ES2336230T3

ES2336230T3 - Celulas madre multipotentes aisladas de la sangre del cordon umbilical y el agente terapeutico celular que comprende las mismas para tratamiento de la enfermedad isquemica.

Info

Publication number: ES2336230T3
Application number: ES05776026T
Authority: ES
Inventors: Kyung Sun Kang
Original assignee: Seoul National University Industry Foundation
Current assignee: Seoul National University Industry Foundation
Priority date: 2005-08-26
Filing date: 2005-08-26
Publication date: 2010-04-09
Anticipated expiration: 2025-08-26
Also published as: EP1807509B1; JP2007528229A; EP1807509A4; DE602005017812D1; US20070110727A1; ATE449165T1; EP1807509A1; WO2007024036A1

Abstract

Células madre adultas que se obtienen por cultivo de sangre derivada del cordón umbilical en un medio que contiene 5-20% de suero o plasma humano y exhiben las características de: (a) exhibir respuestas inmunológicas positivas a la totalidad de CD24, CD29, CD31, CDE33, CD45, CD73 y CD49B, y respuestas inmunológicas negativas a CD34, CD51/61, CD62L, CD62P, CD90, CD133 y CD135; (b) crecer, adhiriéndose a los plásticos y exhibiendo características morfológicas de forma redonda o forma de husillo; y (c) tener la capacidad de diferenciarse en las células derivadas de mesodermo, endodermo y ectodermo.

Description

Células madre multipotentes aisladas de la sangre del cordón umbilical y el agente terapéutico celular que comprende las mismas para tratamiento de la enfermedad isquémica.

Campo técnico

La presente invención se refiere a células madre multipotentes, células madre adultas aisladas por cultivo de sangre del cordón umbilical en un medio que contiene suero o plasma humano, y un agente terapéutico celular para la necrosis isquémica resultante de enfermedad arterial oclusiva, que contiene las células madre multipotentes como ingredientes activos.

Técnica anterior

Con el envejecimiento de la sociedad, el caso de trastorno circulatorio de la sangre causado por enfermedad arterial oclusiva se ha incrementado. Enfermedades típicas de este trastorno circulatorio sanguíneo incluyen infarto de miocardio, infarto cerebral, enfermedad de Buerger, que es una enfermedad vascular periférica oclusiva en la cual los vasos sanguíneos se contraen o llegan a estrecharse debido a inflamación o cambios de la pared vascular en arterias o venas pequeñas en manos o pies, principalmente por debajo de las rodillas, de tal modo que los vasos sanguíneos llegan a obstruirse por completo, así como enfermedad arterial oclusiva causada por trastornos microvasculares o macrovasculares resultantes de complicación diabética.

El infarto de miocardio es una enfermedad en la cual una porción de arteria coronaria que suministra oxígeno y nutrientes al corazón se ocluye hasta detener la circulación sanguínea de tal manera que una pared cardiaca (es decir el miocardio) en dicha porción se degrada. Los infartos cerebrales incluyen infarto cerebral trombótico en el cual los vasos sanguíneos llegan a estrecharse o se ocluyen debido a ateroesclerosis para causar inhibición del flujo sanguíneo y carencia de oxígeno de tal manera que el tejido cerebral se destruye, e infarto cerebral embólico en el cual una pieza (émbolo) desprendida del trombo de una arteria con ateroesclerosis se engancha en la pared vascular para bloquear las arterias durante su flujo a través de los vasos sanguíneos cerebrales de tal manera que el tejido cerebral bajo la misma muere.

Se deduce que la enfermedad de Buerger es resultado de la acción compleja de diversos factores, aunque su causa directa no se ha encontrado. La edad, el sexo, factores genéticos familiares, autoinmunidad, profesiones, el hábito de fumar, y análogos se consideran como factores causantes secundarios. Asimismo, dado que los pacientes con enfermedad de Buerger tienen altos niveles de fibrinógeno en sangre, la constricción de los vasos sanguíneos periféricos resultante de la coagulación excesiva de la sangre, la agregación excesiva de las plaquetas o la excesiva sensibilidad del nervio simpático se supone que son un factor causal.

La gangrena de las extremidades, que es uno de los síntomas más terribles en la complicación diabética, ocurre en la diabetes grave y es un síntoma peligroso cuando los extremos de manos o pies se deterioran gravemente y se ennegrecen. Aunque la causa exacta no es conocida, se deduce que es resultado de síntomas, tales como heridas externas, quemaduras y purulencia. La gangrena de las extremidades es una enfermedad que ocurre frecuentemente en pacientes de más de 50 años de edad y exhibe síntomas de inflamación, ampollas, úlceras, fiebre, y análogos, y en casos severos, conduce a la amputación de manos y pies o a la muerte.

