JP7389507B2 - クローナル幹細胞を含む移植片対宿主病の治療用薬学的組成物 - Google Patents
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Description
本発明は、幹細胞の改善された層分離培養を通して収得されるモノクローナル間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ；ＭＳＣ）を含む移植片対宿主病の予防、治療、または改善用組成物、並びにこれを用いた移植片対宿主病の治療方法に関する。
移植片対宿主病（Ｇｒａｆｔ Ｖｅｒｓｕｓ Ｈｏｓｔ Ｄｉｓｅａｓｅ）は、同種間の骨髄移植や末梢血幹細胞移植、免疫力低下などの理由で行われた輸血などの治療行為により宿主内に流入された他人の免疫細胞であるＴリンパ球が、宿主の免疫機能が低下したときには宿主の免疫システムによって死滅されずに宿主の体内で増殖し、リンパ球が患者の細胞を非自己（ｎｏｎ－ｓｅｌｆ）として認識し、宿主を攻撃する病気であり、症状の程度によっては重度の場合、死亡に至ったりもする疾患である。移植片対宿主病の原因は、大きく２つに分けられるが、宿主の免疫力低下と家族の血液輸血である。移植片対宿主病は、急性と慢性に区分され、施術後１００日前に発生すると急性、施術後１００日後に発生すると慢性として分類される。移植片対宿主病は、急性に起きる場合がほとんどであり、移植片に含まれたＴ細胞が宿主細胞に存在する特異抗原に対して反応を示し、数々の症状を引き起こすが、発生する症状としては、感染症、サイトメガロウイルスに起因する肺炎、肝炎、消化管炎がある。皮膚病変として麻疹と似たような皮膚の発疹が生じるが、主に耳介、手のひら、足の裏に発生するので、他の皮膚疾患と区別される。皮膚疾患と共に肝疾患が伴って黄疸が発生し、肝数値が増加する。消化管に問題がある場合には、吐き気、嘔吐、食欲不振、腹痛、及び下痢などの症状がある。
今まで移植片対宿主病の根本的な治療方法はなく、症状を和らげることができる治療のみ可能であり、ステロイド療法が効果的な治療法として用いられている。
一方、最近、様々な疾患の治療に幹細胞を利用しようとする試みが進められている。幹細胞は、我々の体の２１０個余りのすべての機関の組織として成長することができる潜在的能力を有しており、無限に分裂することができ、適切な操作を通して所望の臓器に分化することができる。このような幹細胞の特性により幹細胞は、新しい治療剤として脚光を浴びており、幹細胞を用いた難病治療の可能性は非常に高いもので、白血病、骨粗しょう症、肝炎、パーキンソン病、老人性認知症、火傷など、数多くの病気の治療が可能なものとして期待されている。
しかし、幹細胞の場合、これを大量に取得することが難しいという点では、まだまだ多くの制約事項がある。幹細胞を取得する方法として凍結胚細胞から得る方法が効率的であるといえるが、倫理的な面ではいまもなお多くの論争がある。このような問題点を解消するために、体細胞核移植方法や成体幹細胞を利用して、幹細胞を取得する方法もやはり多くの研究が進められてきた。胚性幹細胞に対する研究よりも活発に行われる分野は、成体幹細胞の研究である。成体幹細胞は、中枢神経系や骨髄など各種の臓器に残り、成長期の臓器発達と損傷時の再生に関与する細胞として各種臓器に存在するため、骨髄、脾臓、脂肪細胞などを含む種々の部位から取得することができるが、骨髄から得る方法が最も一般的に行われている。しかし、数多くの骨髄細胞の中から間葉系幹細胞を分離し、培養することにおいて常に均一な形態の細胞を得ることが難しいので、このような問題点を補完するための研究が行われている。
本発明者は、新規な層分離培養法と命名された幹細胞の分離方法を発明しており、大韓民国特許出願ＫＲ１０－２００６－００７５６７６号をとして特許出願し、登録を受けた。前記層分離培養法は、他の方法に比べて低コストで行うことができるだけでなく、汚染の問題がなく、他の幹細胞が混入する心配なしにクローナル間葉系幹細胞（ｃＭＳＣ）を効果的に得ることができるという点で、他の幹細胞取得方法に比べて卓越した優秀性を有する。しかし、前記方法の優秀性にもかかわらず、層分離培養法は、間葉系幹細胞を大量産生し、最終産物として用いるためには、ワーキング細胞バンクを製造し、これを介して最終的な産物を取得する工程を経なければ十分な量の中間葉茎細胞を取得することができず、少なくとも継代（Ｐａｓｓａｇｅ）１０回以上の培養が必要という点で、迅速なモノクローナル間葉系幹細胞集団の取得が難しいという限界があった。
したがって、幹細胞の治療剤としての開発は、まだまだ数多くの技術的限界を有しており、特に、移植片対宿主病を効果的に治療するための幹細胞の製造法及びこれを用いた移植片対宿主病の治療方法については、公知されたところがない。
本発明者等は、前記のような層分離培養法の改善により幹細胞の迅速な増殖を誘導するための研究をしていた中、培養細胞密度を低く調節し、抗酸化剤を添加して培養する改善された層分離培養法を利用する場合、より少ない継代培養だけで効果的な細胞増殖率の増加を誘導することができ、これにより取得さるモノクローナル間葉系幹細胞が従来の層分離培養法で取得されるクローナル間葉系幹細胞または従来の幹細胞に比べて移植片対宿主病の治療効果を増大させることを確認し、本発明を完成するに至った。
したがって、本発明の目的は、従来の層分離培養法を改善した幹細胞の層分離培養及び増殖方法により取得されるモノクローナル間葉系幹細胞を含む移植片対宿主病の予防、治療、及び改善用組成物、並びにその製造方法を提供するものである。
前記目的を達成するために本発明は、１）個体から分離された骨髄を、第１容器で培養する段階；２）前記第１容器の上澄み液のみを新しい容器に移し替えて培養する段階；３）前記の新しい容器に存在する細胞を培養し、上澄み液を取得する段階；４）前記３）段階の上澄み液を、２）段階の第１容器の上澄み液とし、２）及び３）段階を１回以上繰り返してモノクローナル幹細胞を得る段階；及び５）前記４）段階のモノクローナル幹細胞を、５０～１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で培地に接種して培養する段階；を通して取得されるモノクローナル幹細胞を含む、移植片対宿主病の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
また、本発明は、１）個体から分離された骨髄を第１容器で培養する段階；２）前記第１容器の上澄み液のみを新しい容器に移し替えて培養する段階；３）前記新しい容器に存在する細胞を培養し、上澄み液を取得する段階；４）前記３）段階の上澄み液を、２）段階の第１容器の上澄み液にし、２）及び３）段階を１回以上繰り返してモノクローナル幹細胞を得る段階；及び５）前記４）段階のモノクローナル幹細胞を、５０～１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で培地に接種して培養する段階を通してモノクローナル幹細胞を取得する段階；とを含む、移植片対宿主病の予防または治療用薬学的組成物の製造方法を提供する。
また、本発明は、１）個体から分離された骨髄を、第１容器で培養する段階；２）前記第１容器の上澄み液のみを新しい容器に移し替えて培養する段階；３）前記の新しい容器に存在する細胞を培養し、上澄み液を取得する段階；４）前記３）段階の上澄み液を２）段階の第１容器の上澄み液とし、２）及び３）段階を１回以上繰り返して、モノクローナル幹細胞を得る段階；及び５）前記４）段階のモノクローナル幹細胞を、５０～１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で培地に接種して培養する段階；を通して取得される移植片対宿主病の予防、改善または治療用幹細胞を提供する。
本発明の改善された幹細胞の層分離培養及び増殖方法によれば、モノクローナル間葉系幹細胞の迅速な増殖により短時間で所望のモノクローナル間葉系幹細胞の大量取得が可能であり、これを通じて取得されるモノクローナル間葉系幹細胞は、移植片対宿主病の治療効果が増大された幹細胞であるところ、移植片対宿主病の治療剤として有用に用いられることができる。
本発明は、間葉系幹細胞の改善された層分離培養及び増殖方法を通じて収得されるモノクローナル幹細胞（ｃＭＳＣ１）を含む移植片対宿主病の予防または治療用薬学的組成物、モノクローナル幹細胞をこれを必要とする個体に投与する段階を含む移植片対宿主病の予防または治療方法に関する。
また、本発明は、間葉系幹細胞の改善された層分離培養及び増殖方法を通じてモノクローナル幹細胞を得る段階；を含む移植片対宿主病の予防または治療用薬学的組成物の製造方法に関する。
本発明の有効成分であるモノクローナル幹細胞は、幹細胞を迅速かつ汚染なく収得することができる層分離培養法の利点に加えて、モノクローナル幹細胞、好ましくは、モノクローナル間葉系幹細胞の迅速な増殖を通じてＷＣＢ（Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）の製造段階なしでも短時間で所望のモノクローナル幹細胞を大量に収得することができる改善された層分離培養法を通じて収得される幹細胞である。前記の方法を通じて収得されるモノクローナル幹細胞は、従来の層分離培養法を通じて収得される幹細胞と比較して移植片対宿主病の治療効果が増大された幹細胞である。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、１）個体から分離された骨髄を、第１容器で培養する段階；２）前記第１容器の上澄み液のみを新しい容器に移し替えて培養する段階；３）前記の新しい容器に存在する細胞を培養し、上澄み液を収得する段階；４）前記３）段階の上澄み液を２）段階の第１容器の上澄み液にし、２）及び３）段階を１回以上繰り返して、モノクローナル幹細胞を得る段階；及び５）前記４）段階のモノクローナル幹細胞を、５０～１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で培地に接種して培養する段階；を通じて収得されるモノクローナル幹細胞を含む、移植片対宿主病の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
本発明は、１）個体から分離された骨髄を、第１容器で培養する段階；２）前記第１容器の上澄み液のみを新しい容器に移し替えて培養する段階；３）前記の新しい容器に存在する細胞を培養し、上澄み液を収得する段階；４）前記３）段階の上澄み液を２）段階の第１容器の上澄み液にし、２）及び３）段階を１回以上繰り返して、モノクローナル幹細胞を得る段階；及び５）前記４）段階のモノクローナル幹細胞を、５０～１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で培地に接種して培養する段階；を通じて収得されるモノクローナル幹細胞を含む、移植片対宿主病の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
