JP6141522B2

JP6141522B2 - 静脈投与用幹細胞組成物

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Publication number: JP6141522B2
Application number: JP2016513860A
Authority: JP
Inventors: ジョンチャンラ; ソングンカン; ジョンユンチョ
Original assignee: R Bio Co Ltd
Current assignee: R Bio Co Ltd
Priority date: 2013-05-15
Filing date: 2014-02-06
Publication date: 2017-06-07
Anticipated expiration: 2034-02-06
Also published as: KR101583569B1; EP3002011A1; CN105377275B; JP2016519142A; KR20140134994A; US20160081917A1; HK1222324A1; CN105377275A; WO2014185620A1; EP3002011A4

Description

本発明は、静脈投与用幹細胞組成物に関し、より詳しくは幹細胞および賦形剤を含有する静脈投与用幹細胞組成物において、前記幹細胞は、血管内投与に適した径を有して、単細胞で存在して、濃度は１×１０^７〜５×１０^８細胞数／ｍＬであることを特徴とする静脈投与用幹細胞組成物に関する。

幹細胞とは、自己複製能力を有すると共に、二つ以上の細胞に分化する能力を有する細胞をいい、万能幹細胞（totipotent stem cell）、分化万能性幹細胞（pluripotent stem cell）、多能性幹細胞（multipotent stem cell）に分類できる。万能幹細胞は、一つの完全な個体に発生していくことができる万能性を有する細胞で、卵子と精子の受精以後８細胞期までの細胞がこのような性質を有し、この細胞を分離して子宮に移植すると一つの完全な個体に発生していくことができる。分化万能性幹細胞は、外胚葉、中胚葉、内胚葉層由来の多様な細胞と組織から発生できる細胞であり、受精４〜５日後現れる胚盤胞（blastocyst）の内側に位置した内部細胞塊（inner cell mass）から由来し、これを胚芽幹細胞といい、多様な他の組織細胞に分化するが新しい生命体を形成することはできない。多能性幹細胞は、この細胞が含まれている組織及び器官に特異的な細胞だけに分化できる幹細胞で、胎児期、新生児期及び成体期の各組織及び臓器の成長と発達のみならず成体組織の恒常性維持と組織損傷時再生を誘導する機能に関与しており、組織特異的多能性細胞を総称して成体幹細胞という。

成体幹細胞は、人体の各臓器に既に存在する細胞を採取して、幹細胞を発展させたもので、特定組織だけに分化する特徴がある。しかし、最近では成体幹細胞を利用して、肝細胞等各種の多様な組織に分化させる実験が成功しており注目される。特に、疾病や事故による機能障害や不調和に陥った生体組織及び臓器の再生及び機能回復のために細胞を積極的に活用して実施する治療法である再生医療において、患者本人から幹細胞、血液由来単核細胞或いは骨髄由来単核細胞を収集する工程、試験管培養で細胞増殖及び／または、分化を誘導する工程、及び選択された未分化（幹細胞及び／または、前駆細胞）及び／または、分化細胞を着床によって患者自身の体に導入する工程を含む方法が多く利用されている。このように、既存の古典的な薬品処置や手術的方法を介した疾病治療が、損傷した細胞・組織・臓器を健康体に変える細胞・組織代替治療法に代替されると予測されるため、幹細胞の活用度はより一層高まることになる。

そこで、現在の幹細胞の多様な機能が研究されており、その中でも中間葉幹細胞（mesenchymal stem cells）を利用した細胞治療技術が脚光を浴び始め、人体から分離した中間葉幹細胞を治療に適するように改善するための技術が開発されている（ＷＯ２００６／０１９３５７、大韓民国登録特許第０７９５７０８号、大韓民国登録特許第０８１８２１４号）。（Leu, Steve Lin et al., Journal of translational medicine, 8(1):63, 2010; Kim, J.M. et al., Brain research, 1183:43, 2007, Kim, Young-Ki et al., Journal of veterinary clicics, 28:122, 2011; Park SS. et al., Cytotherapy, 14(5):584, 2012; Soo-Kyung Kang et al., Stem Cells and Development, 15(4):583, 2006。幹細胞は、関節炎、退行性関節炎などのように損傷部位に直接注入して、治療効果を期待してもよいが、幹細胞を静脈に投与してもよい。静脈を介して投与される幹細胞は損傷された臓器などの損傷した体の内部に直接伝達されて損傷部位を治療する効果を示すことができるので、神経系疾患、アルツハイマー、癌、糖尿、リウマチなどの様々な疾病に対する治療効果を示すことができると予想される。

しかし、現状では、血管内投与に適した幹細胞組成物を製造する方法に対する技術はまだ研究が不十分である。

そこで、本発明者等は、標的部位に安定的に到達して目的する治療効果を示すことができる静脈投与用幹細胞組成物を開発しようと鋭意努力した結果、静脈内に投与される前幹細胞が破砕されたり凝集されず、静脈投与に適した径を有して単細胞形態であると同時に治療効果を示すのに適した数の幹細胞を含有する静脈投与用幹細胞組成物を開発して本発明の完成に至った。