Esta enfermedad arterial oclusiva ocurre con mayor frecuencia en los Coreanos que en los hombres blancos y se admite que asciende a aproximadamente el 15% de las enfermedades arteriales periféricas totales, aunque sus datos estadísticos auténticos en Corea no son todavía suficientes (Laohapensang, K. et al., Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg., 28 (4):418, 2004). La enfermedad arterial oclusiva invade las arterias y venas pequeñas o de tamaño medio en las extremidades distales superiores e inferiores, y el estancamiento de la circulación arterial en los extremos de los miembros causa en la mayoría de los casos trastornos circulatorios periféricos que degradan el tejido del sistema microvascular, dando como resultado enfermedad isquémica. En esta necrosis isquémica, debida a la reducción de la presión del flujo de la sangre arterial y el estancamiento del flujo sanguíneo capilar, los leucocitos y las plaquetas se activan y el endotelio vascular llega a deteriorarse, dando como resultado hipoxia local y cambios metabólicos.

Las terapias para enfermedad oclusiva arterial incluyen cirugía de bypass arterial en la que se utilizan vasos sanguíneos artificiales para fabricar nuevos vasos sanguíneos entre las porciones superior e inferior de las arterias ocluidas de tal manera que la sangre pueda fluir satisfactoriamente a través de las arterias, así como terapia con fármacos consistente en la administración de vasodilatadores, y un método terapéutico de anestesia del nervio simpático del lumbar (sic) a fin de dilatar los pequeños vasos sanguíneos en los miembros. En la actualidad, se están realizando estudios para el desarrollo de un método terapéutico con el uso del factor de crecimiento endotelial vascular 165 (VEGF 165) (Kim, H.J. et al., Exp. Mol. Med., 36 (4):336, 2004) y el desarrollo de un método terapéutico para el trasplante autólogo de células hematopoyéticas (Miyamoto, M. et al., Cell Transplant., 13 (4):429, 2004).

La causa exacta de la necrosis isquémica no se ha encontrado todavía, y la enfermedad tiene una característica que continúa progresando, por lo que se encuentra en una fase en la que no se ha establecido todavía un método de tratamiento seguro. Un propósito final de tratamiento de la necrosis isquémica causada por enfermedades arteriales oclusivas, tales como la enfermedad de Buerger, es lograr que la sangre arterial fluya libremente.

Entretanto, el término "células madre" se refiere a células que tienen no sólo capacidad de autorreplicación sino también la capacidad de diferenciarse en al menos dos células, y pueden dividirse en células madre totipotentes, células madre pluripotentes, y células madre multipotentes.

Las células madre totipotentes son células que tienen propiedades de potencial total capaces de desarrollarse en un individuo perfecto, y estas propiedades son poseídas por células hasta la etapa de 8 células después de la fertilización de un oocito y un espermatozoide. Cuando estas células se aíslan y trasplantan en el útero, las mismas pueden desarrollarse en un individuo perfecto.

Las células madre pluripotentes, que son células capaces de desarrollarse en diversas células y tejidos derivados de las capas ectodérmica, mesodérmica y endodérmica, se derivan de una masa de células interna localizada en el interior de los blastocitos generados 4-5 días después de la fertilización. Estas células se denominan "células madre embrionarias" y pueden diferenciarse en diversas otras células tisulares, pero no forman nuevos organismos vivos.

Las células madre multipotentes, que son células madre capaces de diferenciarse únicamente en células específicas de tejidos y órganos que contienen estas células, están implicadas no sólo en el crecimiento y desarrollo de diversos tejidos y órganos en los periodos fetal, neonatal y adulto, sino también en el mantenimiento de la homeostasis de los tejidos adultos y la función de inducir regeneración después de deterioro tisular. Las células multipotentes con especificidad tisular se denominan colectivamente "células madre adultas".

Las células madre adultas derivadas de sangre del cordón umbilical conocidas hasta ahora incluyen células madre mesenquimáticas capaces de diferenciarse en osteocitos o músculos esqueléticos (Lee, O.K. et al., Blood, 103:1669, 2004; Gang, E.J. et al., BBRC, 321:102, 2004; Gang, E.J. et al., Stem Cell, 22:617, 2004), células madre del corazón capaces de diferenciarse en células cardiacas (US 2004/0126879) y células progenitoras endoteliales (Yamamoto K. et al., Arterio. Thromb. Vasc. Biol., 24: 192, 2004).

Sin embargo, dado que las células madre muestran la capacidad de diferenciarse en tejidos limitados, con inclusión de diferenciación en osteocitos o músculos esqueléticos por las células madre mesenquimáticas, diferenciación en células cardiacas por células madre del corazón, y diferenciación en células endoteliales vasculares por células progenitoras endoteliales, es difícil definir estas células como células madre multipotentes verdaderas. Asimismo, en la bibliografía citada anteriormente, se utilizó un medio que contenía FBS en un proceso de aislamiento de células madre, por lo que el número y la clase de células que pueden obtenerse estarían inevitablemente limitados.

De acuerdo con ello, los autores de la presente invención han cultivado sangre derivada del cordón umbilical utilizando suero o plasma humana como medio, y como resultado, han encontrado que las células adultas resultantes tienen una capacidad excelente de adhesión a los plásticos, se diferencian en diversos tejidos, tales como células osteogénicas y células nerviosas, y son útiles como agente terapéutico celular para la necrosis isquémica causada por la enfermedad arterial oclusiva, completando con ello la presente invención.

