TW202113070A - 間質幹細胞在治療聽力障礙上的醫藥用途 - Google Patents

Abstract

本發明涉及間質幹細胞的醫藥用途，特別是人類皮膚間質幹細胞在治療聽力障礙上的醫藥用途。所述聽力障礙包括但不限於感音神經性聽力障礙、混合性聽力障礙和中樞性聽力障礙。

Description

間質幹細胞在治療聽力障礙上的醫藥用途

本案涉及間質幹細胞的醫藥用途，特別是人類皮膚間質幹細胞在治療聽力障礙上的醫藥用途。

根據中華民國內政部的統計資料，臺灣地區的聽力障礙人口在2017年底已超過12萬人。另有研究報告指出，中國的聽力障礙人口有將近2800萬人，而於2013年全球則有大約十億人罹患不同程度的聽力障礙。兒童的聽力障礙可能影響語言學習和智能發展，對於成人也可能造成生活適應上的不便和工作上的困難，而對於老年人而言，聽力障礙更可能降低他們與他人之間的社交互動，不僅造成孤獨感，更容易提早發生失智症。

聽覺感知的過程基本上是先使聲音通過外耳的耳廓、外耳道到耳膜，再傳導到位於中耳腔的三塊聽小骨，然後由卵圓窗進入內耳，由位於耳蝸基底膜上的內聽毛細胞（inner hair cells）將聲音訊號轉換成神經訊號，經過聽神經和腦幹，最後到達大腦的聽覺區產生聽覺。在這個路徑中的任何位置發生問題就可能會造成聽力障礙。聽力障礙可能由多種不同的病因所造成，它們包括遺傳缺陷、老化、噪音傷害、病原微生物感染、分娩併發症、耳部創傷、藥物或毒物傷害等。依據發生的位置，聽力障礙可以被區分為五種類型：（1）傳導性聽力障礙：發生於外耳或中耳，病因包括有耳垢栓塞、異物、發炎、鼓膜穿孔、中耳積水、聽小骨斷裂或脫臼等，通常屬於輕度至中度聽力障礙，可以藉由藥物或手術來改善；（2）感音神經性聽力障礙：發生於內耳或聽神經，通常是因為耳蝸中的聽毛細胞受損或缺少所致，病因包括有病毒感染、耳毒性藥物中毒、老化、噪音傷害等，罹患此類型聽力障礙的患者通常對於高頻音的敏感性較差；（3）混合性聽力障礙，患者合併罹患有傳導性聽力障礙和感音神經性聽力障礙；（4）中樞性聽力障礙，發生於中樞聽覺神經系統，病因包括有老化、腦傷、神經病變等；以及（5）功能性聽力障礙，患者未發生聽道上的器質性病變，但由於心理或情緒性因素而導致對於聲音的敏感性下降。

舉例來說，含鉑化學治療藥物被廣泛使用於治療肉瘤、惡性上皮腫瘤、淋巴癌變及生殖細胞腫瘤，例如頭頸癌、腦瘤、卵巢癌、膀胱癌、非小細胞肺癌等，其中以順鉑（cisplatin；順式-二氯二氨合鉑(II) ）最具代表性。然而，這類化學治療藥物的一個嚴重副作用是具有耳毒性，使癌症患者的生活品質明顯下降。順鉑的耳毒性主要發生於耳蝸，一般認為與活性氧物質的生成有關。順鉑經由紋狀體血管（stria vascularis）、耳蝸液和聽毛細胞吸收而進入耳蝸組織，使得NADPH氧化酶第3型異構物活化，造成耳蝸內的活性氧物質含量增加。這一方面導致內源性抗氧化物（例如穀胱甘肽）耗竭，使活性氧物質得以攻擊細胞，另一方面活化了轉錄因子NFκB而大量產生促發炎細胞激素，結果造成外聽毛細胞、螺旋神經節細胞和紋狀體血管邊緣細胞發生凋亡，從而導致聽力障礙（請參見Pakenet al .,J Toxicol , 2016, Vol. 2016, Article ID 1809394）。