本発明の目的は、静脈投与用幹細胞組成物を提供するところにある。

前記目的を達成するために、本発明は１０〜２０μｍの径を有して、単細胞で存在する幹細胞を１×１０^７〜５×１０^８細胞数／ｍＬで含有することを特徴とする静脈投与用幹細胞組成物を提供する。
本発明の他の特徴及び具現例は、以下の詳細な説明及び添付された特許請求の範囲からより一層明白になる。

他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。

本発明で用いる用語「幹細胞（stem cell）」は、自己複製能力を有すると共に、二つ以上の細胞に分化する能力を有する細胞をいう。また、「成体幹細胞」は、発生過程が進んで胚芽の各臓器が形成される工程或いは成体工程に現れる幹細胞を意味する。

本発明で用いられる用語「中間葉幹細胞」とはヒトまたは哺乳類の組織から分離した未分化幹細胞であり、多様な組織から由来してもよい。特に、臍帯由来中間葉幹細胞、臍帯血由来中間葉幹細胞、骨髄由来中間葉幹細胞、脂肪由来中間葉幹細胞、筋肉由来中間葉幹細胞、神経由来中間葉幹細胞、皮膚由来中間葉幹細胞、羊膜由来中間葉幹細胞及び胎盤由来中間葉幹細胞であってもよく、各組織から幹細胞を分離する技術は当業界にすでに公示されている。

本発明で用いられる用語「脂肪組織由来中間葉幹細胞」とは、脂肪組織から分離した未分化成体幹細胞であり、本明細書では略して「脂肪由来成体幹細胞」、「脂肪幹細胞」または「脂肪由来幹細胞」とも称する。これは当業界に公示された通常の方法を介して収得できるが、その分離方法は、例えば次のとおりである。即ち、脂肪吸入術から得られる生理食塩水に浮遊された脂肪含有懸濁液（suspension）を培養した後、フラスコなど培養容器に付着した幹細胞層をトリプシンで処理した後回収したり、スクレーパーで掻いて少量の生理食塩水に浮遊されるものを直接回収したりする方法等を介して脂肪由来中間葉幹細胞を分離することができる。

本発明で、「血管内投与に適した大きさを有する幹細胞」とは、血管内に投与された幹細胞が血流内流れや循環を妨げることなく標的組織に容易に移動してその活性を示すことができるように径が静脈の径に比べて小さい、好ましくは径が１０〜２０μｍである幹細胞、より好ましくは径が１０〜１５μｍである幹細胞を意味する。

本発明で、「移送」とは、幹細胞自体または幹細胞を含有する溶液を入れる容器などを自動車などの交通手段によって運送することを意味して、「保管」とは、室温で保管する以外、冷蔵での保管も含む。

本発明で、「幹細胞の破砕および凝集防止」とは、単細胞形態の幹細胞が破壊されたり凝集することなくその形態を維持することを意味して、例えば、移送や保管中幹細胞の細胞膜が破壊されたり細胞間凝集（aggregation）が形成されないで単細胞（single cell）形態を維持することを意味する。

幹細胞は種々の方法、例えば、静脈内、動脈内または腹腔内投与などの方法で体内に投与されるが、その中でも静脈投与は外科的手術をしなくても簡単かつ安全に疾病を治療できて有用である。しかし、静脈内に投与された幹細胞が実際に標的部位に安定的に到達して目的する治療効果を示すためには、様々な要件が満たされなければならない。

まず、血管内に投与された幹細胞が、血流内速度を減少させたり血栓を形成しないように血管内投与に適した大きさでなければならない。種々の組織から由来することができる中間葉幹細胞は、患者やその由来、培養状態や方法によって形態や増殖程度がまちまちであり、その大きさも径が約１０〜３００μｍと多様である。しかしヒトの後毛細管静脈（post-capillary venules）は、その径が約２０〜５０μｍであり、小動脈は径が１０〜３０μｍで（Schmidt GT, 1989）、毛細血管は径が１０μｍ前後で（Schmidt GT,1989; Chien, 1975; John Ross, 1991; Herbert et al., 1989; Arthur and Guyton, 1997; Renkin, 1989; Gaehtgens, 1980; Row 1979）、通常の中間葉幹細胞の径より小さい。従って、相対的に大きさが大きい中間葉幹細胞が静脈内に投与されると、血管内活性に影響を与えうる。具体的に、血流速度を減少させるだけでなく、血液循環を妨げて血流の中断、血栓形成、血管閉塞、さらには死亡を誘発しうる問題点がある。これと関連して、径が約２０〜５３μｍの中間葉幹細胞をマウスに静脈投与時血流速度が減少して、心筋梗塞、血栓形成の誘発が観察されたとの報告がある（D. Furlani et al. Microvasular Research 77(2009) 370-376）。従って、適した大きさの幹細胞を血管内に投与することが重要である。

また、血管内に投与される前幹細胞は、破砕されたり凝集形成がないべきであり、血管内に投与された後にも単細胞として細胞の破壊や凝集が形成されず標的部位に安定的に到達しなければならない。体内投与のために幹細胞にトリプシンなどを処理して単細胞形態で製造できるが、単細胞形態で製造された幹細胞といっても、移送や保管中に細胞膜が破壊されたり細胞間凝集が形成される問題点がある。単細胞形態でなく凝集した幹細胞または破壊された細胞は、静脈投与などの方法で体に投与される場合、血管内皮細胞や血小板などと付着して、血流速度を減少させたり血液循環を妨げ、さらには微細支管や血管などの閉塞を招く恐れもある（D. Furlani et al. Microvasular Research 77(2009) 370-376）。従って、血管内に投与される前細胞が破砕されたり凝集が形成されてはならず、血管内に投与された後にも単細胞として細胞の破壊や凝集が形成されず標的部位に安定的に到達しなければならない。