Descripción de la invención

Es un objeto principal de la presente invención proporcionar células madre multipotentes, que son células madre adultas derivadas de sangre del cordón umbilical, y un método para preparación de las mismas.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un agente terapéutico celular que contiene las células madre adultas como ingredientes activos para el tratamiento de la necrosis isquémica y enfermedades cardiovasculares causadas por enfermedad arterial oclusiva.

Para conseguir los objetivos anteriores, en un aspecto, la presente invención proporciona células madre adultas que se obtienen por cultivo de sangre derivada del cordón umbilical en un medio que contiene 5-20% de suero o plasma humano y exhiben las características de:

(a) exhibir respuestas inmunológicas positivas a la totalidad de CD24, CD29, CD31, CDE33, CD45, CD73 y CD49B, y respuestas inmunológicas negativas a CD34, CD51/61, CD62L, CD62P, CD90, CD133 y CD135;

(b) crecer, adhiriéndose a los plásticos y exhibiendo características morfológicas de forma redonda o forma de husillo; y

(c) tener la capacidad de diferenciarse en las células derivadas de mesodermo, endodermo y ectodermo.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir células madre adultas que exhiben las características (a) a (c), comprendiendo el método los pasos de: cultivar sangre derivada del cordón umbilical en un medio que contiene 5-20% de suero o plasma humano; y recuperar las células madre adultas.

En la presente invención, las células madre adultas exhiben adicionalmente respuestas inmunológicas positivas para SH-2 y/o SH-3 y respuestas inmunológicas positivas o negativas a CD44, CD105 y CD117. Asimismo, las células derivadas del mesodermo son células osteogénicas, células nerviosas o células endoteliales.

En otro aspecto adicional, la presente invención proporciona un agente terapéutico celular que contiene las células madre adultas como ingredientes activos para el tratamiento de la enfermedad necrótica isquémica o enfermedades cardiovasculares causadas por enfermedad oclusiva arterial o venosa. La enfermedad necrótica isquémica incluye infarto de miocardio, infarto cerebral, necrosis avascular de la articulación de la cadera, enfermedad de Buerger, y gangrena de las extremidades resultante de complicaciones diabéticas.

Los objetos, características y realizaciones anteriores y otros de la presente invención se comprenderán más claramente a partir de la descripción detallada que sigue y las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de los dibujos

Fig. 1 ilustra fotografías que muestran una comparación de la adhesión celular entre células obtenidas por cultivo de sangre del cordón umbilical en FBS y células obtenidas por cultivo de sangre del cordón umbilical en medio que contiene plasma humano. Las fotografías de la izquierda en Fig. 1 se tomaron con aumento 200 x, y las fotografías de la derecha se tomaron con aumento de 400 x.

Figs. 2A y 2B muestran que las células madre multipotentes derivadas de sangre del cordón umbilical se diferenciaban en células osteogénicas, y Figs. 2C y 2D muestran los resultados de la tinción Von-Kossa.

Fig. 3 muestra la fijación entre las células madre multipotentes derivadas de sangre del cordón umbilical y antígenos específicos. Figs. 3A y 3B ilustran que las células madre multipotentes exhiben respuestas positivas a NSE (enolasa específica de neuronas), un antígeno específico de neuronas, y GFAP (proteína ácida glial fibrilar), un antígeno específico de los astrocitos, respectivamente, y C y D muestras grupos de control.

Fig. 4 muestra las características inmunológicas de células madre multipotentes derivadas de sangre del cordón umbilical, medidas por citometría de flujo. A y E: grupos de control; B: CD34; C: CD45, D: SH-2; y F: SH-3.

Fig. 5 muestra los resultados de la tinción PAS realizada para examinar la expresión o no expresión de antígenos en las células madre adultas de la invención.

Fig. 6 muestra los resultados para 30 días después de la ruptura vascular de un grupo de ratones de control con necrosis isquémica, en la cual un círculo rojo muestra una región en la que se produjo una amputación.

Fig. 7 muestra los resultados para 30 días después de la administración a un grupo de ratones con necrosis isquémica, a los que se administraron las células madre de la invención inmediatamente después de la ruptura vascular, en la cual un círculo rojo muestra una región en la que se produjo una amputación.

Fig. 8 muestra los resultados para 31 días después de la administración a un grupo de ratones con necrosis isquémica, a los que se administraron las células madre de la invención un día más tarde de la ruptura vascular, en la cual un círculo rojo muestra una región en la que se produjo una amputación.

Fig. 9 es un diagrama gráfico que muestra los días de síntomas y los días de amputación en el modelo de ratón con necrosis isquémica.

Fig. 10 es un diagrama gráfico que muestra la tasa de amputación de cada grupo en el modelo de ratón con necrosis isquémica.

Fig. 11 ilustra fotografías de rayos X tomadas por angiografía 30 días después de la ruptura vascular para cada grupo del modelo de ratón con necrosis isquémica.

