ES2640443T3 - Procedimiento de fabricación de células madres que tienen el tamaño adecuado para la administración intravascular - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento de preparación de células madres pluripotentes o multipotentes que tienen un diámetro de 11- 16 μm en un tamaño adecuado para la administración intravascular, el procedimiento comprende: cultivar células madres en un K-SFM (medio de queratinocitos exento de suero) que contiene N-acetil-L-cisteína (NAC), insulina o factor similar a la insulina, hidrocortisona, factor de crecimiento de fibroblastos básico (b- FGF), FBS (suero bovino fetal), calcio, EGF y selenio.

Description

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DESCRIPCION
Procedimiento de fabricacion de celulas madres que tienen el tamano adecuado para la administracion intravascular Campo tecnico
La presente invencion se refiere a un procedimiento para preparar celulas madre que tienen un diametro de 1-16 pm, que es adecuado para la administracion intravascular.
Tecnica anterior
Las celulas madre se refieren a celulas que tienen no solo capacidad de autorreplicacion sino tambien la capacidad de diferenciarse en al menos dos tipos de celulas, y se pueden dividir en celulas madre totipotentes, celulas madre pluripotentes y celulas madre multipotentes. Las celulas madre totipotentes son celulas que tienen propiedades totipotentes capaces de desarrollarse en un individuo perfecto y estas propiedades las tienen las celulas hasta la etapa celular 8 despues de la fertilizacion de un oocito y un espermatozoide. Cuando estas celulas se aislan y trasplantan al utero, se pueden desarrollar en un individuo perfecto. Las celulas madre pluripotentes, que son celulas capaces de desarrollarse en diferentes celulas y tejidos derivados de las capas ectodermo, mesodermo y endodermo, se obtienen de una masa celular interna dentro de los blastocitos generados 4-5 dias despues de fertilizacion. Estas celulas se llaman “celulas madre embrionarios” y se pueden diferenciar en varias otras celulas tisulares, pero no forman nuevos organismos vivos. Las celulas madre multipotentes, que son celulas madre capaces de diferenciarse solo en celulas especificas de tejidos y organos que contienen esas celulas, estan implicadas no solo en el crecimiento y desarrollo de diferentes tejidos y organos en los periodos fetal, neonatal y adulto sino tambien en el mantenimiento de la hemostasia del tejido adulto y la funcion de induccion de regeneracion tras el dano tisular. Las celulas multipotentes especificas de tejido se llaman colectivamente “celulas madre adultas”.
Las celulas madre adultas se obtienen tomando celulas de diferentes organos humanos y desarrollando las celulas en celulas madre, y se caracterizan porque se diferencian solo en tejidos especificos. Sin embargo, recientemente, experimentos para la diferenciacion de celulas madre adultas en diferentes tejidos, incluyendo celulas de higado, han sido muy exitosos, lo cual se ha convertido en el centro de atencion. En particular, se han hecho esfuerzos en el campo de la medicina regenerativa para la regeneracion de tejidos biologicos y organos y recuperacion de sus funciones que se habian perdido debido a enfermedad o accidente y similares, usando celulas. Los procedimientos que se usan con frecuencia en este campo de la medicina regenerativa comprenden las etapas de: recoger celulas madre, celulas mononucleares derivadas de la sangre o celulas mononucleares derivadas de la medula osea de un paciente; inducir la proliferacion y/o diferenciacion de las celulas por cultivo en tubo; e introducir las celulas seleccionadas no diferenciadas (celulas madre y/o celulas progenitoras) y/o diferenciadas en el cuerpo del paciente para el trasplante. Por consiguiente, se espera que los procedimientos clasicos existentes para tratar enfermedades por medicacion o cirugia sean sustituidos por terapia de sustitucion de celulas/tejidos que sustituye una celula, tejido u organo danado por uno sano, y por lo tanto aumentara mas la utilidad de las celulas madre.
