CN110772481A - 硫化氢修饰的骨髓间充质干细胞外囊泡在缺氧缺血性脑损伤中的应用 - Google Patents

硫化氢修饰的骨髓间充质干细胞外囊泡在缺氧缺血性脑损伤中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供硫化氢修饰的骨髓间充质干细胞外囊泡在缺氧缺血性脑损伤中的应用,属于分子诊断和分子生物学技术领域。本发明通过研究发现采用H2S预处理MSCs胞外囊泡(H2S‑EVs)可有效提高其在缺氧缺血性脑损伤(HIBD)中的疗效,具体的,H2S‑EVs能够有效减轻缺氧缺血性脑损害诱导的脑水肿;减轻缺氧缺血性脑损害诱导的脑梗死;抑制促炎因子表达;促进抑炎因子的表达;促使原驻小胶质细胞和浸润的巨噬细胞向M2表型的极化;改善缺氧缺血性脑损害的远期学习和记忆功能。因此具有良好的实际应用之价值。

Description

硫化氢修饰的骨髓间充质干细胞外囊泡在缺氧缺血性脑损伤 中的应用
技术领域
本发明属于分子诊断和分子生物学技术领域,具体涉及硫化氢修饰的骨髓间充质干细胞外囊泡在缺氧缺血性脑损伤中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解,而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
伴随着二胎政策的实施,迎来了一个新的生产高峰,然而高龄孕妇易发新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)的高危因素将是人们面临的重要问题。HIE指围产期窒息导致的缺氧缺血性脑损害(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD),是临床上引起新生儿死亡以及幸存者长期神经功能缺陷的常见疾病,给社会和家庭带来沉重负担。目前临床上针对该病的治疗主要是营养支持、对症治疗,然而疗效并不理想。因此,寻找更为有效的治疗方法和靶点成为当前迫切需要解决的问题。
目前,骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)来源的细胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)被广泛认为是MSCs发挥其作用的重要方式,基于细胞外囊泡的替代干细胞治疗疾病的方法具有很大潜力,为细胞外囊泡的应用提供了新思路。细胞外囊泡(EVs)是由各种细胞分泌的小的细胞外囊泡,具有类似于细胞膜的双层膜结构,能够与靶细胞进行融合。外泌体直径大约在30至150nm之间,其内含有多种具有生物活性公功能的物质,如:蛋白质、脂质、mRNA、微小RNA(microRNA,miRNA)和长链非编码RNA等,能够对靶细胞的功能和信号进行调控。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明提供硫化氢修饰的骨髓间充质干细胞外囊泡在缺氧缺血性脑损伤中的应用。本发明通过研究发现采用H2S预处理MSCs胞外囊泡(H2S-EVs)可有效提高其在缺氧缺血性脑损伤(HIBD)中的疗效,从而完成本发明。
为实现上述技术目的,本发明采用的技术方案如下:
本发明的第一个方面,提供EVs在制备预防/或治疗缺氧缺血性脑损伤(HIBD)产品中的应用。
其中,所述EVs为骨髓间充质干细胞来源的细胞外囊泡;
所述细胞外囊泡直径为40-100nm;
更进一步的,所述EVs为硫化氢修饰的骨髓间充质干细胞来源的细胞外囊泡。与普通EVs相比,硫化氢修饰的骨髓间充质干细胞来源的细胞外囊泡(H2S-EVs)在缺氧缺血性脑损伤治疗上效果更佳。
所述H2S-EVs制备方法包括:将硫氢化钠(NaHS)加入骨髓间充质干细胞培养基中孵育,收集骨髓间充质干细胞分泌的细胞外囊泡即得。
