ES2581990T3 - Método para el aislamiento y cultivo de células madre adultas derivadas del epitelio amniótico humano - Google Patents
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Abstract
Un método para aislar las células epiteliales amnióticas, que comprende las etapas de: tratar el tejido amniótico humano de la placenta recolectado inmediatamente después del parto con ditiotreitol (DTT) 5-50 mM; tratar el tejido amniótico humano tratado con DTT con 0,025-0,125% de tripsina, y aislar las células epiteliales amnióticas del tejido amniótico.
Description
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encontraron que, cuando el medio DMEM se reemplazó por el medio K-SFM, la habilidad de las células madre adultas para proliferar aumentó adicionalmente en comparación a cuando únicamente se utilizó continuamente (no reemplazados) el medio DMEM o K-SFM (Figura 8). En este proceso, el reemplazo del medio DMEM por el medio K-SFM se realiza preferiblemente en el subcultivo primario de las células madre adultas.
Sin embargo, el medio de cultivo para las células madre adultas derivadas de células epiteliales amnióticas es muy preferiblemente un medio mixto (Gibco) que consiste en una mezcla 1:1 de DMEM y F-12 (mezcla nutriente). En este momento, el medio mixto puede también contener ácido ascórbico, factor de crecimiento epidérmico (EGF), insulina, antibióticos y FBS (suero fetal bovino). En una realización de la presente invención, se utilizaron antimicóticos-antibióticos (Gibco) como antibióticos.
En la presente invención, las células epiteliales amnióticas simples aisladas ser cultivaron principalmente en un medio que contiene el inhibidor de ROCK (cinasa asociada a Rho) para obtener células madre adultas, y luego ser suibcultivaron en presencia del inhibidor de ROCK, de manera que las células madre adultas son mantenidas en un estado no diferenciado.
El inhibidor de ROCK (cinasa asociada a Rho), que es una sustancia que funciona inhibiendo la apoptosis, se sabe que inhibe la sensibilización con Ca2+ inducida por agonista de la regeneración de neuritas, la fosforilación de la miosina y la contracción del músculo liso. Más específicamente, se sabe que el inhibidor de ROCK normaliza la estructura anormal de las células musculares que provocan la hipertensión y el asma, y tiene la función de incrementar el flujo sanguíneo al disco óptico, y reducir continuamente la presión intraocular. Con respecto a las propiedades biológicas, se sabe que el inhibidor de ROCK tiene la función de inhibir la apoptosis y mantener las células en un estado no diferenciado. Recientemente, se llevaron a cabo estudios sobre el uso del inhibidor de ROCK para incrementar la viabilidad de las células madre embrionarias humanas aisladas (Watanabe et al., Nature Biotechnology, 25:681, 2007).
Sin embargo, es obvio para aquellos expertos en la técnica que las células madre embrionarias y las células madre adultas son claramente distinguidas una de la otra, de modo que las fuentes y las habilidades de diferenciación de las mismas difieren claramente una de la otra. No ha existido ningún reporte que confirme que la proliferación de las células madre adultas se incrementan por el uso de un inhibidor de ROCK. Sin embargo, en la presente invención se confirmó que la habilidad de las células madre adultas para proliferar aumentó por un inhibidor de ROCK en el aislamiento y cultivo de las mismas, y también la eficiencia de la proliferación del mantenimiento de las células madre adultas derivadas de células epiteliales amnióticas aumentó adicionalmente por el inhibidor de ROCK.
En el estudio anterior, conducido por Watanabe et al., se utilizó un método de tratamiento de las células madre embrionarias con un inhibidor de ROCK antes de volver a sembrar las células en un medio reciente para el subcultivo. Específicamente, después de que las células madre embrionarias tratadas con el inhibidor de ROCK se sembraron nuevamente sobre un medio reciente, éstas se cultivaron sin tratamiento con el inhibidor de ROCK (Watanabe et al., Nature Biotechnology, 25:681, 2007).
Por otra parte, en la presente invención, un inhibidor de ROCK fue tratado para las células como resiembras para un medio reciente para el subcultivo, estableciendo de este modo un ambiente en el cual el inhibidor de ROCK estuvo continuamente presente durante el subcultivo de las células madre adultas derivadas de células epiteliales amnióticas humanas.