由於聽毛細胞死亡後無法再生，所以涉及聽毛細胞的聽力障礙經常是不可逆的，無法透過手術或藥物治療來恢復或改善，患者只能藉由配戴助聽器來企求改善。因此，業界對於能夠有效治療聽力障礙且更安全、副作用更小的醫療方法和醫藥組成物，存在有殷切的需求。

間質幹細胞（mesenchymal stem cells；MSCs）屬於多功能（multipotent）幹細胞，具有細胞增生及多向分化的能力，可分化成軟骨細胞、脂肪細胞、硬骨細胞等。近年來，由於間質幹細胞具有修復以及替代受損神經元的功能，因此被積極應用於腦部創傷、中風以及神經退化性疾病治療的發展（Hosseiniet al .,Int J Stem Cells 8: 191-9；以及Yoo SWet al .,Exp Mol Med 40: 387-97）。此外，間質幹細胞也具有調節人體免疫功能以及降低細胞氧化壓力的特性，透過外泌微泡的作用，可調節體內免疫功能與氧化壓力失衡的狀態。

經由建立聽力障礙的動物模式，本案發明人發現，間質幹細胞，尤其是人類間質幹細胞，例如人類皮膚間質幹細胞，可以有效地改善這個聽力障礙的動物模式。本案揭露內容顯示，間質幹細胞可以對於聽力障礙帶來有益的效果，可供用做為治療聽力障礙的替代性或補充性藥物。

因此，依據本發明的第一態樣，其提供一種間質幹細胞組成物在製造一供用於治療個體的聽力障礙的醫藥品上的用途，其中，所述間質幹細胞組成物包含間質幹細胞以及一藥學可接受性載劑。

依據本發明的第二態樣，其提供一種治療個體的聽力障礙的方法，所述方法包括向所述個體施用有效量的間質幹細胞組成物；其中，所述間質幹細胞組成物包含間質幹細胞以及一藥學可接受性載劑。

在一個較佳具體例中，所述間質幹細胞是皮膚間質幹細胞。 在另一個較佳具體例中，所述間質幹細胞來自於人類。在一個更佳具體例中，所述間質幹細胞是人類皮膚間質幹細胞。

在一個較佳具體例中，所述聽力障礙選自於由感音神經性聽力障礙、混合性聽力障礙和中樞性聽力障礙所組成的群組。在一個更佳具體例中，所述聽力障礙選自於感音神經性聽力障礙。

在一個較佳具體例中，所述感音神經性聽力障礙是由耳毒性藥物所引發。在一個更佳具體例中，所述耳毒性藥物選自於含鉑化學治療藥物。在一個最佳具體例中，所述含鉑化學治療藥物選自於順鉑。

在一個較佳具體例中，所述個體是人。

在一個較佳具體例中，所述間質幹細胞組成物被製備成無菌液體溶液或懸浮液的注射劑形式。

除非另有說明，本案說明書和申請專利範圍中使用的以下術語具有以下定義。應注意的是，在本案說明書和申請專利範圍中使用的不定冠詞“一個”或“一種”旨在表示一個或多於一個，例如“至少一個”、“至少兩個”或“至少三個”，且並不僅僅指單一的一個。另外，申請專利範圍中使用的術語“包括”、“包含”和“具有”是開放式用語，並且不排除未提及的要素。除非另有說明，術語“或”通常涵蓋“和/或”。在整個說明書和申請專利範圍中使用的術語“約”用於描述和表示不會實質上影響本發明的性質的微小變化。

在本案說明書中，術語“間質幹細胞”或簡稱“MSCs”是指源自於成體基質組織的多能幹細胞（multipotent stem cells），這些成體基質組織包括但不限於骨髓、臍帶、羊膜、羊水、脂肪組織、牙髓腔、骨骼肌和皮膚。MSCs具有自我更新的能力，且具有分化成間質細胞譜系的細胞的能力。本案使用的MSC可以從人類、大鼠、小鼠、綿羊、牛、豬、狗、貓、馬和非人類靈長類動物（例如猴、大猩猩和黑猩猩）中收集。在一較佳具體例中，所述MSCs來自於人。在較佳的具體例中，本案所使用的MSCs是由皮膚單離出來，即皮膚間質幹細胞（SMSCs）。相較於其他MSCs，SMSCs具有來源充沛，取材方便，分離細胞的數量和純度高，以及多次繼代後仍保有幹細胞特性的優勢。在更佳的具體例中，所述皮膚間質幹細胞是人類皮膚間質幹細胞。

