CN110463688B - 一种羊精液的稀释液以及保存方法 - Google Patents
一种羊精液的稀释液以及保存方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种羊精液的稀释液以及保存方法。该稀释液每100mL中包括以下组分：Y‑27632 2HCl 0.16～3.20mg、维生素E 3.5～4.5mL、新鲜卵黄19～21mL、果糖1.2～1.3g、柠檬酸一水合物1.7～1.8g、三羟甲基氨基甲烷3.5～3.6g、维生素C 0.4～0.6g、牛血清白蛋白0.4～0.6g、青霉素钠10000～15000IU、链霉素硫酸盐10000～15000IU，甘油3.5～4.5mL，余量为双蒸水。本发明有效延长了羊精液在低温条件下的保存时间，并提高了保存精子的质量。
Description
技术领域
本发明涉及一种精液稀释液，具体涉及一种羊精液的稀释液以及保存方法。
背景技术
我国养羊业的历史悠久，绵羊和山羊的种质资源丰富，其中养殖数量占比世界第一。养羊业对国家现代化发展有着重要意义，在广阔的草原和农村养羊业有着巨大的发展前景，养羊业的快速发展不仅可以为国家改革开放贡献力量，还可以提高人民生活水平。随着科技不断的进步，我国养羊业发展也有了长足的进步，但也存在不少问题，与发达国家相比差距依旧很大，特别在养殖规模化、饲养集约化等方面。近几年为了提高我国肉羊品种的质量，不断从国外引进优秀肉羊品种，其中杜泊羊就是其中之一，其肉质鲜美，饲料转化率高，瘦肉比高，是我国引进的钻石级肉用绵羊品种，具有很高的经济价值。
早在1928年Yamane等就发现将马的精液用葡萄糖-磷酸盐稀释液稀释后比不稀释的精子存活时间显著提高，体现了稀释液对于精子存活的必要性。稀释液配方也在不断完善中，Lopez等比较了脱脂牛奶稀释液、Test和Tris-海藻糖，发现脱脂牛奶稀释液能够更长时间地保存精子活力。PauLenz等在2002选择了牛奶稀释液、柠檬酸钠稀释液、Tris基础液，发现Tris基础液比牛奶、柠檬酸稀释液更好地保护了精子，延长了精子的保存时间。目前羊精液的稀释液种类少，且冷藏保存条件要求高，成本高，限制了羊精液的稀释液的广泛推广。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种羊精液的稀释液。该稀释液适用于山羊以及绵羊精液的保存，可有效延长精液保存时间以及保存质量。
一种羊精液的稀释液，该稀释液每100mL中包括以下组分：Y-27632 2HCl0.16～3.20mg、维生素E 3.5～4.5mL、新鲜卵黄19～21mL、甘油3.5～4.5mL、果糖1.2～1.3g、柠檬酸一水合物1.7～1.8g、三羟甲基氨基甲烷3.5～3.6g、维生素C 0.4～0.6g、牛血清白蛋白0.4～0.6g、青霉素钠10000～15000IU、链霉素硫酸盐10000～15000IU，余量为双蒸水。
优选方案，稀释液每100mL中包括以下组分：Y-276322HCl 0.6405mg、维生素E4mL、新鲜卵黄20mL、果糖1.26g、柠檬酸一水合物1.72g、三羟甲基氨基甲烷3.53g、维生素C0.5g、牛血清白蛋白0.5g、青霉素钠15000IU、链霉素硫酸盐15000IU、甘油4mL，余量为双蒸水。
本发明的第二个目的是提供第一种利用所述稀释液保存羊精液的保存方法，包括以下步骤：
利用所述稀释液将采集到的合格羊精液进行8倍稀释，将稀释后的精液分装至细管，用聚乙烯醇粉封口，外包脱脂棉后，置于4℃冰箱保存。
本发明的第三个目的是提供第二种利用所述稀释液保存羊精液的保存方法，包括以下步骤：
利用所述稀释液将采集到的合格羊精液进行8倍稀释，将稀释后的精液分装在细管中，所述细管用聚乙烯醇粉封口且外部包裹脱脂棉，之后置于4℃冰箱缓慢降温平衡，接着将所述细管置于预先准备的液氮中熏蒸，最后将细管放入液氮中保存。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明稀释液中各组分介绍如下：
维生素C是一种抗氧化物质，能够有效防止精子磷脂发生过氧化反应而提高精子活力，延长精子在体外的存活时间，其抗氧化作用还体现在作为一种有效的自由基清除剂，能够保护精子细胞中的遗传基因DNA免受氧化破坏。
牛血清白蛋白是一种蛋白类保护剂，能弥补稀释造成的精清中蛋白类运动激活物的下降，维持精子的运动，减少稀释造成的精子头部带相反性电荷所引起的头部凝集，还能中和精子代谢产物，发挥一定的缓冲和抗氧化作用。
