WO2013157850A1 - 혈관 내 투여에 적합한 크기를 가지는 줄기세포의 제조방법 - Google Patents

혈관 내 투여에 적합한 크기를 가지는 줄기세포의 제조방법 Download PDF

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WO2013157850A1
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    • C12N2501/39Steroid hormones

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing stem cells having a size suitable for intravascular administration, and more particularly, to a method for producing stem cells having a diameter of 1 to 16 ⁇ m to be suitable for intravascular administration.
  • Stem cells are cells that have the ability of self-replication and differentiate into two or more cells, and include totipotent stem cells, pluripotent stem cells, and multipotent stem cells. can be classified as a multipotent stem cell.
  • Pluripotent stem cells are pluripotent cells that can develop into a complete individual. Cells up to 8-cells after fertilization of eggs and sperm have this property. Transplantation can result in one complete individual.
  • Pluripotent stem cells are cells that can develop into a variety of cells and tissues derived from ectoderm, mesoderm, and endodermal layer.Inner cell masses located inside the blastocyst appearing after 4-5 days of fertilization.
  • Multipotent stem cells are stem cells that can only differentiate into cells specific to the tissues and organs that contain them, as well as the growth and development of individual tissues and organs in the prenatal, neonatal, and adult phases. It is involved in maintaining homeostasis of adult tissues and inducing regeneration in case of tissue damage, and collectively called tissue-specific pluripotent cells are called adult stem cells.
  • stem cells develop cells by collecting cells already present in various organs of the human body, and are characterized by differentiation only into specific tissues. Recently, however, it is noted that experiments using adult stem cells to differentiate into various tissues such as hepatocytes have been successful.
  • stem cells in regenerative medicine, which is a therapy that actively utilizes cells for the regeneration and recovery of biological tissues and organs that are dysfunctional or incompatible with diseases or accidents, stem cells, blood-derived mononuclear cells or Collecting bone marrow-derived monocytes, inducing cell proliferation and / or differentiation in vitro culture, and introducing selected undifferentiated (stem and / or progenitor cells) and / or differentiated cells into the patient's own body by implantation Many methods, including the step of doing so, have been used. As such, it is expected that the use of stem cells will be further enhanced by the anticipated replacement of disease treatments through classical drug treatment or surgical methods with cell and tissue replacement therapy that replaces damaged cells, tissues, and organs with healthy ones.
  • the present inventors are a basal medium; And culturing stem cells in a medium containing at least two components selected from the group consisting of N-acetyl-L-cysteine (NAC), insulin or insulin like factor, hydrocortisone, basic fibroblast growth factor (bFGF) and antioxidants.
  • NAC N-acetyl-L-cysteine
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • An object of the present invention to provide a method for producing a stem cell having a size suitable for intravascular administration.
  • Another object of the present invention to provide a medium for producing a stem cell having a size suitable for intravascular administration.
  • the present invention is a basic medium; And culturing stem cells in a medium containing at least two components selected from the group consisting of N-acetyl-L-cysteine (NAC), insulin or insulin like factor, hydrocortisone, basic fibroblast growth factor (bFGF) and antioxidants. It provides a method for producing a stem cell having a size suitable for intravascular administration, comprising the step.
  • NAC N-acetyl-L-cysteine
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • the present invention also, a basic medium; And a size suitable for vascular administration, containing two or more components selected from the group consisting of N-acetyl-L-cysteine (NAC), insulin or insulin like factor, hydrocortisone, basic fibroblast growth factor (bFGF) and antioxidants It provides a stem cell production medium having a.
  • NAC N-acetyl-L-cysteine
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • 1 is a graph showing the size of fat-derived mesenchymal stem cells according to the culture medium and passage.
  • Figure 2 is a graph showing the expression of markers of adipose derived mesenchymal stem cells according to the culture.
  • stem cell used in the present invention refers to a cell having the ability of self-replicating and differentiating into two or more cells, and an "adult stem cell” refers to each organ of the embryo during the development process. Refers to stem cells appearing in the stage of formation or adulthood.
  • the term “mesenchymal stem cell” is an undifferentiated stem cell isolated from human or mammalian tissue, and may be derived from various tissues.
  • umbilical cord-derived mesenchymal stem cells umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells, bone marrow-derived mesenchymal stem cells, adipose-derived mesenchymal stem cells, muscle-derived mesenchymal stem cells, nerve-derived mesenchymal stem cells, skin-derived mesenchymal stem cells , Amnion derived mesenchymal stem cells and placental derived mesenchymal stem cells, and techniques for isolating stem cells from each tissue are already known in the art.
  • fatty tissue-derived mesenchymal stem cells refers to undifferentiated adult stem cells isolated from adipose tissue, abbreviated herein as “fat-derived adult stem cells,” “fat stem cells,” or “fat. Derived stem cells ”. This can be obtained through conventional methods known in the art, and the separation method can be as follows, for example. In other words, the suspension containing fat suspended in physiological saline obtained from liposuction, and then treated with trypsin of the stem cell layer attached to the culture vessel, such as a flask and recovered or scraped with a scraper to directly float in a small amount of physiological saline. Adipose-derived mesenchymal stem cells can be separated by a method such as recovery.
  • stem cells having a size suitable for intravascular administration means that the stem cells administered into the blood vessel can be easily moved to the target tissue without disturbing the flow or circulation in the bloodstream and exhibit their activity. It refers to stem cells that are smaller than the diameter of capillaries, preferably 11 to 16 ⁇ m in diameter.
  • Stem cells can be administered into the body in a variety of ways, for example, intravenous, intraarterial, or intraperitoneal administration, among which intravenous administration is useful because it is easy and safe to treat the disease without surgery.
  • intravenous administration is useful because it is easy and safe to treat the disease without surgery.
  • the stem cells administered intravenously should be sized for intravascular administration so that the intracellular flow rate does not decrease or form a thrombus.
  • Mesenchymal stem cells that can be derived from a variety of tissues (mesenchymal stem cells), the shape and extent of proliferation vary depending on the patient, its origin, culture conditions and methods, and the size varies from about 10 to 300 ⁇ m in diameter.
  • human post-capillary venules are approximately 10-50 ⁇ m in diameter, small arteries are 8-30 ⁇ m in diameter (Schmidt GT, 1989), and capillaries are 8 ⁇ m in diameter (Schmidt GT , 1989; Chien, 1975; John Ross, 1991; Herbert et al., 1989; Arthur and Guyton, 1997; Renkin, 1989; Gaehtgens, 1980; Row 1979), smaller than normal mesenchymal stem cells.
  • administration of relatively large mesenchymal stem cells intravenously may affect vascular activity.
  • there is a problem that can not only reduce the blood flow rate, but also interrupt the blood circulation, causing disruption of blood flow, clot formation, vascular blockage, and even death.
