CN104520423A - 用于生产具有适于血管内给药的尺寸的干细胞的方法 - Google Patents

用于生产具有适于血管内给药的尺寸的干细胞的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104520423A
CN104520423A CN201380025722.6A CN201380025722A CN104520423A CN 104520423 A CN104520423 A CN 104520423A CN 201380025722 A CN201380025722 A CN 201380025722A CN 104520423 A CN104520423 A CN 104520423A
Authority
CN
China
Prior art keywords
stem cell
substratum
cell
antioxidant
intravascular administration
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201380025722.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104520423B (zh
Inventor
罗廷灿
姜成根
申一燮
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
RBIOCO., LTD.
Original Assignee
RNL Bio Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by RNL Bio Co Ltd filed Critical RNL Bio Co Ltd
Publication of CN104520423A publication Critical patent/CN104520423A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104520423B publication Critical patent/CN104520423B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0667—Adipose-derived stem cells [ADSC]; Adipose stromal stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0607—Non-embryonic pluripotent stem cells, e.g. MASC
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
    • C12N2500/14—Calcium; Ca chelators; Calcitonin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/33—Insulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/39—Steroid hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明涉及一种用于制备具有适用于血管内给药的尺寸的干细胞的方法，优选用于制备直径范围是11-16μm的干细胞的方法。另外，本发明涉及一种用于制备具有适合于血管内给药的尺寸的干细胞的培养基组合物。根据本发明，可以制备具有适合于血管内给药的尺寸的干细胞，使得经血管内给药到静脉的干细胞可以稳定地到达靶组织，从而可以更有效地提高疗效展现活性，从而使用干细胞创新性地提高了细胞疗法的效力。