Y-27632 2HCl作为ROCK-II的抑制剂，具有通过选择性抑制Ca2+敏感化，而抑制多种兴奋剂诱导的平滑肌收缩。Y-27632 2HCl作用于培养的细胞，抑制Rho诱导的p160 ROCK调节的应力纤维的形成。10μM Y-27632 2HCl处理在无血清悬浮(SFEB)培养基中的人类胚胎干细胞(hES)，能够显著减少分离诱导的凋亡，提高克隆效率(从1％提高到27％)。
果糖：糖类是羊精液保存稀释液中的重要能源物质，其主要功能是为羊精子提供营养和补充能量，另外，糖类能够稳定精子细胞膜蛋白质—脂类复合物，发挥保护精子细胞膜的作用。
柠檬酸一水合物、三羟甲基氨基甲烷：缓冲物质是羊精液保存稀释液中必不可少的成分。在稀释液中加入缓冲物质的目的是为了调节和维持精液正常的pH，以利于精子的存活。
维生素E和维生素C：精液保护液中添加一定浓度的维生素E/维生素C可以减少精子保存过程中产生的过量超氧化产物，降低对精子质膜的氧化应激性损伤，提高的精子保存质量。
新鲜卵黄：作为能源物质也被广泛的应用于羊精液的稀释液中。另外，卵黄中的低密度脂蛋白直接渗入原生质膜，能够起到稳定质膜的作用，发挥保护精子细胞膜的作用。
青霉素钠、链霉素硫酸盐：羊精液在采集和保存过程中，难免会受到某些微生物的污染，在稀释液中添加适宜剂量的抗菌物质能够抑制细菌微生物的孳生，提高对有害细菌的杀灭能力，从而延长羊精子的存活时间。
甘油：作为渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性。
在本发明中，将不同的成分按一定比例组成稀释液对于羊精液的保存效果显著提高，特别是首次将Y-27632 2HCl添加到精液稀释液中，虽然Y-276322HCl在人类胚胎干细胞(hES)培养过程中，具有显著减少分离诱导的凋亡等作用，但其在精液保存过程中未见应用，在本发明中，通过在稀释液中添加Y-27632 2HCl及其它辅助组分，结果显示了添加Y-27632 2HCl的稀释液能够显著延长羊精液在低温条件下的保存时间，并提高了保存精子的质量，为羊精液的长时间保存和远距离运输提供了良好的基础和前提，且能够为解决生产上的这些难题提供理论支持。
(2)利用本发明优选方案配方的稀释液对羊精液进行保存，可以实现羊精液在低温条件下的保存时间达到最长，且精子的质量达到最好。
(3)本发明第一种保存方法的优点：4℃保存时采用将稀释后的精液分装在细管中，用聚乙烯醇粉封口，包裹脱脂棉，置于4℃冰箱缓慢降温，目的是避免精子受到剧烈温度变化刺激，产生应激效应而导致精子死亡。
精子处于低温休眠状态，暂时抑制或者阻止精子的运动，使其代谢速度降低，能量消耗减缓，从而延长精子寿命，同时在稀释液中添加了冷冻保护剂甘油，甘油作为一种渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，从而在一定程度上保护精子存活。
(4)本发明第二种保存方法的优点：将稀释后精液保存在超低温下，是为了达到长期保存精液的目的。该方法采用将稀释后的精液分装在细管中，用聚乙烯醇粉封口，包裹脱脂棉，置于4℃冰箱缓慢降温平衡，目的是避免精子受到剧烈温度变化刺激，产生应激效应而导致精子死亡。
平衡后，将细管置于预先准备的液氮中熏蒸，最后放入液氮中保存。该步骤采用快速降温法，目的是防止在降温过程中精子内形成冰晶，冰晶形成会极大程度地损伤精子细胞，致使精子死亡或者解冻后不具有受精能力。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明技术方案做出更为具体的说明，实施例中所涉及的原料均来自普通市售产品：
实施例1
一种羊精液的稀释液，稀释液每100mL包括以下组分：Y-27632 2HCl、Vitamin E4mL、新鲜卵黄20mL、甘油4mL、果糖1.26g、柠檬酸一水合物1.72g、三羟甲基氨基甲烷3.53g、维生素C 0.5g、牛血清白蛋白0.5g、青霉素钠15000IU、链霉素硫酸盐15000IU，余量为双蒸水。制备5组稀释液，组1：空白对照，Y-276322HCl 0mg；组2：Y-276322HCl 0.1601mg/100mL(对应摩尔浓度为5mM)；组3：Y-276322HCl 0.6405mg/100mL(对应摩尔浓度为20mM)；组4：Y-276322HCl 1.6013mg/100mL(对应摩尔浓度为50mM)；组5：Y-276322HCl 3.2026mg/100mL(对应摩尔浓度为100mM)。
实施例2羊精液的保存方法
1.精液的采集
在实验站附属种羊场固定采精场所，采精前将公羊圈入舍中，在舍中放入用来保定母羊的保定架，采精前将舍内卫生打扫干净。在母羊舍中寻找一只健康无病、体格强壮、性情温顺的发情母羊，将其固定在保定架上，保证母畜在公畜视野内，以便引起公羊性欲。将假阴道、集精杯、玻璃棒清洗干净，在假阴道一端装上提前准备好的集精杯，随后向假阴道的夹层倒入50～60℃热水，装上带活塞的气嘴；用玻璃棒取少量凡士林，在内胎上均匀地涂沫一层，吹气加压后，涂凡士林的一端口呈三角形为宜。