それだけでなく、標的部位に到達した幹細胞が目的とする治療効果を示すように一定濃度以上の細胞投与が前提となるべきである。従って、臨床的に適用しようとする幹細胞を大量に収得することが重要である。

従って、本発明は、血管内に投与される前幹細胞の破砕および凝集を防止し、体内投与に適しており、血管内投与に適した大きさを有して血管内に投与された幹細胞が、血流内速度を減少させたり血栓を形成しないので、安定的に治療効果を示し、安全性が優れた静脈投与用幹細胞組物を提供するためのものである。

従って、一観点において、本発明は、１０〜２０μｍの径を有して、単細胞で存在する幹細胞を１×１０^７〜５×１０^８細胞数／ｍＬで含有することを特徴とする静脈投与用幹細胞組成物に関する。

本発明においては、好ましくは成体幹細胞の脂肪組織、または、毛嚢・羊膜等上皮組織から得られる成体幹細胞を利用することができる。最も好ましくは、脂肪組織由来成体幹細胞を使う。中間葉幹細胞（ＭＳＣｓ）が使用でき、最も好ましくは、脂肪組織由来中間葉幹細胞（Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell、ＡｄＭＳＣｓ）であってもよい。

前記脂肪または上皮組織は、哺乳類由来であることが好ましく、その中でもヒト由来であることがさらに好ましい。本発明の一実施例においては、ヒト脂肪組織由来中間葉幹細胞（Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cell、ＡＤＭＳＣｓ）を使った。

本発明で、静脈投与用幹細胞組成物に含まれる幹細胞は、基本培地；並びにＮＡＣ（N-acetyl-L-cysteine）、アスコルビン酸（ascorbic acid）、インスリンまたはインスリン様因子、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン、ｂＦＧＦ（basic fibroblast growth factor）、ヘパラン硫酸（heparan sulfate）、２−メルカプトエタノール（2-mercaptoethanol）、ＥＧＦ（epidermal growth factor）および抗酸化剤で構成された群で選択される二つ以上の成分を含有する培地で幹細胞を培養して収得する。

本発明の幹細胞組成物に含まれる幹細胞収得のための培養培地で用いられる基本培地（basal medium）は、当業界で幹細胞培養に適すると知られている簡単な組成を有する基本培地を意味する。一般に培養に利用される基本培地としては、ＭＥＭ（Minimal Essential Medium）、ＤＭＥＭ（Dulbecco modified Eagle Medium）、ＲＰＭＩ（Roswell Park Memorial Institute Medium）、Ｋ−ＳＦＭ（Keratinocyte Serum Free Medium）があり、この他にも当業界で利用される培地であれば制限なしに用いられる。好ましくは、Ｍ１９９／Ｆ１２（ｍｉｘｔｕｒｅ）（ＧＩＢＣＯ）、ＭＥＭ−ａｌｐｈａ培地（ＧＩＢＣＯ）、低濃度グルコース含有ＤＭＥＭ培地（Ｗｅｌｇｅｎｅ）、ＭＣＤＢ１３１倍地（Ｗｅｌｇｅｎｅ）、ＩＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ）、Ｋ−ＳＦＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＰＣＭ培地及びＭＳＣ拡張培地（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）で構成された群から選択されうる。特に、この中でも好ましくはＫ−ＳＦＭ培地が用いられる。

前記中間葉幹細胞培養物の獲得に用いられる基本培地は、当業界に公示された、中間葉幹細胞の未分化された表現型の増殖を促すが分化は抑制する添加剤で補充され得る。また、培地は等張液中の中性緩衝剤（例えば、リン酸塩及び／または、高濃度重炭酸塩）及び蛋白質栄養分（例えば、血清、例えば、ＦＢＳ、ＦＣＳ（fetal calf serum）、ウマ血清、血清代替物、アルブミン、または、必須アミノ酸及び非必須アミノ酸、例えば、グルタミン、Ｌ−グルタミン）を含有してもよい。さらに、脂質（脂肪酸、コレステロール、血清のＨＤＬまたはＬＤＬ抽出物）及びこの種の多くの保存液培地で発見されるその他の成分（例えば、インスリンまたはトランスフェリン、ヌクレオシドまたはヌクレオチド、ピルビン酸塩、任意のイオン化形態または塩である糖源、例えば、グルコース、セレニウム、グルココルチコイド、例えば、ヒドロコルチゾン及び／または、還元剤、例えばβ−メルカプトエタノール）を含有してもよい。

また、培地は細胞が互いに癒着したり、容器壁に癒着したり、大きすぎる束を形成することを防止する目的で、好ましくは抗凝集剤（anti-clumping agent）、例えばＣａｔ＃００１００５７ＡＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）等を含む。