前記２）及び３）段階の培養は、３０～４０℃で４時間以下、好ましくは１時間～３時間、より好ましくは１時間３０分～２時間３０分培養し、繰り返し培養は３０～４０℃で４時間以下、好ましくは１時間～３時間、より好ましくは１時間３０分～２時間３０分培養した後、３０～４０℃で１２～３６時間、好ましくは１８時間～３０時間培養を２～３回繰り返し、次いで３０～４０℃で２４～７２時間、３６時間～６０時間、好ましくは３６時間～６０時間で培養し、毎回上澄み液を新しい培養容器に移し替えて行うことができる。
本発明の実施例にて分離した方法を簡単に要約すると、次の通りである。
［図１］
［図１］
培養した細胞は、モノクローナル細胞群を形成するが、このモノクローナル細胞群を分離した後、継代培養を行うことができ、本発明は、層分離培養を通じて収得されたモノクローナル幹細胞を大量に迅速に収得し、移植片対宿主病の治療効果が増大されたモノクローナル幹細胞を収得するために、５）段階の培養段階を含むことを特徴とする。
前記５）段階は、モノクローナル幹細胞を１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）以下の細胞密度、好ましくは５０～１０００細胞／ｃｍ２の密度で培地に接種して培養する段階である。本発明によれば、迅速なモノクローナル幹細胞の増殖を誘導することができるので、最終的な産物を迅速に収得することができ、少ない数の継代培養を通じてＭＣＢ（Ｍａｓｔｅｒ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）を製造することができる。
本発明において、「層分離培養」は、幹細胞を比重によって分離する方法を意味し、最初にヒト骨髄を抽出し、細胞培養液に培養した後、上澄み液のみを収得し、これをコーティング剤が施された又は施されていない培養容器に移し替えて培養した後、同一過程を数回繰り返す工程をいう。このような層分離培養は、遠心分離過程なしに上澄み液を繰り返し収得して培養する工程を繰り返すことを特徴とし、最終的に他の細胞を汚染させることなくモノクローナル幹細胞、好ましくは、モノクローナル間葉系幹細胞を収得することができる利点がある。
本発明の前記１）～５）の段階のうち、１）～４）の段階は、ＫＲ１０－２００６－００７５６７６号、またはＫＲ１０－２００７－００５３２９８号に記載された層分離培養法と同一又は同等に実行されることができ、ＫＲ１０－２００６－００７５６７６号は、本発明に全体として参考になることができる。
従来、ＫＲ１０－２００７－００５３２９８号では、移植片宿主病の治療に関連して、細胞を得る方法として１）個体から骨髄を採取する段階；２）採取した骨髄を培養する段階；３）段階２）の上澄み液のみを新しい容器に移し替えて培養する段階；４）段階３）の上澄み液だけを分離し、コーティング剤が施された培養容器またはコーティング剤が施されていない培養容器で繰り返し培養する段階が開示されており、前記の方法は、遠心分離せずに密度差だけで、モノクローナル幹細胞を収得するという点で、ＫＲ１０－２００６－００７５６７６号の従来の層分離培養法を用いる。
しかし、前記ＫＲ１０－２００６－００７５６７６号及びＫＲ１０－２００７－００５３２９８号の層分離培養法は、モノクローナル幹細胞を低継代で効果的に収得し、これにより移植片対宿主病の治療効果が顕著に改善されたモノクローナル幹細胞を得るための方法が開示されていない。
従来の層分離培養法は、図１で確認されるように、単一コロニーから得られたすべての細胞を６ウェルに移し、８０～９０％コンフルエンシー（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）に増殖させた後、増殖された状態の１回継代（Ｐ１）細胞をｓｅｅｄ ｃｅｌｌにして密度の調節に対する認識がなく、多くの細胞を収得するために４０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）で高密度培養を行う。
その反面、本発明は、２回継代後の培養で細胞密度を調節することにより、移植片対宿主病の予防、治療、改善効果に優れた幹細胞を効率的に収得することができることを基礎とした「改善された層分離培養法」に関するものであり、従来の層分離培養法とｓｅｅｄ ｃｅｌｌ以後の培養段階を異にすることを特徴とする。例えば、具体的に「５）前記４）段階のモノクローナル幹細胞を、５０～１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で培地に接種して培養する段階」を含む。改善された層分離培養法は、従来の層分離培養法に比べて迅速なモノクローナル幹細胞の増殖を誘導することができるので、最終的な産物を迅速に収得することができる。移植片対宿主病の治療に用いるためのモノクローナル幹細胞は、Ｐ２ないしＰ１３継代培養を通じて収得することができ、Ｐ２ないしＰ８のような継代が１０回未満の低継代の培養だけで十分な量の移植片対宿主病の治療効果に優れた幹細胞を収得することができる。例えば、急性移植片対宿主病の場合、凍結型の幹細胞を用いることができ、本発明の改善された層分離培養法で継代が８回以下の培養を通じて収得された幹細胞を凍結および解凍させた後に利用することができる。また、迅速な治療が必要とされる慢性移植片対宿主病の場合、効果的な治療のために、新鮮型幹細胞を利用することができ、この場合、より多量の幹細胞を確保するために、１３回目の継代まで継代を拡張して、幹細胞を収得することができる。前記のように収得される幹細胞は、高密度培養で収得される幹細胞に比べ、すべての免疫関連マーカーの発現が増加され、分化能の維持、老化が抑制されたモノクローナル幹細胞であるところ、従来の遠心分離方法を通じて収得される幹細胞、および既存の層分離培養法によって収得される幹細胞に比べて移植片対宿主病の治療効果が非常に顕著に改善された幹細胞であることができる。
本発明のモノクローナル間葉系幹細胞は、従来の工程のように４０００細胞／ｃｍ２の高密度で培養される場合、細胞増殖能が著しく減少し、間葉系幹細胞のマーカーが変化し、幹細胞の分化能が失われ得る。したがって、改善された層分離培養法を通じて収得されたモノクローナル幹細胞は、低密度ないし中程度の密度、４０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）未満の低細胞密度、例えば、３０００細胞／ｃｍ２以下、好ましくは２０００細胞／ｃｍ２以下、さらに好ましくは５０～１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で培養されたことを意味することができる。
１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）以下の細胞密度でモノクローナル間葉系幹細胞を培養する場合、細胞の増殖能は、４０００細胞／ｃｍ２のように高密度に培養された間葉系幹細胞と比較して、長期間の培養期間の間ずっと著しく高く維持されるので、多くの継代を繰り返さなくても、所望量の大量のモノクローナル細胞を迅速に収得することができるという利点がある。また、前記の細胞密度で、モノクローナル間葉系幹細胞を培養する場合、当該細胞はＤＮＡ損傷が少なく、老化が抑制され、幹細胞の分化能を効果的に維持することができるという利点があり、素早く、且つ迅速に優れた幹細胞特性を有するモノクローナル間葉系幹細胞を収得することができる。
本発明にて用いられる培地は、抗酸化剤を含まない培地であって、前記培地に抗酸化剤が追加された培地または抗酸化剤を含む培地をいずれも含むことができる。
抗酸化剤を含まない培地としては、これに限定されるものではないが、ＤＭＥＭ培地を用いることができ、必要に応じて前記培地に、抗酸化剤をさらに追加して培養を行うことができる。また、必要に応じて抗酸化剤が含まれたα－ＭＥＭ培地を用いて培養を行うことができる。
本発明の抗酸化剤は、細胞培養に用いられることができる抗酸化剤を制限なく含むことができ、グルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）、システイン（Ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、システアミン（Ｃｙｓｔｅａｍｉｎｅ）、ユビキノール（Ｕｂｉｑｕｉｎｏｌ）、ベータ－マーカプトエタノール（ｂ－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）及びアスコルビン酸（Ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ；ＡＡ）からなる群から選択された１種以上であることができる。抗酸化剤が培地に追加された場合、前記抗酸化剤は１０～５０、好ましくは１０～３０、より好ましくは２５μｇ／ｍｌの濃度で追加されることができる。
本発明の一例として、抗酸化剤を含まない培地としてＤＭＥＭ、より好ましくはＬＧ－ＤＭＥＭ培地を使用し、抗酸化剤としてアスコルビン酸を含む培地としてα－ＭＥＭ培地を用いる。
本発明の培養培地として抗酸化剤を含む培地を用いる場合、前記培養培地には、抗生剤としてゲンタマイシンが追加されることができる。
一方、本発明の方法によれば、モノクローナル幹細胞を非常に効果的に増殖することができるので、ＭＣＢを用いてＷＣＢ（Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）を製造する工程が省略されることができる。これは、従来の層分離培養法がＭＣＢ製造後、ＷＣＢを製造する工程を伴う必要があるものに比べ、工程を単純化したものである。
本発明の方法を通じて収得された間葉系幹細胞は、２回継代～１３回継代後、好ましくは２回継代～１２回継代後、さらに好ましくは２回継代～９回継代に収得される幹細胞であることができる。本発明の改善された層分離培養法によれば、継代が１０回未満の培養だけで、治療剤として用いられ得る十分な優れた移植片対宿主病の治療効果を有する、間葉系幹細胞を十分に得ることができ、慢性移植片対宿主病のように、迅速に多くの幹細胞が必要な場合には、継代を最大１３回、すなわち１２回継代まで拡張して培養し、移植片対宿主病の治療効果が促進されたモノクローナル幹細胞をより多く収得することができる。
これは、少なくとも継代が１０回以上の培養が必須に求められていた従来の工程に比べ、より低い継代で収得される幹細胞であり、細胞接種の密度調節を通じて、低継代で急速に増殖した間葉系幹細胞を容易に大量収得することができ、同時に移植片対宿主病の治療効果が改善された間葉系幹細胞であることを示す。
本発明において、前記のような改善された層分離培養法、好ましくは２０００細胞／ｃｍ２以下、さらに好ましくは１０００細胞／ｃｍ２以下の低密度及び抗酸化条件の改善された層分離培養法の方法で収得されたモノクローナル幹細胞（以下、「ｃＭＳＣ１」と表記）は、従来の層分離培養法で収得されるモノクローナル幹細胞（以下、「ｃＭＳＣ２」と表記）と比較して、細胞の大きさがより小さく、均質に形成されることができ、急性だけでなく、慢性移植片対宿主病の生存率を高め、免疫関連マーカーの発現が増加され、個体に投与する際、各種の移植片対宿主病の臨床的因子を効果的に改善させることができる幹細胞であることを特徴とする。