Los inhibidores de ROCK típicos que pueden ser utilizados en la presente invención incluyen Y-27632, HA-1077, Y39983, Wf-536, etc., y entre ellos, se utilizó Y-27632 (Calbiochem o Sigma) en realizaciones ejemplares de la presente invención. Y-27632 tiene la siguiente fórmula estructural 2:
[Fórmula Estructural 2]
La concentración del inhibidor de ROCK que se utiliza en el tratamiento de acuerdo con la presente invención está preferiblemente en el intervalo de 10 nM a 100 M. Si el inhibidor de ROCK es utilizado en la concentración de menos de 10 nM, será difícil de mantener en un estado no diferenciado de las células madre adultas por un periodo prolongado de tiempo, y si el inhibidor de ROCK es utilizado a una concentración mayor de 100 M, puede ocurrir un cambio en la morfología celular, y las células pueden entrar al proceso de diferenciación.
Se describen además las células madre adultas derivadas de células epiteliales amnióticas obtenidas mediante el método como se describe anteriormente. Las características morfológicas e inmunitarias de las células madre
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adultas derivadas de células epiteliales amnióticas, obtenidas mediante el método como se describe anteriormente, serán ahora descritas como sigue:
- (1)
- Características morfológicas
Las células epiteliales amnióticas simples aisladas del tejido amniótico tienen la morfología típica de células epiteliales rectangulares paralelepipédicas o en forma de dado, ligeramente redondeadas, y el tamaño de las células durante el cultivo de aproximadamente 5-10 m. En general, las células epiteliales amnióticas se incrementan en tamaño dependiendo de las condiciones de cultivo, mientras que el citosol se incrementa, con lo cual provoca cambio trofoblástico, o es probable que éstas sufran deformaciones asociadas con la transición epiteliomesenquimatosa mediante el cual las células epiteliales sufren cambios morfológicos dramáticos en el tipo de células madre mesenquimatosas (MSC) (Figura 12). Sin embargo, en la presente invención, las células madre adultas derivadas de células epiteliales amnióticas tratadas con DTT y cultivadas en un medio que contiene el inhibidor de ROCK mantienen continuamente una forma cuboidal simple (la fotografía de la parte más baja de la Figura 12).
- (2)
- Características inmunológicas
Las características inmunológicas de las células madre adultas derivadas de células epiteliales amnióticas de acuerdo con la presente invención se analizaron utilizando un citómetro de flujo y, como resultado, las células fueron positivas para CD9, CD29, CD49f, CD73, CD90 y CD105, y negativas para CD31, CD34, CD45 y CD133 (Figuras 9 y 10).
- (3)
- Estaminalidad
Se encontró que, en las células madre adultas derivadas de células epiteliales amnióticas de la presente invención, fueron expresadas la citoqueratina y la (E)-cadherina epitelial, que indica las características de las células epiteliales, y también fueron expresados SSEA 4, Oct-4, Tra-1-60 y Tra-1-81, que son conocidos como marcadores de las células madre totipotentes (Figura 11).
Además, con respecto a la habilidad de diferenciación de las células madre, las células epiteliales amnióticas tienen características más similares a aquellas de las células madre embrionarias como ya son conocidas en la técnica, y de este modo las células madre adultas de la invención derivadas de las células epiteliales amnióticas tienen también habilidad de diferenciación similar a aquellas de las células madre embrionarias, es decir, la habilidad para diferenciarse en células derivadas del endodermo, del mesodermo y del ectodermo. En el presente Ejemplo 6, se confirmó la habilidad de las células madre adultas de la invención para diferenciarse en adipocitos, osteoblastos y miocitos derivados del mesodermo, y neurocitos derivados del ectodermo.
Se describe además un agente terapéutico celular para tratar heridas en el cuerpo y sobre la superficie del cuerpo, que contiene células madre adultas como un ingrediente activo.
Como se utiliza en la presente, el término “herida” significa un daño corporal provocado por medios físicos que dan como resultado la perturbación de la continuidad de las estructuras y se entiende que incluye la destrucción, corte o ruptura, etc., de la piel, la mucosa o el tejido óseo.
El agente terapéutico celular para tratar heridas, que contiene células madre adultas como un ingrediente activo, puede ser administrado directamente al sitio de la enfermedad, además de la administración parenteral en la forma de inyecciones intravenosas o intramusculares. El agente terapéutico celular puede ser administrado mediante diversas rutas, incluyendo las rutas transdérmicas, subcutáneas, intravenosa e intramuscular.
Las formulaciones para la administración parenteral incluyen disoluciones o suspensiones, emulsiones, etc., acuosas o no acuosas, estériles. Para las disoluciones y sus suspensiones no acuosas, pueden ser utilizados propilenglicol, polietilenglicol, aceite vegetal, tal como aceite de oliva, ésteres inyectables tales como oleato de etilo,
o similares.