Fig. 12 muestra que las células humanas se rastrean con una sonda específica humana utilizando una técnica de hibridación in situ por seccionamiento de tejidos musculares femorales después de la autopsia de un modelo de ratón con necrosis isquémica.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a células madre multipotentes aisladas de sangre del cordón umbilical.

Como se utiliza en esta memoria, el término "sangre del cordón umbilical" se define como sangre recogida de las venas umbilicales que conectan la placenta con un feto. Las células madre multipotentes de acuerdo con la presente invención se derivan preferiblemente de la sangre del cordón umbilical humano.

Aunque un método para aislamiento y purificación de células madre multipotentes a partir de sangre del cordón umbilical no está limitado específicamente, puede utilizarse el método siguiente. En primer lugar, se diluye sangre recogida del cordón umbilical con PBS a una relación dada para agitación, y la solución agitada se separa en Ficoll en una relación de 10-15:20-30, y preferiblemente 15:25. Para este propósito, en 10-20 ml y preferiblemente 15 ml de una solución Ficoll, se vierte cuidadosamente la solución de la muestra de sangre anterior para causar separación de capas, seguido por centrifugación. A continuación, una vez que se han formado tres capas diferentes, se toma mediante una micropipeta una capa de plasma coagulado de color ante de la capa intermedia, se lava 2-5 veces con HBSS, y se centrifuga para recoger una solución de células madre multipotentes derivadas de sangre del cordón umbilical.

Los sedimentos obtenidos finalmente por centrifugación se diluyen en 1-5 ml de medio (MSCBM + MSCGM (caldo de cultivo de células (Cambrex, EE.UU.)) que contiene 5-15% de suero o plasma humano autólogo o alólogo y 10 ng/ml de factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF) y se cultiva en un matraz. En el caso de la siembra en un matraz 75, se ponen aproximadamente 10^{6}-10^{8} células, a las cuales se añade 5-20% de suero humano autólogo o alólogo y 10 ng/ml de factor básico de crecimiento de los fibroblastos (bFGF). Las células se cultivan en una incubadora con 5% CO_{2} a 37ºC. Las células sembradas primeramente en el matraz se transfieren al cabo de aproximadamente 1-2 días. El medio se reemplaza una vez con intervalos aproximados de 3-7 días.

En la presente invención, la solución de células madre multipotentes derivadas de sangre del cordón umbilical se cultivó en un medio que contenía suero o plasma humano en lugar del FBS existente. Como resultado, como se muestra en Fig. 1, el número de células que crecían, adhiriéndose a una cápsula de cultivo era mucho mayor en los medios que contenían 5% y 10% de plasma humano que los medios que contenían 5% de FBS y 10% de FBS.

Los métodos de obtención de células madre multipotentes que expresan los antígenos de superficie deseados del caldo de células madre derivadas de sangre del cordón umbilical obtenido arriba incluyen un método FACS que utiliza un citómetro de flujo con función de clasificación (Int. Immunol., 10 (3): 275, 1998), un método que utiliza cuentas magnéticas, y un método de lavado en batea que utiliza un anticuerpo que reconoce específicamente las células madre multipotentes (J. Immunol., 141 (8): 2797, 1998). Asimismo, métodos para obtención de células madre multipotentes a partir de una gran cantidad de caldo de cultivo incluyen un método en el cual anticuerpos que reconocen específicamente moléculas expresadas en la superficies de las células (a los que se hace referencia en lo sucesivo como "antígenos de superficie") se utilizan solos o en combinación como columnas.

Métodos de clasificación por citometría de flujo pueden incluir un método de carga de gotas de agua y un método de captura de células. En cualquiera de estos métodos, un anticuerpo que reconoce específicamente un antígeno en la superficie celular se marca fluorescentemente, y la intensidad de fluorescencia emitida por un anticuerpo unido a la molécula expresada en la superficie de la célula se convierte en una señal eléctrica, con lo cual la cantidad expresada del antígeno puede cuantificarse. Es asimismo posible separar las células que expresan una pluralidad de antígenos de superficie por combinación de tipos de fluorescencia utilizados para ello. Ejemplos de una fluorescencia que puede utilizarse en este caso incluyen FITC (isotiocianato de fluoresceína), PE (ficoeritrina), APC (alo-ficocianina), TR (rojo Texas), Cy3, CyChrome, Rojo 613, Rojo 670, TRI-Color, Rojo Quantum, etc.

Los métodos FACS que utilizan un citómetro de flujo incluyen: un método en el cual el caldo de células madre anterior se recoge, a partir del cual se aíslan las células mediante, por ejemplo, centrifugación, y se tiñen directamente con anticuerpos; y un método en el cual las células se cultivan y se dejan crecer en un medio adecuado, después de lo cual se tiñen con anticuerpos. La tinción de las células se realiza por mezcla de un anticuerpo primario que reconoce un antígeno de superficie con una muestra de células diana, e incubación de la muestra en hielo durante 30 minutos a 1 hora. Cuando el anticuerpo primario está marcado fluorescentemente, las células se aíslan con un citómetro de flujo después del lavado. Cuando el anticuerpo primario no está marcado fluorescentemente, las células que han reaccionado con el anticuerpo primario y un anticuerpo secundario marcado fluorescente que tiene actividad de fijación al anticuerpo primario se mezclan después del lavado, y se incuban en agua y hielo durante 30 minutos a 1 hora. Después del lavado, las células teñidas con los anticuerpos primario y secundario se aíslan con un citómetro de flujo.