Por lo tanto, las diferentes funciones de las celulas madre se estan estudiando actualmente. En particular, desde que se ha empezado a prestar atencion a la tecnologia de terapia celular usando celulas madre mesenquimales, se ha desarrollado la tecnologia para mejorar las celulas madre mesenquimales para que sean adecuados para fines terapeuticos (WO 2006/019357, patente coreana n° 0795708, y patente coreana n° 0818214).
El documento EP 2837682 describe un procedimiento para prevenir el deterioro y agregacion de celulas madre. El procedimiento comprende suspender las celulas madre en una solucion que contiene aspirina.
El documento WO 2011/049414 describe un procedimiento para inducir la migracion de celulas madre adultas derivadas de tejido adiposo, y mas especificamente, el tratamiento de celulas madre adultas derivadas de tejido adiposo con secreciones de proteinas celulares.
El documento EP 2811015 describe una composicion de medio para rejuvenecer celulas madre mesenquimales de una persona anciana, conteniendo la composicion del medio FBS (suero bovino fetal), un antioxidante, una citoquina y NAC (N-acetil-L-cisteina).
El documento EP 2594636 describe una composicion de medio para cultivar celulas madre mesenquimales, que contiene medio basal, 2-fosfato del acido L-ascorbico, suero bovino fetal, factor de crecimiento de fibroblastos basico (b-FGF), aminoacidos no esenciales (NEAA), insulina, N-acetil-L-cisteina, cloruro calcico e hidrocortisona.
Sin embargo, todavia no se ha estudiado suficientemente la tecnologia relacionada con un procedimiento para preparar celulas madre para la administracion intravascular.
Por consiguiente, los autores de la presente invencion han encontrado que cuando las celulas madre se cultivan en un medio que contiene un K-SFM (medio de queratinocitos exento de suero) que contiene N-acetil- L-cisteina (NAC), insulina o factor similar a la insulina, hidrocortisona, factor de crecimiento de fibroblastos basico (b-FGF), FBS (suero bovino fetal), calcio, EGF y selenio, se pueden preparar celulas madre que tienen
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un tamano adecuado para la administracion intracelular, completando asi la presente invencion.
Descripcion de la invencion Problema tecnico
Un objeto de la presente invencion es proporcionar un procedimiento para preparar celulas madre que tienen un tamano adecuado para la administracion intravascular.
Solucion tecnica
Para lograr los objetivos anteriores, la presente invencion proporciona un procedimiento para preparar celulas madre que tienen un diametro de 11-16 pm en un tamano adecuado para la administracion intravascular, comprendiendo el procedimiento: cultivar celulas madre en un K-SFM (medio de queratinocitos exento de suero) que contiene N- acetil-L-cisteina (NAC), insulina o factor similar a la insulina, hidrocortisona, factor de crecimiento de fibroblastos basico (b-FGF), FBS (suero bovino fetal), calcio, EGF y selenio.
La presente invencion tambien describe una composicion de medio para preparar celulas madre que tienen un tamano adecuado para la administracion intravascular, conteniendo la composicion del medio un medio basal; y al menos dos componentes seleccionados del grupo que consiste en N-acetil-L-cisteina (NAC), insulina o factor similar a la insulina, hidrocortisona, factor de crecimiento de fibroblastos basico (b-FGF) y antioxidante.
Breve descripcion de los dibujos
La figura 1 es un diagrama grafico que muestra el tamano de celulas madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo de acuerdo con el medio y el numero de pases.
La figura 2 es un diagrama grafico que muestra el marcador de expresion de celulas madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo de acuerdo con el medio.
Mejor modo de llevar a cabo la invencion
Salvo que se defina de otra forma, todos los terminos tecnicos y cientificos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende habitualmente un experto en la materia a la que pertenece la invencion. En general, la nomenclatura usada en la presente memoria y los procedimientos experimentales son los conocidos y usados habitualmente en la materia.
Como se usa en el presente documento, el termino “celulas madre” se refiere a celulas que no solo tienen la capacidad de autorreplicarse sino que tambien tienen la capacidad de diferenciarse en al menos dos tipos de celulas. Las “celulas madre adultas” se refieren a celulas madre que aparecen o bien en la etapa en la que se forma cada organo de un embrion despues del proceso de desarrollo o en la etapa adulta.