本発明において、「移植片対宿主病」とは、同種移植時に注入されるドナーの末梢血液や骨髄内Ｔリンパ球を患者の体で、他人のものとして認識して免疫反応が起こる疾患をいい、慢性または急性移植片対宿主病をいずれも含む。移植片対宿主病の治療に用いられる幹細胞は、新鮮型または凍結型をいずれも用いることができ、臨床的判断に従って適宜選択して用いられることができる。
したがって、本発明において、移植片対宿主病は、急性移植片対宿主病または慢性移植片対宿主病をいずれも制限なく含むことができる。
本発明の改善された層分離培養法で収得されるモノクローナル幹細胞は、従来の層分離培養法または遠心分離方法で収得される幹細胞に比べ免疫学的マーカーの発現量が増大したことを特徴とすることができ、例えば、ＩＤＯ（Ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ ２，３－ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）、ＩＣＯＳＬ（Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｌｉｇａｎｄ）、ＴＳＧ６（Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｅ ６ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＣＸＣＬ９（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（ＣＸＣ ｍｏｔｉｆ）ｌｉｇａｎｄ ９）、ＣＸＣＬ１０（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（ＣＸＣ ｍｏｔｉｆ）ｌｉｇａｎｄ １０）、およびＨＯ－１（Ｈｅｍｅ ｏｘｙｇｅｎａｓｅ－１）からなる群から選択された１種以上の免疫関連マーカーの発現量が増加されたものであることができる。
本発明の薬学的組成物は、投与のために前記有効成分に加えて、追加で薬学的に許容可能な担体を１種以上含んで製造することができる。本発明の薬学的組成物に含まれる薬学的に許容される担体は、製剤の際に通常に用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、およびミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の薬学的組成物は、前記成分に加えて潤滑剤、湿潤剤、甘味料、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。
本発明の薬学的組成物の投与量は、前記薬学的組成物の製剤化方法、投与方式、投与時間および／または投与経路などにより多様化することができ、前記薬学的組成物の投与により達成しようとする反応の種類と程度、投与対象となる個体の種類、年齢、体重、一般的な健康状態、疾病の症状や程度、性別、食餌、排泄、当該個体に同時または移植に共に用いられる薬物その他の組成物の成分などをはじめとする種々の因子及び医薬分野でよく知られた類似因子に応じて多様化することができ、当該技術分野における通常の知識を有する者は、目的とする治療に効果的な投与量を容易に決定し、処方することができる。
本発明の薬学的組成物の投与量は、例えば、１日に１ｍｇ／ｋｇないし１，０００ｍｇ／ｋｇであることができるが、前記投与量はいかなる面であれ、本発明の範囲を限定するものではない。
本発明の薬学的組成物の投与経路及び投与方法は、それぞれ独立的であることができ、その方法において特に制限されず、目的とする当該部位に前記薬学的組成物が到達することができる任意の投与経路及び投与方法に従うことができる。
前記薬学的組成物は、経口投与または非経口投与の方法で投与することができる。前記非経口投与方法としては、例えば、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、経皮投与または皮下投与などが含まれ、前記薬学的組成物を疾患部位に塗布したり噴霧、吸入する方法もまた利用することができるが、これに限定されない。
また、本発明は、１）個体から分離された骨髄を、第１容器で培養する段階；２）前記第１容器の上澄み液のみを新しい容器に移し替えて培養する段階；３）前記新しい容器に存在する細胞を培養し、上澄み液を収得する段階；４）前記３）段階の上澄み液を２）段階の第１容器の上澄み液にし、２）及び３）段階を１回以上繰り返して、モノクローナル幹細胞を得る段階；５）前記４）段階のモノクローナル幹細胞を、５０～１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で培地に接種して培養する段階を経て、モノクローナル幹細胞を収得する段階；及び６）前記モノクローナル幹細胞を個体に投与する段階；を含む移植片対宿主病の予防または治療方法を提供する。
本発明において、前記「個体」は、移植片対宿主病の予防または治療が必要な個体を含み、哺乳類またはヒトを除く哺乳類であることができる。
また、本発明は、１）個体から分離された骨髄を、第１容器で培養する段階；２）前記第１容器の上澄み液のみを新しい容器に移し替えて培養する段階；３）前記の新しい容器に存在する細胞を培養し、上澄み液を収得する段階；４）前記３）段階の上澄み液を２）段階の第１容器の上澄み液にし、２）及び３）段階を１回以上繰り返して、モノクローナル幹細胞を得る段階；及び５）前記４）段階のモノクローナル幹細胞を、５０～１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で培地に接種して培養する段階を経て、モノクローナル幹細胞を収得する段階；を含む、移植片対宿主病の予防または治療用薬学的組成物の製造方法を提供する。
本発明の製造方法において、前記５）段階の培養は、１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で培地に接種して行われることを特徴とすることができる。
また、本発明の製造方法において、前記５）段階の培地は、抗酸化剤が追加された培地であることを特徴とすることができる。
また、本発明は、１）個体から分離された骨髄を、第１容器で培養する段階；２）前記第１容器の上澄み液のみを新しい容器に移し替えて培養する段階；３）前記の新しい容器に存在する細胞を培養し、上澄み液を収得する段階；４）前記３）段階の上澄み液を２）段階の第１容器の上澄み液にし、２）及び３）段階を１回以上繰り返して、モノクローナル幹細胞を得る段階；及び５）前記４）段階のモノクローナル幹細胞を５０～１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で培地に接種して培養する段階；を通じて収得される移植片対宿主病の予防、改善または治療用幹細胞を提供する。
本発明によれば、従来の層分離培養法で収得されるモノクローナル幹細胞と比較して優れた移植片対宿主病の予防、改善または治療効果を奏するモノクローナル幹細胞をＷＣＢを製造することなく、迅速且つ容易に収得することができ、前記モノクローナル幹細胞は、薬学、食品、医薬部外品、および化粧料組成物に制限なく含まれることができる。
本発明の治療方法および製造方法において、前記の組成物にて記述された内容が同一に適用されることができ、重複する内容は、明細書の記載の複雑さを避けるために省略する。
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
次の実施例は、本発明を例示するためのものであって、本発明の内容が下記の実施例に限定されない。
次の実施例は、本発明を例示するためのものであって、本発明の内容が下記の実施例に限定されない。
＜実施例１＞改善された層分離培養法の確立
移植片対宿主病により優れた効果を示すモノクローナル間葉系幹細胞を製造するために改善された間葉系幹細胞の層分離培養法及び増殖方法を用いた。改善された間葉系幹細胞の層分離培養法及び増殖方法は、韓国特許出願１０－２００６－００７５６７６号に記載された層分離培養法の培養条件のうち、細胞密度及び培養培地を変更したことを特徴とする。以下の実験では、層分離培養法を通じて収得されたモノクローナル間葉系幹細胞（ｃＭＳＣ）の細胞培養密度をそれぞれ５０細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）（低密度）、１０００細胞／ｃｍ２（中密度）、４，０００細胞／ｃｍ２（高密度）と異にしてそれに応じた細胞の特性を分析した。
移植片対宿主病により優れた効果を示すモノクローナル間葉系幹細胞を製造するために改善された間葉系幹細胞の層分離培養法及び増殖方法を用いた。改善された間葉系幹細胞の層分離培養法及び増殖方法は、韓国特許出願１０－２００６－００７５６７６号に記載された層分離培養法の培養条件のうち、細胞密度及び培養培地を変更したことを特徴とする。以下の実験では、層分離培養法を通じて収得されたモノクローナル間葉系幹細胞（ｃＭＳＣ）の細胞培養密度をそれぞれ５０細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）（低密度）、１０００細胞／ｃｍ２（中密度）、４，０００細胞／ｃｍ２（高密度）と異にしてそれに応じた細胞の特性を分析した。
１．１ 細胞密度に応じた間葉系幹細胞の形態学的変化を確認
まず、長期間培養で細胞密度に応じた間葉系幹細胞の形態学的変化を確認するための実験を行った。長期間培養条件を与えるために５回継代（Ｐ５）、１０回継代（Ｐ１０）、１５回継代（Ｐ１５）の間葉系幹細胞を用いており、それぞれ低密度、中密度、高密度の条件でＬＧ－ＤＭＥＭ培地に接種した。それから、細胞の形態学的変化を顕微鏡で観察し、幹細胞が老化するか否かを判断し、その結果を図２に示した。
まず、長期間培養で細胞密度に応じた間葉系幹細胞の形態学的変化を確認するための実験を行った。長期間培養条件を与えるために５回継代（Ｐ５）、１０回継代（Ｐ１０）、１５回継代（Ｐ１５）の間葉系幹細胞を用いており、それぞれ低密度、中密度、高密度の条件でＬＧ－ＤＭＥＭ培地に接種した。それから、細胞の形態学的変化を顕微鏡で観察し、幹細胞が老化するか否かを判断し、その結果を図２に示した。
図２に示すように、５回継代（Ｐ５）及び１０回継代（Ｐ１０）では、細胞密度に応じて細胞の大きさと形態学的パターンの差が表れており、特にＰ１５の場合、高密度培養条件で平らで大きくなった形態の間葉系幹細胞が観察された。このような形態は、典型的な間葉系幹細胞の老化を示すものであり、長期間培養で細胞の密度調節が間葉系幹細胞の老化を調節することができることを確認した。
１．２ 細胞密度に応じたＭＳＣ細胞の大きさ及び粒度の確認