本发明的第二个方面,提供一种产品,所述产品活性成分包括EVs;所述产品具有预防/或治疗缺氧缺血性脑损伤的作用,更具体的,其具有如下任意一种或多种用途:
(a)减轻缺氧缺血性脑损害诱导的脑水肿;
(b)减轻缺氧缺血性脑损害诱导的脑梗死;
(c)改善缺氧缺血性脑损害诱导的小胶质细胞激活;
(d)抑制促炎因子的表达;
(e)促进抑炎因子的表达;
(f)促使原驻小胶质细胞向M2表型的极化;
(g)促使浸润单核/巨噬细胞向M2表型的极化;
(h)改善缺氧缺血性脑损害的远期学习和记忆功能。
所述EVs为骨髓间充质干细胞来源的细胞外囊泡。
进一步的,所述EVs为硫化氢修饰的骨髓间充质干细胞来源的细胞外囊泡。
所述产品可以为药物。
本发明的有益技术效果:
本发明首次研究发现并证实采用H2S预处理MSCs胞外囊泡(H2S-EVs)可有效提高EVs在HIBD中的疗效。具体的,H2S-EVs能够有效减轻缺氧缺血性脑损害诱导的脑水肿;减轻缺氧缺血性脑损害诱导的脑梗死;抑制促炎因子表达;促进抑炎因子的表达;促使原驻小胶质细胞和浸润的巨噬细胞向M2表型的极化;改善缺氧缺血性脑损害的远期学习和记忆功能。因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例中MSCs-EVs的鉴定相关图;其中,(A)Western blot检测EVs表面标志物CD9、TSG101和Calnexin在MSCs、EVs和H2S-EVs中的表达情况;(B)qNano检测MSCs-EVs直径分布图;(C)透射电镜下观测细胞外囊泡形态。标尺=100nm。
图2为本发明实施例中H2S-EVs的分布和定位相关图;其中,(A)PKH67标记的H2S-EVs在HIBD后24h经心脏给药一次。给药后3天取脑组织行冰冻切片进行免疫荧光实验。标尺=50μm。(A1)在A中用框圈出PKH67热点区域的放大图,标尺=50μm。(B)LPS和PKH67染料标记的H2S-EVs共孵育原代小胶质细胞2h,8h和24h,使用Iba-1进行免疫荧光染色。标尺=20μm。(B1)B中方框区域放大的图,显示了PKH67热点的聚集部位,标尺=5μm。N=4/组。
图3为本发明实施例中观察H2S-EVs对HIBD后新生小鼠脑水肿的影响图。其中,(A)脑组织含水量测定,N=4/组。(B)TTC染色检测脑组织梗死程度,N=4/组。(C)尼氏染色检测脑组织丢失情况,标尺=1000μm。N=4/组。(D)Western blot检测HIBD后三天损伤侧皮层区组织Cleavedcaspase-3和caspase-3的表达量,N=4/组。Value=mean±SD;*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。数据使用单因素方差分析并用Bonferroni校正。
图4为本发明实施例中H2S-EVs抑制HIBD诱导的神经炎症相关图。(A)在Sham,HI,HI+EVs和HI+H2S-EVs各组中使用Iba-1进行小胶质细胞免疫组化染色,标尺=50μm。检测不同组间Iba-1阳性细胞,N=6/组。(B)热图反应HI后三天各组间促炎因子和抑炎因子的mRNA表达水平,N=6/组。Value=mean±SD;**p<0.01,***p<0.001。数据使用单因素方差分析并用Bonferroni校正。
图5为本发明实施例中H2S-EVs治疗促进HIBD后CD11b+/CD45low和CD11b+/CD45high向M2型极化相关图,其中,(A-B)在HIBD后3天损伤侧皮层中,使用Flow Cytometry区分原驻小胶质细胞细胞(CD11b+/CD45low)和浸润的免疫细胞(CD11b+/CD45high)。(C)通过CD11b+/CD45high/CD86high画门圈出M1型浸润的单核/巨噬细胞,通过CD11b+/CD45high/CD206high画门圈出M2型浸润的单核/巨噬细胞。(D)通过CD11b+/CD45low/CD86high画门圈出M1型原驻小胶质细胞,通过CD11b+/CD45low/CD206high画门圈出M2型原驻小胶质细胞。