Description

用于生产具有适于血管内给药的尺寸的干细胞的方法
技术领域
本发明涉及用于制备具有适用于血管内给药的尺寸的干细胞的方法，具体地涉及一种用于制备适合于血管内给药的、具有1-16μm的直径的干细胞的方法。
背景技术
干细胞是指不仅具有自我复制能力，还具有分化为至少两种类型的细胞的能力的细胞，并且可分为全能干细胞、多能干细胞和专能干细胞。全能干细胞是具有能够发育成一个完整个体的全能性质的细胞，而这些性质为卵母细胞和精子受精之后直到八细胞期的细胞所拥有。当这些细胞被分离并移植到子宫内时，就可以发育成一个完整的个体。多能干细胞是能够发育成外胚层、中胚层和内胚层来源的各种细胞和组织的细胞，它们来源于受精后4-5天生成的胚囊内部的内细胞群。这些细胞被称为“胚胎干细胞”，并能分化成各种其他的组织细胞，但不会形成新的活的生物体。专能干细胞是仅能够分化成含有这些细胞的组织和器官特异的细胞的干细胞，它们不仅参与胎儿，新生儿和成人期的各种组织和器官的生长和发育，而且也参与维持成年组织的动态平衡，和组织损伤时的诱导再生功能。组织特异性的专能细胞统称为“成体干细胞”。
成体干细胞是通过从各种人的器官中提取细胞并使该细胞发育为干细胞而获得的，并且其特征在于它们仅分化成特定的组织。然而，近来，用于将成体干细胞分化成各种组织(包括肝细胞)的实验取得了显著的成功，这引起了关注。特别是，已在再生医学领域中努力通过使用细胞进行生物组织和器官的再生，以及恢复因疾病或事故等丧失的功能。在这一领域中经常用于再生医学的方法包括以下步骤：从患者采集干细胞、血液源性的单核细胞或骨髓源性的单核细胞；通过试管培养诱导细胞的增殖和/分化；并通过移植将所选择的未分化(干细胞和/或祖细胞)和/或分化的细胞导入到患者的身体中。因此，预期现有的由药物或手术治疗疾病的经典方法将被用健康的细胞、组织或器官替换受损细胞、组织或器官的细胞/组织替代疗法所替代，因此干细胞的利用将进一步增加。
因此，目前正在研究干细胞的各项功能。特别是，由于使用间充质干细胞的细胞治疗技术开始受到人们的关注，已经开发了用于改善间充质干细胞以使其适合于治疗目的的技术(WO2006/019357，韩国专利号0795708以及韩国专利号0818214)。
然而，与用于制备适合于血管内给药的干细胞的方法相关的技术尚未得到充分研究。
因此，本发明的发明人已经发现，当将干细胞在含有基础培养基和选自N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)、胰岛素或胰岛素样因子、氢化可的松、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和抗氧化剂的组中的至少两种组分的培养基中培养时，可以制备具有适合于细胞内给药的尺寸的干细胞，从而完成了本发明。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于制备具有适用于血管内给药的尺寸的干细胞的方法。
本发明的另一个目的是提供一种用于制备具有适用于血管内给药的尺寸的干细胞的培养基组合物。
为了实现上述目的，本发明提供一种制备具有适合于血管内给药的尺寸干细胞的方法，该方法包括在培养基中培养干细胞的步骤，所述培养基包含基础培养基；和选自N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)、胰岛素或胰岛素样因子、氢化可的松、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和抗氧化剂的组中的至少两种组分。
本发明还提供了一种用于制备具有适用于血管内给药的尺寸的干细胞的培养基组合物，所述培养基组合物含有基础培养基；和选自N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)、胰岛素或胰岛素样因子、氢化可的松、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和抗氧化剂的组中的至少两种组分。
附图说明
图1是示出根据培养基和传代数，脂肪源性间充质干细胞的尺寸的图表。
图2是示出根据培养基，脂肪源性间充质干细胞的标记物表达的图表。
具体实施方式
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述领域的普通技术人员的普遍理解相同的含义。通常，本文中使用的命名法和实验方法是本领域公知并且通常采用的。
如本文所用，术语“干细胞”指不仅具有自我复制的能力，还具有能够分化为至少两种类型的细胞的能力的细胞。“成体干细胞”是指出现在发育过程后形成胚胎的各个器官的阶段，或出现在成体阶段的干细胞。