Como se usa en el presente documento, la expresion “celulas madre mesenquimales” se refiere a celulas madre no diferenciadas que se aislan de tejido humano o de mamifero y pueden derivar de diferentes tejidos. En particular, las celulas madre mesenquimales pueden ser celulas madre mesenquimales derivadas de cordon umbilical, celulas madre mesenquimales derivadas de sangre del cordon umbilical, celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea, celulas madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo, celulas madre mesenquimales derivadas de musculo, celulas madre mesenquimales derivadas de nervios, celulas madre mesenquimales derivadas de piel, celulas madre mesenquimales derivadas de liquido amniotico, o celulas madre mesenquimales derivadas de placenta. La tecnologia para aislar celulas madre de cada tejido ya es conocida en la materia.
Como se usa en el presente documento, “celulas madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo” son celulas madre adultas no diferenciadas aisladas del tejido adiposo y se denominan tambien en el presente documento “celulas madre adultas derivadas de tejido adiposo”, “celulas madre adiposas” o “celulas madre derivadas de tejido adiposo”. Estas celulas se pueden obtener de acuerdo con cualquier procedimiento convencional conocido en la materia. Un procedimiento para aislar celulas madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo puede ser, por ejemplo, el siguiente. Es decir, las celulas madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo se pueden aislar cultivando una suspension que contiene tejido adiposo (en solucion salina fisiologica) obtenido por liposuccion, y despues recogiendo una capa de celulas madre, unida a un recipiente de cultivo tal como un matraz, por tratamiento con tripsina, o recogiendo directamente los suspendidos en una pequena cantidad de solucion salina fisiologica frotando con un rascador.
En la presente invencion, “celulas madre que tienen un tamano adecuado para la administracion intravascular” se refiere a celulas madre que tienen un diametro de 11-16 pm, que es menor que el diametro de las venas o vasos capilares, de modo que las celulas madre, cuando se administran por via intravascular, pueden migrar facilmente a su tejido objetivo sin interferir con el flujo sanguineo o la circulacion y pueden presentar su actividad en el tejido objetivo.
Las celulas madre se pueden administrar al cuerpo por diferentes vias, por ejemplo, por via intravenosa, intraarterial
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o intraperitoneal. Entre dichas vias de administracion, se prefiere la administracion intravenosa, porque permite tratar una enfermedad de una forma conveniente y segura sin operacion quirurgica. Con el fin de que las celulas madre administradas por via intravenosa lleguen el sitio objetivo de forma segura y presenten un efecto terapeutico deseado, deben cumplirse varios requisitos. Primero, las celulas madre deben tener un tamano adecuado para la administracion intravascular de modo que estas celulas madre, cuando se administran por via intravascular, ni reducen la velocidad del flujo sanguineo ni forman trombos. El grado de proliferacion de las celulas madre mesenquimales que se pueden derivar de diferentes tejidos difiere entre pacientes y varia dependiendo de su origen, condiciones o procedimiento de cultivo, y su tamano tambien varia de aproximadamente 10 a 300 pm de diametro. Sin embargo, las venulas postcapilares tienen un diametro de aproximadamente 10-50 pm, las arteriolas tienen un diametro de 8-30 pm (Schmidt GT, 1989), y los vasos capilares tienen un diametro de aproximadamente 8 pm (Schmidt GT, 1989; Chien, 1975; John Ross, 1991; Herbert et al., 1989; Arthur y Guyton, 1997; Renkin, 1989; Gaehtgens, 1980; Row 1979), que son mas pequenos que el diametro de las celulas madre mesenquimales generales. Por lo tanto, cuando se administran por via intravascular celulas madre mesenquimales que tienen un tamano relativamente grande, pueden influir en la actividad intravascular. Especificamente, pueden reducir la velocidad del flujo sanguineo y tambien interferir con la circulacion sanguinea para producir la detencion del flujo sanguineo, formacion de trombo y obstruccion vascular, conduciendo incluso a la muerte. En relacion con esto, se ha descrito que cuando las celulas madre mesenquimales que tenian un diametro de aproximadamente 16-53 pm se administraban por via intravenosa a ratones, se reducia la velocidad del flujo sanguineo y se observaba la induccion de infarto de miocardio y formacion de trombo (D. Furlani et al. Microvasular Research 77 (2009) 370-376). Por lo tanto, es importante administrar celulas madre que tengan un tamano adecuado por una via intracelular. Ademas, las celulas madre no deben deteriorarse o agregarse antes de la administracion intravascular, y deben alcanzar de forma segura su sitio objetivo como celulas individuales sin deterioro o agregacion despues de la administracion intravascular. Ademas, las celulas madre deben administrarse a una determinada concentracion o concentracion mayor de modo que presenten un efecto terapeutico deseado despues de que hayan llegado al sitio objetivo. En vista de los varios requisitos descritos antes, la presente invencion esta dirigida a proporcionar celulas madre que tienen un tamano adecuado para la administracion intravascular, para asi presentar un efecto terapeutico de forma segura sin reducir la velocidad del flujo sanguineo o formar trombos despues de la administracion intravascular.