El método que utiliza cuantas magnéticas permite el aislamiento en masa de las células que expresan los antígenos de superficie diana. Aunque este método es inferior en pureza de las células aisladas que el método arriba descrito que utiliza el citómetro de flujo, el mismo puede asegurar una pureza celular suficiente por purificación repetida.

Los antígenos de superficie pueden incluir antígenos hematopoyéticos, antígenos de superficie de células mesenquimáticas, y antígenos específicos de neuronas del sistema nervioso. Los antígenos hematopoyéticos incluyen CD34 y CD45, los antígenos de superficie de las células mesenquimáticas incluyen SH-2 y SH-3, y los antígenos específicos de neuronas del sistema nervioso incluyen NSE, MAP2 y GFAP. El uso aislado o combinado de anticuerpos que reconocen los antígenos de superficie arriba descritos permite obtener las células deseadas.

En la presente invención, las células madre multipotentes derivadas de sangre del cordón umbilical arriba obtenidas se trasplantaron a un modelo de ratón con necrosis isquémica, y como resultado pudo verse que, en los casos tratados con las células madre multipotentes de la invención, la inducción de los síntomas necróticos se inhibía, y se producían nuevos vasos sanguíneos en sustitución de las arterias femorales seccionadas.

De acuerdo con ello, las células madre multipotentes de la invención pueden utilizarse como agente terapéutico celular para el tratamiento de la enfermedad necrótica isquémica y enfermedades cardiovasculares causadas por enfermedad oclusiva de arterias o venas. El agente terapéutico celular para el tratamiento de la enfermedad necrótica isquémica contiene preferiblemente células de alta pureza que tienen la capacidad de diferenciación en células vasculares, entre las células madre multipotentes de la invención.

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Las células madre multipotentes de la invención se pueden diferenciar y proliferar in vitro dependiendo del tamaño y sitio de la necrosis isquémica, para obtener células que tienen la capacidad de diferenciación en un vaso sanguíneo deseado, que pueden utilizarse para el tratamiento de la enfermedad necrótica isquémica por trasplante de las mismas en sitios de necrosis isquémica. Asimismo, las células madre multipotentes de la invención pueden trasplantarse directamente en sitios de necrosis isquémica o sistemáticamente por inyección intravenosa.

Las células madre multipotentes de la invención exhiben respuestas positivas al antígeno CD45 de monocitos-macrófagos, y respuestas negativas al antígeno CD34 del linaje hematopoyético; por tanto, se consideran como células madre que están en diferenciación de las células hematopoyéticas en monocitos.

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Ejemplos

En lo sucesivo, la presente invención se describirá con mayor detalle mediante ejemplos. Debe entenderse, sin embargo, que estos ejemplos se dan únicamente para propósito de ilustración y no deben considerarse como limitantes del alcance de la presente invención.

Ejemplo 1 Aislamiento de células madre multipotentes a partir de sangre del cordón umbilical

Se recogió sangre del cordón umbilical de recién nacidos a plazo y prematuros en el Hospital de la Universidad Nacional de Seúl y el Hospital Samsung Cheil de acuerdo con las líneas orientativas del Institutional Review Board.

Se diluyeron con PBS 70-100 ml de una muestra de sangre tomada de la sangre del cordón umbilical recogida en una relación de 1:1, seguido por agitación. A continuación, la muestra de sangre se separó en Ficoll en una relación de 15:25, en la cual la muestra de sangre se vertió cuidadosamente en 15 ml de solución Ficoll para causar separación de capas, seguido por centrifugación a 2500 rpm durante 20 minutos. Después de la centrifugación, se formaron 3 capas diferentes, y entre ellas, se recogió con una micropipeta una capa color de ante de plasma coagulado de la capa intermedia, se lavó 3 veces con HBSS, seguido por centrifugación a 1500 rpm durante 15 minutos a fin de obtener sedimentos (caldo de células madre multipotentes derivadas de sangre del cordón umbilical).

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Ejemplo 2 Diferenciación de las células madre multipotentes derivadas de sangre del cordón umbilical en células osteogénicas

El caldo de células madre multipotentes derivadas de sangre del cordón umbilical obtenido en el Ejemplo 1 se diluyó en 1 ml de medio inductor de osteogénesis (0,1 \mumol/l de dexametasona (Sigma, EE.UU.), 0,05 mmol/l de ácido ascórbico-2-fosfato (Sigma, EE.UU.) y 10 mmol/l de beta-glicofosfato (Sigma), 5-20% de suero o plasma humano) y se contó el número de células. A continuación, se cultivaron las células en un matraz (5% CO_{2}; 37ºC; medio reemplazado una vez a intervalos de 3-4 días) para inducir la diferenciación de las células madre multipotentes en células osteogénicas. 14 días después de la iniciación del cultivo, se confirmó por tinción Von-Kassa que las células madre multipotentes derivadas de la sangre del cordón umbilical se diferenciaban en células osteogénicas (véase Fig. 2).

