KR20060090369A - 제대혈로부터 분리한 다분화능 줄기세포 및 이를 함유하는 허혈성 괴사질환에 대한 세포치료제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 제대혈(탯줄혈액)에서 성체줄기세포인 다분화능 줄기세포(Multipotent Stem Cell) 및 이를 함유하는 폐쇄성 동맥질환에 의한 허혈성 괴사질환에 대한 세포치료제에 관한 것으로서, 상세하게는 본 발명의 다분화능 줄기세포는 성체줄기세포임에도 불구하고 골형성 세포 또는 신경세포로 분화하는 능력을 가지고 있어서 대퇴부의 동맥순환 정체가 말초순환장애를 일으킴으로서 미세 혈관계의 조직을 붕괴시켜 허혈성 괴사를 야기하는 질병 뿐만 아니라 뇌경색, 심근경색, 당뇨의 후유증으로 오는 사지 말단의 괴사 등 허혈성 질병등의 치료에 유용하다.

제대혈, 다분화능 줄기세포, 허혈성 괴사

Description

제대혈로부터 분리한 다분화능 줄기세포 및 이를 함유하는 허혈성 괴사질환에 대한 세포치료제{Multipotent stem cells isolated from umbilical cord blood and the cell therapy products comprising the same for treating ischemic hind limb disease}

도 1은 제대혈 유래 다분화능 줄기세포의 면역학적 특성을 나타낸 도로서, 중간엽 연관 항원인 SH-2에 대한 양성(A) 반응과 그 대조군(B), 과요오드산-쉬프 염색에서 양성(C)반응과 그 대조군(D)을 나타낸 도이며,

도 2는 유식세포 분석기를 이용한 제대혈 유래 다분화능 줄기세포의 면역학적 특성을 나타낸 도로서, CD 45(B), SH-2(C), SH-3(D)에 대한 양성반응을, A와 E는 그 대조군을 나타낸 도이고,

도 3은 제대혈 유래 다분화능 줄기세포가 골형성 세포로 분화된 것을 나타낸 도(A, B)로서, Von-Kossa 염색법으로 염색한 도(C, D)로 나타낸 것이고,

도 4는 제대혈 유래 다분화능 줄기세포의 신경계 뉴런의 특이 항원인 NSE(neuron-specific enolase)(A)와 신경계 성상세포의 특이항원인 GFAP(glial fibrillary acidic protein)(B)에 양성반응을 나타낸 도이며, C 와 D는 그 대조군이며,

도 5는 허혈성 괴사 모델의 마우스에서 혈관결절 30일 후 본 발명의 줄기세포를 투여하지 않은 대조군으로서, 적색원은 절단현상이 일어난 부위를 나타내며,

도 6은 허혈성 괴사 모델의 마우스에서 혈관결절 30일 후 즉시 본 발명의 줄기세포를 투여한 군으로서, 적색원은 절단현상이 일어난 부위를 나타내며,

도 7은 허혈성 괴사 모델의 마우스에서 혈관결절 31일 후 본 발명의 줄기세포를 투여한 군으로서, 적색원은 절단현상이 일어난 부위를 나타내며,

도 8은 허혈성 괴사모델의 마우스에서 그 증상일자 및 절단일자를 도표화한 것이며,

도 9는 허혈성 괴사모델의 마우스에서 군별 절단율을 도표화한 것이며,

도 10은 허혈성 괴사 모델의 마우스에서 혈관결절 30일 후, 각 군별 혈관 조영술을 이용하여 X-ray 촬영한 도이다.

본 발명은 제대혈(탯줄혈액)에서 분리해낸 성체줄기세포인 다분화능 줄기세포(Multipotent Stem Cell) 및 이를 함유하여 폐쇄성 동맥질환에 의한 허혈성 괴사 질환에 대한 세포치료제에 관한 것이다.

사회의 고령화와 함께 폐쇄성 동맥질환에 의한 혈행장애를 초래하는 증례가 증가되고 있다. 이러한 혈행장애의 대표적인 질환으로는 심장에 산소와 영양을 날 라다주는 관상동맥의 일부가 막혀, 심근의 모세혈관에 혈액이 공급되지 못해서 그 혈관의 지배에 있는 심근의 세포가 죽어 굳어버리는 심근경색(Heikkila J. Mitral incompetence complicating acute myocardial infarction. Br Heart J., 29, pp162-169, 1967; Barzilai B., Davis VG., Stone PH., Jaffe AS. Prognostic significance of mitral regurgitation in acute myocardial infarction. Am J Cardiol., 65, pp1169-1175, 1990), 뇌의 혈관이 막혀서 혈액순환이 안되어 나타나는 허혈성 뇌졸중으로 뇌 국소부위의 혈액순환이 완전히 차단되어 뇌의 일부분이 죽는 뇌경색(Jung DK., Devuyst G., Maeder P., Bogousslavsky J. Atrial fibrillation with small subcortical infarcts. J. Neurol Neurosurg Psychiatr, 70, p3449, 2001; Ay H., Oliveira-Filho J., Buonanno FS et al. Diffusion-weighted imaging identifies a subset of lacunar infarction associated with embolic source. Stroke, 30, p264450, 1999), 손이나 발, 주로 무릎 아래의 적은 동맥이나 정맥에 염증(가끔 표재성 정맥에 이동성 정맥염)이나 혈관벽의 변화에 의해 혈관이 수축하거나 좁아져 혈전에 의해 혈관이 완전히막히는 폐쇄성 전층성 혈관염 질환인 버거씨병(Wessler S., Buerger`s disease revisited. Surg Clin Nort Am., 49, p703, 1969), 그리고 당뇨 합병증으로 미세혈관과 대혈관의 장애로 일어나는 폐쇄성 동맥질환을 들 수가 있다(S.M. Haffner, S. Lehto, T. Ronnemaa, K. Pyorala and M. Laakso, Mortality from coronary heart disease in subjects with type 2 diabetes and in nondiabetic subjects with and without prior myocardial infarction, N Engl. J. Med., 339, pp 229-234, 1998).