En un aspecto, la presente invencion se dirige a un procedimiento para preparar celulas madre que tienen un diametro de 11-16 pm, en un tamano adecuado para la administracion intravascular, el procedimiento comprende: cultivar celulas madre en un K-SFM (medio de queratinocitos exento de suero) que contiene N- acetil-L-cisteina (NAC), insulina o factor similar a la insulina, hidrocortisona, factor de crecimiento de fibroblastos basico (b-FGF), FBS (suero bovino fetal), calcio, EGF y selenio.
El medio que se usa para obtener las celulas madre mesenquimales cultivadas se puede enriquecer con aditivos de la tecnica, que promueven la proliferacion de las celulas madre mesenquimales en un estado no diferenciado, mientras que inhiben su diferenciacion. Ademas, el medio puede contener un tampon neutro (tal como fosfato y/o bicarbonato en alta concentracion) en solucion isotonica, y un nutriente proteinico (p. ej., suero tal como FBS, FCS (suero de ternero fetal) o suero de caballo, sustituto de suero, albumina o aminoacidos esenciales o no esenciales tales como glutamina o L-glutamina). Ademas, puede contener lipidos (acidos grasos, colesterol, un extracto de suero de HDL o LDL) y otros ingredientes encontrados en la mayoria de los medios madre de esta clase (tal como insulina o transferrina, nucleosidos o nucleotidos, piruvato, una fuente de azucar tal como glucosa, selenio en cualquier forma ionizada o sal, un glucocorticoide tal como hidrocortisona y/o un agente de reduccion tal como p- mercaptoetanol).
Tambien, con el proposito de prevenir que las celulas se adhieran unas a otras, se adhieran a una pared del recipiente o formen agrupaciones demasiado grandes, el medio puede contener ventajosamente un agente antiaglutinacion, tal como uno vendido por Invitrogen (n° de cat. 0010057AE).
Entre ellos, se pueden usar ventajosamente uno o mas de los siguientes aditivos adicionales:
- factor de celulas madre (SCF, factor Steel), otros ligandos o anticuerpos que dimerizan c-kit, y otros activadores de la misma ruta de senalizacion
- ligandos para otros receptores relacionados con tirosina quinasa, tal como el receptor para el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor estimulador de colonias de macrofagos, ligando Flt-3 y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)
- factores que elevan los niveles de AMP ciclico, tales como forskolina
- factores que inducen gp130 tales como LIF o oncostatina-M
- factores de crecimiento hematopoyeticos tales como trombopoyetina (TPO)
- factores de crecimiento transformantes tales como TGFp1
- neurotrofinas tales como CNTF
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- antibioticos tales como gentamicina, penicilina o estreptomicina.