  • the present invention is to provide a stem cell having a size suitable for intravascular administration so that stem cells administered into the blood vessel can stably exhibit a therapeutic effect without decreasing blood flow rate or forming a blood clot. will be.
  • the present invention in one aspect, basal medium; And culturing stem cells in a medium containing at least two components selected from the group consisting of N-acetyl-L-cysteine (NAC), insulin or insulin like factor, hydrocortisone, basic fibroblast growth factor (bFGF) and antioxidants. It provides a method for producing a stem cell having a size suitable for intravascular administration, comprising the step.
  • NAC N-acetyl-L-cysteine
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • Basal medium used in the present invention refers to a conventional medium having a simple composition known in the art as suitable for stem cell culture.
  • Basic media commonly used for culture include MEM (Minimal Essential Medium), DMEM (Dulbecco modified Eagle Medium), RPMI (Roswell Park Memorial Institute Medium), and K-SFM (Keratinocyte Serum Free Medium). Any medium can be used without limitation.
  • M199 / F12 (mixture) (GIBCO), MEM-alpha medium (GIBCO), low glucose containing DMEM medium (Welgene), MCDB 131 medium (Welgene), IMEM medium (GIBCO), K-SFM, DMEM / It may be selected from the group consisting of F12 medium, PCM medium and MSC expansion medium (Chemicon). In particular, among these, K-SFM medium can be used preferably.
  • the basal medium used to obtain the mesenchymal stem cell culture may be supplemented with additives known in the art, which promote the proliferation of the undifferentiated phenotype of mesenchymal stem cells while inhibiting differentiation.
  • the medium may contain neutral buffers (such as phosphates and / or high concentrations of bicarbonate) and protein nutrients (eg, serums such as FBS, fetal calf serum, horse serum, serum substitutes, albumin, or essential amino acids and non-essentials in isotonic solution).
  • Amino acids such as glutamine, L-glutamine).
  • lipids fatty acids, cholesterol, HDL or LDL extracts of serum
  • other components found in most preservative media of this kind such as insulin or transferrin, nucleosides or nucleotides, pyruvate salts, any ionized form or salt
  • Sugar sources such as glucose, selenium, glucocorticoids such as hydrocortisone and / or reducing agents such as ⁇ -mercaptoethanol.
  • the medium also contains anti-clumping agents, such as those sold by Invitrogen (Cat # 0010057AE), for the purpose of preventing cells from adhering to each other, adhering to the vessel wall, or forming too large a bundle. It can be beneficial to do so.
  • anti-clumping agents such as those sold by Invitrogen (Cat # 0010057AE)
  • SCF Stem cell factor
  • Steel factor other ligands or antibodies that dimerize c-kit
  • other active agents of the same signal transduction pathway SCF, Steel factor
  • tyrosine kinase related receptors such as platelet-Derived Growth Factor (PDGF), macrophage colony-stimulating factor, Flt-3 ligand and Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Ligands for PDGF
  • PDGF platelet-Derived Growth Factor
  • macrophage colony-stimulating factor Flt-3 ligand
  • VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
  • Hematopoietic hair growth factors such as thrombopoietin (TPO)
  • Modified growth factors such as TGF ⁇ 1
  • Neurotropins such as CNTF
  • Antibiotics such as gentamicin, penicillin, streptomycin
  • the medium used in the present invention in addition to the basic medium, at least two selected from the group consisting of N-acetyl-L-cysteine (NAC), insulin or insulin like factor, hydrocortisone, basic fibroblast growth factor (bFGF) and antioxidant It may further contain a component.
  • NAC N-acetyl-L-cysteine
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • insulin-like factor As an alternative to insulin, which enhances glucose metabolism and protein metabolism to promote cell growth.
  • IGF-1 Insulin-like growth factor-1
  • the preferred content of insulin-like factor is 10 to 50 ng / ml. If its component is less than 10 ng / ml, it causes apoptosis, and if it exceeds 50 ng / ml, problems of cytotoxicity and cost increase. There is this.
  • fibroblast growth factor bFGF
  • bFGF fibroblast growth factor
  • the preferred content of fibroblast growth factor is 1 to 100 ng / ml.
  • selenium As antioxidants, selenium (selenium), ascorbic acid, vitamin E, catechin, lycopene, beta carotene, coenzyme Q-10, EPA (eicosapentaenoic acid), DHA (docosahexanoic acid) can be used, and preferably selenium can be used. have.
  • selenium was used as an antioxidant, and the amount of selenium used is preferably 0.5 to 10 ng / ml. At this time, if the content thereof is less than 0.5 ng / ml is sensitive to oxygen toxicity, if it exceeds 10 ng / ml because it causes severe cytotoxicity.
  • the medium used in the present invention may further contain a component selected from the group consisting of FBS (fetal bovin serum), calcium and EGF.
  • FBS fetal bovin serum
  • EGF epidermal growth factor
  • the preferred content of epidermal growth factor is 10 to 50 ng / ml, if the content thereof is less than 10 ng / ml has no particular effect, if it exceeds 50 ng / ml is toxic to the cells.
  • Stem cells cultured in the medium according to the present invention is preferably suitable for intravascular administration because it has a diameter of 11 to 16 ⁇ m.
  • the present invention in another aspect, the base medium; And a size suitable for vascular administration, containing two or more components selected from the group consisting of N-acetyl-L-cysteine (NAC), insulin or insulin like factor, hydrocortisone, basic fibroblast growth factor (bFGF) and antioxidants It provides a stem cell production medium having a.
  • NAC N-acetyl-L-cysteine
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • adipose derived mesenchymal stem cells were cultured in the medium according to the present invention.
  • Adipose-derived mesenchymal stem cells can be obtained by the following method. First, the human adipose tissue obtained from the abdomen by liposuction and the like is separated and washed with PBS, and then the tissue is chopped and digested with DMEM medium containing collagen degrading enzyme, followed by washing with PBS and at 1000 rpm. Centrifuge for 5 minutes. The supernatant is removed and the remaining pellets are washed with PBS and centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes. The suspension was removed using 100 mesh and then washed again with PBS.
  • the production method of the present invention may further comprise the step of treating the stem cells cultured in the medium according to the invention with trypsin.
  • Treatment of trypsin with cultured stem cells yields stem cells in the form of a single cell.
  • trypsin inhibits aggregation between cells, and the cells are treated to have the form of single cells. It can be used as long as it can be used.
  • the production method of the present invention may further comprise the step of suspending the stem cells cultured in the medium according to the present invention in an aspirin-containing solution.
  • Floating the cultured stem cells in aspirin-containing solution is useful because it can prevent the stem cells from being broken or aggregated during transportation or storage. Therefore, the stem cells used for intravascular administration can be used after floating in aspirin-containing saline.
  • Aspirin-containing solution refers to a solution containing an aspirin compound
  • the solvent is preferably a saline solution, but in addition to the base commonly used in the art such as Hartmann-D solution, Phosphate Buffered Saline (PBS) Can be used without
  • the aspirin can be used aspirin-like compounds as well as commercially available aspirin preparations.