(E)柱状图表示CD11b+/CD45high浸润的单核/巨噬细胞和CD11b+/CD45low原驻小胶质细胞的定量分析。(F)柱状图表示CD86阳性细胞在CD11b+/CD45high中百分比(即M1型单核/巨噬细胞在所有浸润的单核/巨噬细胞中的百分比)的定量分析;CD206阳性细胞在CD11b+/CD45high中百分比(即M2型单核/巨噬细胞在所有浸润的单核/巨噬细胞中的百分比)的定量分析。(G)柱状图表示CD86阳性细胞在CD11b+/CD45low中百分比(即M1型小胶质细胞在所有原驻小胶质细胞中的百分比)的定量分析;CD206阳性细胞在CD11b+/CD45low中百分比(即M2型小胶质细胞在所有原驻小胶质细胞中的百分比)的定量分析。(H)柱状图表示在原驻小胶质细胞和浸润单核/巨噬细胞中M1/M2比值的定量分析。每管3个脑组织。Value=mean±SD;*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。数据使用单因素方差分析并用Bonferroni校正。
图6为本发明实施例中H2S-EVs改善了新生小鼠HIBD后的远期学习和记忆障碍相关图;其中,(A)在HIBD后35天,使用新物体识别实验(novelobject recognition test,NORT)对小鼠的远期学习和记忆能力进行评估。(B)在HIBD后35天,水迷宫(Morris watermaze,MWM)实验评估小鼠的远期学习和记忆能力。(C)在第6天的空间探索实验中,将平台从水迷宫中撤出,测量以下指标:1)各组小鼠穿越原平台所在位置的次数,2)在原平台所在象限的时间,3)首次到达原平台所在位置的时间。(D)第六天游泳轨迹展示,N=8/只。(E)脑组织形态和尼氏染色。标尺=1000μm,N=4/组。Values=mean±SD,*p<0.05,**p<0.01。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是例示性的,旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解,本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案;还应当理解,本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案,而不是为了限制本发明的保护范围。
本发明的一个典型实施方式中,提供EVs在制备预防/或治疗缺氧缺血性脑损伤产品中的应用。
其中,所述EVs为骨髓间充质干细胞来源的细胞外囊泡;
所述细胞外囊泡直径为40-100nm;
本发明的又一具体实施方式中,所述EVs为硫化氢修饰的骨髓间充质干细胞来源的细胞外囊泡(H2S-EVs)。
所述H2S-EVs制备方法包括:将硫氢化钠(NaHS)加入骨髓间充质干细胞培养基中孵育,收集骨髓间充质干细胞分泌的细胞外囊泡即得。
本发明的又一具体实施方式中,提供一种产品,所述产品活性成分包括EVs;所述产品能够用于预防/或治疗缺氧缺血性脑损害,更进一步的,具有如下任意一种或多种用途:
(a)减轻缺氧缺血性脑损害诱导的脑水肿;
(b)减轻缺氧缺血性脑损害诱导的脑梗死;
(c)改善缺氧缺血性脑损害诱导的小胶质细胞激活;
(d)抑制促炎因子的表达;
(e)促进抑炎因子的表达;
(f)促使原驻小胶质细胞向M2表型的极化;
(g)促使浸润单核/巨噬细胞向M2表型的极化;
(h)改善缺氧缺血性脑损害的远期学习和记忆功能。
所述EVs为骨髓间充质干细胞来源的细胞外囊泡。
本发明的又一具体实施方式中,所述EVs为硫化氢修饰的骨髓间充质干细胞来源的细胞外囊泡。
所述产品为药物,所述药物进一步还包含药学上可接受的载体。
本发明中,药学上可接受的载体在领域内是熟知的,本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。