如本文所用，术语“间充质干细胞”指从人或哺乳动物组织中分离，并且可以源自各种组织的未分化的干细胞。具体地，间充质干细胞可以是脐带源性的间充质干细胞，脐血源性的间充质干细胞，骨髓源性的间充质干细胞，脂肪源性的间充质干细胞，肌肉源性的间充质干细胞，神经源性的间充质干细胞，皮肤源性的间充质干细胞，羊膜源性的间充质干细胞，或胎盘源性的间充质干细胞。用于从各组织中分离干细胞的技术已为本领域所知。
如本文所用，“脂肪组织源性的间充质干细胞”是从脂肪组织中分离的未分化的成体干细胞并且在本文中也称为“脂肪源性成体干细胞”，“脂肪干细胞”或“脂肪源性干细胞”。这些细胞可以根据本领域中已知的任何常规方法获得。一种分离脂肪组织源性的间充质干细胞的方法可以是，例如，如下所述。即，脂肪源性的间充质干细胞可以这样分离：培养通过脂肪抽吸所获得的含有脂肪的悬浮液(在生理盐水中)，收集通过用胰蛋白酶处理而贴附到培养容器(如烧瓶)的干细胞层，或者通过用刮刀刮取而直接收集那些悬浮在少量生理盐水中的干细胞。
在本发明中，“具有适于血管内给药的尺寸的干细胞”是指具有比静脉或毛细血管的直径小，优选为11-16μm的直径的干细胞，这样的干细胞当其血管内给药时，可以很容易地迁移到它们的靶组织，而不干扰血液流动或循环，并可以在靶组织中展现它们的活性。
干细胞可以通过各种途径给药到体内，例如，静脉内、动脉内或腹膜内给药。在这些给药途径中，优选静脉内给药，因为它可以以方便和安全的方式来治疗疾病而不需要外科手术治疗。为了使静脉内给药的干细胞能够安全地到达靶位点，并展现出所期望的治疗效果，应该满足不同的要求。首先，干细胞应具有适于血管内给药的尺寸，使得这些干细胞在血管内给药时，既不减小血流速度也不形成血栓。可从各种组织获得的间充质干细胞的增殖程度在患者之间是不同的并且取决于它们的来源、培养条件或方法而变化，并且其尺寸也从约10至300μm的直径变化。然而，人的毛细血管后微静脉的直径为约10-50μm，小动脉的直径为8-30μm(Schmidt GT,1989)，和毛细血管的直径约8μm(Schmidt GT,1989；Chien,1975；John Ross,1991；Herbert et al.,1989；Arthur and Guyton,1997；Renkin,1989；Gaehtgens,1980；Row 1979)，这比一般的间充质干细胞的直径小。因此，当血管内施用具有相对大的尺寸的间充质干细胞，它们会影响血管内的活性。具体地说，它们可降低血液流速并且还干扰血液循环，造成血液流动停滞、血栓形成和血管阻塞，甚至导致死亡。在这方面，有报道说，当将具有直径为约16-53μm的骨髓间充质干细胞静脉内给予小鼠时，血流速度降低并且观察到心肌梗死和血栓形成的诱发(D.Furlani et al.Microvasular Research 77(2009)370-376)。因此，通过细胞内途径给予具有合适尺寸的干细胞是重要的。此外，干细胞在血管内给药前不应该被破坏或聚集，并应以单细胞安全地到达它们的靶位点而不会在血管内给药后被破坏或聚集。此外，干细胞应以一定的浓度或更高浓度施用，以便它们到达靶位点后展现出期望的治疗效果。鉴于上述若干要求，本发明旨在提供具有适于血管内给药的尺寸的干细胞，从而能够在血管内给药后安全地展现出治疗效果而不降低血流速度或形成血栓。
在一个方面，本发明涉及一种制备具有适于血管内给药的尺寸的干细胞的方法，所述方法包括在培养基中培养干细胞的步骤，所述培养基含有基础培养基的和选自N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)、胰岛素或胰岛素样因子、氢化可的松、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和抗氧化剂的组中的至少两种组分。
本发明中使用的基础培养基是指具有公知的适合于干细胞培养的简单组成的典型培养基。通常用于培养干细胞的基础培养基的实例包括MEM(最低必需培养基)、DMEM(达尔伯克氏改良的伊格尔培养基)RPMI(Roswell Park Memorial Institute Medium)和K-SFM(角质形成细胞无血清培养基)。作为本发明中使用的基础培养基，只要它们在本领域中使用，就可以使用任何培养基而没有任何限制。优选地，所述基础培养基可以选自M199/F12(混合物)(GIBCO)、MEM-α培养基(GIBCO)、低浓度的含葡萄糖的DMEM培养基(Welgene)、MCDB131培养基(Welgene)、IMEM培养基(GIBCO)、K-SFM、DMEM/F12培养基、PCM培养基和MSC扩增培养基(Chemicon)。特别地，其中可以优选使用K-SFM。