由於MSCs會隨著繼代次數增加而逐漸失去活力，所以通常使用第1至10代的MSCs，較佳為使用第2至6代的MSCs。

MSCs可以通過本領域已知的方法從各種來源收集，通常是從組織中單離出幹細胞。隨後在適當的培養基中將MSCs培育一段時間，再收集上清液而得。舉例而言，在收集SMSCs的具體例中，首先通過外科手術由提供者的皮膚獲取皮膚組織，接著使用膠原蛋白酶消化組織，將離心後所沉澱出來的細胞團利用磷酸鹽緩衝液進行清洗，再將細胞置入培養基中培養並且去除其他細胞以收集SMSCs。在較佳的具體例中，MSCs的收集還可以包括利用表面抗原標誌物的差異從細胞培養物中單離出MSCs。單離方法的非限制性實例包括磁性細胞分選（MACS）、螢光啟動細胞分選（FACS）和流式細胞術分選（FCS）。所收集到細胞中如果有超過95%以上的細胞具有CD90、CD73和CD105這三種細胞表面標記，就可以確認它們是人類皮膚間質幹細胞。隨後將所收集到的MSCs培養於適當的培養基中，歷時至少3小時，較佳為3至120小時，更佳為24至96小時，例如72至96小時。

上文所稱“培養基”是指任何含有用於支持人類或動物細胞的活體外培養的液體培養基。在一較佳的具體例中，所述培養基是含有無機鹽類、胺基酸和維生素等基本營養成份的基礎培養基。適用於本發明的基礎培養基的例子包括不限於伊格爾基礎培養基（Basal Medium Eagles；BME）、最低基礎培養基（Minimum Essential Medium；MEM）、達伯克氏改良伊格爾培養基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium；DMEM）、營養混合培養基F-10（HAM's F-10）和營養混合培養基F-12（HAM's F-12），或它們的組合。這些培養基都可以容易地製得或由市面購得。在一更佳的具體例中，所述培養基為DMEM。

如果需要，培養基中可以加入血液組分，例如血清、血漿和富含血小板的血漿（platelet-rich plasma），以支持所培養的細胞的生長。在一較佳具體例中，所述培養基補充有血清，例如補充有血清的DMEM。此處所稱“血清”意指來自於人類或動物的血液的液態製劑，其中血球、纖維蛋白原（fibrinogen）和纖維蛋白（fibrin）皆被移除，用於提供細胞生長所需養料，尤其是指由生活於非疫區的人類或動物所衍生而來的血清製劑，其包括但不限於人血清、胎牛血清（FBS）、小牛血清、成牛血清或是其他動物的血清，例如來自於馬和駱駝的血清製劑。血清在培養基中的用量依據所述培養基的總體積為基準是位於約0.5至20體積%的範圍。視需要，細胞培養基中可以進一步補充其他組分，例如維生素、蛋白質和糖、生長因子（例如FGF和EGF）、抗生素（例如青黴素、鏈黴素和四環素）、殺真菌劑、激素、抗氧化劑等。細胞培養基及培養方法的詳細內容可參見Methods For Preparation of Media, Supplements and Substrate For Serum-Free Animal Cell Culture Alan R. Liss, 紐約 (1984)和Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures, John Wiley & Sons Ltd., Chichester, 英國英格蘭1996。