在本发明的又一具体实施方式中,药学上可接受的载体包括稀释剂和赋形剂。
在本发明的又一具体实施方式中,合适的药学上可接受的载体的实例包括但不限于:(1)Dulbecco磷酸缓冲盐溶液,pH约7.4,包含或不包含大约1mg/ml到25mg/ml人血清白蛋白;(2)0.9%盐水(0.9%w/v氯化钠),和(3)5%(w/v)葡萄糖;也可以包含抗氧化剂例如色胺和稳定剂例如Tween20。
在本发明的又一具体实施方式中,本发明的药物可以是任何适宜的剂型。例如,悬浮剂、乳化剂等。本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送或者局部注射递送到感兴趣组织中。可选地经由静脉内、经皮、鼻内、粘膜或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是,本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化,如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明,但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例
1.实验动物:由山东大学动物中心分批购买出生后三天(postnatal day3,P3)C57BL/6J整窝鼠。饲养于山东大学动物中心SPF级动物饲养房,温度20±2℃,光照12小时与黑暗12小时循环。动物饲养过程中给予充足的鼠粮和水,并可以使动物自由的获得水与实物,使其适应环境成长至出生后7天。动物实验按照国际医学科学组织理事会(CIOMS)提供的《动物研究国际指导原则》进行,严格遵守规定,程序由山东大学动物伦理与福利委员会批准。
2.新生小鼠HIBD模型建立:取出生7天(P7)C57BL/6J小鼠,参照Rice–Vannucci方法,制作HIBD模型。小鼠麻醉后,颈正中切口,分离右侧颈总动脉后双重结扎,剪断血管,缝合切口。每只乳鼠手术时间约10分钟,术后室温恢复0.5h,将乳鼠放入乏氧培养箱(8%O2+92%N2的混合气体),37℃缺氧120min。苏醒后返回母鼠身边继续喂养。
3.实验分组:将新生小鼠随机分为以下4组:对照组(Sham组),HIBD,HIBD+EVs组,HIBD+H2S-EVs组,MSCs-EVs(50μL)于HIBD后24h经心脏一次给药,在外泌体处理后3天和35天,检测病理学、基因蛋白表达和行为学变化。
4.骨髓间充质干细胞(MSCs)的提取与培养:在本实验中使用4周龄的C57BL/6J鼠提取原代骨髓间充质干细胞。具体步骤如下:
从山东大学动物中心购买4周龄雄性C57BL/6J鼠适应性喂养一周后开始提取。首先将超净台以及细胞提取相关物品置于原代超净台内,紫外灯照射半小时。将老鼠深度麻醉处死后置于75%的酒精内浸泡消毒15分钟,所有器械均高压蒸汽灭菌。从腹股沟处剪断小鼠后肢,注意勿剪断股动脉及股静脉。剥离附着于其上的皮肤和肌肉组织,暴露出小鼠鼠股骨,剪断小鼠股骨头和胫骨远端区域,将细胞从股骨中冲洗出来,反复冲洗确保更多的细胞从股骨中冲洗而出。细胞悬浮于含10%胎牛血清的DMEM/F12中,培养2-3天后,原代间充质干细胞贴壁,更换培养基去除未贴壁细胞以及死细胞。当原代间充质干细胞生长至75%-85%时进行细胞传代,当细胞传至第三代时可用于后续实验。
5.H2S的供体-NaHS孵育:P3的MSCs生长至对数期,去除培养基,PBS清洗3次后,把NaHS(1μM)加入无外泌体的血清的DMEM/F12。孵育24h后收取培养基于50ml离心管中。
6.MSCs外囊泡(MSCs-EVs)的收集和鉴定:
