在另一具體例中，本案組成物僅由MSCs及前述藥學可接受性載劑所組成。

下列實施例僅供用於例示本發明，而非限制本發明的範圍。實施例中所載資料，均進行單尾變異數分析，並進行事後檢定杜凱氏最誠實顯著性差異（post-hoc Tukey Honestly Significant Difference）測驗，p值小於0.05時認定為顯著差異。所有資料呈現的方式皆為平均值+ 標準差。

製備例1：皮膚間質幹細胞的製備

將人類皮膚檢體切成約3 mm² 大小後移至內含中性蛋白酶（dispase）及膠原蛋白酶的酵素反應液中，於37℃下作用16小時。將皮膚檢體碎塊及酵素反應液移至離心管中，加入等體積補充有適量血清的杜氏改良伊格爾培養基（DMEM；美國密蘇里州聖路易市Sigma Chemical Co.）進行酵素中和。以1500 rpm離心5分鐘，移除上清液，再加入含有血清及抗生素的DMEM培養基將細胞懸浮並移至新的培養皿中，置於二氧化碳培養箱中在37℃下進行培養。每3-4天更換一次新鮮培養基，待細胞密度約八成滿時進行繼代。利用流式細胞儀偵測皮膚間質幹細胞的分化簇標記（CD markers），即細胞表面抗原CD73、CD90及CD105的表現，以確認培養的細胞是皮膚間質幹細胞。

去除皮膚間質幹細胞培養物的水性部分，並且將細胞加以潤洗，隨後以胰蛋白酶處理細胞使其脫離培養容器，再使細胞懸浮於水性載劑中備用。

實施例1：情緒疾病的小鼠模式

8周齡的C57BL/6雄性小鼠購自於財團法人國家實驗研究院國家實驗動物中心（臺北市），體重約20-30克。實驗動物的飼養密度為每籠4-5隻動物。動物房採24小時自動溫濕調控,維持室溫25-27^o C，照明週期為白天夜晚12/12小時，動物可自由取用水及飼料。所有實驗進行皆配合動物光週期。如圖1所示，透過腹腔注射LPS（Escherichia coli 055:B5，購自於美國密蘇里州聖路易市Sigma-Aldrich公司，產品編號L2880），劑量為1.5mg/kg小鼠體重，以建立情緒疾病的動物模式。對照組為腹腔注射等體積的生理食鹽水。

實施例2：尾部懸吊試驗

如圖1所示，將動物隨機分成四組，包括(I)食鹽水-食鹽水組：在腹腔注射生理食鹽水（第0日）的前7日和前1日，分別以尾靜脈注射一劑食鹽水（n=6；即本組有6隻小鼠）；(II)食鹽水-LPS：在腹腔注射LPS（1.5 mg/kg）的前7日和前1日，分別以尾靜脈注射一劑食鹽水（n=8）； (III) MSC+LPS組：在腹腔注射LPS（1.5 mg/kg）的前7日和前1日，分別以尾靜脈注射一劑製備例1所製得的MSC製劑（3×10⁶ 個細胞）（n=10）；以及(IV)載劑-LPS組：在腹腔注射LPS（1.5 mg/kg）的前7日和前1日，分別以尾靜脈注射一劑載劑（n=12）。

LPS注射24小時後，以尾部懸吊試驗（TST）測量動物的憂鬱行為。在尾部懸吊試驗（TST）中，固定動物的尾部，以頭下腳上的方式懸吊於半空中。利用小型直立式攝影機錄下小鼠尾部懸吊6分鐘的運動狀態，錄製完成的影片再由Panlab Smart 3.0影像追蹤軟體（西班牙Panlab公司）進行分析，計算小鼠在6分鐘內靜止不動的時間。此處所稱“靜止不動”是以小鼠的頭部和所有腳爪都處於完全停止動作的狀態來定義。

行為實驗結束後，小鼠會以心臟採血法收集全血。採集到的血液放入含有肝素的試管內，經1500g下離心10分鐘後，取血漿上清液儲存於-80℃冷凍櫃內。另採集各組小鼠的海馬迴組織。

結果顯示於圖2，其顯示第(II)組小鼠於注射LPS 24小時後，相較於第(I)組注射食鹽水的動物，其不掙扎的時間較少，且統計分析達p＜0.05的顯著性。這指出被注射LPS的小鼠相較於對照組顯現出顯著的焦慮症和憂鬱症行為，成功地建立了焦慮症和憂鬱症的動物模式。經過MSC製劑的注射後（第(III)組），LPS所引起的類憂鬱行為則受到抑制，其與第(II)組的比較達統計上的顯著差異。本實施例的結果指出，MSC注射對於憂鬱症具有醫療效果。

實施例3：MSCs降低血液內發炎因子的濃度

將實施例2所採集到的血液加以解涷，並且接受酵聯免疫吸附試驗（ELISA），以分析IL-6等細胞激素的濃度。各組小鼠的血漿中IL-6的濃度記載於表1如下。

表1. 小鼠血漿中前發炎性細胞激素IL-6的濃度

組別	樣本數	＜可偵測值 （數量）	IL-6濃度  （pg/mL）	平均標準差
(I)	6	4	38.19	3.68
(II)	7	2	111.80	87.02
(III)	7	7	＜可偵測值	---
(IV)	7	1	42.31	8.43