細胞密度に応じた幹細胞の変化をさらに確認するために、老化した細胞から増加したとして知られている細胞の大きさ及び細胞の粒度（ｇｒａｎｕｌａｒｉｔｙ）をフローサイトメトリー分析を通じて定量分析し、その結果を図３に示した。
細胞密度に応じた幹細胞の変化をさらに確認するために、老化した細胞から増加したとして知られている細胞の大きさ及び細胞の粒度（ｇｒａｎｕｌａｒｉｔｙ）をフローサイトメトリー分析を通じて定量分析し、その結果を図３に示した。
図３に示すように、細胞の大きさは、Ｐ５では有意な差を示さなかったが、Ｐ１０及びＰ１５の場合、細胞密度に応じて有意な差を示すことを確認した。特にＰ１０及びＰ１５では、高細胞密度の培養条件で細胞の大きさが有意に増加し、細胞の老化がさらに促進されることが確認された。これと同様に細胞の粒度もやはりすべての継代（Ｐａｓｓａｇｅ）で細胞の密度が高くなるほど有意に増加する結果が表れた。したがって、間葉系幹細胞の長期培養において、細胞の密度調節が細胞の老化を調節する因子となり得ることを確認しており、細胞培養密度を下げることで後期継代で表される形態学的変化が改善され得ることが確認された。
１．３ 培養細胞密度による間葉系幹細胞の老化確認
実施例１．１および１．２から確認された形態学的変化が、実際に間葉系幹細胞における老化依存（ａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）現象であることを確認するために、老化細胞を選択的に染色することができるベータガラクトシダーゼを用いた染色分析法を行い、老化関連遺伝子であるｐ１５、ｐ１６、および増殖マーカーであるＰＣＮＡ遺伝子の発現をＲＴ－ＰＣＲを用いて比較した。その結果をそれぞれ図４及び図５に示した。
実施例１．１および１．２から確認された形態学的変化が、実際に間葉系幹細胞における老化依存（ａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）現象であることを確認するために、老化細胞を選択的に染色することができるベータガラクトシダーゼを用いた染色分析法を行い、老化関連遺伝子であるｐ１５、ｐ１６、および増殖マーカーであるＰＣＮＡ遺伝子の発現をＲＴ－ＰＣＲを用いて比較した。その結果をそれぞれ図４及び図５に示した。
図４に示すように、５回継代（Ｐ５）及び１０回継代（Ｐ１０）では、すべての細胞密度で老化した細胞の染色を確認することはできなかったが、１５回継代（Ｐ１５）では、細胞密度が高くなるほど、老化した細胞の染色が明らかに増加することを確認した。また、図５に示すように、１５回継代（Ｐ１５）では、細胞の培養密度が増加するほど、老化に関連する遺伝子であるＣＤＫ阻害剤ｐ１５及びｐ１６の遺伝子発現が増加し、増殖マーカーであるＰＣＮＡは、減少した。
こうした結果は、間葉系幹細胞の形態学的変化が、間葉系幹細胞の老化と関連があることを示す結果であり、細胞培養密度の調節が間葉系幹細胞の老化を調節することができることを示す結果である。
１．４ 培養細胞密度による間葉系幹細胞の増殖能変化の確認
間葉系幹細胞の増殖能力は継代が進み、細胞の老化が進むにつれて徐々に減少するとして知られている。したがって、増殖能は、間葉系幹細胞の老化を確認できる基準として用いることができ、長期間の細胞培養時、細胞培養密度による間葉系幹細胞の増殖能の比較を行った。各細胞の増殖能は、初期接種細胞数と培養が終わった後、得られる細胞の数を通じて各継代に応じた増殖率を計算して確認し、その結果を表１及び図６に示した。
間葉系幹細胞の増殖能力は継代が進み、細胞の老化が進むにつれて徐々に減少するとして知られている。したがって、増殖能は、間葉系幹細胞の老化を確認できる基準として用いることができ、長期間の細胞培養時、細胞培養密度による間葉系幹細胞の増殖能の比較を行った。各細胞の増殖能は、初期接種細胞数と培養が終わった後、得られる細胞の数を通じて各継代に応じた増殖率を計算して確認し、その結果を表１及び図６に示した。
表１に示すように、低密度で培養された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の場合、５回継代（Ｐ５）、１０回継代（Ｐ１０）、１５回継代（Ｐ１５）で増加倍数（ｆｏｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ）が、８８．４、３４．３、１６．４であるのに対し、中密度で培養された間葉系幹細胞は、８．５、４．９、３．１であり、高密度で培養された間葉系幹細胞は、３．０、１．９、１．１であることが確認された。また、図６に示すように、集団倍加時間（ＰＤＴ）及び集団倍加数（ＰＤＬ）も増加倍数と同じパターンで表れることを確認した。このような結果は、長期間の間葉系幹細胞培養で細胞密度を下げることで、間葉系幹細胞の増殖能を維持させることができることを示す結果であり、同じ継代培養を行っても、間葉系幹細胞の老化を抑制し、寿命を延長させることができることを示す。
１．５ 培養細胞密度による間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の分化能変化の確認
細胞培養密度が幹細胞能に影響を与えるか否かを確認するために、Ｐ５ないしＰ１５培養による分化能を比較した。幹細胞能として脂肪細胞分化能及び骨細胞分化能を確認しており、それぞれの継代及び密度で、正常、定量分析を行った。具体的には、脂肪細胞の分化培養液は、Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｓｏｓｅ ＤＭＥＭ培養液にＮＣＳ（Ｎｅｗｂｏｒｎ Ｃａｌｆ Ｓｅｒｕｍ）（Ｇｉｂｃｏ）、１０－７ｍｏｌデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）（Ｓｉｇｍａ）、０．５ｍＭ ＩＢＭＸ（Ｓｉｇｍａ）、１０μｇ／ｍｌのインスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）（Ｓｉｇｍａ）、１００μＭインドメタシン（ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ）（Ｓｉｇｍａ）を添加した培地を作成して実験し、７日間にわたる分化後、Ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ組織化学染色を通じて確認した。また、Ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ組織化学染色後、イソプロピルアルコールで溶出させ、５００ｎｍで測定した後、定量分析して確認した。
細胞培養密度が幹細胞能に影響を与えるか否かを確認するために、Ｐ５ないしＰ１５培養による分化能を比較した。幹細胞能として脂肪細胞分化能及び骨細胞分化能を確認しており、それぞれの継代及び密度で、正常、定量分析を行った。具体的には、脂肪細胞の分化培養液は、Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｓｏｓｅ ＤＭＥＭ培養液にＮＣＳ（Ｎｅｗｂｏｒｎ Ｃａｌｆ Ｓｅｒｕｍ）（Ｇｉｂｃｏ）、１０－７ｍｏｌデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）（Ｓｉｇｍａ）、０．５ｍＭ ＩＢＭＸ（Ｓｉｇｍａ）、１０μｇ／ｍｌのインスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）（Ｓｉｇｍａ）、１００μＭインドメタシン（ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ）（Ｓｉｇｍａ）を添加した培地を作成して実験し、７日間にわたる分化後、Ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ組織化学染色を通じて確認した。また、Ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ組織化学染色後、イソプロピルアルコールで溶出させ、５００ｎｍで測定した後、定量分析して確認した。
骨細胞分化培養液は、α－ＭＥＭ培養液にＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、５０μｇ／ｍｌ ａｓｃｏｒｂｉｃ ２ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｓｉｇｍａ）、１０－８ｍｏｌデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、１０ｍＭのベータグリセロリン酸（β（ｓｉｇｍａ）を添加した培地を使用しており、２１日間にわたる分化後にＡｌｉｚａｒｉｎ ｒｅｄ Ｓ組織化学染色を通じて確認した。また、Ａｌｉｚａｒｉｎ ｒｅｄ Ｓ組織化学染色後、１０％酢酸で溶出させ、４０５ｎｍで測定し、定量分析して確認した。前記のような方法で脂肪細胞分化能及び骨細胞分化能を確認した結果を図７に示した。
図７に示すように、脂肪細胞分化能は継代が進むにつれて、全体的に減少したが、密度による差が顕著に表れていないのに対し、骨細胞分化能の場合、高密度条件の１５回継代（Ｐ１５）培養群で有意に減少していることを確認した。このような結果から間葉系幹細胞の骨細胞分化能は低い細胞密度で培養した場合、よりうまく維持されることを確認した。
１．６ 培養細胞密度による間葉系幹細胞の抗原プロファイル分析
細胞培養密度が幹細胞の抗原発現にも影響を及ぼすか否かを確認するための実験を行い、各継代および培養密度による陽性および陰性抗原発現の変化をフローサイトメトリー分析で確認し、その結果を表２に示した。
細胞培養密度が幹細胞の抗原発現にも影響を及ぼすか否かを確認するための実験を行い、各継代および培養密度による陽性および陰性抗原発現の変化をフローサイトメトリー分析で確認し、その結果を表２に示した。
表２に示すように、陰性マーカー発現の変化は、明らかに確認されなかったが、一部の陽性マーカーの場合のような継代でも細胞培養密度により発現量の変化が表れることを確認した。
特に１５回継代（Ｐ１５）では、高密度で細胞を培養した場合、ほとんどの良性マーカーの発現量が顕著に減少しただけでなく、ＣＤ７３、ＣＤ１０５は、陰性発現を示し、細胞密度を低く維持し、細胞培養を行うことが非常に重要な因子であることを確認した。
１．７ 培養細胞密度による活性酸素種（ＲＯＳ）産生及びＤＮＡ損傷の比較
間葉系幹細胞の機能の減少とＤＮＡ損傷は関連性があるとして知られており、特に、活性酸素種ＲＯＳによって誘導されるＤＮＡ損傷は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の老化を促進するとして知られている。したがって、培養密度により全活性酸素種（ＲＯＳ）産生及びそれに伴うＤＮＡ損傷が異なって示されるかどうかを確認するために、継代及び細胞培養密度による全細胞性活性酸素種（ＲＯＳ）の量を蛍光強度分析を通じて比較し、ｃｏｍｅｔ分析を通じてＤＮＡ損傷の程度を確認し、その結果を図８に示した。