6.1 MSCs-EVs的收集:在本实验中,使用第三代细胞提取细胞外囊泡。首先使用10万g超高速离心法弃去底部沉淀后获取不含细胞外囊泡的血清。当MSCs生长至50%-60%时,弃去其培养基,使用PBS冲洗三次后替换无不含细胞外囊泡胎牛血清的完全培养基培养细胞,培养36小时后收集细胞上清液。将所收集的细胞上清液首先在4℃条件下8000转离心半小时,以去除死细胞和细胞碎片,然后使用0.22微米的滤器过滤去除较小的细胞碎片。将所获取的上清液吸入100kd的超滤管内,在4℃条件下使用6000g离心半小时,是上清液浓缩至约200微升,最后使用qEV试剂盒纯化,将200微升富含细胞外囊泡的浓缩液加入分离柱内,在分离柱底部会有液体不断滴出,在分离柱顶端不断加入PBS溶液,弃去前三毫升液体后开始收集,可收集到3ML富含细胞外囊泡的PBS悬液,用于后续实验。
6.2利用透射电镜鉴定MSCs-EVs形态:取8μl EVs悬液滴至载体铜网(220目)上,静置2min,用滤纸吸去铜网外侧多余样品,加入8μl 1%的磷钨酸负染液滴于铜网上,室温复染2min,再用滤纸小心吸去多余染液,铜网放置白炽灯下烤干约10min。利用透射电镜下观察并采集照片。
6.3利用Western blot鉴定MSCs-EVs表面标志物:提取好的MSCs-EVs,加入RIPA蛋白裂解液裂解组织。利用BCA法蛋白浓度定量,常规Westernblot检测CD9和CD81的表达
6.4利用流式鉴定MSCs-EVs表面标志物:将提取后的EVs置于离心管中,离心去上清,用PBS重悬至100μl,加入10μl FITC-CD9/CD81抗体混匀,室温避光孵育30min。再次加入500μl PBS混匀,离心去上清。用PBS重悬至100μl EVs,利用流式细胞仪检测EVs表面标记物表达。
6.5利用qNano仪器鉴定EVs直径和含量:qNano仪器主要基于可调电阻脉冲原理(Tunable Resistive Pulse Sensing,TRPS)来表征粒子(50nm–10um)的一些特征。参数如下:0.76V电压,125nA电流,纳米孔臂直接的距离设定为47.12mm.首先利用PBS将MSCs-EVs1:100稀释,然后取稀释好的EVs(40μl)加入上样槽中,加压至700Pa,让样品匀速通过纳米孔。当每个颗粒通过样品孔时,会对原电场电流产生一个瞬间变化。每次样本测试结束后,在上样槽中加入已知浓度和大小的标准样品CPC100和样本进行校准比对,最后利用软件ICS.3.3.2.2000进行校准处理。
7.小胶质细胞摄入MSCs-EVs的检测:
7.1用PKH67Green Fluorescent Cell Linker Kit染料标记MSCs-EVs:根据试剂说明书:用1mL稀释液C配置新鲜的PKH67溶液(浓度为4×10-6mol/L),在1mL 2×MSCs-EVs中加入1mL 2×PKH67孵育5min,加入2mL血清孵育1min终止反应。离心弃上清,用不含血清培基进一步洗3遍,沉淀用200μL PBS重悬外泌体备用。
7.2整体动物的检测:PKH67标记的EVs(50μL)于HIBD后24h经心脏给药,在EVs处理后3天、7天、14天和28天,每组选取10张大脑冠状切片(between-1.60to-2.00mm frombregma),DAPI复染细胞核,荧光显微镜观察拍照。
7.3离体细胞的检测:将原代小胶质细胞接种于已铺有多聚赖氨酸的盖玻片上贴壁培养,细胞密度至70-80%后用PBS漂洗3次,加入PKH67标记的MSCs-EVs至原代小胶质中孵育24h。收集细胞爬片DAPI复染细胞核,荧光显微镜观察拍照。
8.病理变化:HIBD后3天,取HIBD小鼠,检测脑组织含水量,断头取脑,电子天平分别称出左右侧大脑湿重,然后将左脑置于80℃恒温干燥箱中48h后取出,称干重。根据以下公式计算脑组织含水量及脑损伤程度:脑组织含水量=(损伤侧湿重-损伤侧干重)/损伤侧湿重×100%。
9.TTC和nissl染色:外泌体处理后3天、7天、14天和28天脑组织常规TTC和nissl染色观察小鼠受损脑区形态变化和组织丢失情况。