심근경색은 심장에 산소와 영양을 날라다주는 관상동맥의 일부가 막혀, 혈류가 중단됨으로써 그 부분의 심장의 벽, 즉 심근이 썩는 병이다. 원인으로 제일 중요한 것은 관상동맥의 경화로 인한 협착이나 폐색으로, 심근경색의 대부분에서 볼 수 있다. 종류는 급격히 심장의 일부가 썩어 30% 이상의 환자가 사망하는 병인 급성 심근경색, 일단 썩은 부분은 원상태로 회복되지 않으므로, 이것이 흉터로 남아있게 되는 상태가 되는 진구성 심근경색이 있다. 심근경색의 원인으로는 급성 관상동맥 폐색이 주요 원인이 되며, 그 95% 이상이 관상동맥 경화증으로 되는 것이고 나머지 5% 미만이 기타원인, 즉 매독, 전색, 대동맥 동맥류, 결핵, 선천성 기형 또는 신생물 등으로 된다.

뇌경색은 죽상 동맥경화로 혈관이 좁아지거나 막혀서 흘러갈 피가 모자라고 이어서 산소가 모자라서 뇌조직이 죽는 혈전성 뇌경색과 뇌경색 죽상 동맥경화가 있는 동맥의 혈전에서 떨어져 나온 조각(색전)이 뇌혈관을 따라 흘러가다 걸려서 동맥을 막기 때문에 그 아래의 뇌조직이 죽는 색전성 뇌경색이 있다. 혈전성 뇌경색은 대체로 병이 계속 나빠지는 경향이 있고 대개 환자는 나이가 많고 고혈압이나 당뇨병, 동맥경화로 인한 심장병이 있는 경우가 많다. 색전성 뇌경색은 동맥의 끝부분인 큰골의 피질에 잘 생기고 또 여러군데에 동시에 생기는 수가 많고 부분적으로는 핏줄이 터지기도한다. 피가 제일 많이 가는 중대뇌동맥에 흔하다. 색전이 뇌혈관의 죽상 동맥경화에서 떨어져 나올 수도 있고 멀리는 심장(심방세동, 급성울혈성심부전, 심장판막질환, 심내막염 등)에서도 온다.

버거씨병은 직접적인 원인은 규명되고 있지 않으나 여러 가지 원인적 요소들이 복합적으로 작용한 것으로 추측되고 있다. 나이나 성별, 종족 유전적요인, 자가면역성, 직업, 흡연 등이 이차적인 원인적 요소라고 생각되어 지고 있는데, 그 중에서도 흡연이 이 병의 원인 및 진행과 가장 밀접한 관련이 있다고 보고되었다(T. Heatherton, L. Kozlowsk, R. Frecker and K. Fagerstrom,The Fagerstrom test for nicotine dependence: a revision of the Fagerstrom Tolerance Questionnaire, Br. J. Addict, 86, pp1119-1127, 1991). 또한 사회 경제적으로 빈곤한 계층에서 주로 발병하며, 호냉노출이나 곰팡이 감염도 원인의 한 요소로 추정되고 있다. 또 이들 환자들에게는 혈중 피브리노겐수치가 다소 높아서 혈액의 과응고 상태나 혈소판의 과응집 상태 또는 교감신경의 과민 상태로 오는 말초 혈관 수축 등도 원인적 요소로 추정된다(Wessler S., Buerger`s disease revisited. Surg Clin Nort Am., 49, p703, 1969; T. Heatherton, L. Kozlowsk, R. Frecker and K. Fagerstrom,The Fagerstrom test for nicotine dependence: a revision of the Fagerstrom Tolerance Questionnaire, Br. J. Addict, 86, pp1119-1127, 1991).

그리고 당뇨병 합병증에서 가장 무서운 증상 중의 하나인 사지괴저는 당뇨병이 중증일 때 생기며 일단 이 병에 걸리면 손이나 발끝이 시커멓게 썩어 들어가는 위험한 증상이다. 정확한 원인은 알 수 없으나 외상, 화상, 화농 등의 증상에서 기인하는 것으로 추측하고 있고 괴저는 50세 이후의 환자에게서 많이 나타나며 염증, 수포, 궤양 등을 일으키며 열이 나고 심한 경우에는 손, 발의 절단에서부터 생명을 잃게까지 하는 증상이다(S.M. Haffner, S. Lehto, T. Ronnemaa, K. Pyorala and M. Laakso, Mortality from coronary heart disease in subjects with type 2 diabetes and in nondiabetic subjects with and without prior myocardial infarction, N Engl. J. Med., 339, pp229-234, 1998).

이러한 폐쇄성 동맥질환은 한국에서는 아직까지 확실한 통계가 미흡하나 구미 백인들보다 빈도가 높아 전체 말초 동맥질환의 약 15% 정도일 것으로 추측된다(Joyce JW. Buerger's disease (thromboangiitis obliterans). Rheum Dis. Clin. North Am., 16, pp463-470, 1990; Laohapensang K., Rerkasem K., Kattipattanapong V..,Seasonal variation of Buerger's disease in Northern part of Thailand, Eur. J. Vasc Endovasc Surg., Oct;28(4), pp418-420 z9, 2004; T. Heatherton, L. Kozlowsk, R. Frecker and K. Fagerstrom, The Fagerstrom test for nicotine dependence: a revision of the Fagerstrom Tolerance Questionnaire, Br. J. Addict, 86, pp1119-1127, 1991). 폐쇄성 동맥질환은 원위상지와 하지에 작거나 중간크기의 동맥과 정맥을 침범하며 대부분 사지 말단부의 동맥순환정체가 말초순환장애를 일으킴으로써, 미세혈관계의 조직을 붕괴시켜 허혈성 괴사를 야기한다. 이 허혈성 괴사시에는 동맥혈류압 감소와 모세혈관혈류의 정체로 인해, 백혈구와 혈소판이 활성화되고 혈관 내피에 손상을 입히고 결국 국소적인 저산소증과 대사변화를 초래한다.