用于获取所培养的间充质干细胞的基础培养基可以补充有在本领域中促进未分化状态的间充质干细胞的增殖，而抑制其分化的添加剂。此外，该培养基可以含有中性缓冲液(如磷酸盐和/或高浓度的碳酸氢盐)的等渗溶液，蛋白质营养素(例如，血清如FBS、FCS(胎牛血清)或马血清、血清替代品、白蛋白或者必需的或非必需氨基酸如谷氨酸或L-谷氨酰胺)。此外，可含有脂质(脂肪酸、胆固醇、血清中的HDL或LDL提取物)和在这类的多数保存培养基(stock media)中发现的其它成分(如胰岛素或转铁蛋白、核苷或核苷酸、丙酮酸盐、糖源如葡萄糖、任何离子化形式或盐的硒、糖皮质激素如氢化可的松和/或还原剂如β-巯基乙醇)。
此外，为了防止细胞彼此粘附、贴附在容器壁上或形成过大的簇，培养基可以有利地含有抗结块剂，如由Invitrogen(目录#0010057AE)出售的。
其中，可有利地使用以下附加的添加剂中的一种或多种：
·干细胞因子(SCF，Steel因子)，二聚化c-kit的其它配体或抗体，以及同一信号传导途径的其它活化剂
·其它酪氨酸激酶相关受体的配体，所述受体例如血小板源性生长因子(PDGF)、巨噬细胞集落刺激因子、Flt-3配体和血管内皮生长因子(VEGF)的受体
·提升环AMP的水平的因子，如毛喉素
·诱导gp130的因子，如LIF或抑瘤素-M
·造血生长因子，如血小板生成素(TPO)
·转化生长因子，如TGFβ1
·神经营养因子，如CNTF
·抗生素，如庆大霉素、青霉素或链霉素。
用于本发明中的培养基除了基础培养基外，还可含有选自N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)、胰岛素或胰岛素样因子、氢化可的松、成纤维细胞生长因子(bFGF)和抗氧化剂中的至少两种组分。
具体地，该培养基可含有胰岛素样因子如胰岛素替代物，其功能是通过增强葡萄糖代谢和蛋白质代谢来促进细胞生长。特别是，优选使用重组IGF-1(胰岛素样生长因子1)。胰岛素样因子的优选含量为10-50ng/ml。如果胰岛素样因子的含量低于10ng/ml，会发生细胞凋亡，而如果该含量超过50ng/ml，将增加细胞毒性和培养基的成本。
该培养基可含有可以在体内诱导不同类型的细胞增殖的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。优选地，使用重组bFGF蛋白。bFGF的优选含量为1-100ng/ml。
可在本发明中使用的抗氧化剂的例子包括硒、抗坏血酸、维生素E、儿茶素、番茄红素、β胡萝卜素、辅酶Q-10、EPA(二十碳五烯酸)、DHA(二十二碳六烯酸)等。优选地，可使用硒。在本发明的一个实例中，使用硒作为抗氧化剂。培养基中的硒的含量优选为0.5-10ng/ml。如果硒的含量小于0.5ng/ml，培养基将会对氧中毒敏感，而如果其含量超过10ng/ml，将导致严重的细胞毒性。
用于本发明中的培养基还可以含有选自由的FBS(胎牛血清)、钙和EGF的组中的组分。表皮生长因子(EGF)可以体内诱导不同类型的细胞增殖的并且优选使用重组EGF蛋白。表皮生长因子的优选含量为10-50ng/ml。如果表皮生长因子在培养基中的含量低于10ng/ml，将没有特别的效果，而如果该含量超过50ng/ml，将对细胞有毒。
在根据本发明的培养基中培养的干细胞优选具有11-16μm直径，并且因此适合于血管内给药。
因此，在另一个方面，本发明涉及一种用于制备具有适于血管内给药的尺寸的干细胞的培养基组合物，所述培养基组合物含有基础培养基；和选自N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)、胰岛素或胰岛素样因子、氢化可的松、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和抗氧化剂的组中的至少两种组分。
在本发明的一个实例中，在本发明的培养基中培养脂肪源性间充质干细胞。脂肪源性间充质干细胞可以以下面的方式获得。首先，将通过脂肪抽吸或类似方法从获自腹部的人脂肪组织分离并用PBS洗涤，然后将组织切碎，并用含有胶原酶的DMEM培养基降解。降解的组织用PBS洗涤，并在1000rpm下离心5分钟。除去上清液，并将残留在底部的沉淀用PBS洗涤，然后以1000rpm离心5分钟。将得到的细胞通过100目过滤器过滤以除去碎片，然后用PBS洗涤。细胞在DMEM培养基(10％FBS，2mMNAC，0.2mM抗坏血酸)中培养过夜，然后用PBS将未附着于培养容器底部的细胞洗掉，将培养基更换为含有NAC、抗坏血酸、碳酸钙、rEGF、胰岛素和氢化可的松的K-SFM培养基并以2天的间隔将细胞传代培养，由此得到脂肪源性间充质干细胞。除了这种方法，在本领域中已知的任何方法也可用于获得间充质干细胞。
本发明的制备方法可进一步包括用胰蛋白酶处理在本发明的培养基中培养的干细胞的步骤。当用胰蛋白酶处理培养的干细胞时，可以得到以单个细胞的形式存在的干细胞。这里，胰蛋白酶作用是抑制细胞间的聚集，使得细胞保持为单细胞。也可以使用任何能抑制细胞间聚集的物质代替胰蛋白酶。