  • the amount of the aspirin added is preferably 0.0001 to 0.01 mg / ml. If the amount of aspirin added is higher than that, the survival rate of the cells may decrease, and if less than that, the effect of inhibiting cell aggregation may be insignificant.
  • the adipose tissue isolated from abdominal fat by liposuction was washed with PBS, and then finely chopped the adipose tissue and then subjected to DMEM media containing collagenase type 1 (1mg / ml) for 2 hours at 37 ° C. Tissue was degraded.
  • the collagenase treated tissues were washed with PBS, centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes, the supernatant was removed, the pellet was washed with PBS and centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes. After removing the suspended solids by filtering to 100 mesh, washed with PBS, incubated in DMEM medium with 10% FBS, 2mM NAC (N-acetyl-L-cysteine), 0.2mM ascorbic acid.
  • Adipose-derived mesenchymal stem cells obtained by culturing to passage 3 in Example 1 were seeded in each of the following media and cultured for 5 days. Cell size and cell characteristics were measured on the 5th day of culture.
  • DMEM + FGF DMEM (low-glucose) + 10% FBS + 5 ng / ml FGF
  • the cell size was the smallest in the 'KSFM + additive' culture group, and the cell size of the groups cultured with ⁇ -MEM as the basal was larger than that of the DEME group.
  • the other medium showed a larger cell size of 20 ⁇ m or more as passage was progressed, while maintaining 11 to 16 ⁇ m afterwards (FIG. 1).
  • the positive marker expression of stem cells has no effect on the medium, but the negative marker was treated with DMEM + FGF (%) than cells cultured in the 'KSFM + additive' medium group.
  • the expression rate was higher in the cells of the culture medium group (FIG. 2).
  • Adipose-derived stem cells were cultured in the medium and the 'KSFM + additive' group from which the active ingredients were removed, respectively. After passage up to 3 passages in each of the media, trypsin was treated, and the cell diameter was measured by a confocal microscope.
  • the size of adipose-derived stem cells cultured in a medium containing selenium was 11.6 to 16.5 ⁇ m, but the size of stem cells cultured in a medium containing selenium was 18.1 to 23.9 ⁇ m.
  • stem cells having a diameter of 11 to 16 ⁇ m may be prepared, and thus, stem cells having an excellent stability may be prepared because they can be easily moved to target tissues and have excellent stability. It can be greatly improved.

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Abstract

본 발명은 혈관 내 투여에 적합한 크기를 가지는 줄기세포의 제조방법에 관한 것으로, 바람직하게는 직경이 11 내지 16㎛인 줄기세포의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 혈관 내 투여에 적합한 크기를 가지는 줄기세포 제조용 배지에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 혈관 내 투여에 적합한 크기를 가지는 줄기세포를 제조할 수 있어, 혈관 내로 투여된 줄기세포가 안정적으로 표적 조직에 도달하여 활성을 나타내는 효능을 보다 효율적으로 높일 수 있으므로 줄기세포를 이용한 세포치료 효능을 획기적으로 증진시킬 수 있다.

Description

혈관 내 투여에 적합한 크기를 가지는 줄기세포의 제조방법
본 발명은 혈관 내 투여에 적합한 크기를 가지는 줄기세포의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 혈관 내 투여에 적합하도록 직경이 1 내지 16㎛인 줄기세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.
줄기세포(stem cell)는 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 만능 줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)로 분류할 수 있다. 만능 줄기세포(totipotent stem cell)는 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있는 만능의 성질을 가진 세포로 난자와 정자의 수정 이후 8세포기까지의 세포가 이러한 성질을 가지며 이 세포를 분리하여 자궁에 이식하면 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있다. 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell)는 외배엽, 중배엽, 내배엽층 유래의 다양한 세포와 조직으로 발생할 수 있는 세포로서, 수정 4~5일 후 나타나는 배반포(blastocyst)의 안쪽에 위치한 내세포괴(inner cell mass)에서 유래하며, 이를 배아 줄기 세포라 하며 다양한 다른 조직 세포로 분화되지만 새로운 생명체를 형성하지는 못한다. 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)는 이 세포가 포함되어 있는 조직 및 기관에 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 줄기세포로서, 태아기, 신생아기 및 성체기의 각 조직 및 장기의 성장과 발달은 물론 성체조직의 항상성 유지와 조직손상 시 재생을 유도하는 기능에 관여하고 있으며 조직 특이적 다능성 세포들을 총칭하여 성체 줄기세포라 한다.
성체 줄기세포는 인체의 각종 장기에 이미 존재하는 세포를 채취, 줄기세포를 발전시킨 것으로 특정 조직으로만 분화되는 특징이 있다. 그러나 최근에는 성체 줄기세포를 이용, 간세포 등 각종 여러 조직으로 분화시키는 실험이 성공을 거두고 있어 주목된다. 특히, 병이나 사고에 의한 기능 장애나 부조화에 빠진 생체 조직 및 장기의 재생 및 기능 회복을 위해 세포를 적극적으로 활용하여 실시하는 치료법인 재생 의료에 있어서, 환자 본인으로부터 줄기세포, 혈액 유래 단핵세포 혹은 골수 유래 단핵세포를 수집하는 단계, 시험관 배양으로 세포 증식 및/또는 분화를 유도하는 단계, 및 선택된 미분화(줄기세포 및/또는 전구세포) 및/또는 분화세포를 착상에 의해 환자 자신의 몸에 도입하는 단계를 포함하는 방법이 많이 이용되고 있다. 이처럼, 기존의 고전적인 약물처치나 수술적 방법을 통한 질병치료가 손상된 세포·조직·장기를 건강한 것으로 바꾸는 세포·조직 대체치료법으로 대체될 것으로 예측됨으로써, 줄기세포의 활용도는 더욱 높아지게 될 것이다.
이에, 현재 줄기세포의 다양한 기능이 연구되고 있는 실정이며, 그 중에서도 중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cells)를 이용한 세포치료기술이 각광을 받기 시작하면서, 인체로부터 분리된 중간엽 줄기세포를 치료에 적합하도록 개선하기 위한 기술이 개발되고 있다 (WO 2006/019357, 대한민국 등록특허 제0795708호, 대한민국 등록특허 제0818214호).