폐쇄성 동맥질환의 치료는 막힌 동맥 상하부위 사이에 동맥의 피가 잘 흐를수 있도록 인조혈관 등을 이용하여 새로운 혈관을 만들어 주는 동맥 우회 수술이 있으며(Hunink MGM, Wong JB, Donaldson MC, et al., Revascularization of femoropopliteal disease: A decision and cost-effectiveness analysis., JAMA, 274, p165171, 1995), 이외에도 혈관 확장제를 투여하는 약물요법도 있고(Duda SH, Pusich B., Richter G., et al., Sirolimus-eluting stents for the treatment of obstructive superficial femoral artery disease: Six-month results. Circulation, 106, pp1505-1509, 2002), 다리에 있는 작은 혈관을 확장시켜 주기 위해 요추부위의 교감신경을 마비시키는 치료법(De Giacomo T., Rendina EA, Venuta F., Lauri D., Mercadante ES, Anile M., Coloni GF, Thoracoscopic sympathectomy for symptomatic arterial obstruction of the upper extremities., Ann Thorac Surg., 74(3), pp885-888, 2002 Sep) 등이 있다. 요사이는 혈관내피세포 성장인자(VEGF: Vascular Endothelial Growth Factor 165)를 이용한 치료법의 개발(Kim HJ, Jang SY, Park JI, Byun J, Kim DI, Do YS, Kim JM, Kim S,Kim BM, Kim WB, Kim DK., Vascular endothelial growth factor-induced angiogenic gene therapy in patients with peripheral artery disease., Exp. Mol. Med., 36(4), pp336-344, 2004 Aug)과 자가 조혈모 세포이식을 통한 치료법 개발 등 많은 연구들이 진행되고 있다(Miyamoto M., Yasutake M., Takano H., Takagi H., Takagi G., Mizuno H., Kumita S., Takano T., Therapeutic angiogenesisby autologous bone marrow cell implantation for refractory chronic periperal arterial disease using assessment of neovascularization by 99mTc-tetrofosmin perfusion scintigraphy. Cell Transplant., 13(4), pp429-437, 2004).

이러한 폐쇄성 동맥질환은 허혈성 괴사를 야기한다. 이러한 증상은 그 원인 이 아직 정확하게 밝혀져 있지 않으며 또한 질환이 계속 진행되는 특성이 있기 때문에 아직 확실한 근치적 치료법이 정립되어 있지 않은 단계이다. 버거씨병 등을 폐쇄성 동맥질환에 의한 허혈성괴사를 치료하는 최종적인 목적은 동맥혈류를 원활히 만드는 것이다.

줄기세포(Stem Cell)란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 이는 만능 줄기 세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)로 분류될 수 있다.

만능 줄기 세포(totipotent stem cell)는 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있는 만능의 성질을 가진 세포로 난자와 정자의 수정 이후 8세포기 까지의 세포가 이러한 성질을 가지며 이 세포를 분리하여 자궁에 이식하면 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있다.

전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell)는 외배엽, 중배엽, 내배엽층 유래의 다양한 세포와 조직으로 발생할 수 있는 세포로서, 수정 4-5일 후 나타나는 배반포(blastocyst)의 안쪽에 위치한 내세포괴(inner cell mass)에서 유래하며, 이를 배아 줄기 세포라 하며 다양한 다른 조직 세포로 분화되지만 새로운 생명체를 형성하지는 못한다.

마지막으로, 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)는 이 세포가 포함되어 있는 조직 및 기관에 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 줄기세포로서, 태아기, 신생아기 및 성체기의 각 조직 및 장기의 성장과 발달은 물론 성체조직의 항상성 유지와 조직손상 시 재생을 유도하는 기능에 관여하고 있으며 조직 특이적 다능성 세포들을 총칭하여 성체 줄기 세포라고 한다.

이에 본 발명자들은 성체줄기세포임에도 불구하고 제대혈에서 분리해낸 다분화능 줄기세포가 골형성 세포 또는 신경세포로 분화함을 밝혀내고, 이의 폐쇄성 동맥질환에 의한 허혈성 괴사질환의 세포치료제로서 유용함을 확인함으로서 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 제대혈에서 분리해낸 성체줄기세포인 다분화능 줄기세포 및 이를 함유하여 폐쇄성 동맥질환에 의한 허혈성 괴사 질환에 대한 세포치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 제대혈에서 분리됨을 특징으로 하는 성체줄기세포의 일종인 다분화능 줄기세포를 제공한다.

상기 다분화능 줄기세포는 CD 34 음성, HLA-DR 음성, CD62L 음성, CD62P 음성, CD 24 음성, CD133 음성 CD90음성, CD 29양성, CD51/61양성, CD44 양성, CD 29양성, CD135양성, CD 45 양성, CD49B 양성, CD105 양성, SH-2 양성, SH-3 양성 중에서 어느 하나 또는 복수의 면역학적 특성을 나타낸다.

상기에서 성체줄기세포가 복수의 면역학적 특성을 나타내는 경우에는 CD 105, CD 29, CD 44, CD 49b 양성을 공통적으로 나타는 경우를 포함한다.

또한, 상기 다분화능 줄기세포는 골형성 세포 또는 신경세포로 분화되는 능력을 가진다.