その中でも、下記の１以上の追加の添加剤を用いることが好ましい：
・幹細胞因子（ＳＣＦ、Ｓｔｅｅｌ因子）、ｃ−ｋｉｔを二量化する他のリガンドまたは抗体、及び同じ信号伝達経路の他の活性剤
・他のチロシンキナーゼ関連レセプター、例えば血小板−誘導された成長因子（Platelet-Derived Growth Factor、ＰＤＧＦ）、マクロファージコロニー−刺激因子、Ｆｌｔ−３リガンド及び血管内皮成長因子（Vascular Endothelial Growth Factor、ＶＥＧＦ）のレセプターのためのリガンド
・環状ＡＭＰ濃度を高める因子、例えばフォルスコリン
・ｇｐ１３０を誘導する因子、例えばＬＩＦまたはオンコスタチン−Ｍ
・造血母成長因子、例えばトロンボポイエチン（ＴＰＯ）
・変形性成長因子、例えばＴＧＦβ１
・ニュロトロフィン、例えばＣＮＴＦ
・抗生剤、例えばゲンタマイシン（gentamicin）、ペニシリン、ストレプトマイシン。

本発明の幹細胞組成物に含まれる幹細胞収得のための培養培地は、前記基本培地以外に、ＮＡＣ、アスコルビン酸、インスリンまたはインスリン様因子、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン、ｂＦＧＦ、ヘパラン硫酸、２−メルカプトエタノール、ＥＧＦ及び抗酸化剤で構成された群から選択される二つ以上の成分をさらに含有してもよい。

具体的に、インスリンを代替する成分として、インスリン様因子を含有してもよいが、これはブドウ糖の代謝と蛋白質の代謝を向上させて、細胞成長を促す役割を果たす。特に、組換えＩＧＦ−１（Insulin-like growth factor-1）を用いることが好ましい。インスリン様因子の好ましい含有量は、１０〜５０ｎｇ／ｍＬであり、この成分が１０ｎｇ／ｍＬ未満の場合にはアポトーシス（Apoptosis）を招いて、５０ｎｇ／ｍＬを超える場合には細胞毒性及び費用増加の問題点がある。ヒドロコルチゾンの場合、その含有量は６０〜８０ｎｇ／ｍＬであってもよい。
培地は、線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含有できるが、これはインビボ状態で多様な形態の細胞増殖を引き起こすことができる。好ましくは組換え蛋白質を用いる。線維芽細胞増殖因子の好ましい含有量は１〜１００ｎｇ／ｍＬである。

抗酸化剤としては、セレニウム（selenium）、アスコルビン酸、ビタミンＥ、カテキン、リコペン、βカロチン、コエンザイムＱ−１０、ＥＰＡ（eicosapentaenoic acid）、ＤＨＡ（docosahexanoic acid）等が用いられ、好ましくは、セレニウムが用いられる。本発明の一実施例では、抗酸化剤としてセレニウムを用いて、用いられるセレニウムの量は、０．５〜１０ｎｇ／ｍＬであることが好ましい。この時、これの含有量が０．５ｎｇ／ｍＬ未満なら酸素毒性に敏感であり、１０ｎｇ／ｍＬを超えると深刻な細胞毒性を招くためである。アスコルビン酸の場合、その含有量は０．１〜０．３ｍＭで用いても良い。

本発明で用いられる培地は、ＦＢＳ（fetal bovin serum）、カルシウムおよびＥＧＦで構成された群で選択される成分を追加で含有してもよい。カルシウムの含有量は、０．０５〜０．１３ｍＭの量で含まれてもよい。上皮細胞成長因子（Epidermal growth factor；ＥＧＦ）は、インビボの状態で様々な形態の細胞増殖を引き起こすことができ、好ましくは組換えタンパク質を用いる。上皮細胞成長因子の好ましい含有量は、１０〜５０ｎｇ／ｍＬであり、この含有量が１０ｎｇ／ｍＬ未満なら特別な効果がなく、５０ｎｇ／ｍＬを超えると細胞に毒性を有する。

本発明に係る前記培地で培養された幹細胞は、好ましくは１０〜２０μｍ、より好ましくは１０〜１５μｍの径を有するため、血管内投与に適している。

また、本発明に係る培地で幹細胞を培養する場合、好ましくは４〜６回継代培養時７×１０^５〜５×１０^８細胞数／ｍＬで増殖した幹細胞を得ることができる。また、前記継代培養を介して幹細胞の数を増加させる間、機能的／形態学的に細胞の変形も起きないので、本発明に係る幹細胞は臨床に効果的に適用することができる。従来の方法に係る幹細胞培養によると、高収率の幹細胞を得るためには、継代培養を何回も行わなければならず、手間や時間が掛かり過ぎて、特に継代培養に必要な培地成分のうち一部は、非常に高価で経済的にも長所がなかった。しかし、本発明に係る培地を用いる場合、ただ３〜５回の継代培養だけでも臨床的に適用可能なほどの高濃度の幹細胞を製造することが可能である。

従って、他の観点において、本発明は、基本培地；並びにＮＡＣ、アスコルビン酸、インスリンまたはインスリン様因子、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン、ｂＦＧＦ、ヘパラン硫酸、２−メルカプトエタノール、ＥＧＦおよび抗酸化剤で構成された群で選択される二つ以上の成分を含有する、静脈投与に適した幹細胞製造用培地を提供する。