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Ejemplo 3 Diferenciación de las células madre multipotentes derivadas de sangre del cordón umbilical en células nerviosas

El caldo de células madre multipotentes derivadas de la sangre del cordón umbilical obtenido en el Ejemplo 1 se diluyó en 1 ml de medio inductor de nervios (que contenía 10 ng/ml de crecimiento básico de fibroblastos (Roche, Suiza), 10 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico humano (Roche/Suiza) y 10 ng/ml de factor de crecimiento neural humano (Invitrogen, EE.UU.) en 5-20% de suero o plasma humano) y se contó el número de células. Las células se cultivaron en un matraz con 5% de CO_{2} y a 37ºC para inducir la diferenciación de las células madre multipotentes en células nerviosas. 14 días después de la iniciación del cultivo, se confirmó que las células madre multipotentes exhibían respuestas positivas a NSE (enolasa específica de neuronas), un antígeno específico de neuronas, y GFAP (proteína ácida fibrilar glial), un antígeno específico de los astrocitos. Esto sugiere que las células madre multipotentes derivadas de la sangre del cordón umbilical se diferenciaban en células nerviosas (véase Fig. 3).

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Ejemplo 4 Características inmunológicas de las células madre multipotentes derivadas de sangre del cordón umbilical

Para examinar las características inmunológicas de las células madre multipotentes derivadas de la sangre del cordón umbilical obtenidas en el Ejemplo 1, se analizó el patrón de expresión de los antígenos de la superficie celular. Para este propósito, 2 x 10^{6}-10^{7} de las células cultivadas en el Ejemplo 1 se lavaron con solución PBS y se incubaron con anticuerpos para los antígenos respectivos a la temperatura ambiente. La expresión o no expresión de los antígenos se analizó con un citómetro de flujo. Asimismo, se realizó PAS (tinción con ácido peryódico).

Como resultado, como se muestra en Fig. 4, las células madre multipotentes derivadas de la sangre del cordón umbilical de la invención exhibían respuestas positivas de 63,38%, 96,54% y 63,99% a CD45, SH-2 y SH-3, respectivamente, y una respuesta negativa mayor que 90% a CD34. Asimismo, se analizaron inmunofenotipos para otros antígenos y, como resultado, las células madre multipotentes exhibían características inmunológicas de fenotipos CD51-61-negativos, CD62L-negativos, CD62P-negativos, CD133-negativos, CD135-negativos, CD90-negativos, CD29-positivos, CD44-positivos o negativos, CD49B-positivos, CD105(SH-2)-positivos o negativos, y CD-90 negativos.

Entretanto, como se muestra en Fig. 5, las células madre multipotentes exhibían respuesta positiva en la tinción BAS.

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Ejemplo 5 Efecto terapéutico de las células madre multipotentes sobre el modelo de necrosis isquémica (1) Preparación de los animales de test

Se adquirieron 20 ratones hembra de 6 semanas BALB/cANCrjBgi-nu de Orient Co., Ltd. y se aclimataron durante una semana. A continuación, entre ellos, se seleccionaron 18 animales para uso en los ejemplos de test siguientes. Los animales seleccionados se recogieron en una bandeja MI montada con un filtro HEPA a una temperatura de 32 \pm 3ºC, una humedad relativa de 60 \pm 10%, ventilaciones de 10-12/h, un tiempo de iluminación de 12 horas, y una intensidad de iluminación de 250-200 lux mientras se dejaba que tomaran discrecionalmente alimento sólido (Purina Co.) esterilizado con vapor de alta presión y agua potable esterilizada con vapor de alta presión. Durante los periodos de aclimatación y test, se recogieron 7 animales por jaula de policarbonato MI (26 x 42 x 18 cm; fabricada por Myoung-jin Mechanical Co., Corea).

Los ratones recogidos se midieron respecto a sus pesos antes del test y se dividieron aleatoriamente en los 3 grupos siguientes sin diferencia alguna en sus pesos entre los grupos: un grupo de control de 7 animales; un grupo constituido por 8 animales tratados inmediatamente con las células madre multipotentes, y un grupo constituido por 3 animales tratados con las células madre multipotentes un día más tarde (véase la Tabla 1).

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TABLA 1 Construcción de los grupos de test

1

De acuerdo con el artículo anterior (Nicholson, C.D. et al., Int. J. Sports Med., 13 (1): 60, 1992), los tres grupos de animales se anestesiaron por inyección intra-abdominal de 1,2 mg de quetamina y, a continuación, se practicó una incisión en la región femoral izquierda de cada individuo, y se cortó y suturó la arteria femoral para establecer un modelo de ratón con enfermedad de Buerger.