또한, 본 발명은 제대혈에서 분리해낸 다분화능 줄기세포를 함유하는 세포를 이용한 폐쇄성 동맥질환에 의한 허혈성 괴사질환에 대한 세포치료제를 제공한다.

상기 허혈성 괴사 질환에는 심근경색, 뇌경색, 버거씨 병, 당뇨 합병증에 의한 사지괴저를 포함한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 제대혈에서 분리된 다분화능 줄기세포를 제공한다.

상기 제대혈은 인간을 포함한 포유동물에서 태반과 태아를 연결하는 제대정맥으로부터 채취된 혈액으로 정의되며, 본 발명의 다분화능 줄기세포는 인간의 제대혈을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 제대혈에서 본 발명의 다분화능 줄기세포를 분리, 정제하는 방법은 하기와 같다.

제대혈에서 다분화능 세포를 취득하는 방법으로서는 특별히 한정되지 않지만, 이하의 방법으로 취득할 수 있다.

제대혈에서 채취한 혈액을 PBS와 일정 비율로 희석, 교반시키고 이를 10-15 : 20-30, 바람직하게는 15:25의 비율로 피콜 상 분리를 실시한다. 10-20 ㎖, 바람직하게는 15㎖의 피콜용액에 상기에서 PBS와 혼합, 교반시킨 혈액샘플을 부드럽게 흘려 층이 분리되도록 한 다음 원심분리를 실시한다. 그 후 세 개의 서로 다른 층이 형성되면, 그 중에서 가운데 층의 버피코트를 마이크로 파이펫으로 취하고, 버피코트는 HBSS로 2 내지 5회 세척하고 원심분리를 수행하여 제대혈 유래 다분화능 줄기 세포액을 수득할 수 있다.

원심분리 한 후의 최종 수득된 펠렛을 5% 송아지 혈청을 포함하는 DMEM 배지 1 내지 5㎖에 희석하여 플라스크에 10⁴ 내지 10⁹, 바람직하게는 10⁶ 내지 10⁸ 정도의 세포를 넣어주고 10 내지 20%, 바람직하게는 10 내지 15%의 열에 불활성화하는 FBS를 첨가하고, 5% CO₂, 37℃의 배양기에서 배양을 하며, 배지는 3 내지 7일에 1회 교체하도록 한다.

상기에서 수득한 제대혈 유래 다분화능 줄기세포를 취득하는 방법은 하기와 같다. 따라서 본 발명은 상기한 다분화능 줄기세포를 수득하는 분리공정 및 이 분리공정으로 얻어지는 다분화능 줄기세포를 제공한다.

상기에서 수득한 제대혈 유래 줄기세포액으로부터 목적의 표면항원을 발현하고 있는 세포를 취득하는 방법으로서는 소팅 기능을 가진 플로우 사이토미터를 사용한 FACS 법(Int. Immunol., 10(3), pp275-283, 1998), 자기 비즈를 사용하는 방법, 본 발명의 다분화능 줄기세포를 특이적으로 인식하는 항체를 사용한 패닝법(J., Immunol., 141(8), pp2797-2800, 1998) 등을 들 수 있다. 또한, 대량의 배양액 등으로부터 본 발명의 다분화능 줄기세포를 취득하는 방법으로서는, 세포의 표면에 발현되어 분자(이하, 표면 항원이라 칭함)를 특이적으로 인식하는 항체를 단 독 또는 조합하여 칼럼으로서 사용함으로서, 본 발명의 다분화능 줄기세포를 취득할 수도 있다.

플로우 사이토미터 소팅 방식으로서는, 수적하전 방식, 셀캡쳐 방식 등을 들수 있다(플로우 사이토미터 자유자재, p14-23, 슈준사, 1999). 어떠한 방법도 세포의 표면 항원을 특이적으로 인식하는 항체를 형광으로 표지하고, 표지된 항체와 항원의 결합체에 형광 측정을 실시하여 형광 강도를 전기 신호로 변환함으로서 세포의 항원 발현량을 정량할 수 있다. 또한, 사용하는 형광의 종류를 조합함으로서, 복수의 표면 항원을 발현하고 있는 세포를 분리하는 것도 가능하다. 형광으로서는, FITC(fluorescein isothiocyanate), PE(phycoerythrin), APC(allo-phycocyanin), TR(TexasRed), Cy3, CyChrome, Red613, Red670, TRI-Color, QuantumRed 등을 들 수 있다.

플로우 사이토미터를 사용한 FACS 법으로서는, 상기에서 수득한 줄기세포용액을 수집하고, 원심분리 등의 방법으로 세포를 분리한 후, 직접 항체로 염색하는 방법과 한번 적당한 배지 중에서 배양, 증식을 실시한 후에 항체를 염색하는 방법을 이용할 수 있다. 세포의 염색은 우선, 표면 항원을 인식하는 일차항체와 목적 세포샘플을 혼합하고, 얼음위에서 30 분 내지 1시간 인큐베이션한다. 일차 항체가 형광으로 표지되어 있는 경우에는 세정 후 플로우 사이토미터로 분리를 실시한다. 일차 항체가 형광 표지되어 있지 않는 경우에는 세정 후 일차 항체에 대해서 결합 활성을 갖는 형광 표지된 이차 항체와 일차 항체가 반응한 세포를 혼합하고, 다시 얼음물에서 30 분 내지 1시간 인큐베이션한다. 세정 후, 일차 항체와 이차 항체에 서 염색된 세포를 플로우 사이토미터로 분리를 실시한다.

자기 비즈를 사용하는 방법에는, 목적 표면 항원을 발현하고 있는 세포를 대량으로 분리할 수 있다. 분리 순도는 전술한 플로우 사이토미터를 사용하는 방법에는 미치지 않지만, 정제를 반복함으로서 충분히 높은 세포순도를 확보할 수 있다.