本发明的制备方法还可以包括将在本发明的培养基中培养的干细胞在含阿司匹林的溶液中悬浮的步骤。当培养的干细胞被悬浮在含阿司匹林的溶液中时，可以在运输或储存过程中有效地防止干细胞被破坏或聚集。因此，用于血管内给药的干细胞可以在干细胞被悬浮在含阿司匹林的生理盐水后使用。所述含阿司匹林的溶液是指含有阿司匹林化合物的溶液。该溶液的溶剂可以是生理盐水。除了生理盐水外，可以使用于本领域中通常使用的任何碱，如哈特曼-D溶液或PBS(磷酸盐缓冲盐水)而没有限制。作为阿司匹林，不仅可使用商购的阿斯匹林制剂，也可以使用类阿斯匹林化合物。阿司匹林的添加量优选为0.0001-0.01mg/ml。如果阿司匹林的添加量大于上述范围的上限时，细胞生存力会降低，而如果用量低于上述范围的下限时，抑制细胞聚集的效果可能不够。
以下，详细参照实施例对本发明进行进一步进行说明。对于本领域的普通技术人员来说显而易见的是，这些实施例是说明性的目的，并且不应当被解释为限制本发明的范围。
实施例1：人脂肪组织源性间充质干细胞的分离
将脂肪抽吸从腹部组织分离的脂肪组织用PBS洗涤并切细，然后将组织于37℃在补充有1型胶原酶(1mg/ml)的DMEM培养基中消化2小时。将胶原酶处理的组织用PBS洗涤，并在1000rpm下离心5分钟。除去上清液，将沉淀用PBS洗涤，然后以1000rpm离心5分钟。将得到的细胞通过100目过滤器过滤以除去碎片，然后将细胞用PBS洗涤，并在含有10％FBS、2mM NAC(N-乙酰-L-半胱氨酸)和0.2mM抗坏血酸的DMEM培养基在培养过夜。
然后，用PBS洗涤以除去非贴壁细胞，将培养基更换为K-SFM(角质形成细胞无血清培养基)同时以2天的时间间隔对剩余的细胞进行3次传代培养，从而分离脂肪源性间充质干细胞,所述K-SFM培养基含有5％FBS、2mM NAC、0.2mM抗坏血酸、0.09mM钙、5ng/ml rEGF、5μg/ml胰岛素、10ng bFGF和74ng/ml氢化可的松。
将在实施例1中通过传代培养3代获得的脂肪源性间充质干细胞接种在下列各培养基中并培养5天。培养5天后，测量细胞的尺寸和特性。
培养基组成
1)KSFM+添加剂：K-SFM+FBS+NAC+抗坏血酸+钙+rEGF+胰岛素+bFGF的+氢化可的松+硒；
2)DMEM+FGF：DMEM(低葡萄糖)+10％FBS+5ng/ml FGF；
3)α-MEM+FGF：α-MEM+10％FBS+5ng/ml FGF。
表1
[表1]：根据培养基的组成的细胞尺寸(μm)
传代2 传代3 传代4
KSFM+添加剂 14±2.0 13.8±2.2 14.1±2.4
DMEM+FGF 20±1.7 21.8±1.4 22.1±1.8
α-MEM+FGF 20.3±2.1 19.2±1.8 22.0±1.9
‘KSFM+添加剂’培养组中的细胞的细胞尺寸是最小的，并且使用α-MEM培养基作为基础培养基的培养组中的细胞尺寸的变化大于DEME组。'KSFM+添加剂’组的细胞保持11-16μm的尺寸，而其它培养基组随着传代数增加，表现出细胞尺寸大于20μm(参见图1)。
通过FACS，分析使用上述培养基获得的传代-4的脂肪源性间充质干细胞的特性。
表2
[表2]
KSFM+添加剂 DMEM+FGF α-MEM+FGF
CD 29 99.0％ 99.4％ 99.9％
CD 90 99.7％ 99.6％ 99.6％
CD 31 0.1％ 4.2％ 0.5％
CD 34 0.0％ 2.3％ 0.2％
CD 45 0.1％ 4.2％ 2.1％
对使用上述培养基获得的脂肪源性间充质干细胞的特性进行分析，并且结果表明培养基对于干细胞的阳性标记物的表达没有影响，但阴性标记物的表达水平在DMEM+FGF培养基组的细胞中比在'KSFM+添加剂’培养基组的细胞中略高(参见图2)。
通过SEM(扫描电子显微镜)对实施例1中分离的干细胞进行观察，并且结果可以看出，干细胞大多具有约11-16μm的直径并且不形成细胞聚集体。
实施例2：用于制备小尺寸的干细胞的培养基组分的研究
制备没有作为加入到实施例1中所用的K-SFM培养基中的活性成分的FBS、NAC、抗坏血酸、碳酸钙、rEGF、5ng/ml胰岛素、bFGF、氢化可的松和硒中每一种的培养基，以及将脂肪源性干细胞在'KSFM+添加剂培养基基组和上述不含每种活性成分的培养基中培养。将细胞在各培养基中传代3次培养后，将细胞用胰蛋白酶处理，然后使用激光共聚焦显微镜测量细胞的直径。结果可以看出，在含有硒的培养基中培养的脂肪源性干细胞的尺寸为11.6-16.5μm，但在无硒的培养基中培养的干细胞的尺寸为18.1-23.9μm。
工业实用性
根据本发明，可以制备直径为11-16μm的干细胞，它们容易迁移到它们的靶组织并具有高稳定性。因此，干细胞的血管内给药在细胞治疗中的效果可以显著增加。
虽然本发明已参照具体的特征作了详细描述，但对于本领域技术人员显而易见是该描述仅仅用于优选实施方式，并不限制本发明的范围。因此，本发明的实际范围由所附权利要求及其等同物来限定。