Especificamente, el medio contiene factor similar a la insulina como sustituto de insulina, que funciona para promover el crecimiento celular potenciando el metabolismo de la glucosa y el metabolismo de proteinas. En particular, se usa preferiblemente el IGF-1 recombinante (factor de crecimiento similar a la insulina 1). El contenido preferido del factor similar a la insulina es 10-50 ng/ml. Si el contenido del factor similar a la insulina es menor de 10 ng/ml, se producira apoptosis, y si el contenido es mayor de 50 ng/ml, aumentara la citotoxicidad y el coste del medio.
El medio contiene factor de crecimiento de fibroblastos basico (bFGF) que puede inducir diferentes tipos de proliferacion celular in vivo. Preferiblemente, se usa el bFGF recombinante. El contenido preferido de bFGF es 1 -100 ng/ml.
El antioxidante que se usa en la presente invencion es selenio. El contenido de selenio en el medio es preferiblemente 0,5-10 ng/ml. Si el contenido de selenio es menor de 0,5 ng/ml, el medio sera sensible a la toxicidad por oxigeno, y si el contenido es mayor de 10 ng/ml, producira citotoxicidad grave.
El medio que se usa en la presente invencion contiene un componente seleccionado del grupo que consiste en FBS (suero bovino fetal), calcio y EGF. El factor de crecimiento epidermico (EGF) puede inducir diferentes tipos de proliferacion celular in vivo, y se usa preferiblemente la proteina EGF recombinante. El contenido preferido del factor de crecimiento epidermico es 10-50 ng/ml. Si el contenido del factor de crecimiento epidermico en el medio es menor de 10 ng/ml, no tendra un efecto particular, y si el contenido es mayor de 50 ng/ml, sera toxico para las celulas.
Las celulas madre cultivadas en el medio de acuerdo con la presente invencion tienen un diametro de 11-16 pm, y por lo tanto son adecuadas para la administracion intravascular.
Se describe ademas una composicion de medio para preparar celulas madre que tienen un tamano adecuado para la administracion intravascular, conteniendo la composicion del medio un medio basal; y al menos dos componentes seleccionados del grupo que consiste en N-acetil-L-cisteina (NAC), insulina o factor similar a la insulina, hidrocortisona, factor de crecimiento de fibroblastos basico (b-FGF), y antioxidante.
En un ejemplo de la presente invencion, se cultivaron celulas madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo en el medio. Las celulas madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo se pueden obtener de la siguiente forma. Primero, se aisla tejido adiposo humano obtenido del abdomen por liposuccion o similar, y se lava con PBS, despues de lo cual el tejido se corta finamente y se degrada usando medio DMEM que contiene colagenasa. El tejido degradado se lava con PBS y se centrifuga a 1000 rpm durante 5 minutos. Se separa el liquido sobrenadante, y el sedimento que queda en el fondo se lava con PBS y despues se centrifuga a 1000 rpm durante 5 minutos. Las celulas resultantes se filtran a traves de un filtro de malla n° 100 para separar los residuos y despues se lavan con PBS. Las celulas se cultivan durante la noche en medio DMEM (fBs al 10%, NAC 2 mM, acido ascorbico 0,2 mM), y despues las celulas que no se adhirieron al fondo del recipiente de cultivo se lavan con PBS, y las celulas se subcultivan mientras el medio se sustituye por medio K-SFM que contiene NAC, acido ascorbico, calcio, rEGF, insulina e hidrocortisona en intervalos de 2 dias, obteniendo asi las celulas madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo. Ademas de este procedimiento, se puede usar tambien cualquier procedimiento conocido en la materia para obtener celulas madre mesenquimales.
El procedimiento de preparacion de la presente invencion puede comprender ademas la etapa de tratar las celulas madre, cultivadas en el medio de la presente invencion, con tripsina. Cuando las celulas madre cultivadas se tratan con tripsina, se pueden obtener celulas madre en forma de celulas individuales. En el presente documento, la tripsina funciona para inhibir la agregacion intercelular de modo que las celulas se mantienen como celulas individuales. Tambien se puede usar cualquier sustancia capaz de inhibir la agregacion intercelular en lugar de la tripsina.