각종 표면 항원으로서는 조혈관련항원, 중간엽계 세포의 표면 항원, 신경계 뉴런의 특이항원, 인테그린 수용체 관련항원, 파골세포 관련항원, 매트릭스 수용체 관련항원, 조직적합 항원 등을 들 수 있다.

상기 조혈관련항원으로는 CD 34, CD 45 등이며, 중간엽계 세포의 표면 항원으로는 SH-2, SH-3 등을 들 수 있으며, 신경계 뉴런의 특이항원으로는 NSE, GFAP 등을 들 수 있으며, 또한, 인테그린 수용체(integrin receptor) 관련항원은 CD 29 등이며, 파골세포(osteoclast) 관련항원은 CD 51/61 등이며, 매트릭스 수용체(matrix receptor) 관련항원 CD 44 등이며, 조직적합항원의 경우에는 HLA-DR 등이며, 그 외 CD 62L, CD 62P, CD 24, CD 133, CD 90, CD 135, CD 49B, CD 105 등을 포함한다.

전술한 각종 표면 항원을 인식하는 항체를 단독 혹은 조합하여 사용함으로서, 목적으로 하는 세포를 취득할 수 있다.

본 발명의 제대혈 유래 다분화능 줄기세포의 경우, 상기 각종 표면 항원에 대하여, 조혈관련항원인 CD 34, 조직적합항원인 HLA-DR에 대하여 모두 음성을 나타내어 이들 항원의 결여로 인하여 본 발명의 제대혈유래 다분화능 줄기세포는 조직 또는 장기이식의 가장 큰 문제점인 거부반응을 최소화할 수 있다. 또한 중간엽관련 항원인 SH-2, SH-3에 대해서는 양성반응을, 인테그린 수용체 항원인 CD 29 에대해서는 양성을, 파골세포 관련항원인 CD 51/61에 대하여 양성을, 매트릭스 수용체 관련항원인 CD 44에 대해서 양성을, 기타 CD 62L, CD 62P, CD 24, CD 133, CD 90에 대해서는 모두 음성을, CD 135, CD 49B, CD 105에 대해서는 모두 양성반응을 나타낸다.

본 발명은 상기에서 수득된 제대혈 유래 다분화능 줄기세포를 허혈성 괴사모델을 이용한 마우스 모델에 이식시킨 결과, 본 발명의 다분화능 줄기세포를 투여한 경우에는 그 괴사증상유발이 저해되고, 결절된 대퇴동맥을 대신하는 신생혈관의 생성에 관여하고 있음을 확인하였다.

본 발명의 다분화능 줄기세포는 폐쇄성 동맥 질환에 의한 허혈성 괴사 질환에 대한 세포 치료제로서 사용할 수 있다.

허혈성 괴사 질환에 대한 세포치료제로서는 본 발명의 다분화능 줄기세포 중에서도 혈관세포로의 분화능을 갖는 세포를 고순도로 포함한 세포를 들 수 있다.

본 발명의 다분화능 줄기세포는 허혈성 괴사의 크기 및 부위에 따라 시험관내(in vitro)에서 분화, 증식시킴으로서, 원하는 혈관으로의 분화능을 갖는 세포를 취득하고, 이것을 허혈성 괴사 부위로 이식함으로서 허혈성 괴사질환의 치료에 사용할 수 있다. 또는, 허혈성 괴사 부위로 본 발명의 다분화능 줄기세포를 직접 이식시킬 수도 있다.

이하에서, 실시예 및 실험예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명한다. 그러나 실시예 및 실험예가 본 발명을 한정하는 것은 아니다.

실시예 1. 제대혈에서 다분화능 줄기세포의 분리 및 배양

제대혈(Umbilical cord blood)은 위원회지침서(institutional guidelines)에 따라 서울대학교 대학병원과 삼성제일병원에서 정상(full-term)분만과 조산(preterm) 분만에서 수집하였다.

상기에서 입수한 제대혈로부터 얻은 혈액샘플 70 - 100 ㎖ 을 PBS와 1:1 비율로 희석, 교반하였다. 그 후 15:25의 비율로 피콜 상 분리를 실시하였다. 15㎖의 피콜 용액에 PBS와 1:1의 비율로 희석된 혈액 샘플을 부드럽게 흘려 층이 분리되도록 한 다음 원심분리(2500 rpm, 20분) 하였다. 원심분리 후 층은 아래로부터 세 개의 서로다른 층이 형성되는데 이 중에서 중간층의 버피코트를 마이크로 피펫으로 취하였고, 버피코트는 이후 HBSS로 세 번 세척한 다음 원심분리하여(1500 rpm, 15분) 최종적인 펠렛을 수득하여 제대혈 유래 다분화능 줄기세포액을 수득하였다.

상기에서 수득한 최종 다분화능 줄기세포액을 5% 송아지 혈청을 포함하는 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle Media low glucose, GIBCO-BRL, USA) 1㎖에 희석하여 75-플라스크에 10⁶ - 10⁸ 정도의 세포를 넣어주고, 10 -15%의 혈에 불활성화하는 FBS를 첨가해주었다. 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 배양을 하고 플라스크에 처음 씨딩(seeding)된 세포는 약 1-2주일 후 트랜스퍼(transfer)해주며, 배지는 3 -7일에 1회 교체하여 배양을 한 후 다분화능 줄기세포를 다음 논문의 방법을 응용하여 분리 하였다(Gutierrez-Rodriguez M., Reyes-Maldonado E., Mayani H., Characterization of the adherent cells developed in Dexter-type long-term cultures from human umbilical cord blood. Stem cells, 2000, 18(1), pp46-52; Goodwin H., Bicknese A., Chien S., et al., Multilineage differentiation activity by cells isolated from umbilical cord boold : Expression of bone, fat, and neural markers. Biol. Blood Marrow Transplant 2001, 7, pp581-588).