그러나, 혈관 내 투여에 적합하도록 줄기세포를 제조하는 방법에 대한 기술은 아직까지 연구가 미흡한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 기본 배지; 및 NAC(N-acetyl-L-cysteine), 인슐린 또는 인슐린 유사인자, 하이드로코르티손, bFGF (basic fibroblast growth factor) 및 항산화제로 구성된 군에서 선택되는 2가지 이상의 성분을 함유하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 경우, 혈관 내 투여에 적합한 크기의 줄기세포를 제조할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 혈관 내 투여에 적합한 크기를 가지는 줄기세포의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 혈관 내 투여에 적합한 크기를 가지는 줄기세포 제조용 배지를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기본배지; 및 NAC(N-acetyl-L-cysteine), 인슐린 또는 인슐린 유사인자, 하이드로코르티손, bFGF (basic fibroblast growth factor) 및 항산화제로 구성된 군에서 선택되는 2가지 이상의 성분을 함유하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 혈관 내 투여에 적합한 크기를 가지는 줄기세포의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 기본배지; 및 NAC(N-acetyl-L-cysteine), 인슐린 또는 인슐린 유사인자, 하이드로코르티손, bFGF (basic fibroblast growth factor) 및 항산화제로 구성된 군에서 선택되는 2가지 이상의 성분을 함유하는, 혈관 내 투여에 적합한 크기를 가지는 줄기세포 제조용 배지를 제공한다.
도 1은 배양액과 계대에 따른 지방유래 중간엽 줄기세포의 크기를 나타낸 그래프이다.
도 2는 배양액에 따른 지방유래 중간엽 줄기세포의 마커발현을 나타내는 그래프이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서 사용하는 용어 “줄기세포(stem cell)”란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, “성체 줄기세포”는 발생과정이 진행되어 배아의 각 장기가 형성되는 단계 혹은 성체단계에서 나타나는 줄기세포를 의미한다.
본 발명에서 사용하는 용어 “중간엽 줄기세포”는 인간 또는 포유류의 조직으로부터 분리해 낸 미분화된 줄기세포로서, 다양한 조직에서 유래할 수 있다. 특히, 제대 유래 중간엽 줄기세포, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포, 골수 유래 중간엽 줄기세포, 지방 유래 중간엽 줄기세포, 근육 유래 중간엽 줄기세포, 신경 유래 중간엽 줄기세포, 피부 유래 중간엽 줄기세포, 양막 유래 중간엽 줄기세포 및 태반 유래 중간엽 줄기세포일 수 있으며, 각 조직에서 줄기세포를 분리하는 기술은 당해 업계에 이미 공지되어 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 “지방 조직 유래 중간엽 줄기세포”란 지방조직에서 분리해 낸 미분화된 성체 줄기세포로서, 본 명세서에 축약하여 “지방 유래 성체 줄기세포”, “지방 줄기세포” 또는 “지방 유래 줄기세포”라고 지칭하기도 한다. 이는 당업계에 공지된 통상의 방법을 통하여 수득할 수 있는데, 그 분리 방법은 예를 들어 다음과 같을 수 있다. 즉, 지방흡입술로부터 얻어지는 생리 식염수에 부유된 지방 함유 suspension을 배양한 다음, 플라스크 등 배양용기에 부착된 줄기세포 층을 트립신으로 처리한 다음 회수하거나, 스크래퍼로 긁어서 소량의 생리 식염수에 부유되는 것을 직접 회수하거나 하는 방법 등을 통해 지방 유래 중간엽 줄기세포를 분리할 수 있다.
본 발명에서 “혈관 내 투여에 적합한 크기를 가지는 줄기세포”란 혈관 내로 투여된 줄기세포가 혈류 내 흐름이나 순환을 방해하지 않으면서 표적 조직으로 용이하게 이동하여 그 활성을 나타낼 수 있도록 직경이 정맥이나 모세혈관의 직경에 비하여 작은, 바람직하게는 직경이 11 내지 16㎛인 줄기세포를 의미한다.
줄기세포는 다양한 방법, 예를 들면, 정맥내, 동맥내 또는 복강내 투여 등의 방법으로 신체 내로 투여될 수 있는데 그 중에서도 정맥 내 투여는 외과적 수술 없이도 간편하면서도 안전하게 질병을 치료할 수 있어 유용하다. 그러나 정맥 내로 투여된 줄기세포가 실제로 표적 부위에 안정적으로 도달하여 목적하는 치료효과를 나타내기 위해서는 여러 가지 요건이 만족되어야 한다. 먼저, 혈관 내로 투여된 줄기세포가 혈류 내 속도를 감소시키거나 혈전을 형성하지 않도록 혈관 내 투여에 적합한 크기여야 한다. 다양한 조직에서 유래될 수 있는 중간엽 줄기세포 (Mesenchymal stem cell)는 환자나 그 유래, 배양 상태나 방법에 따라 형태나 증식 정도가 제각각이며 그 크기도 직경이 약 10 내지 300 ㎛으로 다양하다. 그러나 인간의 후모세관 정맥 (post-capillary venules)은 대략 그 직경이 10 내지 50㎛이며, 소동맥은 직경이 8 내지 30㎛이고 (Schmidt GT, 1989), 모세혈관은 직경이 8㎛ 정도로 (Schmidt GT, 1989; Chien, 1975; John Ross, 1991; Herbert et al., 1989; Arthur and Guyton, 1997; Renkin, 1989; Gaehtgens, 1980; Row 1979), 보통의 중간엽 줄기세포의 직경보다 작다. 따라서, 상대적으로 크기가 큰 중간엽 줄기세포가 정맥 내로 투여되면 혈관 내 활성에 영향을 줄 수 있다. 구체적으로, 혈류 속도를 감소시킬 수 있을 뿐 아니라, 혈액 순환을 방해하여 혈류의 중단, 혈전 형성, 혈관 폐색, 심지어 사망을 유발할 수 있다는 문제점이 있다. 이와 관련하여, 직경이 약 16 내지 53 ㎛인 중간엽 줄기세포를 마우스에 정맥 내 투여시 혈류 속도가 감소되었고, 심근 경색, 혈전 형성의 유발이 관찰되었다는 보고가 있다 (D.Furlani et al. Microvasular Research 77 (2009) 370-376). 따라서, 적합한 크기의 줄기세포를 혈관 내에 투여하는 것이 중요하다. 또한, 혈관 내로 투여되기 전 세포의 파쇄나 응집 (aggregation)이 형성되지 않아야 하며, 혈관 내로 투여된 후에도 단일 세포 (single cell)로서 세포의 파괴나 응집의 형성 없이 표적 부위에 안정적으로 도달하여야 한다. 뿐만 아니라, 표적 부위에 도달한 줄기세포가 목적하는 치료효과를 나타내도록 일정 농도 이상의 세포 투여가 전제되어야 한다. 상기 여러 요건 중, 본 발명은 혈관 내 투여에 적합한 크기를 가져서 혈관 내로 투여된 줄기세포가 혈류 내 속도를 감소시키거나 혈전을 형성함 없이 안정적으로 치료효과를 나타내도록 하기 위한 줄기세포를 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 일 관점에서, 기본 배지; 및 NAC(N-acetyl-L-cysteine), 인슐린 또는 인슐린 유사인자, 하이드로코르티손, bFGF (basic fibroblast growth factor) 및 항산화제로 구성된 군에서 선택되는 2가지 이상의 성분을 함유하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 혈관 내 투여에 적합한 크기를 가지는 줄기세포의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 기본 배지(basal medium)는 당업계에서 줄기세포 배양에 적합하다고 알려져 있는 간단한 조성을 가지는 통상적인 배지를 뜻한다. 일반적으로 배양에 이용되는 기본 배지로는 MEM (Minimal Essential Medium), DMEM (Dulbecco modified Eagle Medium), RPMI (Roswell Park Memorial Institute Medium), K-SFM (Keratinocyte Serum Free Medium)이 있으며, 이 외에도 당해 업계에서 이용되는 배지라면 제한없이 사용할 수 있다. 바람직하게는, M199/F12(mixture)(GIBCO), MEM-alpha배지(GIBCO), 저농도 글루코오스 함유 DMEM배지(Welgene), MCDB 131배지(Welgene), IMEM배지(GIBCO), K-SFM, DMEM/F12 배지, PCM 배지 및 MSC 확장배지 (Chemicon)로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 특히, 이 중에서도 바람직하게는 K-SFM 배지를 사용할 수 있다.