術語“培養”是指在有利於MSCs生長和存活的活體外條件下維持MSCs。培養MSCs的手段屬於本案所涉技術領域的常規例行手段。本案通過標準方法使用無菌處理和操作來培養MSC。一般來說，培養的最適溫度約為35至37^o C。在一較佳具體例中，細胞是在二氧化碳培養箱內進行培養。所述二氧化碳培養箱通常設定於恆溫（例如37°C）、穩定的CO₂ 水準（例如5%）、恆定的酸鹼度（例如pH 7.2-7.4）和較高的相對飽和濕度（例如95%），以模擬細胞在生物體內的生長環境。

培養完成後，可以藉由離心或過濾等慣用手段來加工MSCs培養物，以去除水性部分，隨後以胰蛋白酶使MSCs脫離附著的表面，從而收穫細胞。

如本說明書所公開的，MSCs，特別是SMSCs，例如來自於人類皮膚組織的SMSCs，具有治療聽力障礙的效果。本案所使用的術語“聽力障礙”泛指一個體對於聲音感知的敏感度下降。對於人類個體來說，“聽力障礙”主要是指其對於日常說話的頻率具有較低的敏感度。依據世界衛生組織（WHO）於1997年頒布的標準，可以根據在500Hz、1000Hz、2000Hz和4000Hz四個頻率的平均聽力閾值，將聽力障礙的嚴重程度分成4個等級：26~40分貝（dB）屬輕度聽力障礙，41~60分貝為中度，61~80分貝為重度，大於80分貝為深度。臨床上，可以藉由聽力檢查來診斷聽力障礙，這些聽力檢查包括（1）行為或主觀聽力檢查，例如純音聽力檢查（pure tone audiometry）、音叉檢查、語音聽力檢查等；以及（2）生理或客觀聽力檢查，例如聽性腦幹反應（auditory brainstem response；ABR）測驗、聽阻聽力檢查（impedance audiometry）、耳聲傳射檢查（oto-acoustic emissions）等。也可以額外進行鼓室聽力檢查、電腦斷層掃描和磁核共振成像，以協助專科醫師進行診斷。在較佳的具體例中，所述聽力障礙包括但不限於傳導性聽力障礙、感音神經性聽力障礙、混合性聽力障礙和中樞性聽力障礙。在更佳的具體例中，所述聽力障礙是選自於由感音神經性聽力障礙、混合性聽力障礙和中樞性聽力障礙所組成的群組。在又更佳的具體例中，所述聽力障礙是選自於感音神經性聽力障礙，特別是指涉及耳蝸內的聽毛細胞退化、受傷或死亡的感音神經性聽力障礙。聽毛細胞的損傷可以透過下文實施例3的組織化學分析和/或上述聽力檢查所得到聽力圖顯示對於中、高頻音失去敏感性來進行評估。

在較佳的具體例中，所述聽力障礙是導因於聽毛細胞的先天性遺傳缺陷（例如粒線體DNA突變、OTOF 基因突變）、後天性化學或物理損傷（例如耳毒性藥物中毒、噪音傷害）、傳染性病原感染（例如流行性腦膜炎、流行性腮腺炎、麻疹、猩紅熱、流行性感冒）或是老年性功能退化（例如因血管硬化造成聽毛細胞供血不足）。在更佳的具體例中，所述聽力障礙是由耳毒性藥物所引發。本案所使用的術語“耳毒性藥物”是指給藥後可能造成耳蝸中的外聽毛細胞和/或內聽毛細胞的損傷的藥劑，其包括但不限於（1）胺基苷類抗生素，例如慶大黴素、卡那黴素、多粘菌素、雙氫鏈黴素、新黴素等；（2）抗癌藥劑，包括含鉑化學治療藥物（例如順鉑、卡鉑（carboplatin）、奈達鉑（nedaplatin）、奧沙利鉑（oxaliplatin）、洛鉑（lobaplatin）和米鉑（miriplatin））、長春花鹼類抗癌劑、氨甲蝶呤（methotrexate）等；（3）抗虐疾用藥，例如奎寧；（4）利尿劑，例如依他尼酸（ethacrynic acid）、呋塞米（furosemide）；（5）類固醇，例如促腎上腺皮質激素、去氫可的松（prednisone）；（6）非類固醇型鎮熱解痛劑，例如水楊酸、雙氯芬酸、布洛芬；（7）β受體阻斷劑，例如普拉洛尔（practolol）、美托洛爾（metoprolol）；（8）抗癲癇劑，例如苯妥英（phenytoin）、乙琥胺（ethosuximide）；（9）情緒調整藥物，例如百憂解（prozac）、阿普唑侖（alprazolam）；以及其他藥物，例如沙利度胺（thalidomide）。更佳為所述耳毒性藥物是選自於上述含鉑化學治療藥物，尤以順鉑最佳。