El procedimiento de preparacion de la presente invencion puede comprender ademas una etapa de suspender las celulas madre, cultivadas en el medio de cultivo de la presente invencion, en una solucion que contiene aspirina. Cuando las celulas madre cultivadas se suspenden en una solucion que contiene aspirina, se puede prevenir eficazmente que las celulas madre se deterioren o agreguen durante el transporte o almacenamiento. Por lo tanto, las celulas madre que se usan para la administracion intravascular se pueden usar despues de que se hayan suspendido en una solucion salina fisiologica que contiene aspirina. La solucion que contiene aspirina se refiere a una solucion que contiene un compuesto aspirina. El disolvente de la solucion puede ser solucion salina fisiologica. Ademas de la solucion salina fisiologica, se puede usar sin limitacion cualquier base, como solucion de Hartman-D o PBS (solucion salina tamponada con fosfato), que se usa en general en la materia. Como aspirina, se puede usar no solo una formulacion de aspirina disponible en el mercado, sino tambien un compuesto similar a la aspirina. La cantidad de aspirina anadida es preferiblemente 0,0001-0,01 mg/ml. Si la cantidad de aspirina anadida es mayor que el limite superior del intervalo anterior, la viabilidad celular puede disminuir, y si la cantidad es menor que el limite inferior del intervalo anterior, el efecto de inhibicion de la agregacion celular puede ser insuficiente.
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EJEMPLOS
En lo sucesivo, la presente invencion se describira con mas detalle con referenda a los ejemplos.
Ejemplo 1: Aislamiento de celulas madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo
Tejido adiposo aislado de tejido abdominal por liposuccion se lavo con PBS y se corto finalmente, despues de lo cual el tejido se digirio en medio DMEM enriquecido con colagenasa de tipo 1 (1 mg/ml) a 37°C durante 2 horas. El tejido tratado con colagenasa se lavo con PBS y se centrifugo a 1000 rpm durante 5 minutos. Se separo el liquido sobrenadante, y el sedimento se lavo con PBS y despues se centrifugo a 1000 rpm durante 5 minutos. Las celulas resultantes se filtraron a traves de un filtro de malla n° 100 para separar los residuos, despues de lo cual las celulas se lavaron con PBS y se cultivaron durante la noche en medio DMEM que contenia FBS al 10%, NAC (N-acetil-L- cisteina) 2 mM y acido ascorbico 0,2 mM.
Despues las celulas no adherentes se separaron por lavado con PBS, y las celulas que quedaban se cultivaron durante 3 pases, mientras el medio se sustituia por K-SFM (medio de quratinocitos exento de suero) que contenia FBS al 5%, NAC 2 mM, acido ascorbico 0,2 mM, calcio 0,09 mM, rEGF 5 ng/ml, insulina 5 pg/ml, bFGF 10 ng e hidrocortisona 74 ng/ml) en intervalos de 2 dias, aislando asi las celulas madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo.
Las celulas madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo obtenidas por cultivo durante 3 pases en el ejemplo 1, se sembraron en cada uno de los siguientes medios y se cultivaron durante 5 dias. A los 5 dias de cultivo se midieron el tamano y las caracteristicas de las celulas.
Composicion del medio
1) KSFM + aditivo: K-SFM + FBS + NAC + acido ascorbico + calcio + rEGF + insulina + bFGF + hidrocortisona + selenio;
2) DMEM+FGF: DMEM (bajo contenido en glucosa) + FBS al 10% + FGF 5 ng/ml; (referencia)
3) a-MEM+FGF: a-MEM + FBS al 10% + FGF 5 ng/ml. (referencia)
Tabla 1: Tamano de las celulas (pm) de acuerdo con la composicion del medio
Pase 2 Pase 3 Pase 4
KSFM+aditivo
14 ± 2,0 13,8 ± 2,2 14,1 ± 2,4
DMEM+FGF
20 ± 1,7 21,8 ± 1,4 22,1 ± 1,8
a-MEM+FGF
20,3 ± 2,1 19,2 ± 1,8 22,0 ± 1,9
El tamano celular de las celulas del grupo de cultivo de “KSFM + aditivo” era el mas pequeno, y el cambio en el tamano celular del grupo cultivado usando a-MEM como el medio basal era mayor que el del grupo de DMEM. Las celulas del grupo de “KSFM + aditivo” mantenian un tamano de 11-16 pm, mientras que otros grupos de medios mostraban un tamano celular mayor de 20 pm al aumentar el numero de pases (vease la figura 1).