상기 중간엽 줄기세포 배양물의 획득에 사용되는 기본 배지는 당 업계에 공지된, 중간엽 줄기세포의 미분화된 표현형의 증식을 촉진하면서 분화는 억제하는 첨가제로 보충될 수 있다. 또한, 배지는 등장액 중의 중성 완충제(예컨대 인산염 및/또는 고농도 중탄산염) 및 단백질 영양분(예를 들면 혈청, 예컨대 FBS, FCS (fetal calf serum), horse serum, 혈청 대체물, 알부민, 또는 필수 아미노산 및 비필수 아미노산, 예컨대 글루타민, L-글루타민)을 함유할 수 있다. 나아가, 지질(지방산, 콜레스테롤, 혈청의 HDL 또는 LDL 추출물) 및 이 종류의 대부분의 보존액 배지에서 발견되는 기타 성분(예컨대 인슐린 또는 트랜스페린, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드, 피루빈산염, 임의의 이온화 형태 또는 염인 당원, 예컨대 글루코스, 셀레늄, 글루코코르티코이드, 예컨대 히드로코르티존 및/또는 환원제, 예컨대 β-메르캅토에탄올)을 함유할 수 있다.
또한, 배지는 세포가 서로 유착하거나, 용기벽에 유착하거나, 너무 큰 다발을 형성하는 것을 방지할 목적으로, 항응집제 (anti-clumping agent), 예컨대 Invitrogen이 판매하는 것들(Cat# 0010057AE)을 포함하는 것이 유익할 수 있다.
그 중에서도, 하기의 1이상의 추가의 첨가제를 사용하는 것이 유리할 수 있다:
·줄기 세포 인자(SCF, Steel 인자), c-키트를 이량화하는 다른 리간드 또는 항체, 및 동일한 신호 전달 경로의 다른 활성제
·다른 티로신 키나아제 관련 수용체, 예컨대 혈소판-유도된 성장 인자(Platelet-Derived Growth Factor; PDGF), 대식세포 콜로니-자극 인자, Flt-3 리간드 및 혈관 내피 성장 인자(Vascular Endothelial Growth Factor; VEGF)의 수용체를 위한 리간드
·환형 AMP 농도를 높이는 인자, 예컨대 포르스콜린
·gp130을 유도하는 인자, 예컨대 LIF 또는 Oncostatin-M
·조혈모 성장 인자, 예컨대 트롬보포이에틴(TPO)
·변형성 성장 인자, 예컨대 TGFβ1
·뉴로트로핀, 예컨대 CNTF
·항생제, 예컨대 겐타마이신 (gentamicin), 페니실린, 스트렙토마이신
본 발명에서 사용되는 배지는 상기 기본 배지 이외에, NAC(N-acetyl-L-cysteine), 인슐린 또는 인슐린 유사인자, 하이드로코르티손, bFGF (basic fibroblast growth factor) 및 항산화제로 구성된 군에서 선택되는 2가지 이상의 성분을 추가로 함유할 수 있다.
구체적으로, 인슐린을 대체하는 성분으로 인슐린 유사인자를 함유할 수 있는데, 이는 포도당 대사와 단백질 대사를 향상시켜 세포성장을 촉진하는 역할을 한다. 특히 재조합 IGF-1(Insulin-like growth factor-1)을 사용하는 것이 바람직하다. 인슐린 유사인자의 바람직한 함량은 10 내지 50 ng/ml이며, 이의 성분이 10 ng/ml미만일 경우에는 세포자살(Apoptosis)을 초래하며, 50 ng/ml을 초과할 경우에는 세포독성 및 비용증가의 문제점이 있다.
섬유아세포 증식인자 (bFGF)를 함유할 수 있는데, 이는 in vivo 상태에서 다양한 형태의 세포증식을 야기할 수 있으며, 바람직하기로는 재조합 단백질을 사용한다. 섬유아세포 증식인자의 바람직한 함량은 1 내지 100 ng/ml이다.
항산화제로는 셀레늄(selenium), 아스코르브산, 비타민 E, 카테킨, 라이코펜, 베타카로틴, 코엔자임 Q-10, EPA(eicosapentaenoic acid), DHA(docosahexanoic acid) 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 셀레늄을 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 항산화제로서 셀레늄을 사용하였으며, 사용되는 셀레늄의 양은 0.5 내지 10 ng/ml 인 것이 바람직하다. 이때, 이의 함량이 0.5 ng/ml 미만이면 산소독성에 민감하며, 10 ng/ml을 초과하면 심각한 세포독성을 초래하기 때문이다.
본 발명에서 사용되는 배지는 FBS (fetal bovin serum), 칼슘 및 EGF으로 구성된 군에서 선택되는 성분을 추가로 함유할 수 있다. 상피세포 성장인자(Epidermal growth factor; EGF)는 in vivo 상태에서 다양한 형태의 세포증식을 야기할 수 있으며, 바람직하기로는 재조합 단백질을 사용한다. 상피세포 성장인자의 바람직한 함량은 10 내지 50 ng/ml이며, 이의 함량이 10 ng/ml 미만이면 특별한 효과가 없으며, 50ng/ml을 초과하면 세포에 독성을 가진다.
본 발명에 따른 배지에서 배양된 줄기세포는 바람직하게는 11 내지 16㎛의 직경을 가지므로 혈관 내 투여에 적합하다.