一方、本発明に係る幹細胞組成物に含まれる幹細胞を製造するに当たり、上述した本発明に係る培地で静脈投与用幹細胞をトリプシンで処理してもよい。培養された幹細胞をトリプシンで処理すると、単細胞形態の幹細胞を得ることができるが、この時、トリプシンは細胞間の凝集を抑制して細胞が単細胞の形態を有するように処理するもので、細胞間の凝集形成を抑制できる物質であるなら、その代わりに用いることができる。

また、本発明に係る静脈投与用組成物に含まれる幹細胞を製造するに当たり、上述した本発明に係る培地で培養された幹細胞をアスピリン含有溶液に浮遊させてもよい。

本発明で、「アスピリン含有溶液」とは、アスピリン化合物を含有する溶液を意味し、溶媒としては、好ましくは生理食塩水を用いることができるが、その他にもハートマン−Ｄ溶液、ＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline）等当業界で一般的に用いる基剤なら制限せず用いることができる。前記アスピリンは通常市販されているアスピリン製剤だけでなくアスピリン様化合物を用いてもよい。本発明の一実施例では、アセチルサリチル酸（Ｓｉｇｍａ；Ａ５３７６）、アルタルジル注（Arthalgyl Injection）またはアスピリンリジン（Ｓｈｉｎｐｏｏｎｇ製薬）を生理食塩水に添加してアスピリン含有溶液を製造した。この時、添加されるアスピリンの含有量は、０．０００１〜０．０１ｍｇ／ｍＬであることが好ましい。添加されるアスピリンの量がそれより多いと、細胞の生存率が減少して、それより少なければ細胞破壊や凝集抑制の効果が不十分である。

幹細胞を前記アスピリン含有溶液に浮遊させると、移送や保管中幹細胞の破砕および凝集が現れないので、このような幹細胞は体内投与に直ちに適用することができるため有用である。従って、好ましくは血管投与時用いられる幹細胞は、アスピリン含有生理食塩水に浮遊させた後利用する。

培養された幹細胞をアスピリン含有溶液で浮遊させると、移送や保管中幹細胞が破砕されたり凝集するのを防ぐことできるので、有用である。従って、血管内投与時用いられる幹細胞は、アスピリン含有生理食塩水に浮遊させた後利用することができる。アスピリン含有溶液は、アスピリン化合物を含有する溶液を意味して、溶媒は好ましくは生理食塩水を用いるが、その他にもハートマン−Ｄ溶液、ＰＢＳ等当業界で一般的に用いる基剤であれば制限せず用いてもよい。前記アスピリンは、通常市販されているアスピリン製剤だけでなくアスピリン様化合物を用いてもよい。前記添加されるアスピリンの含有量は、０．０００１〜０．０１ｍｇ／ｍＬであることが好ましい。添加されるアスピリンの量がそれより多いと、細胞の生存率が減少して、それより少なければ細胞凝集抑制の効果が不十分である。

上述した方法により収得した幹細胞を含有する本発明の静脈投与用幹細胞組成物は、患者の静脈内に直接投与されることができる。

投与量は、例えば、治療しようとする目的部位周辺の静脈血管に１ヶ所または複数ヶ所（例えば２〜５０ヶ所）に投与することができて、投与量は１．０×１０^５〜１．０×１０^８細胞／ｋｇ（体重）、より好ましくは１．０×１０^６〜１．０×１０^７細胞／ｋｇ（体重）である。但し、投与量は、患者の体重、年齢、性別、症状、投与組成物の形態、投与方法などにより異なってもよく、当業者ならば適切に調整することが可能である。投与回数は１回または臨床上容認可能な副作用の範囲で複数回可能で、投与部位についても１ヶ所または複数ヶ所投与してもよい。ヒト以外の動物に対しても、ｋｇ当りヒトと同じ投与量にしたり、または、例えば目的の動物とヒトとの虚血器官（心臓など）の容積比（例えば平均値）等で前記の投与量を換算した量を投与してもよい。本発明の治療対象の動物としては、ヒトおよびその他の目的とするほ乳動物が挙げられ、具体的にはヒト、猿、マウス、ラット、ウサギ、羊、牛、犬、馬、豚などが含まれる。

本発明に係る静脈投与用幹細胞組成物は、幹細胞を１×１０^７〜５×１０^８細胞数／ｍＬで含有してもよい。

本発明に係る静脈投与用幹細胞組成物は、薬学的に許容できる担体および／または添加物などを含む組成物であってもよい。例えば、滅菌水、生理食塩水、慣用の緩衝剤（リン酸、クエン酸、その他の有機酸など）、安定剤、塩、酸化防止剤（アスコルビン酸など）、界面活性剤、懸濁剤、等張化剤、または、保存剤などを含んでもよい。局所投与のために、バイオポリマーなどの有機物、ヒドロキシアパタイトなどの無機物、具体的にはコラーゲンマトリックス、ポリ乳酸ポリマーまたはコポリマー、ポリエチレングリコールポリマーまたはコポリマーおよびその化学的誘導体などと組み合わせるのも好ましい。