Las caracteristicas de las celulas madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo de 4 pases obtenidas usando el medio de cultivo anterior se analizaron por FACS.
Tabla 2
KSFM+aditivo DMEM+FGF (-MEM+FGF
CD 29
99,0 % 99,4 % 99,9 %
CD 90
99,7 % 99,6 % 99,6 %
CD 31
0,1 % 4,2 % 0,5 %
CD 34
0,0 % 2,3 % 0,2 %
CD 45
0,1 % 4,2 % 2,1 %
Se analizaron las caracteristicas de las celulas madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo obtenidas usando
los medios descritos antes, y como resultado, se mostro que el medio no tenia efecto en la expresion de marcadores positivos de las celulas madre, pero el nivel de expresion de marcadores negativos era ligeramente mayor en las celulas del grupo de medio de DMEM + FGF que en el celulas del grupo de medio de “KSFM + aditivo” (vease la figura 2).
5 Las celulas madre aisladas en el ejemplo 1 se observaron por SEM (microscopia electronica de barrido), y como resultado, se podia ver que las celulas madre tenian mayoritariamente un diametro de aproximadamente 11-16 pm y que no se formaba un agregado de las celulas.
Ejemplo 2: Investigacion de los componentes del medio para preparar celulas madre de tamano pequeno
Se prepararon medios exentos de cada uno de FBS, NAC, acido ascorbico, calcio, rEGF, insulina 5 ng/ml, bFGF, 10 hidrocortisona y selenio, que son ingredientes activos anadidos al medio K-SFM usado en el ejemplo 1, y se cultivaron celulas madre derivadas de tejido adiposo en el grupo de medio de “KSFM + aditivo” y el medio exento de cada uno de los ingredientes activos. Despues de cultivar las celulas en cada uno de los 3 medios durante 3 pases, las celulas se trataron con tripsina, y despues se midio el diametro de las celulas con microscopio confocal. Como resultado, se podia ver que el tamano de las celulas madre derivadas de tejido adiposo cultivadas en el medio que 15 contenia selenio era 11,6-16,5 pm, pero el tamano de las celulas madre cultivadas en medio exento de selenio era 18,1-23,9 pm.
Aplicabilidad industrial
De acuerdo con la presente invencion, se pueden preparar celulas madre que tienen un diametro de 11-16 pm, que migran facilmente a su tejido objetivo y tienen estabilidad alta. Por lo tanto, se puede aumentar significativamente el 20 efecto de la administracion intravascular de las celulas madre en la terapia celular.

Claims (5)

  1. REIVINDICACIONES
    1. - Un procedimiento de preparacion de celulas madres pluripotentes o multipotentes que tienen un diametro de 11
    16 pm en un tamano adecuado para la administracion intravascular, el procedimiento comprende: cultivar celulas madres en un K-SFM (medio de queratinocitos exento de suero) que contiene N-acetil-L-cisteina 5 (NAC), insulina o factor similar a la insulina, hidrocortisona, factor de crecimiento de fibroblastos basico (b-
    FGF), FBS (suero bovino fetal), calcio, EGF y selenio.
  2. 2. - El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el procedimiento comprende ademas tratar las celulas madres
    cultivadas con tripsina.
  3. 3. - El procedimiento de la reivindicacion 1 o 2, en el que el procedimiento comprende ademas suspender las celulas
    10 madres cultivadas en una solucion que contiene aspirina.
  4. 4. - El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que las celulas madres son celulas madres adultas.
  5. 5. - El procedimiento de la reivindicacion 4, en el que las celulas madres son celulas madres mesenquimales
    derivadas de tejido adiposo.
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