따라서 본 발명은 다른 관점에서, 기본배지; 및 NAC(N-acetyl-L-cysteine), 인슐린 또는 인슐린 유사인자, 하이드로코르티손, bFGF (basic fibroblast growth factor) 및 항산화제로 구성된 군에서 선택되는 2가지 이상의 성분을 함유하는, 혈관 내 투여에 적합한 크기를 가지는 줄기세포 제조용 배지를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서는 본 발명에 따른 배지에서 지방 유래 중간엽 줄기세포를 배양하였다. 지방 유래 중간엽 줄기세포는 다음과 같은 방법으로 획득할 수 있다. 우선, 지방흡입술(Liposuction) 등에 의해 복부로부터 얻어진 인간 지방조직을 분리하여 PBS로 세척한 다음, 조직을 잘게 자른 후 콜라겐 분해 효소를 첨가한 DMEM배지를 사용하여 분해 후, PBS로 세척하고 1000 rpm에서 5분간 원심분리 한다. 상층액은 제거하고 바닥에 남은 펠렛은 PBS로 세척한 후 1000 rpm으로 5분간 원심분리 한다. 100 매쉬를 사용하여 부유물을 제거한 다음, PBS로 다시 세척하였다. DMEM(10% FBS. 2 mM NAC, 0.2 mM 아스코르브산)배지에서 배양하고, 하룻밤 지난 후 배양용기 바닥에 부착되지 않은 세포들은 PBS로 세척하고, NAC, 아스코르브산, 칼슘, rEGF, 인슐린 및 하이드로코티손을 함유한 K-SFM 배지를 2일마다 교체하면서 배양하여 중간엽 줄기세포를 분리하여 계대 배양하여 중간엽 줄기세포를 얻을 수 있다. 그러나 이 외에도 당업계에 공지된 방법으로 중간엽 줄기세포를 얻을 수 있다.
본 발명의 제조방법은, 본 발명에 따른 배지에서 배양된 줄기세포를 트립신으로 처리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 배양된 줄기세포에 트립신을 처리하면 단세포 형태의 줄기세포를 얻을 수 있는데, 이때 트립신은 세포 간의 응집을 억제하여 세포가 단세포 (single cell)의 형태를 갖도록 처리되는 것으로, 세포 간의 응집 형성을 억제할 수 있는 물질이면 대체하여 사용할 수 있다.
본 발명의 제조방법은, 본 발명에 따른 배지에서 배양된 줄기세포를 아스피린 함유 용액에 부유시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 배양된 줄기세포를 아스피린 함유 용액에서 부유시키면 이송이나 보관 중 줄기세포가 파쇄되거나 응집되는 것을 방지할 수 있으므로 유용하다. 따라서, 혈관 내 투여시 사용되는 줄기세포는 아스피린 함유 생리식염수에 부유시킨 후 이용할 수 있다. 아스피린 함유 용액은 아스피린 화합물을 함유하는 용액을 의미하는 것으로, 용매는 바람직하게는 생리식염수를 사용할 수 있으나 그 외에도 하트만-D 용액, PBS(Phosphate Buffered Saline) 등 당업계에서 일반적으로 사용하는 기제라면 제한없이 사용할 수 있다. 상기 아스피린은 통상 시판되고 있는 아스피린 제제뿐 아니라 아스피린 유사 화합물을 사용할 수 있다. 상기 첨가되는 아스피린의 함량은 0.0001 내지 0.01 mg/ml인 것이 바람직하다. 첨가되는 아스피린의 양이 그보다 많으면 세포의 생존율이 감소할 수 있으며, 그보다 적으면 세포 응집 억제의 효과가 미비할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 인간 지방조직 유래 중간엽 줄기세포 분리
지방흡입술(Liposuction)에 의해 복부지방으로부터 분리된 지방조직을 PBS로 세척한 다음, 지방조직을 잘게 자른 후 콜라게나아제 타입 1 (1mg/ml)을 첨가한 DMEM media를 이용해 37℃에서 2시간 동안 조직을 분해시켰다. 콜라게나아제 처리된 조직을 PBS로 세척 후 1000rpm에서 5분간 원심분리 하여, 상층액을 제거하고, 펠렛을 PBS로 세척한 후 1000rpm으로 5분간 원심분리하였다. 100 mesh에 필터링하여 부유물을 제거한 후 PBS로 세척하고, 10% FBS, 2mM NAC(N-acetyl-L-cysteine), 0.2mM 아스코르브산이 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다.
하룻밤 지난 후 부착되지 않은 세포들은 PBS로 세척하고, 5% FBS, 2mM NAC, 0.2mM 아스코르브산, 0.09mM 칼슘, 5ng/ml rEGF, 5ng/ml 인슐린, 10 ng bFGF 및 74ng/ml 하이드로코르티손 및 1ng/ml의 셀레늄(selenium)을 함유한 K-SFM(Keratinocyte Serum Free Medium)을 2일마다 교체하면서 계대배양하였으며, 3계대 배양하여 지방 유래 중간엽 줄기세포를 분리하였다.
실시예 1에서 3 계대까지 배양하여 얻은 지방 유래 중간엽 줄기세포를 하기의 각 배지에 seeding하고 5일에 걸쳐 배양하였다. 5일의 배양일에 세포의 크기와 세포 특성을 측정하였다.
배지 조성
1) KSFM+첨가물: K-SFM + FBS + NAC + 아스코브루산 + 칼슘 + rEGF
+ 인슐린 + bFGF + 하이드로코르티손 + 셀레늄
2) DMEM+FGF: DMEM(low-glucose) + 10 % FBS + 5 ng/ml FGF
3) α-MEM+FGF: α-MEM + 10 % FBS + 5 ng/ml FGF
표 1 배지 조성에 따른 세포 크기 (㎛)
Passage 2 Passage 3 Passage 4
KSFM + 첨가물 14±2.0 13.8±2.2 14.1±2.4
DMEM + FGF 20±1.7 21.8±1.4 22.1±1.8
α-MEM+FGF 20.3±2.1 19.2±1.8 22.0±1.9
세포의 크기는 ‘KSFM+첨가물’ 배양군의 세포가 가장 작았고, α-MEM을 basal로 하여 배양한 군들의 세포 크기가 DEME 군보다 세포 크기의 변화가 컸다.‘KSFM+첨가물’군의 세포는 계대를 거쳐도 11 ~ 16㎛을 유지하는 것에 반해, 타배지군들은 계대가 진행될수록 20㎛ 이상의 큰 세포 크기를 나타냈다 (도 1).
상기 조건의 배양 배지로부터 얻은 계대 4 지방 유래 중간엽 줄기세포를 FACS 측정하여 세포 특성을 확인하였다.
표 2
KSFM+첨가물 DMEM+FGF α-MEM+FGF
CD 29 99.0% 99.4% 99.9%
CD 90 99.7% 99.6% 99.6%
CD 31 0.1% 4.2% 0.5%
CD 34 0.0% 2.3% 0.2%
CD 45 0.1% 4.2% 2.1%
상기 배지로부터 얻은 지방 중간엽 줄기세포의 특성을 확인 한 결과, 줄기세포의 positive 마커 발현에는 배지에 대한 영향이 없으나 negative 마커는 ‘KSFM+첨가물’ 배지군에서 배양한 세포보다 DMEM + FGF(%)처리된 배양 배지군의 세포에서 발현률이 좀 더 높았다 (도 2).