Para los seres humanos, el agente terapéutico celular puede ser administrado, en general a una dosis de 104-1010 células/cuerpo, y preferiblemente 106-108 células/cuerpo, una vez o varias veces al día.
No obstante, se debe entender que la dosis efectiva de los ingredientes activos debe ser determinada por diversos factores relacionados, tales como la ruta de administración, la enfermedad o padecimiento que va a ser tratado, la edad, género, y peso del paciente, y la severidad de la enfermedad. De este modo, los intervalos de dosis anteriormente mencionados de los ingredientes activos no limitan el alcance de la presente invención de ninguna manera.
Las células madre adultas pueden ser ventajosamente utilizadas para reparación de tejidos y sanado de heridas. Las células madre adultas derivadas de células epiteliales amnióticas que poseen características similares a aquellas de las células madre embrionarias tienen la habilidad para diferenciarse en células endodérmicas, mesodérmicas y ectodérmicas, y de este modo pueden ser utilizadas para el sanado de heridas y reparación y
regeneración de tejidos. Además, las células madre adultas pueden diferenciarse, y proliferar y regenerarse dentro del hueso, cartílago, músculo, ligamentos y/o tejidos nerviosos, y de este modo son útiles como un agente terapéutico celular.
Ejemplos
5 De aquí en adelante, la presente invención será descrita con detalle adicional con referencia a los ejemplos. Se debe entender, no obstante, que estos ejemplos son para fines ilustrativos únicamente y no deben ser considerados como limitantes del alcance de la presente invención.
Diversos medios y reactivos utilizados en los siguientes ejemplos se adquirieron de las compañías mostradas en la Tabla 1 siguiente.
10 Tabla 1
- Artículos
- Marcas Catálogo No.
- Medio
- DMEM/F-12 Gibco 11320
- EGF
- Sigma E9644
- Peprotech
- 100-15
- Gibco
- 13247-051
- FBS
- Gibco 16000
- Insulina
- Sigma 11882
- Acido ascórbico
- Sigma A 8960
- Antibiótico-antimicótico
- Gibco 15240
- inhibidor de ROCK
- Y-27632 Calbiochem CNB 688000
- Sigma
- Y0503
- Solución de Tripsina
- Tripsina-EDTA Gibco 15400
- L/G DMEM
- Gibco 11885
- Disolución amortiguadora
- HBSS Gibco 14175
- Subcultivo
- TrypLE-Express Gibco 12604
- DTT
- DTT
- Gibco 15508-013
Ejemplo 1: Aislamiento de las células epiteliales amnióticas a partir de tejido amniótico mediante tratamientocon DTT (ditiotreitol) y tripsina
Las membranas amnióticas se recolectaron en los partos normales y en partos prematuros en el Hospital Guro de la
15 Universidad de Corea de acuerdo con las normas del Consejo de Revisión Institucional de la Universidad de Corea, y se utilizaron para fines de investigación. El tejido amniótico requerido en los experimentos se aisló de la placenta, y el tejido aislado se almacenó en una disolución salina fisiológica que contenía antibiótico, o en medio DMEM.
Se pesaron 5 g de tejido amniótico y se lavaron con HBSS. Para el aislamiento estable de las células epiteliales amnióticas, el proceso de lavado fue llevado a cabo utilizando amortiguador HBSS, más similar a los constituyentes 20 del cuerpo humano en vez de utilizar PBS general. El tejido amniótico lavado se transfirió a un tubo de 50 ml, y se le añadió DTT 10 mM. Después del tratamiento con DTT durante 30 minutos, el sobrenadante se descartó, el tejido amniótico se cortó finamente, y el tejido amniótico finamente cortado se trató con 0,05% de tripsina-EDTA reciente a 37ºC durante 42 minutos bajo agitación, degradando de este modo químicamente el tejido. El tejido químicamente degradado se agitó en torbellino durante 1 minuto, y luego se filtró principalmente a través de una malla de 1 mm y
25 secundariamente se filtró a través de una malla de 100 m, eliminando así tejido no degradado. El tejido filtrado se centrifugó a 1800 rpm durante 10 minutos. Los peletes de células individuales en el fondo se suspendieron perfectamente, obteniendo de este modo las células epiteliales amnióticas.
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concentración preferida del inhibidor de ROCK estuvo en el intervalo de 10 nM a 100 M, y la concentración más preferida fue aproximadamente 10 M.