Claims (17)

1.一种制备具有适合于血管内给药的尺寸的干细胞的方法，所述方法包括：在培养基中培养干细胞，所述培养基含有基础培养基；和选自N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)、胰岛素或胰岛素样因子、氢化可的松、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和抗氧化剂的组中的至少两种组分。
2.根据权利要求1的方法，其中所述基础培养基选自M199/F12(混合物)(GIBCO)、MEM-α培养基(GIBCO)、低浓度的含葡萄糖的DMEM培养基(Welgene)、MCDB131培养基(Welgene)、IMEM培养基(GIBCO)、K-SFM、DMEM/F12培养基、PCM培养基和MSC扩增培养基(Chemicon)。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗氧化剂选自硒、抗坏血酸、维生素E、儿茶素、番茄红素、β胡萝卜素、辅酶Q-10、EPA(二十碳五烯酸)和DHA(二十二碳六烯酸)。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述抗氧化剂是硒。
5.根据权利要求1的方法，其中所述培养基还含有选自FBS(胎牛血清)、钙和EGF的组中的组分。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括用胰蛋白酶处理所培养的干细胞。
7.根据权利要求1或6所述的方法，其中所述方法进一步包括在含有阿司匹林的溶液中悬浮所培养的干细胞。
8.根据权利要求1的方法，其中具有适合于血管内给药的尺寸的干细胞的直径为11-16μm。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述干细胞是成体干细胞。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述干细胞是脂肪组织源性的间充质干细胞。
11.一种用于制备具有适合于血管内给药的尺寸的干细胞的培养基组合物，该培养基包含基础培养基；和选自N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)、胰岛素或胰岛素样因子、氢化可的松、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和抗氧化剂的组中的至少两种组分。
12.根据权利要求11的培养基组合物，其中所述基础培养基选自M199/F12(混合物)(GIBCO)、MEM-α培养基(GIBCO)、低浓度的含葡萄糖的DMEM培养基(Welgene)、MCDB131培养基(Welgene)、IMEM培养基(GIBCO)、K-SFM、DMEM/F12培养基、PCM培养基和MSC扩增培养基(Chemicon)。
13.根据权利要求11的培养基组合物，其中所述抗氧化剂选自硒、抗坏血酸、维生素E、儿茶素、番茄红素、β胡萝卜素、辅酶Q-10、EPA(十碳五烯酸)和DHA(十二碳六烯酸)。
14.根据权利要求11的培养基组合物，其中所述抗氧化剂是硒。
15.根据权利要求11的培养基组合物，其中所述培养基还含有选自FBS(胎牛血清)、钙和EGF的组的组分。
16.根据权利要求11的培养基组合物，其中所述干细胞是成体干细胞。
17.根据权利要求16的培养基组合物，其中所述干细胞是脂肪组织源性的间充质干细胞。
CN201380025722.6A 2012-04-18 2013-04-17 用于生产具有适于血管内给药的尺寸的干细胞的方法 Active CN104520423B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20120040488 2012-04-18
KR10-2012-0040488 2012-04-18
PCT/KR2013/003251 WO2013157850A1 (ko) 2012-04-18 2013-04-17 혈관 내 투여에 적합한 크기를 가지는 줄기세포의 제조방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104520423A true CN104520423A (zh) 2015-04-15
CN104520423B CN104520423B (zh) 2017-07-04