실시예 1에서 분리된 줄기세포를 SEM(Scanning Electron Microscopy)으로 관찰하여 측정한 결과, 대부분의 줄기세포가 약 11 내지 16㎛의 직경을 가지며, 세포 간 응집이 형성되지 않음을 확인할 수 있었다.
실시예 2. Small size 줄기세포 제조용 배지성분의 탐색
실시예 1에서 사용된 K-SFM 배지에 첨가되는 활성성분인 FBS, NAC, 아스코르브산, 칼슘, rEGF, 5ng/ml 인슐린, bFGF, 하이드로코르티손 및 셀레늄(selenium) 중 하나씩을 제거한 배지를 제조하고, 상기 활성성분이 각각 제거된 배지 및 ‘KSFM+첨가물’ 군에서 지방 유래 줄기세포를 배양하였다. 상기 각각의 배지에서 3 passage까지 계대한 후 트립신을 처리한 뒤 공초점 현미경 (confocal microscope)으로 세포 직경을 측정하였다. 그 결과 셀레늄이 포함된 배지에 배양된 지방 유래 줄기세포의 크기는 11.6 ~ 16.5㎛ 였으나, 셀레늄이 제거된 배지에서 배양한 줄기세포 크기는 18.1 ~ 23.9㎛인 것을 확인할 수 있었다.
본 발명에 따르면, 직경이 11 내지 16㎛인 줄기세포를 제조할 수 있어, 표적 조직으로의 이동이 용이하며 안정성이 우수한 줄기세포를 제조할 수 있으므로 줄기세포의 혈관 내 투여에 의한 세포치료 효능을 획기적으로 증진시킬 수 있다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (17)

  1. 기본 배지; 및 NAC(N-acetyl-L-cysteine), 인슐린 또는 인슐린 유사인자, 하이드로코르티손, bFGF (basic fibroblast growth factor) 및 항산화제로 구성된 군에서 선택되는 2가지 이상의 성분을 함유하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 혈관 내 투여에 적합한 크기를 가지는 줄기세포의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 기본 배지는 M199/F12(mixture)(GIBCO), MEM-alpha배지(α-Minimal Essential Medium: Welgene), 저농도 글루코오스 함유 DMEM배지(Welgene), MCDB 131배지(Welgene), IMEM배지(GIBCO), K-SFM, DMEM/F12 배지, PCM 배지 및 MSC 확장 배지 (Chemicon)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 혈관 내 투여에 적합한 크기를 가지는 줄기세포의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항산화제는 셀레늄, 아스코르브산, 비타민 E, 카테킨, 라이코펜, 베타카로틴, 코엔자임 Q-10, EPA(eicosapentaenoic acid) 및 DHA(docosahexanoic acid)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 혈관 내 투여에 적합한 크기를 가지는 줄기세포의 제조방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 항산화제는 셀레늄인 것을 특징으로 하는 혈관 내 투여에 적합한 크기를 가지는 줄기세포의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 배지는 FBS (fetal bovin serum), 칼슘 및 EGF으로 구성된 군에서 선택되는 성분을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 혈관 내 투여에 적합한 크기를 가지는 줄기세포의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 배양된 줄기세포를 트립신으로 처리하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 혈관 내 투여에 적합한 크기를 가지는 줄기세포의 제조방법.
  7. 제1항 또는 제6항에 있어서, 배양된 줄기세포를 아스피린 함유 용액에 부유시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 혈관 내 투여에 적합한 크기를 가지는 줄기세포의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 혈관 내 투여에 적합한 크기를 가지는 줄기세포는 직경이 11 내지 16㎛인 것을 특징으로 하는 혈관 내 투여에 적합한 크기를 가지는 줄기세포의 제조방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 성체 줄기세포인 것을 특징으로 하는 혈관 내 투여에 적합한 크기를 가지는 줄기세포의 제조방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 줄기세포는 지방 조직 유래 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 혈관 내 투여에 적합한 크기를 가지는 줄기세포의 제조방법.
  11. 기본배지; 및 NAC(N-acetyl-L-cysteine), 인슐린 또는 인슐린 유사인자, 하이드로코르티손, bFGF (basic fibroblast growth factor) 및 항산화제로 구성된 군에서 선택되는 2가지 이상의 성분을 함유하는, 혈관 내 투여에 적합한 크기를 가지는 줄기세포 제조용 배지.
  12. 제11항에 있어서, 상기 기본 배지는 M199/F12(mixture)(GIBCO), MEM-alpha배지(α-Minimal Essential Medium: Welgene), 저농도 글루코오스 함유 DMEM배지(Dulbecco modified Eagle Medium: Welgene), MCDB 131배지(Welgene), IMEM배지(GIBCO), K-SFM, DMEM/F12 배지, PCM 배지 및 MSC 확장 배지 (Chemicon)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 혈관 내 투여에 적합한 크기를 가지는 줄기세포 제조용 배지.
  13. 제11항에 있어서, 상기 항산화제는 셀레늄, 아스코르브산, 비타민 E, 카테킨, 라이코펜, 베타카로틴, 코엔자임 Q-10, EPA(eicosapentaenoic acid) 및 DHA(docosahexanoic acid)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 혈관 내 투여에 적합한 크기를 가지는 줄기세포 제조용 배지.
  14. 제11항에 있어서, 상기 항산화제는 셀레늄인 것을 특징으로 하는 혈관 내 투여에 적합한 크기를 가지는 줄기세포 제조용 배지.
  15. 제11항에 있어서, 상기 배지는 FBS (fetal bovin serum), 칼슘 및 EGF으로 구성된 군에서 선택되는 성분을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 혈관 내 투여에 적합한 크기를 가지는 줄기세포 제조용 배지.
  16. 제11항에 있어서, 상기 줄기세포는 성체 줄기세포인 것을 특징으로 하는 혈관 내 투여에 적합한 크기를 가지는 줄기세포 제조용 배지.