表1顯示，尾靜脈施打MSC製劑的動物，其血漿中IL-6的濃度低於可偵測值（IL-6最低的偵測濃度為15.6 pg/ml）。

實施例4：MSCs增加海馬迴內BDNF的生成

將實施例2中所採集的海馬迴組織進行ELISA，以分析海馬迴組織中的腦源性神經滋養因子（BDNF）含量。圖3顯示，相較於其他三組，尾靜脈施打MSC製劑的小鼠的海馬迴組織中的BDNF濃度相對較高。

實施例5：強迫游泳測試

重複實施例2，建立情緒疾病的小鼠模式，其中第(I)、(II)、(III)和(IV)組的樣本數分別為8、13、8和15隻小鼠。本實施例與實施例2的不同處在於，LPS注射24小時後，利用強迫游泳測試（FST）來測量動物的類憂鬱行為表現。在FST中，準備直徑20公分，高30公分的透明圓筒，加入15公分高的乾淨自來水，水溫維持在23-25℃。開啟70-72分貝的白噪音後，握住小鼠尾巴將其慢慢放入水中。入水初期小鼠會依求生本能拼命游泳，直至其感到無助時便會放棄掙扎呈現漂浮不動狀態。利用小型攝影機錄下小鼠在進行強迫游泳測試6分鐘的運動狀態，再利用Panlab Smart 3.0影像追蹤軟體（西班牙Panlab公司）對錄製完成的影片進行分析，計算小鼠在這6分鐘內漂浮不動時間所占的百分比。

結果顯示於圖4。比較(I)與(II)兩組動物不掙扎的時間百分比，可以得知注射LPS 24小時後，對於小鼠的類憂鬱行為具有明顯的誘發效果（統計分析達 p＜0.01 的極顯著差異）。由(III)與(IV)兩組間的比較得知，預先注射兩劑MSC製劑（各劑含有約3x10⁶ 個細胞）後，對LPS所引起的類憂鬱行為會有明顯的抑制作用（統計分析達 p＜0.01 的極顯著差異）。相對地，預先注射兩劑載劑則對 LPS 所引起的類憂鬱行為沒有明顯的抑制作用。本實例的結果指出，注射 MSC 後，對於小鼠模式的類憂鬱行為具有明顯的改善效果。

以上諸實施例僅供說明本發明之用，而並非對本發明的限制，相關領域中具有通常知識者，在不脫離本發明的技術範圍做出的各種變換或變化也應屬於本發明的保護範疇。

無

圖1是情緒疾病的小鼠模式的建立流程，顯示在LPS誘發類憂鬱行為前7日和前1日，分別經由尾靜脈注射人類皮膚間質幹細胞；

圖2為柱狀圖，顯示各組小鼠模式在尾部懸吊試驗（TST）中的表現；

圖3為柱狀圖，顯示各組小鼠模式的海馬迴中的腦源性神經滋養因子（BDNF）的濃度；以及

圖4為柱狀圖，顯示各組小鼠模式在強迫游泳測試（FST）中的表現。

Claims (8)

1. 一種間質幹細胞組成物在製造一供用於預防或治療個體的情緒疾病的醫藥品上的用途，其中該間質幹細胞組成物包含間質幹細胞以及一藥學可接受性載劑。
2. 如請求項1所述的用途，其中該間質幹細胞是皮膚間質幹細胞。
3. 如請求項1所述的用途，其中該間質幹細胞來自於人類。
4. 如請求項2所述的用途，其中該皮膚間質幹細胞是人類皮膚間質幹細胞。
5. 如請求項1所述的用途，其中該情緒疾病選自於由重鬱症（major depressive disorder）、輕性抑鬱症（minor depression）、雙極性疾患（bipolar disorder）、持續型輕鬱症（dysthymia）、持續性輕躁症（cyclothymia）、經期前症候群（pre-menstrual syndrome）、經期前情緒障礙症（premenstrual dysphoric disorder）、廣泛性焦慮症（generalized anxiety disorder）、恐懼症（phobias，包括社交恐懼症（social phobia）、幽閉恐懼症（claustrophobia）和廣場恐懼症（agoraphobia）等特定物件恐慌症、恐慌性障礙（panic disorder）、強迫症（obsessive compulsive disorder）和創傷後壓力障礙症（post-traumatic stress disorder））、暴食症（bulimia）、厭食症（anorexia）、青少年憂鬱症（adolescent depression）和拔毛癖（trichotillomania）所組成的群組。
6. 如請求項5所述的用途，其中該情緒疾病選自於由重鬱症、輕性抑鬱症、雙極性疾患和持續型輕鬱症所組成的群組。
7. 如請求項1所述的用途，其中該個體是人。
8. 如請求項1所述的用途，其中該間質幹細胞組成物被製備成無菌液體溶液或懸浮液的注射劑形式。

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