本案發明人藉由將順鉑給予小鼠，從而透過順鉑的耳毒性建立起一個聽力障礙的動物模式，本案藉由將MSCs給予這個動物模式，評估MSCs對於聽力障礙的醫療效果。下文實施例2記載的聽性腦幹反應測驗和實施例3記載的組織化學分析，它們的實驗結果一致性地顯示出，由順鉑所引發的聽力障礙的典型症狀，例如聽力減退和聽毛細胞損傷，可以藉由給予MSCs而改善。值得注意的是，給予耳毒性藥物是被選用做為代表性的聽力障礙引發模式，因為藉其所引發的典型聽力障礙症狀，也普遍出現於由其他因素所引發的聽力障礙。

雖然不希望被任何理論所拘束，但我們推測，當MSCs進入聽力障礙患者體內後，可以分泌多種生長因子、細胞因子和趨化因子，這些因子可以增強細胞存活、修復細胞、減少發炎。MSCs也可能透過釋出外泌微泡而降低細胞的氧化壓力，避免其邁向凋亡。

因此，本案涵蓋了MSC用於治療個體的聽力障礙的醫學用途，以及治療個體的聽力障礙的方法，該方法包括向個體施用有效量的MSC。

本文所用的術語“個體”意在涵蓋人類或非人類脊椎動物，例如非人類哺乳動物。非人類哺乳動物包括家畜、伴侶動物、實驗動物和非人類靈長類動物。非人類個體還包括但不限於馬、牛、豬、山羊、狗、貓、小鼠、大鼠、豚鼠、沙鼠、倉鼠、水貂和兔。應理解的是，較佳的個體是人，尤其是患有或有風險患有聽力障礙的人類患者。

本說明書所稱“治療”意指將本案說明書所述情緒疾病或是它們的一或多種症狀的進展予以逆轉、緩和、延遲發作或抑制。在一些具體例中，治療可以在發展出一或多種症狀後再施行。治療亦可於症狀解除後持續施行，以延遲其復發。

MSCs可以搭配一藥學可接受性載劑共同調配，而製作成適合給予個體的間質幹細胞組成物。本案所稱“藥學可接受性載劑”意指被使用做為承載MSCs的載體的惰性物質，其對於施用的部位不具有毒性、刺激性、熱原性、抗原性及溶血性，而且無實質的藥理活性，也不會妨礙所述MSCs的有益效果的發揮。這些藥學或化妝品可接受性載劑均為本案所屬技術領域中具有通常知識者所熟悉（請參見Remington: The Science and Practice of Pharmacy , Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995)；Hoover, John E.,Remington’s Pharmaceutical Sciences , Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975；Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds.,Pharmaceutical Dosage Forms , Marcel Decker, New York, N.Y., 1980；以及Pharmaceutical Dosage Fo rmsand Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 1999)）。一般來說，藥學可接受性載劑的用量是依據組成物的總重量為基準為約1%至約99.9%，較佳為約50%至約99%。藥學可接受性載劑的適用種類視組成物的形式而定。

MSCs可以通過任何合適的途徑施用給個體。在一個較佳的具體例中，間質幹細胞組成物被製備成注射劑，其呈現無菌的液體溶液或懸浮液的形式，以將MSCs經由靜脈、動脈或脊髓液等位置導入個體體內。在這個具體例中，較佳為所述藥學可接受性載劑與個體的血液等滲。合適的藥學可接受性載劑包括但不限於水、生理食鹽水、平衡鹽溶液（例如磷酸鹽緩衝生理鹽水（PBS）、漢克氏平衡鹽溶液（HBSS））、植物油、右旋糖、甘油、乙醇、潤濕劑、乳化劑和pH緩衝劑。在一些具體例中，可能需要用防腐劑（例如硫柳汞或疊氮化鈉）配製組成物，以利於長期儲存。載劑還可以含有其它藥學上可接受的賦形劑，用於改變或維持組成物的pH值、滲量、粘度、透明度、顏色、無菌性、穩定性、溶解速率或氣味。