Ejemplo Comparativo 1: Efecto de la adición del inhibidor ROCK sobre la promoción de la proliferación de células madre
Con el fin de examinar el efecto del inhibidor de ROCK, 4 x 106 células epiteliales amnióticas obtenidas en el Ejemplo 1 se subcultivaron en un medio DMEM/F-12 que contenía FBS, ácido ascórbico, factor de crecimiento epidérmico, insulina y un antibiótico, durante 4 días. Luego, las células se sembraron en cada uno de un medio que contenía 10 M del inhibidor de ROCK Y-27632 y un medio que no contenía el inhibidor de ROCK, y se observaron 1 día, 2 días, y 3 días después de la siembra.
Como resultado, como se puede observar en la Figura 5, cuando las células epiteliales amnióticas obtenidas se cultivaron en ausencia del inhibidor de ROCK, la proliferación de las células madre adultas fue muy lenta debido a la apoptosis. Sin embargo, cuando las células epiteliales amnióticas se cultivaron en presencia del inhibidor de ROCK, se inhibió la apoptosis de las células epiteliales amnióticas, mientras que la proliferación de las células madre adultas aumentó significativamente.
El tratamiento con tripsina que ha sido convencionalmente utilizado en el subcultivo tiene un problema por cuanto la eficacia del cultivo se reduce debido a la necesidad de la tripsina, pero se puede observar que la adición del inhibidor de ROCK activó la proliferación de las células madre adultas al prevenir la apoptosis provocada por el tratamiento con tripsina y la inhibición de la diferenciación celular, mientras que ayudó a la proliferación estable de las células madre adultas no diferenciadas.
Ejemplo 3: Comparación de las habilidades de las células madre para proliferar de acuerdo al periodo de tratamiento del inhibidor de ROCK
Con el fin de mejorar adicionalmente la habilidad de proliferación de las células epiteliales amnióticas obtenidas en el Ejemplo 1, se comparó el método utilizado en el estudio de células madre embrionarias (Watanabe et al., Nature Biotechnology, 25:681, 2007) y el método de adición del inhibidor de ROCK durante el cultivo. En otras palabras, el cultivo en el cual se añadieron 10 M del inhibidor de ROCK únicamente antes de la resiembra se comparó con el cultivo en el cual se añadió el inhibidor de ROCK incluso después de la resiembra.
Como resultado, como se puede observar en la Figura 6, en el caso (A) del tratamiento con el inhibidor de ROCK únicamente antes de la resiembra, la habilidad de proliferación de las células madre adultas derivadas de las células epiteliales amnióticas aumentó claramente en comparación al control sin el tratamiento con el inhibidor de ROCK. Mientras tanto, en el caso (B) en el cual se añadió continuamente el inhibidor de ROCK durante la resiembra y el procedimiento de cultivo, la habilidad de proliferación de las células madre adultas fue superior en comparación al caso (A) en el cual el inhibidor de ROCK se añadió únicamente antes de la resiembra. En otras palabras, en el caso
(B) en el cual el inhibidor de ROCK se añadió continuamente incluso durante el cultivo después de la resiembra, la habilidad de proliferación de las células madre adultas derivadas de las células epiteliales amnióticas aumentó muy significativamente.
Ejemplo 4: Incremento en la habilidad de proliferación de las células madre de acuerdo al reemplazo del medio durante el cultivo de las células epiteliales amnióticas
Las células epiteliales amnióticas obtenidas en el Ejemplo 1 se cultivaron en cada uno del medio DMEM y el medio K-SFM durante 3 días, 6 días y 8 días, respectivamente.
El medio DMEM se suplementó con FBS, factor de crecimiento epidérmico, ácido ascórbico, aminoácidos no esenciales y un antibiótico, y el medio K-SFM se suplementó con FBS, factor de crecimiento epidérmico, ácido ascórbico, hidrocortisona, NAC, insulina y un antibiótico. Como resultado, como se muestra en la Figura 7, se observó que la habilidad de proliferación de las células madre adultas derivadas de células epiteliales amnióticas fue más alta en el medio DMEM que en el medio K-SFM.