Las células madre multipotentes cultivadas en el Ejemplo 1 se lavaron dos veces con PBS y se trataron con tripsina al 0,45%, y las células se recogieron y centrifugaron para eliminar el sobrenadante. A continuación, después de desactivar la tripsina por lavado con PBS, se sometieron las células a una segunda centrifugación a fin de recoger 1,7 x 10^{6} \sim 10^{7} células. Las células recogidas se suspendieron en 100 \mul de solución salina fisiológica esterilizada y se administraron en cada músculo femoral de 8 ratones (el grupo que se trató inmediatamente con las células madre multipotentes). Asimismo, se administró el cultivo en cada músculo femoral izquierdo de 3 ratones (control de medio).

(2) Observación de los días de síntomas y días de amputación para el modelo de necrosis isquémica

Durante 30 días después de la administración de las células madre multipotentes de la invención a los ratones con necrosis isquémica inducida como se ha descrito arriba, se observaron las regiones femorales de los animales de test. Los días que exhibían síntomas y los días que exhibían amputación se registraron por separado, y antes de la iniciación del test y al final del test, se midieron los animales de test respecto a sus pesos y se sometieron a autopsia una vez completado el test. Para análisis estadístico de los pesos de los animales de test, y análogos medidos durante el test, se realizó ANOVA de una sola vía a fin de examinar la significación entre los grupos, y una vez reconocido la significación, se realizó el test t de Dunnett a fin de examinar la significación estadística entre el grupo de control y los grupos de test (p < 0,05).

Como resultado, como se muestra en Figs. 6 a 8, todos los miembros del grupo de control sin tratar con las células madre multipotentes derivadas de sangre del cordón umbilical de la invención exhibían un fenómeno de corte (observado en un círculo rojo) 30 días después del corte de los vasos sanguíneos (véase Fig. 6). Por el contrario, el grupo que se trató inmediatamente con las células madre multipotentes exhibía una amputación en sólo 5 animales entre un total de 8 animales, y los individuos Núms. 6 y 8 exhibían patrones de comportamiento prácticamente normales aun cuando habían sido inducidos con la enfermedad de Buerger, y se evitó la amputación del individuo No. 4 por la enfermedad de Buerger (véase Fig. 7). Entretanto, el grupo tratado con medio de cultivo exhibió la existencia de amputación en los tres animales de test, lo que sugería que este grupo tiene poco o ningún efecto terapéutico sobre el tratamiento de la angiogénesis en comparación con el grupo al que se administraron inmediatamente las células madre multipotentes (véase Fig. 8).

Adicionalmente, sobre la base del día en que se estableció el modelo de necrosis isquémica, se examinó que el individuo durante los días que presentaban síntomas (sensación de frío en las regiones vasculares cortadas y exhibición de un fenómeno de Raynaud) y durante los días que exhibían la amputación de la pata o dedo del pie izquierdo (Tabla 2).

TABLA 2

2

Como resultado, como se muestra en la Tabla 2, el grupo al que se administraron inmediatamente las células madre multipotentes exhibía una significación inferior a 0,05 en los días con síntomas y los días de amputación, y los grupos restantes no exhibían significación. Se determinó el peso de cada individuo, se calculó el valor medio y la desviación estándar de cada grupo, y como resultado, no se observó un cambio significativo en sus pesos medidos antes y después del test.

Entretanto, se compararon los días con síntomas y los días de amputación entre el grupo de control y los grupos a los que se administraron las células madre multipotentes derivadas de sangre del cordón umbilical de la invención (Fig. 9). Como resultado, el grupo al que se administraron inmediatamente células madre multipotentes exhibía un cambio estadísticamente significativo menor que 0,05 en los días con síntomas en comparación con el grupo de control. Aunque no existía cambio significativo alguno en los días de amputación, el grupo al que se administraron inmediatamente las células madre multipotentes exhibía un valor mayor en los días de amputación que el grupo de control y el grupo de control de medio, lo que indicaba que una amputación por rotura vascular ocurre lentamente en el grupo al que se administraron inmediatamente las células madre multipotentes.

Se examinó la tasa de amputación para cada grupo con necrosis isquémica, y como resultado, como se muestra en Fig. 10, el grupo de control y el grupo al que se administraron las células madre multipotentes un día más tarde exhibían una tasa de amputación de 100%, en tanto que el grupo que se trató inmediatamente con las células madre multipotentes exhibía una tasa de amputación de 62,5%. Estos resultados sugieren que la administración de las células madre multipotentes inmediatamente después de la rotura vascular permite reducir la amputación y actúa también ventajosamente para reducir una línea de amputación.

(3) Angiografía

La angiografía es una evaluación vascular que utiliza rayos X y hace posible observar los vasos sanguíneos por rayos X mediante inyección de un agente de contraste (yodo-113) en los vasos sanguíneos de los corazones de los ratones. La presencia o ausencia de anormalidad de los vasos sanguíneos se examina por rayos X a fin de poder determinar el nombre de la enfermedad, la localización de las lesiones, o la progresión de la enfermedad.