10.受损脑区神经元凋亡检测:TUNEL免疫荧光法检测:每组选取10张大脑冠状切片(between-1.60to-2.00mm from bregma),PBS冲洗后,用0.1%Triton X-100,0.1%柠檬酸钠在冰上促渗2min。制备TUNEL反应混合液,滴加50μl TdT+450μl荧光素标记的dUTP液;37℃避光孵育1h,DAPI核复染5min,封片后荧光显微镜(OLYMPUS-BX51)下观察右侧脑区TUNEL阳性细胞数。
11.Real-time PCR:检测损伤侧脑组织皮层区CD11b、CD32、CD86、CD206、COX2、IL-1β、IL-6、iNOS、TNFα的表达。
12.免疫组化小胶质细胞激活程度检测:使用免疫组化标准化操作流程,滴加Iba-1一抗过夜,二抗孵育后苏木素染色,盐酸酒精分化后氨水反蓝,封片后观察。
13.流式检测小胶质细胞激活情况:每组选取受损脑区,分离、剪碎后放置于10ml的消化液中消化(1mg/ml collagenase II,0.5mg/ml of DNase I in PBS)37℃1h。经过70μm 尼龙网状过滤。420×g室温离心10min后,弃上清,用4ml 40%Percoll重悬沉淀。然后在细胞悬液加入4ml 75%Percoll溶液,离心500×g室温20min。小心吸取表面的细胞,使用anti-mouse CD45-APC,anti-mouse CD11b-FITC,anti-mouse CD86-PercpCy5.5,anti-mouse CD206-PE染色后上机检测。
实验结果:
1.MSCs-EVs的鉴定
如图1所示,(A)Western blot检测EVs表面标志物CD9在两种EVs和MSCs中的表达无明显差别;TSG101在MSCs中表达量较少,在两种EVs中则均有表达。内质网特异性钙结合蛋白Calnexin在MSCs中表达明显而极少出现在细胞外囊泡中。(B)qNano检测MSCs-EVs直径分布图,结果显示提取的囊泡直径在40-100nm之间,符合外泌体的特点。(C)透射电镜下观测细胞外囊泡形态,可见MSCs-EVs有圆形或类圆形膜结构,呈茶托形。
2.H2S-EVs的分布和定位(体内和体外)
如图2所示,(A)PKH67标记的H2S-EVs在HIBD后24h经心脏给药一次。给药后3天取脑组织行冰冻切片进行免疫荧光实验。结果显示PKH67染料标记的H2S-EVs被Iba-1阳性细胞所摄取;其中(A1)为在A中用框圈出PKH67热点区域的放大图。(B)LPS和PKH67染料标记的H2S-EVs共孵育原代小胶质细胞2h,8h和24h,使用Iba-1进行免疫荧光染色,结果显示H2S-EVs被原代小胶质细胞摄取。标尺=20μm。(B1)为B中方框区域放大的图,显示了PKH67热点的聚集部位。
3.H2S-EVs对HIBD后新生小鼠的治疗
观察H2S-EVs对HIBD后新生小鼠脑水肿的影响。两种EVs在HIBD后24h经心脏给药一次。给药后3天取脑组织进行实验。如图3所示,(A)脑组织含水量测定,结果显示与普通EVs相比H2S-EVs更能减轻其脑水肿程度。(B)TTC染色检测脑组织梗死程度,使用Image-ProPlus 6.0软件进行分析,结果显示与普通EVs相比H2S-EVs更能减轻其脑梗死程度。(C)尼氏染色检测脑组织丢失情况,结果显示与普通EVs相比H2S-EVs更能减轻其脑组织丢失情况。(D)Western blot检测HIBD后三天损伤侧皮层区组织Cleaved caspase-3和caspase-3的表达量,其结果使用Image-Pro Plus 6.0进行分析,结果显示两种EVs治疗均能使得HIBD后三天脑组织皮层区Cleaved caspase-3表达下调,其中H2S-EVs效果更为明显。
4.H2S-EVs抑制HIBD诱导的神经炎症