Family

ID=49383731

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380025722.6A Active CN104520423B (zh) 2012-04-18 2013-04-17 用于生产具有适于血管内给药的尺寸的干细胞的方法

Country Status (11)

Country Link
US (2) US10815459B2 (zh)
EP (1) EP2840133B1 (zh)
JP (1) JP5926447B2 (zh)
KR (1) KR101467480B1 (zh)
CN (1) CN104520423B (zh)
AU (1) AU2013250089B2 (zh)
BR (1) BR112014025931A2 (zh)
ES (1) ES2640443T3 (zh)
MX (1) MX359004B (zh)
WO (1) WO2013157850A1 (zh)
ZA (1) ZA201407585B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107090428A (zh) * 2017-04-25 2017-08-25 徐子雁 自体来源的间充质干细胞向鼻粘膜样上皮细胞分化方法及试剂盒
CN109790516A (zh) * 2016-07-29 2019-05-21 罗廷灿 制备抑制癌细胞增殖的间充质干细胞的方法
TWI715874B (zh) * 2018-09-27 2021-01-11 台灣粒線體應用技術股份有限公司 無血清培養液以及使用此無血清培養液分離和放大培養幹細胞方法

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2827207T3 (es) * 2011-12-01 2021-05-20 R Bio Co Ltd Composición de medio de cultivo de rejuvenecimiento de células madre
CA2968048A1 (en) * 2014-10-29 2016-05-06 R Bio Co., Ltd. Medium composition for culturing stem cells
US10894947B1 (en) * 2016-04-29 2021-01-19 Hope Biosciences, Llc Method for generating protein rich conditioned medium
KR101648915B1 (ko) * 2016-05-16 2016-08-17 주식회사 디지레이 줄기세포의 응집방지 방법 및 그 조성물
CN109423476A (zh) * 2017-08-21 2019-03-05 青岛瑞思德生物科技有限公司 用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒
CN109423473A (zh) * 2017-08-21 2019-03-05 青岛瑞思德生物科技有限公司 用于制备胎盘干细胞的试剂盒
KR102233568B1 (ko) * 2019-12-13 2021-03-30 주식회사 알바이오 항암 바이러스가 도입된 중간엽 줄기세포의 세포 생존능을 향상시키는 방법
CN117946969A (zh) * 2024-03-27 2024-04-30 内蒙古医科大学附属医院(内蒙古自治区心血管研究所) 一种具有比对功能的间充质干细胞培养基及其工作方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6103530A (en) * 1997-09-05 2000-08-15 Cytotherapeutics, Inc. Cultures of human CNS neural stem cells
US20090233360A1 (en) * 2008-03-17 2009-09-17 Uti Limited Partnership Methods and Compositions for Culturing of neural Precursor Cells
WO2010091226A1 (en) * 2009-02-05 2010-08-12 Resolvyx Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for organ preservation
WO2011049414A2 (ko) * 2009-10-23 2011-04-28 주식회사 알앤엘바이오 지방조직 유래 성체 줄기세포 이동을 유도하는 방법
WO2012012570A2 (en) * 2010-07-20 2012-01-26 University Of Southern California High telomerase activity bone marrow mesenchymal stem cells, methods of producing the same and pharmaceuticals and treatment methods based thereon

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2527293T3 (es) 2004-08-16 2015-01-22 Cellresearch Corporation Pte Ltd Aislamiento de células madre/progenitoras de membrana amniótica del cordón umbilical
US7989205B2 (en) 2005-10-06 2011-08-02 American Cryostem Corporation Cell culture media, kits and methods of use
KR100679642B1 (ko) * 2005-11-16 2007-02-06 주식회사 알앤엘바이오 인간 지방조직 유래 다분화능 줄기세포 및 이를 함유하는세포치료제
KR100818214B1 (ko) 2006-09-29 2008-04-01 재단법인서울대학교산학협력재단 인간 태반조직의 양막 또는 탈락막 유래 다분화능 줄기세포및 그 제조방법
US20090124007A1 (en) * 2006-11-15 2009-05-14 Seoul National University Industry Foundation Method for the Simultaneous Primary-Isolation and Expansion of Endothelial Stem/Progenitor Cell and Mesenchymal Stem Cell Derived From Mammal Including Human Umbilical Cord
KR100795708B1 (ko) 2006-12-26 2008-01-17 주식회사 알앤엘바이오 인간 양막 상피세포 유래 성체 줄기세포의 분리 및 배양방법
KR100883565B1 (ko) * 2007-02-14 2009-02-13 (주)프로스테믹스 지방 줄기세포의 조직 재생 능력을 최적화한 조건 배지를 함유한 조직 재생용 주사제 첨가제
JP2008212022A (ja) 2007-03-01 2008-09-18 Olympus Corp 組織由来幹細胞の分離装置および分離方法
US8455251B2 (en) 2007-11-09 2013-06-04 Rnl Bio Co., Ltd. Method for isolating and culturing adult stem cells derived from human amniotic epithelium
CN101748096B (zh) * 2008-12-17 2013-03-13 北京汉氏联合生物技术有限公司 亚全能干细胞、其制备方法及其用途
US20120263685A1 (en) * 2009-10-08 2012-10-18 Rnl Bio Co., Ltd Anti-tumor composition comprising human-derived adult stem cells
KR101211913B1 (ko) 2010-07-16 2012-12-13 주식회사 알앤엘바이오 양막유래 중간엽 줄기세포 배양을 위한 배지조성물 및 이를 이용한 양막유래 중간엽 줄기세포의 배양방법
KR20120057784A (ko) 2010-11-29 2012-06-07 주식회사 알앤엘바이오 줄기세포의 안정성 증진용 조성물
ES2827207T3 (es) * 2011-12-01 2021-05-20 R Bio Co Ltd Composición de medio de cultivo de rejuvenecimiento de células madre
AU2013247455A1 (en) * 2012-04-13 2014-11-20 R Bio Co., Ltd. Method and composition for preventing stem cell disruption and aggregation
KR101523040B1 (ko) 2012-06-26 2015-05-26 라정찬 고농도의 줄기세포 제조방법