間葉系幹細胞の機能の減少とＤＮＡ損傷は関連性があるとして知られており、特に、活性酸素種ＲＯＳによって誘導されるＤＮＡ損傷は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の老化を促進するとして知られている。したがって、培養密度により全活性酸素種（ＲＯＳ）産生及びそれに伴うＤＮＡ損傷が異なって示されるかどうかを確認するために、継代及び細胞培養密度による全細胞性活性酸素種（ＲＯＳ）の量を蛍光強度分析を通じて比較し、ｃｏｍｅｔ分析を通じてＤＮＡ損傷の程度を確認し、その結果を図８に示した。
図８に示すように、全ＲＯＳ産生は、全継代で細胞培養密度が増加するほど増加する傾向を確認し、特に１０回継代（Ｐ１０）と１５回継代（Ｐ１５）では、有意にＲＯＳ産生が増加することを確認した（Ａ）。ｃｏｍｅｔ分析では、ＤＮＡの損傷が最も弱いＣＣ１から損傷が最も深刻なＣＣ５に分類してデータを分析し、損傷が最も深刻なＣＣ５の場合、細胞培養密度が高くなるほど有意に増加することを確認した。その反面、ＣＣ１は、細胞密度が高くなるほど有意に低くなる傾向を示した（Ｂ）。
さらにＤＮＡ損傷がＲＯＳによって誘発されたかどうかを確認するために、ＲＯＳによるＤＮＡ損傷を確認する８－ＯＨｄＧの濃度を確認する実験を行った。８－ＯＨｄＧ分析方法は、次のとおりである。それぞれの細胞から得られたＤＮＡ試料５０μｌを８－ＯＨｄＧが結合されたプレート（８－ＯＨｄＧ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｃｏａｔｅｄ ｐｌａｔｅ）に入れた後、常温で１０分間培養した。その後、抗－８－ＯＨｄＧ抗体（ａｎｔｉ－８－ＯＨｄＧ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を追加で入れ、常温で一時間培養し、３回洗浄した後、ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅを各ウェル（ｗｅｌｌ）に入れた後、再び１時間常温で培養した。この後、再び３回洗浄した後、基質溶液（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を入れ、常温で３０分間培養した。最後に静止溶液（Ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を入れてから、４５０ｎｍでの吸光度を測定して確認し、その結果を図９に示した。
図９に示すように、ＤＮＡ損傷が最も深刻なものとして表れた１５回継代（Ｐ１５）群では、細胞培養密度が高くなるほど、８－ＯＨｄＧの濃度が有意に増加することを確認した。このような結果を通じて高密度培養条件で産生されるＲＯＳによってＤＮＡ損傷が増加するものであり、これにより、間葉系幹細胞の老化が促進されることを示す。
このような結果は、細胞培養密度を低く調節することが中葉幹細胞のＲＯＳ産生の増加によるＤＮＡ損傷から間葉系幹細胞を保護する役割をすることができることを示す結果である。
１．８ 抗酸化剤処理による間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の増殖及び活性酸素種（ＲＯＳ）の産生能の確認
間葉系幹細胞の増殖が高密度培養条件で産生されるＲＯＳによって影響を受けるかどうかを確認するため、ＲＯＳ消去実験を行った。１１回継代（Ｐ１１）ないし１５回継代（Ｐ１５）で高密度培養条件および高密度培養条件に抗酸化剤であるアスコルビン酸２５μｇ／ｍｌを培地に添加して培養した後、二つのグループ間の増殖率の増加倍数（Ｆｏｌｄ）を比較し、その結果を図１０に示した。
間葉系幹細胞の増殖が高密度培養条件で産生されるＲＯＳによって影響を受けるかどうかを確認するため、ＲＯＳ消去実験を行った。１１回継代（Ｐ１１）ないし１５回継代（Ｐ１５）で高密度培養条件および高密度培養条件に抗酸化剤であるアスコルビン酸２５μｇ／ｍｌを培地に添加して培養した後、二つのグループ間の増殖率の増加倍数（Ｆｏｌｄ）を比較し、その結果を図１０に示した。
図１０に示すように、高密度培養条件で増加倍数がＰ１１ないしＰ１５でそれぞれ２．６、１．９、１．６であり、継代回数が増加するにつれて増殖能が低下するとともに老化が現れ始めたが、抗酸化剤を処理した場合、全継代で約５０％程度の増殖能が高く維持されることを確認した。また、抗酸化剤処理群で成長増加倍数（ｇｒｏｗｔｈ ｆｏｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ）は、Ｐ１１ないしＰ１５において、それぞれ３．８、２．９、２．５であってＰ１５まで増殖能が高く維持された。
終点（Ｅｎｄｐｏｉｎｔ）であるＰ１５で高密度培養条件単独及び高密度培養条件＋抗酸化剤処理の二つのグループ間のＲＯＳレベルを確認した結果を図１１に示した。
図１１に示すように、抗酸化剤であるアスコルビン酸を処理して増殖が増加した条件では、ＲＯＳレベルもはやり減少していることを確認した。したがって、ＭＳＣ培養は、高密度ではない低い細胞密度で行うことが好ましく、高密度細胞培養から誘導されるＲＯＳ産生を抗酸化剤で消去する場合、間葉系幹細胞の増殖能を増加させることができることを確認した。すなわち、高密度条件はＲＯＳにより間葉系幹細胞の増殖能が抑制され、細胞密度が低くなるほどＲＯＳが減少し、間葉系幹細胞増殖能が促進されることができる。
このような結果を総合してみると、層分離培養を通じて得られたモノクローナル間葉系幹細胞の増殖、培養および幹細胞能を維持するためには、培養条件のうち、細胞密度を１０００細胞／ｃｍ２以下の密度で調節することが重要であり、抗酸化剤を添加して培養する場合、細胞培養で誘発され得る酸化ストレスを抑制し、間葉系幹細胞の増殖を効果的に促進することができることを確認した。また、継代回数が１５以上の幹細胞は、５回継代または１０回継代の幹細胞と比較したとき、細胞の形態学的変化が著しくなり、幹細胞の老化促進、分化能減少のような結果が確認されるので、１０００細胞／ｃｍ２以下の密度で、低継代数で培養するのが最も効果的であることを確認された。
＜実施例２＞改善された層分離培養法の検証
前記実施例１を通じて、層分離培養法で収得された間葉系幹細胞培養において、細胞密度の調節、継代調節及び抗酸化剤の添加が重要な因子となることを確認したので、韓国特許出願１０－２００６－００７５６７６号に記載された層分離培養法の既存の工程で収得されたモノクローナル間葉系幹細胞を細胞培養密度を異にして、抗酸化剤であるアスコルビン酸が添加された培地で培地を変えながら、モノコロニーＭＳＣの増殖能及びそれに伴う細胞収得効果を比較した。
前記実施例１を通じて、層分離培養法で収得された間葉系幹細胞培養において、細胞密度の調節、継代調節及び抗酸化剤の添加が重要な因子となることを確認したので、韓国特許出願１０－２００６－００７５６７６号に記載された層分離培養法の既存の工程で収得されたモノクローナル間葉系幹細胞を細胞培養密度を異にして、抗酸化剤であるアスコルビン酸が添加された培地で培地を変えながら、モノコロニーＭＳＣの増殖能及びそれに伴う細胞収得効果を比較した。
以前、韓国特許出願１０－２００６－００７５６７６号では、単一性細胞群であるコロニーをウェル当りの細胞数１００～６００移し、それ以後の継代培養では、ｃｍ２当たり４０００個の細胞で培養を行った。
また、層分離培養法を通じて収得された中間葉骨髄細胞を用いた移植片対宿主病治療剤が開示されているＫＲ１０－２００７－００５３２９８号では、層分離培養法によって収得された単一性細胞群を１回継代に該当する６－ウェル培養容器に細胞数１００～６００移すという事実のみが開示されてあるだけで、２回継代後のコロニーでない個々の細胞の反復的な培養密度調節に対する構成及びこれに伴う効果については全く開示されていない。前記出願に記載された従来の層分離培養法によると、十分な量の移植片対宿主病の予防、治療、改善効果があるモノクローナル幹細胞を得るために、少なくとも１０回継代以上の培養を行わければならない。その反面、本発明の改善された層分離培養法では、２回継代後、低細胞密度条件、２回継代～１３回継代のような低継代培養を通じて効果的に目的とするモノクローナル幹細胞を大量に収得することができる。
具体的には、本改善方法では、層分離培養法で収得された１回継代（Ｐ１）のコロニーを培養した後、２回継代（Ｐ２）後の継代培養では、低密度である１０００細胞／ｃｍ２以下で細胞を分注し、これを４０００細胞／ｃｍ２の細胞培養の効果と比較した。また、細胞培養培地を抗酸化剤が含まれたα－ＭＥＭ培地と抗酸化剤が既に含まれたＬＧ－ＤＭＥＭ培地を異にして、これによる細胞増殖効果を比較した。
改善された層分離培養法の効果を確認するための実験群を、次の表３に工程改善部分を図１２ａ及び図１２ｂに模式化して示した。
図１２ａに示すように、１回継代を収得する工程までは、従来の層分離培養法と改善された層分離培養法が工程を同様に進めたが、改善された層分離培養法は、拡張された１回継代細胞をｓｅｅｄ ｃｅｌｌとして用いて培養する段階以後の継代培養工程が従来の層分離培養法と異なる。既存の層分離培養法は、密度の条件について認識せずに多くの細胞を収得することを目的とし、４０００細胞／ｃｍ２以上の高密度継代培養を行うが、改善された層分離培養法は、継代培養の密度を低密度である１０００細胞／ｃｍ２以下に調節することにより、２回継代後、継代９回以下の培養だけで最終的な産物を十分な量で収得することができ、より多くのモノクローナル幹細胞を収得するためには、最大１３回継代まで拡張培養することができる。２回継代後の培養工程を図１２ｂに詳細に示した。
細胞株は、層分離培養法によって分離された細胞株であり、ＳＣＭ０１ないＳＣＭ０８とそれぞれ命名した。
２．１ 胞株密度及び培地による増殖効果の確認
前記ＳＣＭ０１ないし０８細胞株を用いて培養を行い、継代培養による細胞増殖効果を、細胞数、集団倍加時間（ＰＤＴ；Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｄｏｕｂｌｉｎｇ Ｔｉｍｅ）、集団倍加数（ＰＤＬ；Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｄｏｕｂｌｉｎｇ Ｌｅｖｅｌ）にそれぞれ比較し、これを図１３～図２０に示した。
前記ＳＣＭ０１ないし０８細胞株を用いて培養を行い、継代培養による細胞増殖効果を、細胞数、集団倍加時間（ＰＤＴ；Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｄｏｕｂｌｉｎｇ Ｔｉｍｅ）、集団倍加数（ＰＤＬ；Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｄｏｕｂｌｉｎｇ Ｌｅｖｅｌ）にそれぞれ比較し、これを図１３～図２０に示した。