如图4所示,(A)在Sham,HI,HI+EVs和HI+H2S-EVs各组中使用Iba-1进行小胶质细胞免疫组化染色。检测不同组间Iba-1阳性细胞,N=6/组。结果显示,较之于EVs,H2S-EVs更能改善由于HIBD诱导的小胶质细胞激活。(B)热图反应HI后三天各组间促炎因子和抑炎因子的mRNA表达水平,右侧为基因表达的基础水平,左侧为经Bonferroni校正后方差分析的P值。a-HI VS Sham;b-HI+EVs VS HI;c-HI+H2S-EVs VS HI;d-HI+H2S-EVs VS HI+EVs。结果显示:H2S-EVs更能抑制促炎因子的表达水平,同时能显著上调抑炎因子CD206的表达水平。
5.H2S-EVs治疗促进HIBD后CD11b+/CD45low和CD11b+/CD45high向M2型极化
如图5所示,(A-B)在HIBD后3天损伤侧皮层中,使用Flow Cytometry区分原驻小胶质细胞细胞(CD11b+/CD45low)和浸润的免疫细胞(CD11b+/CD45high)。(C)通过CD11b+/CD45high/CD86high画门圈出M1型浸润的单核/巨噬细胞,通过CD11b+/CD45high/CD206high画门圈出M2型浸润的单核/巨噬细胞。(D)通过CD11b+/CD45low/CD86high画门圈出M1型原驻小胶质细胞,通过CD11b+/CD45low/CD206high画门圈出M2型原驻小胶质细胞。(E)柱状图表示CD11b+/CD45high浸润的单核/巨噬细胞和CD11b+/CD45low原驻小胶质细胞的定量分析。结果显示:在HIBD后H2S-EVs治疗显著减少了外周单核/巨噬细胞的浸润,减少了原驻小胶质细胞的丢失。(F)柱状图表示CD86阳性细胞在CD11b+/CD45high中百分比(即M1型单核/巨噬细胞在所有浸润的单核/巨噬细胞中的百分比)的定量分析;CD206阳性细胞在CD11b+/CD45high中百分比(即M2型单核/巨噬细胞在所有浸润的单核/巨噬细胞中的百分比)的定量分析。结果显示:在HIBD后使用H2S-EVs治疗,可以看到M1型浸润的单核/巨噬细胞百分比有轻微下调,但其差异未有统计学意义;但是,H2S-EVs治疗可以显著上调M2型浸润的单核/巨噬细胞百分比。(G)柱状图表示CD86阳性细胞在CD11b+/CD45low中百分比(即M1型小胶质细胞在所有原驻小胶质细胞中的百分比)的定量分析;CD206阳性细胞在CD11b+/CD45low中百分比(即M2型小胶质细胞在所有原驻小胶质细胞中的百分比)的定量分析。结果显示:H2S-EVs治疗可以明显下调M1型原驻小胶质细胞的百分比。(H)柱状图表示在原驻小胶质细胞和浸润单核/巨噬细胞中M1/M2比值的定量分析。结果显示:H2S-EVs治疗可以明显降低在原驻小胶质细胞和浸润单核/巨噬细胞中M1/M2比值。
6.H2S-EVs改善了新生小鼠HIBD后的远期学习和记忆障碍
如图6所示,(A)在HIBD后35天,使用新物体识别实验(novel object recognitiontest,NORT)对小鼠的远期学习和记忆能力进行评估。(B)在HIBD后35天,水迷宫(Morriswater maze,MWM)实验评估小鼠的远期学习和记忆能力。在HIBD后35-40天,连续5天测量(4次/天)小鼠从入水到找到平台的时间(逃逸潜伏期),即为定位航行实验。(C)在第6天的空间探索实验中,将平台从水迷宫中撤出,测量一下指标:1)各组小鼠穿越原平台所在位置的次数,2)在原平台所在象限的时间,3)首次到达原平台所在位置的时间。(D)第六天游泳轨迹展示。(E)脑组织形态和尼氏染色。结果显示:H2S-EVs治疗有效改善了新生小鼠HIBD后的远期学习和记忆障碍。
应注意的是,以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明,但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.EVs在制备预防/或治疗缺氧缺血性脑损伤产品中的应用;