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6103530A (en) * 1997-09-05 2000-08-15 Cytotherapeutics, Inc. Cultures of human CNS neural stem cells
US20090233360A1 (en) * 2008-03-17 2009-09-17 Uti Limited Partnership Methods and Compositions for Culturing of neural Precursor Cells
WO2010091226A1 (en) * 2009-02-05 2010-08-12 Resolvyx Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for organ preservation
WO2011049414A2 (ko) * 2009-10-23 2011-04-28 주식회사 알앤엘바이오 지방조직 유래 성체 줄기세포 이동을 유도하는 방법
WO2012012570A2 (en) * 2010-07-20 2012-01-26 University Of Southern California High telomerase activity bone marrow mesenchymal stem cells, methods of producing the same and pharmaceuticals and treatment methods based thereon

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JEONG CHAN RA ET AL.: "Safety of Intravenous Infusion of Human Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells in Animals and Humans", 《STEM CELLS AND DEVELOPMENT》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109790516A (zh) * 2016-07-29 2019-05-21 罗廷灿 制备抑制癌细胞增殖的间充质干细胞的方法
US11788061B2 (en) 2016-07-29 2023-10-17 Jeong Chan Ra Method for producing mesenchymal stem cells that inhibit proliferation of cancer cells
CN107090428A (zh) * 2017-04-25 2017-08-25 徐子雁 自体来源的间充质干细胞向鼻粘膜样上皮细胞分化方法及试剂盒
CN107090428B (zh) * 2017-04-25 2021-05-07 徐子雁 自体来源的间充质干细胞向鼻粘膜样上皮细胞分化方法及试剂盒
TWI715874B (zh) * 2018-09-27 2021-01-11 台灣粒線體應用技術股份有限公司 無血清培養液以及使用此無血清培養液分離和放大培養幹細胞方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP2840133A1 (en) 2015-02-25
AU2013250089B2 (en) 2016-08-18
EP2840133B1 (en) 2017-06-14
BR112014025931A2 (pt) 2017-07-11
ES2640443T3 (es) 2017-11-03
US20150072421A1 (en) 2015-03-12
JP2015514416A (ja) 2015-05-21
AU2013250089A1 (en) 2014-11-06
CN104520423B (zh) 2017-07-04
ZA201407585B (en) 2016-01-27
MX2014012516A (es) 2015-06-23
KR101467480B1 (ko) 2014-12-01
EP2840133A4 (en) 2016-01-06
JP5926447B2 (ja) 2016-05-25
US20210040453A1 (en) 2021-02-11
WO2013157850A1 (ko) 2013-10-24
MX359004B (es) 2018-09-12
KR20130117343A (ko) 2013-10-25
US10815459B2 (en) 2020-10-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104520423A (zh) 用于生产具有适于血管内给药的尺寸的干细胞的方法
KR101523040B1 (ko) 고농도의 줄기세포 제조방법
Tekkatte et al. “Humanized” stem cell culture techniques: the animal serum controversy
AU2002229533B2 (en) Human cord blood derived unrestricted somatic stem cells (ussc)
ES2613930T3 (es) Procedimiento de cultivo de células procedentes de tejido adiposo y sus aplicaciones
CN104755609B (zh) 用于防止干细胞破碎和聚集的方法和组合物
JP6267324B2 (ja) 幹細胞の再生能向上のための培地組成物及びこれを利用した幹細胞の培養方法
AU2002229533A1 (en) Human cord blood derived unrestricted somatic stem cells (ussc)
AU2013206755B2 (en) Activating adipose-derived stem cells for transplantation
CN105377275B (zh) 用于静脉给药的干细胞组合物
CN110840914B (zh) 细胞治疗剂用于缓解或改善血管病变的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CP01 Change in the name or title of a patent holder
CP01 Change in the name or title of a patent holder

Address after: Seoul, South Kerean

Co-patentee after: Luo Tingcan

Patentee after: RBIOCO., LTD.

Address before: Seoul, South Kerean

Co-patentee before: Luo Tingcan

Patentee before: RNL BIO CO., LTD.