本発明に係る静脈投与用幹細胞組成物は、好ましくは注射に適した剤形で調製されなければならない。このためには、本発明の幹細胞は、薬学的に許容される水溶液中に溶解しているかまたは溶液状態で凍結したものが好ましい。従って、本発明の静脈投与用幹細胞組成物は、幹細胞を懸濁または希釈するために用いることができる、薬学的に許容できる目的とする担体を追加で含んでもよい。このような担体としては、例えば蒸溜水、生理食塩水、ＰＢＳまたは、ハートマン−Ｄ（韓国中外製薬）を用いた方がよい。

医薬製剤としての形態を取るために必要な製剤担体や賦形剤を、さらには安定化剤や吸着防止剤を含有できて、剤形も注射剤を用いることができて、注射時痛みを減少させることができる無痛化剤を用いることができて、必要に応じて適当なデバイスを用いてもよい。

本発明に係る静脈投与用幹細胞組成物の形態は、注射器やデバイスに含まれた最終注入形態、冷凍が可能なクライオバイアル（cryovial）の形態、または、液状医薬品を入れることができるパイロジェンがないガラス瓶とゴム栓、アルミニウムキャップ形態で充填されることができる。デバイスの形態としては、注射器、マルチシリンジなどが用いられ、四肢虚血性疾患の場合には細胞が投与される間細胞がせん断（shear）されて損傷を与えず苦痛を最小化できる注射針（needle）を利用して好ましくは２０ゲージ〜３０ゲージの範囲で投与する部位を考慮して用いて、シリンジやデバイスが細胞生存力に影響を及ぼさない素材を用いる。

本発明に係る静脈投与用幹細胞組成物に、その投与方法や剤形に応じて必要な場合、懸濁剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、界面活性化剤、希薄剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、緩衝剤、含硫還元剤、酸化防止剤などを適切に添加してもよい。

懸濁剤の例としては、メチルセルロース、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセルロース、アラビアガム、トラガント粉末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートなどが挙げられる。溶液補助剤としては、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート８０、ニコチン酸アミド、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、マクロゴール、ヒマシ油脂肪酸エチルエステルなどが挙げられる。安定化剤としては、デキストラン４０、メチルセルロース、ゼラチン、亜硫酸ナトリウム、メタ硫酸ナトリウムなどが挙げられる。等張化剤としては、例えばＤ−マンニトール、ソルビトールなどが挙げられる。保存剤としては、例えばパラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾール、クロロクレゾールなどが挙げられる。吸着防止剤としては、例えばヒト血清アルブミン、レシチン、デキストラン、エチレンオキサイド・プロピレンオキサイド共重合体、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。含硫還元剤としては、例えばＮ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルホモシステイン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸およびその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、炭素原子数１〜７のチオアルカン酸などのスルフヒドリル基を有するものなどが挙げられる。酸化防止剤としては、例えばエリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、Ｌ−アスコルビン酸およびその塩、Ｌ−アスコルビン酸パルミテート、Ｌ−アスコルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピルまたは、エチレンジアミン４酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウムなどのキレート剤が挙げられる。凍結保存剤としては、例えばＤＭＳＯ、グリセロールなどが挙げられる。さらには、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、炭酸水素ナトリウムなどの無機塩；クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、酢酸ナトリウムなどの有機塩などの通常添加される成分を含有してもかまわない。

本発明の一実施例では、本発明に係る培地で脂肪由来中間葉幹細胞を培養した。脂肪由来中間葉幹細胞は、次のような方法で取得することができる。まず、脂肪吸入術（Liposuction）等によって腹部から得られたヒト脂肪組織を分離してＰＢＳで洗浄した後、組織を細かく切った後、コラーゲン分解酵素を添加したＤＭＥＭ培地を用いて分解した後、ＰＢＳで洗浄して１０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。上澄み液は取り除いて底に残ったペレットはＰＢＳで洗浄した後、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。１００μｍメッシュを用いて浮遊物を取り除いた後、ＰＢＳで再び洗浄した。ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、２ｍＭＮＡＣ、０．２ｍＭアスコルビン酸）培地で培養して、一夜過ぎた後、培養容器底に付着しなかった細胞はＰＢＳで洗浄して、ＮＡＣ、アスコルビン酸、カルシウム、ＥＧＦ、インスリンおよびヒドロコルチゾンを含有したＫ−ＳＦＭ培地を２日ごとに取り替えながら培養して中間葉幹細胞を分離して、継代培養して中間葉幹細胞を得ることができる。しかしこの他にも当業界に公示された方法で中間葉幹細胞を得ることができる。

以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者にとって自明である

実施例１：ヒト脂肪組織由来中間葉幹細胞分離
脂肪吸入術により腹部脂肪から脂肪組織を各々分離してＰＢＳで洗浄した。洗浄された脂肪組織を細かく切った後、コラゲナーゼタイプ１（１ｍｇ／ｍＬ）を添加したＤＭＥＭｍｅｄｉａを利用して３７℃で２時間組織を分解させた。コラゲナーゼ処理された組織をＰＢＳで洗浄した後１０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、上澄み液を取り除いて、ペレットをＰＢＳで洗浄した後、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。１００μｍｍｅｓｈにフィルタリングして浮遊物を取り除いた後、ＰＢＳで洗浄して、１０％ＦＢＳ、２ｍＭＮＡＣ、０．２ｍＭアスコルビン酸が添加されたＤＭＥＭ培地で培養した。