根據本發明，術語“施用”包括通過任何合適的途徑將處在合適的組成物中的MSCs分配、遞送或給予給個體，以將所述間質幹細胞組成物或其代謝物組（metabolome）傳輸至個體中的所需要的位置，從而使所述組成物或其代謝物組與目標細胞或組織接觸。在一個具體例中，間質幹細胞組成物在情緒疾病發作之前、期間和/或之後施用給個體。在一個具體例中，可以將一種或多種治療劑與間質幹細胞組成物一起施用給個體。間質幹細胞組成物可以在施用所述一種或多種治療劑之前（例如0.5小時、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、18小時、24小時、36小時、2天、3天、4天、5天、 6天、7天或更長時間）、同時或之後（例如0.5小時、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、18小時、24小時、36小時、2天、3天 、4天、5天、6天、7天或更長時間）施用。間質幹細胞組成物和所述治療劑可以通過不同的方案（例如不同的計畫）、不同的施用途徑或不同的劑量來施用。

間質幹細胞組成物以治療有效量施用給個體，以引發研究人員、獸醫、醫生或其他臨床醫師所尋求的在細胞、組織、系統、動物或人類中的生物學或藥物回應，並較佳為穩定、改善或緩解個體中疾病狀況的一種或多種症狀，例如耳鳴、聽毛細胞死亡、聽力下降或喪失、耳部悶塞感、間歇性聲音模糊、語言辨識能力變差或失真、幻聽、回避社交、眩暈、以及頭痛。因此，術語“有效量”是指當向個體施用有效量的組成物時，產生觀察到上述任何一個症狀減輕的藥效的間質幹細胞組成物的量。儘管有效量通常通過將它們與不存在有本文公開的間質幹細胞組成物時觀察到的效果（即，對照組）相比較的效果來確定，但實際劑量根據所選擇的特定施用途徑來計算。可以根據所選擇的特定施用途徑來計算實際劑量。相關領域中具有通常知識者會常規地進一步細化確定適當的施用劑量所需的計算。因此，當施用給人類個體時，較佳為每天、每週或一周兩次以1×10⁴ 個細胞/kg體重/天至1×10⁷ 個細胞/kg體重/天的用量，例如以5×10⁵ 個細胞/kg體重/天至5×10⁶ 個細胞/kg體重/天的用量施用所述間質幹細胞組成物。

在較佳的具體例中，所述間質幹細胞組成物用於自體細胞治療，也就是預先由一個體取得間質幹細胞，於體外培養後再植回同一個體。如本案所屬技術領域中具有通常知識者所知悉，自體免疫療法副作用相對較少，安全性較高，也不容易發生過敏和排斥的現象。

在另一具體例中，所述組成物主要由MSCs及前述藥學可接受性載劑所組成。此處所稱“主要由…所組成”意指所記載的成分組合中不排除另外含有實質上不會影響前述組成物的性質和功能的其他未記載組成分。在另一具體例中，本案組成物僅由MSCs及前述藥學可接受性載劑所組成。

下列實施例僅供用於例示本發明，而非限制本發明的範圍。實施例中所載資料，皆以平均值+ 標準差呈現。使用司徒登氏t -測驗來進行雙組比較，且使用單因子變異數分析來比較多組之間的平均數差異。p值小於0.05時認定為顯著差異。