  17. 제16항에 있어서, 상기 줄기세포는 지방 조직 유래 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 혈관 내 투여에 적합한 크기를 가지는 줄기세포 제조용 배지.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017532973A (ja) * 2014-10-29 2017-11-09 アール バイオ カンパニー リミテッドR Bio Co., Ltd. 幹細胞培養のための培地組成物
CN117946969A (zh) * 2024-03-27 2024-04-30 内蒙古医科大学附属医院(内蒙古自治区心血管研究所) 一种具有比对功能的间充质干细胞培养基及其工作方法

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2811015B1 (en) * 2011-12-01 2020-09-02 R Bio Co., Ltd. Culture-medium composition for rejuvenating stem cells
US10894947B1 (en) * 2016-04-29 2021-01-19 Hope Biosciences, Llc Method for generating protein rich conditioned medium
KR101648915B1 (ko) * 2016-05-16 2016-08-17 주식회사 디지레이 줄기세포의 응집방지 방법 및 그 조성물
JP6918943B2 (ja) * 2016-07-29 2021-08-11 ラ,チョンチャン 癌細胞の増殖を抑制する間葉幹細胞の製造方法
CN107090428B (zh) * 2017-04-25 2021-05-07 徐子雁 自体来源的间充质干细胞向鼻粘膜样上皮细胞分化方法及试剂盒
CN109423473A (zh) * 2017-08-21 2019-03-05 青岛瑞思德生物科技有限公司 用于制备胎盘干细胞的试剂盒
CN109423476A (zh) * 2017-08-21 2019-03-05 青岛瑞思德生物科技有限公司 用于制备脂肪间充质干细胞的试剂盒
TWI715874B (zh) * 2018-09-27 2021-01-11 台灣粒線體應用技術股份有限公司 無血清培養液以及使用此無血清培養液分離和放大培養幹細胞方法
KR102233568B1 (ko) * 2019-12-13 2021-03-30 주식회사 알바이오 항암 바이러스가 도입된 중간엽 줄기세포의 세포 생존능을 향상시키는 방법

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6103530A (en) * 1997-09-05 2000-08-15 Cytotherapeutics, Inc. Cultures of human CNS neural stem cells
WO2006019357A1 (en) 2004-08-16 2006-02-23 Cellresearch Corporation Pte Ltd Isolation of stem/progenitor cells from amniotic membrane of umbilical cord.
KR100795708B1 (ko) 2006-12-26 2008-01-17 주식회사 알앤엘바이오 인간 양막 상피세포 유래 성체 줄기세포의 분리 및 배양방법
KR100818214B1 (ko) 2006-09-29 2008-04-01 재단법인서울대학교산학협력재단 인간 태반조직의 양막 또는 탈락막 유래 다분화능 줄기세포및 그 제조방법
KR20080075959A (ko) * 2007-02-14 2008-08-20 (주)프로스테믹스 지방 줄기세포의 조직 재생 능력을 최적화한 배양액을 함유한 조직 재생용 주사제 조성물
US20090124007A1 (en) * 2006-11-15 2009-05-14 Seoul National University Industry Foundation Method for the Simultaneous Primary-Isolation and Expansion of Endothelial Stem/Progenitor Cell and Mesenchymal Stem Cell Derived From Mammal Including Human Umbilical Cord
US20090233360A1 (en) * 2008-03-17 2009-09-17 Uti Limited Partnership Methods and Compositions for Culturing of neural Precursor Cells
US20110312091A1 (en) * 2008-12-17 2011-12-22 Baona Zhao Pluripotent stem cells, method for preparation thereof and uses thereof

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007044418A2 (en) * 2005-10-06 2007-04-19 Moscatello David K Cell culture media, kits and methods of use
KR100679642B1 (ko) * 2005-11-16 2007-02-06 주식회사 알앤엘바이오 인간 지방조직 유래 다분화능 줄기세포 및 이를 함유하는세포치료제
JP2008212022A (ja) 2007-03-01 2008-09-18 Olympus Corp 組織由来幹細胞の分離装置および分離方法
CN101765657A (zh) 2007-11-09 2010-06-30 Rnl生物技术株式会社 分离和培养来自人羊膜上皮细胞的成人干细胞的方法
EP2393353A4 (en) * 2009-02-05 2013-12-25 Resolvyx Pharmaceuticals Inc COMPOSITIONS AND METHODS OF ORGAN CONSERVATION
US20120263685A1 (en) * 2009-10-08 2012-10-18 Rnl Bio Co., Ltd Anti-tumor composition comprising human-derived adult stem cells
EP2511365A4 (en) * 2009-10-23 2013-07-03 Rnl Bio Co Ltd METHOD FOR INDUCING MIGRATION OF ADULT STEM CELLS DERIVED FROM ADIPOSE TISSUE
KR101211913B1 (ko) 2010-07-16 2012-12-13 주식회사 알앤엘바이오 양막유래 중간엽 줄기세포 배양을 위한 배지조성물 및 이를 이용한 양막유래 중간엽 줄기세포의 배양방법
ES2712709T3 (es) 2010-07-20 2019-05-14 Univ Southern California Células madre mesenquimales de médula ósea con telomerasa de alta actividad, métodos de producción de las mismas y productos farmacéuticos y métodos de tratamiento basados en las mismas
KR20120057784A (ko) * 2010-11-29 2012-06-07 주식회사 알앤엘바이오 줄기세포의 안정성 증진용 조성물
EP2811015B1 (en) 2011-12-01 2020-09-02 R Bio Co., Ltd. Culture-medium composition for rejuvenating stem cells
CN104755609B (zh) * 2012-04-13 2017-09-05 R生物有限公司 用于防止干细胞破碎和聚集的方法和组合物
KR101523040B1 (ko) 2012-06-26 2015-05-26 라정찬 고농도의 줄기세포 제조방법

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6103530A (en) * 1997-09-05 2000-08-15 Cytotherapeutics, Inc. Cultures of human CNS neural stem cells
WO2006019357A1 (en) 2004-08-16 2006-02-23 Cellresearch Corporation Pte Ltd Isolation of stem/progenitor cells from amniotic membrane of umbilical cord.
KR100818214B1 (ko) 2006-09-29 2008-04-01 재단법인서울대학교산학협력재단 인간 태반조직의 양막 또는 탈락막 유래 다분화능 줄기세포및 그 제조방법
US20090124007A1 (en) * 2006-11-15 2009-05-14 Seoul National University Industry Foundation Method for the Simultaneous Primary-Isolation and Expansion of Endothelial Stem/Progenitor Cell and Mesenchymal Stem Cell Derived From Mammal Including Human Umbilical Cord
KR100795708B1 (ko) 2006-12-26 2008-01-17 주식회사 알앤엘바이오 인간 양막 상피세포 유래 성체 줄기세포의 분리 및 배양방법
KR20080075959A (ko) * 2007-02-14 2008-08-20 (주)프로스테믹스 지방 줄기세포의 조직 재생 능력을 최적화한 배양액을 함유한 조직 재생용 주사제 조성물
US20090233360A1 (en) * 2008-03-17 2009-09-17 Uti Limited Partnership Methods and Compositions for Culturing of neural Precursor Cells
US20110312091A1 (en) * 2008-12-17 2011-12-22 Baona Zhao Pluripotent stem cells, method for preparation thereof and uses thereof

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
D. FURLANI ET AL., MICROVASULAR RESEARCH, vol. 77, 2009, pages 370 - 376
See also references of EP2840133A4 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017532973A (ja) * 2014-10-29 2017-11-09 アール バイオ カンパニー リミテッドR Bio Co., Ltd. 幹細胞培養のための培地組成物
CN117946969A (zh) * 2024-03-27 2024-04-30 内蒙古医科大学附属医院(内蒙古自治区心血管研究所) 一种具有比对功能的间充质干细胞培养基及其工作方法

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