Mientras tanto, se realizaron experimentos diversificados para la producción en masa de las células madre adultas derivadas de células epiteliales amnióticas. Como resultado, como se puede observar en la Figura 8, el método de reemplazar el medio DMEM por el medio K-SFM en el subcultivo primario incrementó la proliferación de las células madre adultas derivadas de las células epiteliales amnióticas. Además, cuando las células madre adultas se cultivaron en el medio DMEM durante 4 días y se observaron, las células madre proliferaron casi a la misma velocidad similar. Además, cuando el medio DMEM se reemplazó por el medio K-SFM después de 4 días de subcultivo primario, y las células se cultivaron en medio reemplazado durante 2 días, las células madre adultas cultivadas en el medio K-SFM reemplazado mostraron mayor habilidad de proliferación en comparación con las células madre adultas cultivadas en el medio DMEM solo, sin reemplazo del medio.
Ejemplo 5: Características de las células madre adultas derivadas de las células epiteliales amnióticas
5-1: Análisis de citometría de flujo de la expresión del antígeno de superficie
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Las células madre adultas derivadas de células epiteliales amnióticas cultivadas en el Ejemplo 2 se caracterizaron por marcadores antigénicos superficiales de la serie CD. CD9 (célula epitelial, adhesión), Se aplicaron CD29 (marcador de células mononucleares), CD31 (marcadores de células endoteliales y de células madre), CD34 (marcadores de células madre hematopoyéticas), CD45 (PTPR, ASV, marcador de leucocito), CD49f (marcador de la integrina alfa 6), CD73, CD90 (marcador de células madre mononucleares), CD105 (marcador TGF beta 1), y CD133 (marcador de células madre hematopoyéticas) para el análisis de FACS.
Las células madre adultas derivadas de células epiteliales amnióticas obtenidas en el Ejemplo 2 se lavaron con PBS y se trataron con tripsina. Luego, las células se recolectaron y se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 minutos. Después de que el sobrenadante se desechó, las células se añadieron a una disolución amortiguadora de bloqueo (5% de suero (suero de cabra normal + suero de caballo normal)) y se incubaron a 4ºC durante 60 minutos, seguido de la centrifugación a 1500 rpm durante 5 minutos. Después de que se desechó el sobrenadante, las células se suspendieron en PBS y aplicaron a cada pocillo a una densidad celular de 1 x 105 células, que es el mismo número de un control negativo y los marcadores antigénicos CD. Se añadió un anticuerpo monoclonal anti-humano de ratón conjugado a R-ficoeritrina (PE)/FITC (isotiocianato de fluoresceína) a cada pocillo, y las células se incubaron a 4ºC durante 40 minutos. Después de la incubación, las células se centrifugaron a 1500 rpm durante 3 minutos. Después de que se eliminó el sobrenadante, las células se lavaron con PBS y se centrifugaron a 1500 rpm durante 3 minutos. Luego, después de que se eliminó el sobrenadante, las células se lavaron con PBS y se centrifugaron a 1500 rpm durante 3 minutos. Después de que se eliminó el sobrenadante, las células se analizaron utilizando un citómetro de flujo.
Las células se tiñeron con CD9 anti-humano conjugado con FITC (isotiocianato de fluoresceína) (Becton-Dickinson), CD34 (Becton-Dickinson), CD45 (Becton-Dickinson), CD105 (Becton-Dickinson) y CD29 anti-humano conjugado a PE (ficoeritrina) (Becton-Dickinson), CD31 (Becton-Dickinson), CD49f (Becton-Dickinson), CD73 (Becton-Dickinson), CD90 (Becton-Dickinson), y CD133 (Miltenyi biotec). Se utilizó una muestra réplica como un control no teñido para asegurar la especificidad.
Como resultado, como se muestra en las Figuras 9 y 10, con respecto a las características inmunológicas, las células madre adultas derivadas de células epiteliales amnióticas fueron positivas para CD9, CD29, CD49f, CD73, CD90 y CD105, y fueron negativas para CD31, CD34, CD45 y CD133.
5-2: Estaminalidad de las células madre adultas derivadas de células epiteliales amnióticas
Las células madre adultas derivadas de células epiteliales amnióticas obtenidas en el Ejemplo 2 se lavaron tres veces con PBS y se fijaron con PBS que contenía 4% de paraformaldehído, a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de que las células se lavaron tres veces con PBS durante 3 minutos cada vez, las células se sometieron a permeabilización con PBS que contenía 0,1% de Triton-X100 a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de que las células se lavaron tres veces con PBS por 3 minutos cada vez, las células se incubaron con el amortiguador de bloqueo (2,5% de disolución de suero, NSG + NHS) a temperatura ambiente durante 30 minutos, y se incubaron con el PBS que contenía el anticuerpo primario a temperatura ambiente durante 1 hora. Las células se lavaron tres veces con PBS durante 5 minutos cada vez, y se incubaron con un anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante 30 minutos en condiciones de oscuridad. Las células se lavaron tres veces con PBS, y luego se montaron. Las células obtenidas de este modo fueron examinadas para la especificidad de SSEA 4, Oct-4, Tra-1-60, Tra-1-81, Citoqueratina y E-cadherina.