一夜過ぎた後付着しなかった細胞はＰＢＳで洗浄して、５％ＦＢＳ、２ｍＭＮＡＣ、０．２ｍＭアスコルビン酸、０．０９ｍＭカルシウム、５ｎｇ／ｍＬｒＥＧＦ、５μｇ／ｍＬインスリン、１０ｎｇｂＦＧＦおよび７４ｎｇ／ｍＬヒドロコルチゾンおよび１ｎｇ／ｍＬのセレニウムを含有したＫ−ＳＦＭを２日ごとに取替えながら継代培養して、３継代培養して脂肪由来中間葉幹細胞を分離した。

実施例２：静脈投与用幹細胞培養のために適切な培地成分の探索
実施例１で用いられたＫ−ＳＦＭ培地に添加される活性成分であるＦＢＳ、ｂＦＧＦ、インスリン、ヒドロコルチゾン、ＥＧＦ、アスコルビン酸、ＮＡＣおよびセレニウムを共に含有する培地（培地１）と前記活性成分中一つ以上を取り除いた培地（培地２〜培地１０）を下記のように製造した。具体的な培地成分は次のとおりである：

培地１：Ｋ−ＳＦＭ培地＋ＦＢＳ＋ＮＡＣ＋アスコルビン酸＋インスリン＋ヒドロコルチゾン＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ＋セレニウム
培地２：Ｋ−ＳＦＭ培地＋ＮＡＣ＋アスコルビン酸＋インスリン＋ヒドロコルチゾン＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ＋セレニウム（培地１の成分中ＦＢＳを取り除く）
培地３：Ｋ−ＳＦＭ培地＋ＦＢＳ＋ＮＡＣ＋アスコルビン酸＋インスリン＋ヒドロコルチゾン＋ＥＧＦ＋セレニウム（培地１の成分中ｂＦＧＦを取り除く）
培地４：Ｋ−ＳＦＭ培地＋ＦＢＳ＋ＮＡＣ＋アスコルビン酸＋ヒドロコルチゾン＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ＋セレニウム（培地１の成分中インスリンを取り除く）
培地５：Ｋ−ＳＦＭ培地＋ＦＢＳ＋ＮＡＣ＋アスコルビン酸＋インスリン＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ＋セレニウム（培地１の成分中ヒドロコルチゾンを取り除く）
培地６：Ｋ−ＳＦＭ培地＋ＦＢＳ＋ＮＡＣ＋アスコルビン酸＋インスリン＋ヒドロコルチゾン＋ｂＦＧＦ＋セレニウム（培地１の成分中ＥＧＦを取り除く）
培地７：Ｋ−ＳＦＭ培地＋ＦＢＳ＋ＮＡＣ＋インスリン＋ヒドロコルチゾン＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ＋セレニウム（培地１の成分中アスコルビン酸を取り除く）
培地８：Ｋ−ＳＦＭ培地＋ＦＢＳ＋アスコルビン酸＋インスリン＋ヒドロコルチゾン＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ＋セレニウム（培地１の成分中ＮＡＣを取り除く）
培地９：Ｋ−ＳＦＭ培地＋ＦＢＳ＋ＮＡＣ＋アスコルビン酸＋インスリン＋ヒドロコルチゾン＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ（培地１の成分中セレニウムを取り除く）
培地１０：Ｋ−ＳＦＭ培地＋ＦＢＳ＋ＮＡＣ＋アスコルビン酸＋インスリン＋ヒドロコルチゾン＋セレニウム（培地１の成分中ｂＦＧＦおよびＥＧＦを取り除く）

前記活性成分が各々取り除かれた培地（培地２〜培地１０）およびＫ−ＳＦＭ培地（対照群）で脂肪由来幹細胞を培養した。各々の培地で３継代まで細胞を継代した後トリプシンを処理した後、共焦点顕微鏡（confocal microscope）で細胞径を測定した。
測定結果、実施例１で用いられた培地で培養された幹細胞は約１０〜１５μｍの粒度を有することを確認した（図示しない）。

実施例３：幹細胞の増殖能に影響を及ぼす培地成分の探索
実施例２で製造した培地１〜培地１０で脂肪由来幹細胞を培養した。脂肪幹細胞は２０代、３０代、７０代、８０代の各年齢代別男３人から収得した脂肪由来幹細胞を利用した。実施例１の方法で収得した脂肪由来幹細胞を前記各々の培地で１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬを播種して培養日別（ｄａｙ１、ｄａｙ２、ｄａｙ３、ｄａｙ４）でトリプシンを処理した後、共焦点顕微鏡で細胞数を確認した。下記の表１では、各年齢別に男３人（Ｎ＝３）の細胞数の平均を示した。その結果、下記の表でわかるように本発明に係る培養方法によると、幹細胞を４継代培養する場合、約７×１０^５〜１．１×１０^６細胞数／ｍＬの幹細胞を製造する可能性があることを確認することができた（表１参照）。また、年齢別に多少差があるが、培地９番の場合ＣＰＤＬ（Cell population doubling level）値が最も高く、２０代および３０代の場合には１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの幹細胞を播種した時４日（ｄ４）になる時点で細胞数が１０〜１１倍増加して、７０代および８０代の場合には細胞数が７〜９倍増加したことを確認することができた（図示しない）。