Antes de la autopsia, todos los animales del grupo de control, el grupo al que se administraron inmediatamente las células madre multipotentes, y el grupo al que se administraron las células madre multipotentes un día más tarde, se anestesiaron por inyección intra-abdominal con quetamina (100 mg/kg) y se les administró un agente de contraste. Al cabo de 2 minutos, se observó cada grupo respecto a las arterias femorales y nuevos vasos sanguíneos utilizando rayos X.

Como resultado, como se muestra en Fig. 11, no se observaron nuevos vasos sanguíneos en el grupo de control y el grupo al que se administraron las células madre multipotentes un día más tarde, en tanto que sí se observaron en el grupo al que se administraron inmediatamente las células madre multipotentes, en el cual no se produjo la amputación de la extremidad inferior izquierda.

(4) Hibridación in situ

Después de la autopsia, la sangre muscular de todos los individuos de cada grupo se retiró por recogida de sangre del corazón. Los tejidos musculares en las regiones femorales izquierda y derecha de cada individuo de los grupos animales se fijaron con una solución fijadora constituida por una mezcla de solución de paraformaldehído-fosfato al 4% y solución de sacarosa al 1,5%. Los tejidos femorales fijados se dejaron en reposo a 4ºC hasta que se sedimentaron en solución de fosfato de sacarosa al 30%. A continuación, cada uno de los tejidos se embebió en parafina y se seccionó finamente con un microtomo en un espesor de 5 \mum. A continuación, se dejaron reaccionar las secciones con solución de prehibridación (50% formamida, 4 XSSC, DTT 50 mM, 4x solución de Denhardt, x TED, 100 \mug/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado, y 250 \mug/ml de RNA de levadura) a 42ºC durante 1 hora. A la solución resultante, se añadió DNA marcado con DIG (100 ng/ml) y se dejó reaccionar con la solución de prehibridación durante 24 horas a fin de que una sonda de DNA específica humana marcada con DIG se fijara a mRNA. Los tejidos femorales se lavaron con cada una de soluciones 2X, 1X y 0,5X de SSC dos veces durante 10 minutos cada vez, y se fijaron sobre un portaobjetos de vidrio, seguido por secado a la temperatura ambiente durante 2 horas.

Como resultado, tal como puede verse en Fig. 12, el grupo de control no se marcaba con la sonda humana, pero los individuos del grupo al que se administraron las células madre multipotentes se marcaban con la sonda humana en las células endoteliales.

Aunque la presente invención se ha descrito en detalle con referencia a las características específicas, será evidente para los expertos en la técnica que esta descripción se da únicamente para una realización preferida y no limita el alcance de la presente invención. Así, el alcance sustancial de la presente invención estará definido por las reivindicaciones adjuntas y equivalentes de las mismas.

Aplicabilidad industrial

Como se ha descrito en detalle anteriormente, la presente invención proporciona células madre multipotentes aisladas de sangre del cordón umbilical utilizando suero o plasma humano. Las células madre de acuerdo con la presente invención tienen la capacidad de diferenciarse en células osteogénicas, células nerviosas, y análogas, aun cuando se trata de células madre adultas. Por tanto, las células madre de la invención serán útiles como agente terapéutico celular para enfermedades de necrosis isquémica causadas por enfermedad arterial oclusiva o isquémica y enfermedades cardiovasculares.

Claims

1. Células madre adultas que se obtienen por cultivo de sangre derivada del cordón umbilical en un medio que contiene 5-20% de suero o plasma humano y exhiben las características de:

2. Las células madre adultas de acuerdo con la reivindicación 1, que exhiben adicionalmente respuestas inmunológicas positivas a SH-2 y/o SH-3.

3. Las células madre adultas de acuerdo con la reivindicación 1, que exhiben respuestas inmunológicas positivas o negativas a CD44, CD105 y CD117.

4. Las células madre adultas de acuerdo con la reivindicación 1, en las cuales las células derivadas de mesodermo son células osteogénicas, células nerviosas o células endoteliales.

5. Un método para producir células madre adultas que exhiben las características siguientes:

(c) tener la capacidad de diferenciarse en las células derivadas de mesodermo, endodermo y ectodermo,

comprendiendo el método los pasos de: cultivar sangre derivada del cordón umbilical en un medio que contiene 5-20% de suero o plasma humano; y recuperar las células madre adultas.

6. El método para producir células madre adultas de acuerdo con la reivindicación 5, en el cual el suero o plasma humano es autólogo o alólogo.

7. Un agente terapéutico celular que contiene las células madre adultas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 como ingredientes activos para el tratamiento de la enfermedad necrótica isquémica o enfermedades cardiovasculares causadas por enfermedad oclusiva arterial o venosa.

8. El agente terapéutico celular de acuerdo con la reivindicación 7, en el cual la enfermedad necrótica isquémica se selecciona del grupo constituido por infarto de miocardio, infarto cerebral, necrosis avascular de la articulación de la cadera, enfermedad de Buerger, y gangrena de las extremidades resultante de complicaciones diabéticas.