실시예 2. 제대혈 유래 다분화능 줄기세포의 면역학적 특성

상기 실시예 1에서 수득한 제대혈 유래 다분화능 줄기세포의 면역학적 특성을 알아보기 위하여 세포표면항원의 발현 양상을 조사하였다.

본 실시예에서 면역표현형 확인대상이 된 항원은 조혈관련항원으로 CD 34, CD 45, 중간엽계 세포의 표면 항원으로 SH-2, SH-3, 인테그린 수용체(integrin receptor) 관련항원으로 CD 29, 파골세포(osteoclast) 관련항원으로 CD 51/61, 매트릭스 수용체(matrix receptor) 관련항원으로 CD 44, 조직적합항원으로 HLA-DR, 그 외 CD 62L, CD 62P, CD 24, CD 133, CD 90, CD 135, CD 49B, CD 105이다.

상기 실시예 1에서 배양한 세포를 2×10⁶ 개가 되도록 준비하여 2% FBS를 함유하는 PBS 용액으로 세척하고, 각 항원에 해당하는 항체와 실온에서 반응시켰다. 항원의 발현여부는 유세포분석기(flow cytometer)를 이용하여 확인하였다. 또한, PAS(periodic acid stain) 염색을 하였다.

그 결과 본 발명의 제대혈 유래 다분화능 줄기세포는 조혈관련항원인 CD 34, 조직적합항원인 HLA-DR에 대하여 모두 음성을 나타내고, 중간엽관련항원인 SH-2, SH-3에 대해서는 양성반응을, 인테그린 수용체 항원인 CD29 에대해서는 양성을, 파골세포 관련항원인 CD51/61에 대하여 양성을, 매트릭스 수용체 관련항원인 CD 44에 대해서 양성을, 기타 CD 62L, CD 62P, CD 24, CD 133, CD 90에 대해서는 모두 음성을, CD 135, CD 49B, CD 105에 대해서는 모두 양성반응을 나타내었다. 좀더 구체적으로는 도 1에서 보는 바와 같이 중간엽 줄기세포의 대표적인 항체인 CD 45(B)에 대해서는 63.38%, SH-2(C)에 대해서는 96.54%, SH-3(D)에 대해서는 63.99%의 양성반응을 나타내었다.

또한, 도 2에서 보는 바와 같이 PAS 염색에서 역시 양성반응을 나타내었다.

실험예 1. 제대혈 유래 다분화능 줄기세포의 골형성 세포로의 분화

상기 실시예 1에서 수득한 제대혈 유래 다분화능 줄기세포가 골형성세포로 잘 분화하는지를 확인하는 하기의 실험을 하였다.

상기 실시예 1에서 수득한 제대혈 유래 다분화능 줄기세포를 1㎖ 골형성 유도배지인 0.1 umol/L 덱사메타손(dexamethasone, Sigma, USA), 0.05mmol/L 2 인산 아스코르브산(ascorbic acid-2-phosphate, Sigma, USA), 10 mmol/L 베타-글라이코포스페이트(beta-glycophosphate, Sigma), 5% 송아지혈청을 포함하는 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle Media low glucose, GIBCO-BRL, USA)에 희석하여 세포 수를 센 다음 플라스크에 깔아서 5 % C0_2, 37℃ 배양기에서 배지는 3-4일에 한번씩 갈아주며 배양을 하여 다분화능 줄기세포의 골형성 세포로 분화를 유도하였다. 배양을 시작한 14일 째 광학현미경으로 세포를 관찰하였으며, 또한 Von-Kassa 염색법을 이용하여 세포를 염색하여 세포의 분화여부를 관찰하였다.

상기 실험 수행의 결과, 도 3에서 보는 바와 같이 제대혈 유래 다분화능 줄기세포가 도 3(A, B)처럼 세포의 형태가 변화하였고, 도 3(C,Ｄ）과 같이 염색된 것을 확인함으로서 본 발명의 제대혈 유래 다분화능 줄기세포가 골형성 세포로 분화되었음을 확인하였다.

실험예 2. 제대혈 유래 다분화능 줄기세포의 신경 세포로의 분화

상기 실시예 1에서 수득한 제대혈 유래 다분화능 줄기세포가 신경세포로 잘 분화하는지를 확인하는 하기의 실험을 하였다.

상기 실시예 1에서 수득한 제대혈 유래 다분화능 줄기세포액을 5% 송아지혈청을 포함하는 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle Media low glucose, GIBCO-BRL, USA)에 10 ng/ml BFG(basic fibroblast growth, Roche, Switzerland), 10 ng/ml HEGF(human epidermal growth factor, Roche, Switzerland), 10 ng/ml HNGF(human neural growth factor, Invitrogen, USA)를 첨가한 신경인성배지 1㎖에 희석하여 세포 수를 센 다음 플라스크에 깔아서 5 % C0_2, 37℃ 배양기에서 배양을 하여 다분화능 줄기세포의 신경세포로 분화를 유도하였다. 배양 시작한 14일 째 신경계 뉴런 의 특이항원인 NSE(neuron-specific enolase) 와 신경계의 성상세포 특이항원인 GFAP(glial fibrillary acidic protein)과 반응시켜 본 발명의 제대혈 유래 다분화능 줄기세포가 신경세포로의 분화여부를 관찰하였다.