実施例４：幹細胞の単細胞維持能力
（１）アセチルサリチル酸を濃度別に添加した生理食塩水で処理
記実施例１で分離した脂肪組織由来中間葉幹細胞にトリプシン処理した後、アセチルサリチル酸（Acetylsalicylic acid）（Ｓｉｇｍａ；Ａ５３７６）を濃度別に添加した生理食塩水に１．０×１０^７ｃｅｌｌｓ濃度で浮遊させた後、１２時間、２４時間での生存率を観察した。前記アセチルサリチル酸を添加した生理食塩水は、生理食塩水にアセチルサリチル酸を濃度別に添加して３７℃で３０分間超音波処理（sonication）して製造した。

実験結果、生理食塩水１０ｍＬに対してアスピリンの添加量が１．０ｍｇ以上である場合には細胞毒性があることを確認することができた。

（２）アルタルジル注を濃度別に添加した生理食塩水で処理
前記実施例１で分離した脂肪組織由来中間葉幹細胞にトリプシン処理した後、アルタルジル注を濃度別に添加した生理食塩水に１．０×１０^７ｃｅｌｌｓ濃度で浮遊させた後、１２時間、２４時間での生存率を観察した。

実験の結果、生理食塩水１０ｍＬに対してアスピリンの添加量が０．００１〜０．１ｍｇである場合には、脂肪幹細胞の生存に影響を与えないことを確認することができた。脂肪幹細胞をアスピリン浮遊液に浮遊時７２時間まで静置可能であるが、好ましくは２４時間以内で処理する。

（３）アルタルジル注を濃度別に添加した生理食塩水に処理した幹細胞の増殖力
前記実施例１で分離した脂肪組織由来中間葉幹細胞にトリプシン処理した後、アルタルジル注を濃度別に添加した生理食塩水に１．０×１０^７ｃｅｌｌｓ濃度で浮遊させた後、２４時間後の生存率を観察した。

実験の結果、生理食塩水１０ｍＬに対してアルタルジル注の添加量が０．００１〜０．１ｍｇである場合、脂肪幹細胞の増殖能力に影響を与えないことを確認することができた。
また、前記浮遊させた細胞１．０×１０^６ｃｅｌｌｓを７日間培養した後の細胞数と生存率も観察した結果を下記に示した。

（４）アスピリンリジン（Ｓｈｉｎｐｏｏｎｇ製薬）を添加した生理食塩水に処理した幹細胞の特性
前記実施例１で分離した脂肪組織由来中間葉幹細胞にトリプシン処理した後、アスピリンリジン（Ｓｈｉｎｐｏｏｎｇ製薬）を濃度別に添加した生理食塩水に幹細胞を１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ濃度で浮遊させた後、５日間培養して細胞数を測定した。そして２４時間冷蔵保管後ＦＡＣＳを測定して細胞特性を確認した。

実験結果、アスピリンリジン濃度による細胞生存率は多少減少したが有意的でなく、５日間培養した後の細胞数も個体差はあるものも濃度別差は殆どなかった。２４時間アスピリンが添加された生理食塩水に浮遊した後２４時間冷蔵保管した脂肪由来中間葉幹細胞の特性もアスピリン濃度による影響はないことが観察された。

本発明に係る静脈投与用幹細胞組成物は、静脈投与時血管を全く塞がずに損傷部位に幹細胞を伝達するので、優れた治療効果を示すことができて、幹細胞の血管内投与による細胞治療効能を画期的に増進させることができる。

以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。

Claims

下記の工程を含み、１０〜２０μｍの径を有して、単細胞で存在する幹細胞を１×１０^７〜５×１０^８細胞数／ｍＬで含有することを特徴とする静脈投与用幹細胞組成物の製造方法：
（ａ）脂肪組織または上皮組織由来の成体幹細胞をＫＳＦＭ；並びにＦＢＳ、ＮＡＣ、アスコルビン酸、インスリンまたはインスリン様因子、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン、ｂＦＧＦ、ヘパラン硫酸、２−メルカプトエタノール、ＥＧＦおよびセレニウムを含有する培地で培養する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）で培養して収得した幹細胞をアスピリン含有溶液に浮遊させる工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）で収得した幹細胞を１×１０^７〜５×１０^８細胞数／ｍＬで含有する静脈投与用幹細胞組成物を製造する工程。
前記幹細胞は、径が１０〜１５μｍであることを特徴とする請求項１に記載の静脈投与用幹細胞組成物の製造方法。
前記アスピリン含有溶液は、生理食塩水、ハートマン−Ｄ溶液及びＰＢＳで構成された群から選択される溶液をさらに含有することを特徴とする請求項１又は２に記載の静脈投与用幹細胞組成物の製造方法。
前記アスピリンは、イソソルビドを基にしたアスピリンまたはニコチン酸を基にしたアスピリン化合物の中から選択されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の静脈投与用幹細胞組成物の製造方法。
前記アスピリンの含有量は、０．０００１〜０．０１ｍｇ／ｍＬであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の静脈投与用幹細胞組成物の製造方法。
前記幹細胞は、成体幹細胞であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の静脈投与用幹細胞組成物の製造方法。
前記幹細胞は、脂肪組織由来間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項６に記載の静脈投与用幹細胞組成物の製造方法。