其中,所述EVs为骨髓间充质干细胞来源的细胞外囊泡。
2.如权利要求1所述应用,其特征在于,所述细胞外囊泡直径为40-100nm。
3.如权利要求1所述应用,其特征在于,所述EVs为硫化氢修饰的骨髓间充质干细胞来源的细胞外囊泡。
4.一种产品,其特征在于,所述产品活性成分包括权利要求1-3任一项所述EVs;所述产品用于预防/或治疗缺氧缺血性脑损害。
5.如权利要求4所述产品,其特征在于,所述产品具有如下任意一种或多种用途:
(a)减轻缺氧缺血性脑损害诱导的脑水肿;
(b)减轻缺氧缺血性脑损害诱导的脑梗死;
(c)改善缺氧缺血性脑损害诱导的小胶质细胞激活;
(d)抑制促炎因子的表达;
(e)促进抑炎因子的表达;
(f)促使原驻小胶质细胞向M2表型的极化;
(g)促使浸润单核/巨噬细胞向M2表型的极化;
(h)改善缺氧缺血性脑损害的远期学习和记忆功能。
6.如权利要求4或5所述产品,其特征在于,所述产品为药物。
7.如权利要求6所述产品,其特征在于,所述药物还包含药学上可接受的载体。
8.如权利要求7所述产品,其特征在于,所述药学上可接受的载体包括稀释剂和赋形剂。
9.如权利要求7所述产品,其特征在于,所述药学上可接受的载体包括抗氧化剂和稳定剂。
10.如权利要求6所述产品,其特征在于,所述产品剂型为悬浮剂或乳化剂。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111714516A (zh) * 2020-06-10 2020-09-29 山东大学 MSCs-EVs在制备治疗HI诱导的神经炎症的产品中的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018131779A1 (ko) * 2017-01-16 2018-07-19 사회복지법인 삼성생명공익재단 신생아 hie 치료용 조성물

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018131779A1 (ko) * 2017-01-16 2018-07-19 사회복지법인 삼성생명공익재단 신생아 hie 치료용 조성물

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZHANG Q ET AL: "Preconditioning of bone marrow mesenchymal stem cells with hydrogen sulfide improves their therapeutic potential", 《ONCOTARGET》 *
杨佳等: ""间充质干细胞来源的胞外囊泡的研究进展"", 《医学研究杂志》 *
杨苗等: ""骨髓间充质干细胞对缺氧缺血性脑损伤海马组织中自噬的调节"", 《上海交通大学学报(医学版)》 *
疏佳萍: ""骨髓间充质干细胞源性的外泌体对早产儿脑损伤模型的免疫调节研究"", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *
聂国明等主编: "《实用儿科疾病诊疗技术及临床实践》", 31 October 2015, 西安:西安交通大学出版社 *
郑臻等: ""骨髓间充质干细胞治疗缺氧缺血性脑损伤的研究现状"", 《中华妇幼临床医学杂志》 *
陈昌辉主编: "《儿科常见疾病专题讲座》", 31 August 2013, 成都:四川大学出版社 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111714516A (zh) * 2020-06-10 2020-09-29 山东大学 MSCs-EVs在制备治疗HI诱导的神经炎症的产品中的应用

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