Como resultado, como se muestra en la Figura 11, las células madre adultas de acuerdo con la presente invención fueron positivas para SSEA 4, Oct-4, Tra-1-60 y Tra-1-81, las cuales pueden ser consideradas como marcadores de células no diferenciadas, es decir, marcadores de células madre. También, las células madre adultas fueron positivas para citoqueratina y E-cadherina, que pueden ser consideradas como marcadores de las células epiteliales.
5-3: Características morfológicas de las células madre adultas derivadas de las células epiteliales amnióticas
Las células madre adultas derivadas de células epiteliales amnióticas obtenidas en el Ejemplo 2 se retiraron de la incubadora y se observaron bajo un microscopio de fluorescencia Zeiss Axiovert 200 a una amplificación de 100x. También, las células se fotografiaron con un AxioCam MRm CCD montado sobre el microscopio. El diámetro de las células se midió utilizando el programa proporcionado AxioVision versión 4.5, y el tamaño del núcleo de las células y el tamaño del citoplasma se examinaron a partir de la fotografía, determinando de este modo la morfología de las células madre derivadas de células epiteliales amnióticas.
Como resultado, como se muestra en la Figura 12, las células madre adultas de acuerdo con la presente invención mantuvieron la morfología típica de las células epiteliales rectangulares paralelepipédicas o en forma de dado, ligeramente redondeadas, y el tamaño (diámetro) de las células durante el cultivo fue aproximadamente 5-10 m.
Ejemplo 6: Diferenciación de las células madre adultas derivadas de las células epiteliales amnióticas
6-1: Diferenciación en adipocitos
de diámetro. Inmediatamente después de la inducción de la herida, se inyectó un total de 50 l del material de ensayo preparado, en tres sitios intradérmicos cerca de la herida. Los sitios de inyección estuvieron espaciados a aproximadamente 1 cm de la periferia de la herida, con el fin de reducir al mínimo la pérdida del material de ensayo a través de la superficie de la herida.
5 Para examinar el efecto de sanado de herida, la condición de los animales se examinó una vez o más cada día, y la porción de herida se fotografió inmediatamente, 3 días, 6 días, 7 días, 9 días y 14 días después de la cirugía. Los resultados del análisis se muestran en la Figura 15. La Figura 15 se obtuvo mediante la colocación de papel filtro circular del mismo tamaño que aquel de la herida sobre la herida, fotografiando la herida junto con el papel de filtro circular como el área de píxel de referencia.
10 Como resultado, como se muestra en la Figura 15, se puede observar que la velocidad de cierre de la herida del grupo administrado con las células madre derivadas de células epiteliales amnióticas fue mayor que la del grupo administrado con disolución salina.
Además, 21 días después de la cirugía en la cual la herida inducida se recuperó completamente, los animales de ensayo fueron sometidos a autopsia y se sometieron a una biopsia de piel. Los resultados de la biopsia del tejido en
15 cada grupo después de que la herida inducida fue recuperada se muestran en la Figura 16. Como se muestra en la Figura 16, en la piel del control, existió únicamente una masa de tejido fibroso, mientras que en el grupo administrado con las células madre epiteliales amnióticas, se observó una gran cantidad de apéndices cutáneos tales como folículos pilosos y glándulas sudoríparas en el tejido de la piel recuperada.
A partir de tales resultados, se puede encontrar que las células madre epiteliales amnióticas de acuerdo con la
20 presente invención funcionaron para promover la re-epitelialización del tejido de la piel y facilitaron la regeneración de los apéndices cutáneos.
APLICABILIDAD INDUSTRIAL
Como se describió anteriormente con detalle, las células madre derivadas de células epiteliales amnióticas humanas de acuerdo con la presente invención son fácilmente extraídas en comparación con las células madre terapéuticas
25 existentes, tales como las células madre de sangre de cordón umbilical y las células madre de médula ósea, el rendimiento inicial de las mismas aumenta mediante el tratamiento con DTT, y la velocidad de proliferación de las mismas aumenta significativamente al cultivarlas en un medio que contiene el inhibidor de ROCK. De este modo, el método de la presente invención puede ser utilizado para preparar eficientemente las células madre adultas útiles como agentes terapéuticos celulares.
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