図１３～図２０にて確認されるように、ｃｍ２当たり１０００個の細胞密度で接種して培養されたすべての実験群において、ｃｍ２当たり４０００個の細胞密度で接種して培養した実験群よりも優れた細胞増殖効果を示した。また、同じ１０００個の細胞密度群であっても、抗酸化剤であるアスコルビン酸が含まれたα－ＭＥＭ培地で培養された１０００ａｌｐｈａ実験群において、より顕著な細胞増殖効果が確認された。
２．２ 細胞株密度による増殖効果の比較
培養細胞数による増殖率をより正確に比較するために、培養培地をそれぞれＬＧ ＤＭＥＭまたはα－ＭＥＭ培地に固定し、ｃｍ２当たり１０００または４０００個の細胞接種密度による細胞増殖効果を比較し、その結果を図２１～図２４に示した。
培養細胞数による増殖率をより正確に比較するために、培養培地をそれぞれＬＧ ＤＭＥＭまたはα－ＭＥＭ培地に固定し、ｃｍ２当たり１０００または４０００個の細胞接種密度による細胞増殖効果を比較し、その結果を図２１～図２４に示した。
図２１に示すように、ＬＧ ＤＭＥＭで培養されたＳＣＭ０１ないしＳＣＭ０８細胞株の２回継代（Ｐ２）ないし５回継代（Ｐ５）での増殖率がｃｍ２当たり４０００個の細胞数の接種群よりも１０００個の細胞数で接種して培養したとき、著しく高いことが確認されており、５回継代（Ｐ５）で確認されたｃｍ２当たり４０００個の細胞接種に比べて１０００個の細胞接種群の増殖率は、最低３．０８ないし最大４８．５０倍であることを確認した。また、図２２に示すように、ｃｍ２当たり１０００個の細胞接種群のＰＤＴ値もすべての細胞株において、ｃｍ２当たり４０００個の細胞接種よりも低いか、或いは同じようなレベルで示され、ＰＤＬ値は、すべての細胞株において、ｃｍ２当たり４０００個の細胞接種に比べて高い値が確認された。
また、図２３に示すように、α－ＭＥＭで培養されたＳＣＭ０１ないしＳＣＭ０８細胞株全部、１０００個の細胞数で接種して培養したとき、ＤＭＥＭ実験群と同じ傾向を示し、５回継代（Ｐ５）で確認されたｃｍ２当たり４０００個の細胞株接種に比べてｃｍ２当たり１０００個の細胞接種群の増殖率は、最低６．３２ないし最大８５．６３倍であることが確認された。また、図２４に示すように、ｃｍ２当たり１０００個の細胞接種群のＰＤＴ値も全細胞株において、ｃｍ２当たり４０００個の細胞接種よりも低いか、或いは同じようなレベルで示され、ＰＤＬ値は、すべての細胞株において、ｃｍ２当たり４０００個の細胞接種に比べて高い値が確認された。
このような結果は、ｃｍ２当たり４０００個の高密度細胞接種培養に比べてｃｍ２当たり１０００個以下の細胞接種を通じて素早くモノクローナル間葉系幹細胞の増殖を誘導することができることを示す結果である。
２．３ 培養培地による増殖効果の比較
前で実施例２．２を通して１０００細胞／ｃｍ２培養が４０００細胞／ｃｍ２培養に比べ、優れた増殖効果を示すことがあることを確認したので、細胞数を１０００個で固定し、培地を変数として変化させながら、細胞増殖効果を比較することにより、培養培地条件による増殖効果をさらに検証し、その結果を図２５および図２６に示した。
前で実施例２．２を通して１０００細胞／ｃｍ２培養が４０００細胞／ｃｍ２培養に比べ、優れた増殖効果を示すことがあることを確認したので、細胞数を１０００個で固定し、培地を変数として変化させながら、細胞増殖効果を比較することにより、培養培地条件による増殖効果をさらに検証し、その結果を図２５および図２６に示した。
図２５に示すように、培養培地をα－ＭＥＭ及びＤＭＥＭに変えながら、細胞増殖率を比較した結果、ＬＧ－ＤＭＥＭに比べてα－ＭＥＭ培地を用いた実験群で最低１．７７倍から６．３９倍の高い細胞増殖率を確認した。また、図２６に示すように、ＰＤＴは、すべてのα－ＭＥＭ実験群で低く示され、ＰＤＬは増加したことが確認された。
このような実験結果は、細胞接種密度をｃｍ２当たり１０００個以下の細胞で調節し、低継代で培養することに加え、抗酸化剤が添加された培地を用いて培養した場合、細胞の増殖効率を最大化とすることができることが示される。
＜実施例３＞ 改善工程の樹立
前記実施例を通して間葉系幹細胞培養において、細胞密度の調節及び抗酸化剤の添加が重要な因子となり得ることを確認したので、韓国特許出願１０－２００６－００７５６７６号及び１０－２００７－００５３２９８号に記載された層分離培養法の既存の工程に加えて、細胞培養密度及び培地の条件を異にし、モノコロニーの間葉系幹細胞を、低継代で効果的に収得することができる改善された過程を確立し、これを総合的に下記の表４（ＤＭＥＭ培地を利用した培養条件）および表５（α－ＭＥＭ培地を用いた培養条件）に示した。
前記実施例を通して間葉系幹細胞培養において、細胞密度の調節及び抗酸化剤の添加が重要な因子となり得ることを確認したので、韓国特許出願１０－２００６－００７５６７６号及び１０－２００７－００５３２９８号に記載された層分離培養法の既存の工程に加えて、細胞培養密度及び培地の条件を異にし、モノコロニーの間葉系幹細胞を、低継代で効果的に収得することができる改善された過程を確立し、これを総合的に下記の表４（ＤＭＥＭ培地を利用した培養条件）および表５（α－ＭＥＭ培地を用いた培養条件）に示した。
より具体的には、本発明の骨髄由来の間葉系幹細胞の層分離培養工程及び増殖培養を次のように行った。
骨髄ドナーの臀部に局所麻酔薬で麻酔した後、臀部の骨に注射針を刺し、骨髄を採取した。１００ｍｍ培養容器に２０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含む１４ｍｌ ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ｀ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ｀ｓ Ｍｅｄｉｕｍ、ＧＩＢＣＯ－ＢＲＬ、Ｌｉｆｅ－ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＭＤ、ＵＳＡ）、ヒトの骨髄１ｍｌを入れ、３７℃、ＣＯ２細胞培養器で２時間培養した。培養後、培養容器を片方に軽く傾け、底に張り付いている細胞がなるべく浮き上がらないように最大限に培養容器の上層培養液のみ新しい容器に移し替えた。
同様の過程をもう一度繰り返した後、収得した培養液を底に膠原質（ｃｏｌｌａｇｅｎ）がコーティングされた培養容器（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に移し替えた後、３７℃で２時間培養した。培養液を再び新しい膠原質がコーティングされた容器に移し替え、２４時間後再び新しい容器に移し替え、２４時間後にまた新たな容器に移し替えた。最後に、４８時間後、新しい容器に移し替えた後、残存する細胞が培養容器の底に張り付いて育っていることを目視で確認した。前の数々の層分離段階を経て、この段階まで至ることができる細胞は、細胞の割合が他の細胞よりもはるかに小さい細胞であることを推測することができる。
約１０～１４日間の時間が経過すると、細胞がモノコロニー（ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｌｏｎｙ）を形成するが、このモノクローナル細胞群をトリプシンを処理して分離し、６－ウェル培養容器に移し替えた。３７℃、５％ＣＯ２細胞培養器で４～５日培養した後、約８０％育ったときに、細胞を０．０５％ｔｒｙｐｓｉｎ／１ｍＭ ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ－ＢＲＬ）を処理して収得した後、Ｔ１７５培養容器に移し替え、低細胞密度で継代培養した。
このように、初期継代での細胞密度を１０００細胞／ｃｍ２のレベルに下げて培養する場合、他の工程はすべて同じように調節したにもかかわらず、間葉系幹細胞の増殖能及び幹細胞の特性が優秀に維持されて、同じ継代でも増殖を効果的に誘導されることを確認した。特に細胞密度を下げて培養する場合、既存の工程で必要とされていた間葉系幹細胞でＷＣＢ（Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）の製造過程を省略することができ、細胞の製造期間を効果的に短縮することができる。特に継代を少なくすると、老化が比較的ゆっくり進んだ細胞を大量に得ることができ、このような細胞を治療剤として用いる場合、治療効果が優れるものと期待することができる。
また、培養培地として抗酸化剤が添加されたα－ＭＥＭを用いる場合、高密度の細胞培養で誘導されるＲＯＳストレスが抗酸化剤処理によって効果的に改善され、間葉系幹細胞の細胞増殖能が回復することができ、従来の工程に比べて細胞の継代を大幅に短縮させ、間葉系幹細胞の特性を維持する老化が進んでいない新鮮な状態の単一コロニー間葉系幹細胞を迅速かつ安定的に収得することができるという特徴がある。
前記のような内容を総合してみると、低密度細胞培養は、短時間に多くの細胞を得ることができ、製造工程は簡素化させるだけでなく、長期間培養（ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｃｕｌｔｕｒｅ）でも、間葉系幹細胞の特性を完全に維持する老化されていない状態の細胞を収得することができるので、良質の幹細胞の産生を可能にすることを確認した。
これにより、以下、移植片対宿主病の治療のための実験において、前記実施例を通じて構築した改善方法で収得される幹細胞を用いた。
＜実施例４＞ 改善層分離培養法を通じて収得された幹細胞の移植片対宿主病の治療効果の確認
４．１ 移植片対宿主病の動物モデル作製
移植片対宿主病の動物モデルの作製方法を図２７に示した。まず、ＢＡＬＢ／ｃマウスに８．５Ｇｙ量の放射能を照射し、２４時間後に、雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｎから骨髄細胞（５ｘ１０６／０．１ｍｌ）と脾臓細胞（５ｘ１０６／０．１ｍｌ）を抽出し、放射能が照射されＢＡＬＢ／ｃマウスの静脈を通じて注入した。移植片対宿主病のマウスモデルが構築されたかを確認するために、作製されたマウスにおいて、皮膚、毛質（ｆｕｒ ｔｅｘｔｕｒｅ）、腹水（ａｓｃｉｔｅｓ）、下痢（ｄｉａｒｒｈｅａ）、猫背（ｈｕｎｃｈｅｄ ｂａｃｋ）を観察し、移植片対宿主病の臨床的な症状を示すかどうかを確認した。作製されたマウスを図２８に示した。
４．１ 移植片対宿主病の動物モデル作製
移植片対宿主病の動物モデルの作製方法を図２７に示した。まず、ＢＡＬＢ／ｃマウスに８．５Ｇｙ量の放射能を照射し、２４時間後に、雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｎから骨髄細胞（５ｘ１０６／０．１ｍｌ）と脾臓細胞（５ｘ１０６／０．１ｍｌ）を抽出し、放射能が照射されＢＡＬＢ／ｃマウスの静脈を通じて注入した。移植片対宿主病のマウスモデルが構築されたかを確認するために、作製されたマウスにおいて、皮膚、毛質（ｆｕｒ ｔｅｘｔｕｒｅ）、腹水（ａｓｃｉｔｅｓ）、下痢（ｄｉａｒｒｈｅａ）、猫背（ｈｕｎｃｈｅｄ ｂａｃｋ）を観察し、移植片対宿主病の臨床的な症状を示すかどうかを確認した。作製されたマウスを図２８に示した。