상기 실험 수행의 결과, 도 4에서 보는 바와 같이, 본 발명의 제대혈 유래 다분화능 줄기세포는 도 4(A)에서와 같이 신경계 뉴런의 특이항원인 NSE에 대하여 양성반응을 나타내고, 또한 도 4(B)에서와 같이 신경계 성상세포의 특이항원인 GFAP에 대하여 양성반응을 나타냄을 확인함으로서 제대혈 유래 다분화능 줄기세포가 신경 세포로 분화되었음을 확인할 수 있었다.

참고예 1. 실험동물의 준비

BALB/c ANCrjBgi-nu 종 6주령의 암컷 20마리를 (주)오리엔트에서 구입하여 1주일간의 순화기간을 둔 후 18마리를 선별하여 하기 실험예에 사용하였다. 온도 22 ±3℃, 상대습도 50±10%, 환기 회수 10 내지 12 회/시간, 조명시간 12시간, 조도 150-200 lux로 하여 HEPA 필터가 장착된 MI rack에서 고압증기멸균된 실험동물용 고형사료((주) 퓨리나)를 자유 섭취시키며, 음수는 고압증기멸균된 상수도를 자유섭취 시키며 사육하였다.

순화기간 및 실험기간 중에 폴리카보네이트 MI 케이지(polycarbonate MI cage, 26× 42× 18cm, 명진기계제작)에서 사육상자당 7마리로 사육하였고, 사육상자에는 시험번호, 동물번호 및 투여량을 기입하였다.

실험예 3. 허혈성 괴사모델에 대한 제대혈 유래 다분화능 줄기세포의 치료효과

상기 참고예 1에서 사육시킨 마우스는 시험 전에 체중을 측정하여 군간 체중 차이가 없게 무작위법으로 군분리를 실시하여, 18마리 중 7마리를 대조군, 8마리를 다분화능 줄기세포 즉시 투여군, 3마리를 다분화능 줄기세포 하루 후 투여군으로 총 3개군으로 분리하였다. 마우스는 꼬리에 유성매직으로 표시하여 식별하였다(하기 표 1 참조).

시험군 구성

군	성별	동물수	동물번호
대조군	Female	7	CF1 -7
다분화능줄기세포즉시 투여군	Female	8	MSCF1 -8
다분화능줄기세포하루후 투여군	Female	3	MSC-1F1 -3

상기 참고예 1에서 1주일의 순화기간을 거친 3개군에 다음 논문을 응용하여(Nicholson CD, Angersbach D, Wilke R., The effect of physical training on rat calf muscle, oxygen tension, blood flow, metabolism and function in an animal model of chronic occlusive peripheral vascular disease., Int. J. Sports Med., 1992 Jan;13(1):pp60-64) 케타민 1.2mg을 복강내 주사를 이용해 마취를 한 다음 각 개체의 왼쪽 대퇴부를 절개한 후에 대퇴동맥을 결절하고 봉합실로 봉합하여 버거씨 병 마우스 모델을 확립하였다.

상기 실시예 1에서 배양한 다분화능 줄기세포가 적당한 수가 되었을 때, 배양되고 있는 플라스크를 PBS로 2회 세척해준 후 0.25% 트립신을 처리하여 세포를 수거하고 이는 원심분리를 통해 상층액이 제거하였다. 이후 시럼이 첨가된 PBS로 세척하여 트립신을 불황성화 시킨 후 2차 원심분리를 실시하여 1.3 × 10⁶개의 세포를 수거하였다. 이를 멸균생리식염수 100㎕에 부유시켜 다분화능 줄기세포 즉시 투여군 8마리의 각 대퇴부 근육에 투여하였다. 또한 상기 허혈성 괴사유발후 24 시간후에 같은 방법으로 1.3 × 10⁶개의 다분화능 줄기세포를 멸균생리식염수 100㎕에 부유시켜 다분화능 줄기세포 하루 후 투여군 3마리의 각 왼쪽 대퇴부 근육에 투여하였다.

3-1. 허혈성 괴사모델의 일자별 관찰

상기와 같이 허혈성 괴사를 유도한 마우스에 본 발명의 제대혈 유래 다분화능 줄기세포를 투여한 후 30일 동안 실험동물의 대퇴부를 관찰하였는바, 증상이 나타난 일자와 절단이 나타난 일자를 구분하여 기록하였고, 시험 시작전과 종료시점에서 시험동물의 체중을 측정하고 시험이 종료된 후 부검하였다. 시험 중 측정된 시험동물의 체중 등에 관한 자료의 통계학적 분석을 위하여 one-way ANOVA를 실시하여 군간 유의성을 검정하였고, 유의성이 인정되면 Dunnett's t-test를 실행하여 대조군과 시험군간의 통계학적 유의성을 검정하였다(p<0.05).

상기 실험 수행의 결과, 도 5 내지 7에서 보는 바와 같이 혈관결절 30일 후 본 발명의 제대혈 유래 다분화능 줄기세포를 투여하지 않은 대조군 총 7마리의 누드 마우스 가운데 7마리 모두 적색원으로 관찰되는 절단현상이 나타났고(도 5 참조), 다분화능 줄기세포 즉시 투여군의 경우에는 총 8마리 가운데 5마리만이 절단현상이 나타났으며 6, 8번 개체의 경우 버거씨병을 유발시켰음에도 불구하고 거의 정상적인 행동양상을 보였으며, 4번 개체의 경우 버거씨병에 의한 절단이 예방이 되었다(도 6 참조). 또한, 다분화능 줄기세포 하루 후 투여군의 경우에는 총 3마리의 실험동물 가운데 3마리 모두 절단현상이 발생하였으며, 이는 다분화능 줄기세포 즉시 투여군와 비교하였을 때 혈관신생등의 치료적 효과가 없음을 확인할 수 있었다(도 7 참조).