製備例1：皮膚間質幹細胞的製備

將人類皮膚檢體切成約3 mm² 大小後移至內含中性蛋白酶（dispase）及膠原蛋白酶的酵素反應液中，於37℃下作用16小時。將皮膚檢體碎塊及酵素反應液移至離心管中，加入等體積補充有適量血清的杜氏改良伊格爾培養基（DMEM；美國密蘇里州聖路易市Sigma Chemical Co.）進行酵素中和。以1500 rpm離心5分鐘，移除上清液，再加入含有血清及抗生素的DMEM培養基將細胞懸浮並移至新的培養皿中，置於二氧化碳培養箱中在37℃下進行培養。每3-4天更換一次新鮮培養基，待細胞密度約八成滿時進行繼代。利用流式細胞儀偵測皮膚間質幹細胞的分化簇標記（CD markers），即細胞表面抗原CD73、CD90及CD105的表現，以確認培養的細胞是皮膚間質幹細胞。

去除皮膚間質幹細胞培養物的水性部分，並且將細胞加以潤洗，隨後以胰蛋白酶處理細胞使其脫離培養容器，再使細胞懸浮於水性載劑中備用。

實施例1：聽力損傷的小鼠模式

8周齡的C57BL/6雌性小鼠購自於樂斯科生物科技股份有限公司（台北市）。動物飼養於無菌環境並且採24小時自動溫濕調控，維持室溫20-22^o C，濕度50%±5%，照明週期為白天夜晚12/12小時，動物餵以標準囓齒動物飼料。如圖1所示，由第0日至第5日每天透過腹腔注射順鉑（購自於美國密蘇里州聖路易市Sigma–Aldrich Chemical Co.），劑量為4 mg/kg小鼠體重，以建立聽力損傷的動物模式。對照組為腹腔注射等體積的0.25%二甲基亞碸（DMSO）。

將動物隨機分成五組，包括（I）DMSO-載劑對照組：在第0日至第5日，每天透過腹腔注射100μL含有0.9%氯化鈉和0.25%二甲基亞碸的水溶液，第8日以尾靜脈注射100μL不含MSC的載劑（n=6；即本組有6隻小鼠）；（II）DMSO-MSC對照組：在第0日至第5日，每天透過腹腔注射100μL含有0.9%氯化鈉和0.25%二甲基亞碸的水溶液，第8日以尾靜脈注射100μL製備例1所製得的MSC製劑（3×10⁶ 個細胞）（n=6）；（III）CIS-載劑組：第0日至第5日每天透過腹腔注射100μL順鉑（溶於0.9% NaCl），第8日以尾靜脈注射100μL不含MSC的載劑（n=9）；（IV）CIS-MSC組：第0日至第5日每天透過腹腔注射100μL順鉑，第8日以尾靜脈注射100μL製備例1所製得的MSC製劑（ 1×10⁶ 個細胞）（n=9）；以及（V）CIS-MSC組：第0日至第5日每天透過腹腔注射100μL順鉑，第8日以尾靜脈注射100μL製備例1所製得的MSC製劑（ 3×10⁶ 個細胞）（n=9）。

實施例2：聽性腦幹反應（ABR）測驗

如圖1所示，對於實施例1建立的動物模式，於第0日給予順鉑前以及於第15日分別以聽性腦幹反應（ABR）測驗來評估各組動物的聽力閾值，並且記錄其差值為閾值偏移（單位為分貝（dB））。閾值偏移的數值愈大，表示由順鉑所引發的聽力損傷愈嚴重。在ABR測驗中，使用氯胺酮（40mg/kg）和甲苯噻嗪（xylazine；10mg/kg）來麻醉動物，而且在整個測驗過程在熱墊上進行使動物保暖。將探針電極插入動物的頭頂皮下，並且將參考電極插入動物雙耳耳殼下方的皮膚底下，再利用ABR工作站（BIOPAC Systems公司）給予低頻4kHz、中頻8kHz或高頻12 kHz的系列猝發音。ABR波形是在10毫秒的區間內加以平均。聲音強度是在聽力閾值附近以每10分貝的間隔變化。依據ABR記錄，經由兩位獨立的觀察人員進行盲析。