図２８に示すように、本発明の作製方法により作製されたマウスは、対照群に比べて毛並みが荒く、毛先が裂けながら抜ける現象が現れ、毛色が黄色を帯びることを確認した。また、腹水がたまってきて血便の症状が現れ、猫背などが見られた。その他に運動量及び食事量もやはり対照群に比べて減少することが確認された。
さらに移植片対宿主病の動物モデルの構築を検証するためにフローサイトメトリー分析、免疫組織化学分析を行った。
まず、フローサイトメトリー分析を用いて、マウスの表現型、免疫細胞、炎症細胞の観察を行い、その結果を図２９に示した。
図２９に示すように、本発明の作製方法で作製された移植片対宿主病のマウスは、Ｎａｉｖｅマウスに比べて、Ｃ５７ＢＬ／６レシピエント血中のＭＨＣ ＩＩ表現型を示した。
組織染色による免疫組織化学分析を移植片対宿主病誘導７日目および１４日目に行い、その結果を図３０に示した。
図３０に示したように、本発明の作製方法で作製された移植片対宿主病のマウスは、Ｎａｉｖｅマウスに比べて真皮層が厚く発達していることが確認された。また、異常角化細胞、血管周辺部に単核球浸潤が観察された。特に移植片対宿主病誘導後１４日目には、Ｎａｉｖｅマウスに比べて表皮層と真皮層が全部厚く発達されており、真皮層下の脂肪層は崩れ、毛包や皮脂腺に損傷があることが確認された。
移植片対宿主病が誘導されたマウスが、Ｎａｉｖｅマウスに比べて体重の変化があるかどうかを確認するために、疾患誘導後４週間の間体重の変化を測定し、その結果を図３１に示した。
図３１に示すように、移植片対宿主病が誘導されたマウスは、Ｎａｉｖｅマウスに比べて体重が減少しており、移植後１０日目に体重変化が最も大きく表れたことが確認された。
前記のような結果は、移植片対宿主病マウスの構築が効果的に達成されたことを示す。
本発明の移植片対宿主病の動物モデル作製およびその後、治療方法を簡略に模式化して図３２に示した。
４．２ ＧＣＭ（ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）対比移植片対宿主病の治療効果の確認
４．２．１ 改善層分離培養法による幹細胞の製造及び投与
実施例３の改善層分離培養法に基づいて、細胞培養密度を１０００細胞／ｃｍ２以下とし、抗酸化剤を含むａ－ＭＥＭ培地を用いて、モノクローナル間葉系幹細胞を収得した。抗生剤としてはゲンタマイシンが追加され、α－ＭＥＭ培養液で行った（表５参照）。以下、１０００細胞／ｃｍ２以下の低密度及び抗酸化条件の改善層分離培養法を通じて収得された幹細胞を「ｃＭＳＣ１」と命名した。比較群として移植片対宿主病が誘発されたマウスにＧＣＭ（ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）方法で分離された幹細胞を投与した群を設定し、「ＧＣＭ－ＭＳＣ」と命名し、ｃＭＳＣ１と同様に投与した。
４．２．１ 改善層分離培養法による幹細胞の製造及び投与
実施例３の改善層分離培養法に基づいて、細胞培養密度を１０００細胞／ｃｍ２以下とし、抗酸化剤を含むａ－ＭＥＭ培地を用いて、モノクローナル間葉系幹細胞を収得した。抗生剤としてはゲンタマイシンが追加され、α－ＭＥＭ培養液で行った（表５参照）。以下、１０００細胞／ｃｍ２以下の低密度及び抗酸化条件の改善層分離培養法を通じて収得された幹細胞を「ｃＭＳＣ１」と命名した。比較群として移植片対宿主病が誘発されたマウスにＧＣＭ（ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）方法で分離された幹細胞を投与した群を設定し、「ＧＣＭ－ＭＳＣ」と命名し、ｃＭＳＣ１と同様に投与した。
本発明のｃＭＳＣ１注入による移植片対宿主病の治療効果を確認するために、移植片対宿主病が誘発された実施例４．１のＢＡＬＢ／ｃマウスに１×１０６ｃＭＳＣ１を１、３、および５日目に投与して治療効能を観察し、その具体的な治療プロトコルを図３３に示した。移植片対宿主病治療のために用いた実験群Ｇ１ないしＧ５、及び各実験群に属する個体数は、次の表６の通りであり、１、３、５日目に投与した容量（１日目の投与＝１ｓｔ、３日目の投与＝２ｎｄ、５日目の投与＝３ｒｄ）は、表７に示す。
４．２．２ ｃＭＳＣ１投与による治療効果の確認
移植片対宿主病のマウスの生存率測定
移植片対宿主病の誘発後、対照群、実験群を含むＧ１ないしＧ５の生存率を約２０日間確認し、その結果を表８および図３４に示した。
移植片対宿主病のマウスの生存率測定
移植片対宿主病の誘発後、対照群、実験群を含むＧ１ないしＧ５の生存率を約２０日間確認し、その結果を表８および図３４に示した。
図３４および表８に示すように、移植片対宿主病のマウスに細胞安定化剤のみを投与したＧ３実験群では１０日目にマウスがすべて斃死したのに対し、ＧＣＭ－ＭＳＣを投与したＧ４実験群では１０日目に５０％が生存し、１５日目にすべて斃死した。ｃＭＳＣ１を投与したＧ５実験群では、１０日目、１５日目にそれぞれ９０％及び７０％が生存し、改善層分離培養であるａ－ＭＥＭ培地で低濃度で培養されたクローナル幹細胞を、当該疾患に適用した場合、生存率を効果的に改善することができることが確認された。
移植片対宿主病マウスの臨床症状の改善効果確認
本発明のｃＭＳＣ１投与による移植片対宿主病の臨床症状の改善効果を確認した。下記表９の基準に基づいて実験動物の臨床症状を各項目別に０～２点と数値化し、合計１０点で計算して示し、その結果を図３５～図４０に示した。
本発明のｃＭＳＣ１投与による移植片対宿主病の臨床症状の改善効果を確認した。下記表９の基準に基づいて実験動物の臨床症状を各項目別に０～２点と数値化し、合計１０点で計算して示し、その結果を図３５～図４０に示した。
図３５に示すように、本発明のｃＭＳＣ１を投与したマウスが移植片対宿主病誘発後７、１０、１４日目に評価した臨床点数が最も低いことが確認された。
図３６～図４０は、項目別の臨床的症状に対する点数を示した図であり、それぞれ皮膚、毛質、下痢、腹水、マウスの姿勢（猫背）に関する結果を示す。図３６～図４０で確認できるように、すべての臨床的症状において、本発明のｃＭＳＣ１を投与したマウスが、細胞安定化剤のみ投与した実験群に比べ著しい臨床症状の改善効果を示した。また、ＧＣＭ－ＭＳＣを投与した群と比較したとき、著しく優れた効果を示した。
前記のような結果を改善層分離培養法であるａ－ＭＥＭ培地で低濃度で培養する方法により収得したクローナル幹細胞が移植片対宿主病マウスの生存率を高め、あらゆる臨床的症状を改善する効果を有しており、移植片対宿主病の治療剤として有用に用いられることを確認した。
＜実施例５＞ 改善層分離培養法を通じて収得された幹細胞の治療効果の比較
５．１．改善層分離培養法を通じて収得された幹細胞と既存の層分離培養法を通じて収得された幹細胞の細胞特性の比較
ｃＭＳＣ１は、低密度及び抗酸化培地条件を有する改善された層分離培養法を通じて収得した間葉系幹細胞であり、前で確認したように、従来の層分離培養法により収得された間葉系幹細胞に比べて幹細胞の特性及び増殖能が効果的に維持されるなどの優秀性を有する。ｃＭＳＣ１が従来の層分離方法で分離された幹細胞と比較して移植片対宿主病の治療剤として、より優秀性を有するか否かを確認するための比較実験を行った。比較群としては抗酸化剤が追加されておらず、面積当たり培養細胞数が４０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上である従来層分離培養法で分離された幹細胞（以下、「ｃＭＳＣ２」とする）と同様の層分離方法を基本とし、抗酸化剤が追加されたα－ＭＥＭにおいて、低密度で培養して収得されたモノクローナル間葉系幹細胞（ｃＭＳＣ１）を用いて、これを整理して、表１０に示した。
５．１．改善層分離培養法を通じて収得された幹細胞と既存の層分離培養法を通じて収得された幹細胞の細胞特性の比較
ｃＭＳＣ１は、低密度及び抗酸化培地条件を有する改善された層分離培養法を通じて収得した間葉系幹細胞であり、前で確認したように、従来の層分離培養法により収得された間葉系幹細胞に比べて幹細胞の特性及び増殖能が効果的に維持されるなどの優秀性を有する。ｃＭＳＣ１が従来の層分離方法で分離された幹細胞と比較して移植片対宿主病の治療剤として、より優秀性を有するか否かを確認するための比較実験を行った。比較群としては抗酸化剤が追加されておらず、面積当たり培養細胞数が４０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上である従来層分離培養法で分離された幹細胞（以下、「ｃＭＳＣ２」とする）と同様の層分離方法を基本とし、抗酸化剤が追加されたα－ＭＥＭにおいて、低密度で培養して収得されたモノクローナル間葉系幹細胞（ｃＭＳＣ１）を用いて、これを整理して、表１０に示した。
ｃＭＳＣ２と本発明のｃＭＳＣ１の細胞数、細胞の大きさを顕微鏡で確認し、その結果を図４１に示した。図４１に示すように、産生工程を異にして収得したｃＭＳＣ２と本発明のｃＭＳＣ１は、細胞の大きさと数が異なることを確認した。
両細胞間の大きさの差異を検証するために、Ｎｕｃｌｅｏ Ｃｏｕｎｔｅｒ ＮＣ－２５０機器を用いて、細胞の大きさを確認した。より具体的には、間葉系幹細胞は、プラスチックに張り付いて育つ特徴があるので、Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡを用いて、細胞をプラスチックから浮き上がらす作業を行うが、このときの細胞の写真を撮って円形であったときの細胞の状態において差異があることを確認でき、Ｎｕｃｌｅｏ Ｃｏｕｎｔｅｒ ＮＣ－２５０機器を用いて、細胞の大きさを確認し、その結果を図４２および表１１に示した。
図４２に示すように、円形の状態でも両細胞間の大きさの差異を確認することができ、機器を通じて細胞直径を確認したとき、ｃＭＳＣ２は１０．２～３２．６μｍと細胞の大きさが多様に分布すること分かった。これに対し、ｃＭＳＣ１は１０．２～１８．３μｍとｃＭＳＣ２より細胞の大きさが小さく、均質であることが確認された。
さらにフローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）を用いて、前方散乱／側方散乱光（ＦＳＣ／ＳＳＣ）値を同一に指定した際にも、フローサイトメトリー分析でも、細胞の大きさが差異があるかどうかを確認し、その結果を図４３に示した。
図４３に示すように、ｃＭＳＣ２は、細胞の大きさが大きいので、細胞が全体的に広く分布しているのに対し、ｃＭＳＣ１は、細胞の大きさが小さくて側散乱光（ＳＳＣ）２００Ｋ内に分布していることが確認された。
前記のように、ｃＭＳＣ１が細胞の大きさがより小さく、均質に形成されることにより間葉系幹細胞が培養されると同時に分泌されるサイトカインの量が変化され、ｃＭＳＣ１の移植片対宿主病の治療効果がさらに強化されるものと予想されるところ、移植片大宿主疾患に対する治療効果の増大を確認するためのｉｎ ｖｉｔｒｏの実験を行った。活性化されたＴ細胞の抑制率を混合リンパ球反応（Ｍｉｘｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＭＬＲ）条件で確認し、何ら刺激を与えていない細胞の状態で免疫関連マーカー（ＩＤＯ、ＩＣＯＳＬ、ＴＳＧ６、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＨＯ－１）の発現量をｑＰＣＲ法で両細胞を比較し、その結果を図４４に示した。