또한, 하기 표 2에서 보는 바와 같이 허혈성 괴사모델 확립한 날을 0일로 기준하여 각 개체별로 증상(혈관결절 부위에 냉감이 느껴지고 레이노현상을 보임)이 보인 일자와 왼쪽 다리나 발가락이 절단된 현상을 보인 일자를 기록하여 이에 대한 각 군별 평균과 표준편차에서, 증상일자에서 다분화능 줄기세포 즉시 투여군이 0.05 미만의 유의성을 보였으며 나머지는 유의성이 나타나지 않았고, 각 군별 총 개체수에 대한 절단된 개체수의 비율(절단율)을 구하고 각 개체별 체중을 측정하여 각 군별 평균과 표준편차를 구하였는바, 실험 전/후에 측정된 체중에 대한 유의적인 변화는 관찰할 수 없었다.

	실험개체수	실험전 체중(g) ± SD	실험 후 체중(g) ± SD	절단 개체수 (절단율)	증상일자 ± 표준편차 (개체수)	절단일자 ± 표준편차 (개체수)
대조군	7	20.0± 0.89	20.2± 1.07	7(100%)	1.86± 0.38(7)	6.57± 2.64(7)
다분화능 줄기세포 즉시투여군	8	20.0± 0.74	20.4± 0.55	5(62.5%)	4.00*± 1.77(8)	7.80± 3.56(5)
다분화능 줄기세포 하루 후 투여군	9	20.1± 1.27	20.4± 1.78	3(100%)	1.00± 0(3)	3.33± 0.58(3)

한편, 도 8에서 보는 바와 같이, 대조군과 본 발명의 제대혈 유래 다분화능 줄기세포 투여군의 증상일자 및 절단일자를 비교하였을 경우 대조군에 비하여 다분화능 줄기세포 즉시 투여군은 증상일자에서 통계상 0.05 미만의 유의적인 변화를 확인할 수 있었으며, 절단일자의 경우에는 유의적인 변화는 없었으나 다분화능 줄기세포 즉시 투여군의 경우 대조군과 다분화능 줄기세포 하루 후 투여군에 비하여 상대적으로 길어 혈관결절에 의한 절단현상이 느리게 일어나는 것으로 보인다.

또한, 도 9에서 보는 바와 같이 허혈성 괴사 모델의 군별 절단율을 보면 대조군과 다분화능 줄기세포 하루 후 투여군 100%의 절단율을 보임을 확인할 수 있었고, 다분화능 줄기세포 즉시 투여군은 62.5%의 절다율을 보여 다분화능 줄기세포를 혈관결절 후 바로 투여하게 되면 절단현상의 경감을 도모하고 절단선을 낮추는데 있어서 탁월함을 확인할 수 있었다.

3-2. 혈관 조영술

혈관조영술은 방사선(X-ray)을 이용한 혈관 검사로서, 마우스의 심장 혈관으 로 조영제(아이오다인-131)를 주사하여 X-ray 상에서 혈관을 볼 수 있다. 이때 X-ray 상에서 혈관의 이상여부를 판단하여 병명이나 병소의 위치, 병의 진행정도를 확인할 수 있게 된다. 따라서 상기 대조군, 다분화능 줄기세포 즉시 투여군, 다분화능 줄기세포 하루 후 투여군의 마우스의 부검을 하기 전 각 개체를 케타민(100㎎/㎏)의 복강주사를 이용해 마취를 한 다음 혈관조영제를 투여하고 2분이 지난후 X선을 이용하여 각 군의 대퇴동맥과 신생혈관을 확인하였다.

상기실험 수행의 결과, 도 10에서 보는 바와 같이 대조군과 다분화능 줄기세포 하루 후 투여군은 신생혈관을 확인할 수 없었으나, 혈관결절 후에도 왼쪽 하지의 절단현상이 일어나지 않았던 다분화능 줄기세포 즉시 투여군의 개체에서는 신생혈관을 확인할 수 있었다.

상술한 바와 같이, 본 발명은 제대혈(탯줄혈액)에서 다분화능 줄기세포(Multipotent Stem Cell)를 분리하여 성체줄기세포임에도 불구하고 골형성 세포 또는 신경세포로 분화할 수 있는 능력을 갖고 있어 이는 폐쇄성 동맥질환에 의한 허혈성 괴사질환에 대한 세포치료제로서 이용될 수 있다.

Claims (6)

1. 제대혈에서 분리됨을 특징으로 하는 성체줄기세포인 다분화능 줄기세포.
2. 제 1항에 있어서, 상기 다분화능 줄기세포는 CD 34 음성, HLA-DR 음성, CD 62L 음성, CD 62P 음성, CD 24 음성, CD 133 음성 CD 90 음성, CD 29 양성, CD51/61양성, CD44 양성, CD 29 양성, CD 135 양성, CD 45 양성, CD 49B 양성, CD 105 양성, SH-2 양성, SH-3 양성 중에서 어느 하나 또는 복수의 면역학적 특성을 나타냄을 특징으로 하는 다분화능 줄기세포.
3. 제 2항에 있어서, 상기의 복수의 면역학적 특성을 나타내는 다분화능 줄기세포는 CD105, CD29, CD44, CD49b 양성을 공통적으로 나타냄을 특징으로 하는 다분화능 줄기세포.
4. 제 1항에 있어서, 상기 다분화능 줄기세포는 골형성 세포 또는 신경세포로 분화되는 능력을 가짐을 특징으로 하는 줄기세포.
5. 제 1항의 제대혈에서 분리해낸 다분화능 줄기세포를 함유한 세포를 이용한 폐쇄성 동맥질환에 의한 허혈성 괴사질환에 대한 세포치료제.
6. 제 5항에 있어서, 상기 허혈성 괴사 질환은 심근경색, 뇌경색, 버거씨 병 또는 당뇨 합병증에 의한 사지괴저병인 세포치료제.

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