圖2是依據三個獨立ABR測驗所得到的平均值繪製而成的柱狀圖，其顯示第(III)組被注射順鉑的小鼠，無論給予低頻、中頻或高頻的系列猝發音，其ABR測驗的閾值偏移都比第(I)組被注射DMSO的小鼠更高，且統計分析都達到p>0.05的顯著性。這指出被注射順鉑的小鼠相較於對照組顯現出顯著的聽力減退，本申請成功地建立了聽力損傷的動物模式。經過MSC製劑的注射後（第(IV)組和第(V)組），由順鉑所引發的閾值偏移在高頻猝發音下觀察到顯著的改善，其與第(III)組的比較達統計上的顯著差異，但在低頻和中頻猝發音下則未觀察到顯著差異。這是由於小鼠對於12 kHz以上的高頻音具有敏銳的聽力，而對於低頻和中頻音則比較不敏感。本實施例的結果指出，注射MSC製劑具有改善聽力損傷的效果。

實施例3：組織化學分析

在第22日，以異氟醚麻醉實施例1的各組小鼠，並且先灌注以生理鹽水，再灌注以多聚甲醛磷酸鹽緩衝液。採集位於動物內耳的耳蝸組織，並且於4°C下以新配製成的4%多聚甲醛加以固定30分鐘。將耳蝸組織包埋於冷凍組織包埋劑中，隨後切片成10微米厚度。於37°C下，使所有的切片與4',6-二脒基-2-苯基吲哚、MYO7A多株抗體和鬼筆環肽共同培育，以利用螢光染色法顯示耳毛細胞的細胞核、肌凝蛋白和細胞骨架。經過磷酸緩衝液洗滌三次後，在雷射共軛焦顯微鏡下（型號TCS-SP2；德國海德堡市Leica Microsystems Heidelberg GmbH）觀察耳毛細胞狀況。

圖3顯示，其顯示第(III)組被注射順鉑的小鼠，其耳毛細胞比第(I)組被注射DMSO的小鼠的耳毛細胞呈現出明顯的缺損（如箭頭所指），這再次指出本申請成功地建立了聽力損傷的動物模式。相較於第(III)組，尾靜脈施打MSC製劑的小鼠（第(IV)組和第(V)組），其耳毛細胞的缺損情形有明顯的改善。

以上諸實施例僅供說明本發明之用，而並非對本發明的限制，相關領域中具有通常知識者，在不脫離本發明的技術範圍做出的各種變換或變化也應屬於本發明的保護範疇。

無

圖1是聽力障礙的小鼠模式的建立流程，顯示在第0日至第5日每天透過腹腔注射順鉑，而於第8日經由尾靜脈注射人類皮膚間質幹細胞；

圖2為柱狀圖，顯示各組小鼠模式在聽性腦幹反應（ABR）測驗中的表現；以及

圖3為經過免疫螢光染色的組織分析照片，顯示各組小鼠模式的耳蝸組織中的聽毛細胞狀況。

Claims (10)

1. 一種間質幹細胞組成物在製造一供用於治療個體的聽力障礙的醫藥品上的用途，其中該間質幹細胞組成物包含間質幹細胞以及一藥學可接受性載劑。
2. 如請求項1所述的用途，其中該間質幹細胞是皮膚間質幹細胞。
3. 如請求項2所述的用途，其中該皮膚間質幹細胞是人類皮膚間質幹細胞。
4. 如請求項1所述的用途，其中該聽力障礙選自於由感音神經性聽力障礙、混合性聽力障礙和中樞性聽力障礙所組成的群組。
5. 如請求項4所述的用途，其中該聽力障礙選自於感音神經性聽力障礙。
6. 如請求項5所述的用途，其中該感音神經性聽力障礙是由耳毒性藥物所引發。
7. 如請求項6所述的用途，其中該耳毒性藥物選自於含鉑化學治療藥物。
8. 如請求項7所述的用途，其中該含鉑化學治療藥物選自於順鉑。
9. 如請求項1所述的用途，其中該個體是人。
10. 如請求項1所述的用途，其中該間質幹細胞組成物被製備成無菌液體溶液或懸浮液的注射劑形式。

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