図４４に示すように、活性化されたＴ細胞の抑制率を混合リンパ球反応条件で確認した結果、両細胞はいずれもＴ ｃｅｌｌ：ＭＳＣ ＝ １：４の条件で９５％の高い抑制率を示したが、何ら刺激を与えていない状態の免疫関連マーカー（ＩＤＯ、ＩＣＯＳＬ、ＴＳＧ６、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＨＯ－１）の発現量と比較した結果、ｃＭＳＣ１の免疫関連マーカーの発現量が高いことが確認され、これはｃＭＳＣ１が移植片対宿主病の治療剤として用いる際、既存の方法で得られた細胞よりもより良い治療効能を奏することができることを示す結果である。
５．２．改善層分離培養法を通じて収得された幹細胞と、既存の層分離培養法を通じて収得された幹細胞のＧＶＨＤ治療効果の比較
実施例５．１を通じて改善層分離培養法で収得された幹細胞が既存の層分離培養法を通じて収得された幹細胞と比較してＧＶＨＤの治療剤として、より適切な細胞の特性を示すことが確認されたので、急性ＧＶＨＤ動物モデルを作製し、ｃＭＳＣ１及びｃＭＳＣ２の治療効果を動物モデルで確認した。
実施例５．１を通じて改善層分離培養法で収得された幹細胞が既存の層分離培養法を通じて収得された幹細胞と比較してＧＶＨＤの治療剤として、より適切な細胞の特性を示すことが確認されたので、急性ＧＶＨＤ動物モデルを作製し、ｃＭＳＣ１及びｃＭＳＣ２の治療効果を動物モデルで確認した。
急性ＧＶＨＤモデル確立のために受容体であるＢＡＬＢ／ｃの免疫細胞をすべて除去するために致死量に近い７．０Ｇｙの放射線を照射し、約２４時間後にレシピエントであるＣ５７ＢＬ／６Ｎから分離した骨髄細胞と脾臓細胞それぞれ５×１０６／１００μｌずつＰＢＳに混合し、放射線が照射されたＢＡＬＢ／ｃに尾静脈を通じて２００μｌ注入して疾患を誘発した。この後、確立されたＧＶＨＤ動物モデルに改善された層分離培養法を通じて収得された幹細胞ｃＭＳＣ１及びｃＭＳＣ２を投与した。１０００ｃｅｌｌ／ｃｍ２以下で培養する改善された層分離培養法で収得された幹細胞実験群では、１００ ｃｅｌｌ／ｃｍ２（ｃＭＳＣ１（１００））及び１０００ｃｅｌｌ／ｃｍ２（ｃＭＳＣ１（１０００））に継代培養して収得される幹細胞を用い、既存の層分離培養法に対応した高密度培養ｃＭＳＣ２は、４０００ｃｅｌｌ／ｃｍ２で継代培養して収得される幹細胞を用いた。ｃＭＳＣ１（１００）、ｃＭＳＣ１（１０００）、ｃＭＳＣ２実験群全部において、細胞生存率は、それぞれ平均９９．５３％、９９．６６％、９９．８％と示され、密度調節培養細胞毒性を示さないことを確認した。細胞ｃＧＶＨＤ動物モデルに投与される投与物質及び全投与量を下記の表１２に示した。
ＧＶＨＤの重症度程度は、皮膚に肉眼上で観察される皮膚の角質や傷、毛抜けや粗さと、猫背、下痢と腹水、姿勢、動きなどの各症状の重症度をそれぞれ点数化して確認し、生存率により分析した。
各実験群の投与による生存率を確認した結果を図４５および表１３に示した。
表１３及び図４５に示すように、正常対照群（Ｎａｉｖｅ、Ｇ１）と骨髄細胞のみ移植した群（ＢＭ、Ｇ２）では、２８日間の観察期間の間、すべての個体が生存したが、ＧＶＨＤを誘導し、ＰＢＳのみを投与した実験群（ＧＶＨＤ＋ＰＢＳ、Ｇ３）では７日目から生存率が８０％以下までに下がり、１１日目には５０％、１５日目には、１匹を除いて、すべての個体が死亡したことを確認した。
その一方、培養条件とは無関係にＰＢＳ単独注入グループと比較したとき、ｃＭＳＣ注入群全部の生存率が劣る時点を２倍以上増大させたことを確認した（ＰＢＳ：７日、ｃＭＳＣ注入群：１６～１８日）。具体的には、従来の層分離培養法で収得された幹細胞（ｃＭＳＣ２、Ｇ６）投与群は、１８日目から生存率が減少し始めて２７日目に生存率が５０％まで減少し、観察期間（２８日目）までは、全体の４０％が生存した。改善された層分離培養法を通じて収得されたｃＭＳＣ１（１００）、ｃＭＳＣ１（１０００）は、投与群両者全部１８日目から生存率が減少したが、その後には生存率が維持され、２８日目まで全体の７０％が生存していることを確認した。これは、従来の層分離培養法に比べ約１．５倍以上の生存率の増加であり、改善された層分離培養法を通じて収得された幹細胞が、従来の層分離培養法を通じて収得された幹細胞に比べ優れたＧＶＨＤの治療効果を奏することができることを示す結果である。
実験群によるＧＶＨＤ動物モデルの臨床症状を評価した結果を図４６に示した。
図４６に示すように、幹細胞移植してから２８日後、皮膚の角質及び血痕、毛の状態、腹水、下痢有無、猫背などを総合的に評価した臨床症状を観察した結果、ＧＶＨＤ＋ＰＢＳ（Ｇ３）群に比べて培養条件とは無関係にｃＭＳＣ注入群では、臨床症状が改善されたことが確認された。特にＧＶＨＤ＋ｃＭＳＣ１（１００）（Ｇ４）及びＧＶＨＤ＋ｃＭＳＣ１（１０００）（Ｇ５）では、従来の層分離培養法で収得された高密度培養ｃＭＳＣ２投与群（Ｇ６）と比較して、より効果的な臨床症状の改善が確認され、こうした差異は、１５日目以後から目立った。２８日目の実験動物の状態によると、ＧＶＨＤ＋ｃＭＳＣ１（１００）（Ｇ４）及びＧＶＨＤ＋ｃＭＳＣ１（１０００）（Ｇ５）実験群がＰＢＳ及びｃＭＳＣ２投与群に比べて臨床症状が好転したことを肉眼でも確認することができた。
前記のような結果を総合してみると、改善された層分離培養法を通じて収得されたｃＭＳＣ１を用いれば、移植片対宿主病の生存率を高め、各種臨床症状を効果的に改善させることができることが確認された。特に、本発明に係るｃＭＳＣ１は、従来のモノクローナル間葉系幹細胞と比較して増殖能及び幹細胞の特性が優秀に維持され、増殖が効果的に維持されるばかりで、既存の治療剤の製造のために産生されるモノクローナル間葉系幹細胞に比べてＷＣＢの製造過程を省略することができ、少ない継代回数で収得が可能であり、老化が進んでいない新鮮な状態のモノクローナルであるので、従来のモノクローナル間葉系幹細胞に比べてより優れた移植片対宿主病の治療が可能であることを知ることができる。
Claims (6)
- １）個体から分離された骨髄を、第１容器で培養する段階と、
２）前記第１容器の上澄み液のみ新しい容器に移し替えて培養する段階と、
３）前記の新しい容器に存在する細胞を培養し、上澄み液を収得する段階と、
４）前記３）段階の上澄み液を２）段階の第１容器の上澄み液にし、２）及び３）段階を１回以上繰り返して、モノクローナル幹細胞を得る段階と、
５）前記４）段階のモノクローナル幹細胞を、５０～１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で培地に接種して１回継代培養する段階と、
６）前記５）段階の継代培養されたモノクローナル幹細胞を、５０～１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で培地に接種して２～１３回継代培養する段階と、を通じて収得されるモノクローナル間葉系幹細胞を含む、移植片対宿主病の予防または治療用薬学的組成物であって、
前記５）および６）段階における培地に、グルタチオン、システイン、システアミン、ユビキノール、β－メルカプトエタノールおよびアスコルビン酸からなる群から選択される抗酸化剤が追加されている、前記組成物。 - 前記５）および６）段階の培養は、１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で培地に接種して行われることを特徴とする請求項１に記載の移植片対宿主病の予防または治療用薬学的組成物。
- 前記移植片対宿主病は、急性移植片対宿主病または慢性移植片対宿主病であることを特徴とする請求項１に記載の移植片対宿主病の予防又は治療用薬学的組成物。
- 前記モノクローナル幹細胞は、ＩＤＯ（Ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ ２，３－ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）、ＩＣＯＳＬ（Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｌｉｇａｎｄ）、ＴＳＧ６（Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｅ ６ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＣＸＣＬ９（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（ＣＸＣ ｍｏｔｉｆ）ｌｉｇａｎｄ ９）、ＣＸＣＬ１０（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（ＣＸＣ ｍｏｔｉｆ）ｌｉｇａｎｄ １０）、およびＨＯ－１（Ｈｅｍｅ ｏｘｙｇｅｎａｓｅ－１）からなる群から選択された１種以上の免疫関連マーカーの発現量が増加したものであることを特徴とする請求項１に記載の移植片対宿主病の予防または治療用薬学的組成物。
- １）個体から分離された骨髄を、第１容器で培養する段階と、
２）前記第１容器の上澄み液のみ新しい容器に移し替えて培養する段階と、
３）前記の新しい容器に存在する細胞を培養し、上澄み液を収得する段階と、
４）前記３）段階の上澄み液を２）段階の第１容器の上澄み液にし、２）及び３）段階を１回以上繰り返し、モノクローナル幹細胞を得る段階と、
５）前記４）段階のモノクローナル幹細胞を、５０～１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で培地に接種して１回継代培養する段階を経て、モノクローナル幹細胞を収得する段階と、
６）前記５）段階の継代培養されたモノクローナル幹細胞を、５０～１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で培地に接種して２～１３回継代培養する段階と、を含む、移植片対宿主病の予防または治療用薬学的組成物の製造方法であって、
前記５）および６）段階における培地に、グルタチオン、システイン、システアミン、ユビキノール、β－メルカプトエタノールおよびアスコルビン酸からなる群から選択される抗酸化剤が追加されている、前記製造方法。 - 前記５）および６）段階の培養は、１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で培地に接種して行われることを特徴とする請求項５に記載の移植片対宿主病の予防または治療用薬学的組成物の製造方法。
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