2.羊精液的低温保存方法
利用实施例1所制备的稀释液将采集到的合格羊精液进行8倍稀释，将稀释后的精液分装至细管，用聚乙烯醇粉封口，外包脱脂棉后，置于4℃冰箱保存。
3.羊精液的冷冻保存方法
利用实施例1所制备的稀释液将采集到的合格羊精液进行8倍稀释，将稀释后的精液分装在细管中，用聚乙烯醇粉封口，包裹脱脂棉，置于4℃冰箱缓慢降温平衡后，将细管置于预先准备的液氮中熏蒸，最后放入液氮中保存。
4.精液指标检测
隔一段时间检测一次精子活力、质膜完整率、顶体完整率。
精子活力的测定方法：将精液用稀释液稀释后进行保存，分别在不同时间通过CASA系统进行精子质量分析。
质膜完整率的测定方法：使用渗透肿胀试验(HOST)检测，取200μL低渗液(配方：4.9g柠檬酸三钠，9.0g果糖蒸馏水加至1000mL)添加到20μL的精液中，混合并在37℃下孵育35min后抹片风干，用2％戊二醛固定15min后水洗待干后。在显微镜下进行检测，计数200个精子，将符合检测标准的精子数除以总精子数。精子质膜完整率＝(质膜完整精子数/精子总数)×100％。
顶体完整率的测定方法：采用姬姆萨染色法，取20μL稀释后的精液抹片风干后，用4％甲醛固定15min，冲洗干净并风干，用移液枪吸取新配制姬姆萨染液进行染色，保证染液均匀布满在抹片上染色2h。最后水洗风干，在显微镜下按照检测标准进行检测，计数200个精子。精子顶体完整率＝(顶体正常的精子数/精子总数)×100％。
4.结果分析
实施例1制备的稀释液在低温保存下对绵羊精子的影响
A.实施例1所测定的精子活率的数据如表1所示。
表1实施例1中不同稀释液在4℃保存温度下对绵羊精子活率(％)的影响
注：a,b,c,d表示每列中不同组之间的差异显著性，字母相同表示无差异显著性(p>0.05),字母不同表示有差异显著性(p<0.05)。Treatment表示Y-27632 2HCl不同处理浓度。
由表1可知，羊精液在4℃保存2d后，5、20和50mM Y-27632 2HCl处理组能有效提高精子活率。其中，20和50mM的Y-27632 2HCl处理组与对照组之间差异达到显著水平(P<0.05)。在保存3～15d后，5、20和50mM Y-276322HCl处理组的精子活率显著高于空白对照(P<0.05)，并且20mM处理组的精子活率大部分显著高于5和50mM处理组(P<0.05)。另外，在20mM的Y-27632 2HCl处理作用18d后，精子活率仍能达到60.73％，而空白对照组精子已经死亡。
以上结果表明，在4℃保存绵羊精子时，在稀释液中添加Y-27632 2HCl能有效提高精子保存活率。同时采用20mM的Y-27632 2HCl更能有效延长精液在4℃保存的时间。另外，从结果分析，精子活率并不随Y-27632 2HCl浓度的增加而呈增加趋势，表明Y-27632 2HCl是非剂量依赖型精液保存添加物。
B.实施例1所测定的精子质膜完整率的数据如表2所示
表2实施例1中不同稀释液在4℃保存温度下对绵羊精子质膜完整率(％)的影响
注：a,b,c,d表示每列中不同组之间的差异显著性，字母相同表示无差异显著性(p>0.05),字母不同表示有差异显著性(p<0.05)。Treatment表示Y-276322HCl不同处理浓度。
由表2可知，羊精液在5种稀释液处理0h后，各组处理的精子质膜完整率没有显著差异。4℃保存1～9d后，5、20和50mM处理组的精子质膜完整率显著高于其余各组(P<0.05)，其中，20mM处理组的质膜完整率大部分显著高于5和50mM处理组(P<0.05)，而5mM处理组的精子质膜完整率与50mM处理组之间无显著差异。保存9～15d后，20mM处理组的质膜完整率仍显著高于对照组(P<0.05)。但从数据显示看出，50mM处理组数据略高于对照和100mM。另外，在0～15d保存期间100mM处理组与对照组无显著性差异。结果显示，在稀释液中添加Y-276322HCl能有效提高精子质膜完整率，延缓精子质膜完整率下降趋势，同时添加20mM的Y-276322HCl更能有效保证15d内精子质膜完整性的稳定和缓慢的下降趋势。
C.实施例1所测定的精子质膜完整率的数据如表3所示
表3实施例1中不同稀释液在4℃保存温度下对绵羊精子顶体完整率(％)的影响
注：a,b,c,d表示每列中不同组之间的差异显著性，字母相同表示无差异显著性(p>0.05),字母不同表示有差异显著性(p<0.05)。Treatment表示Y-276322HCl不同处理浓度。
由表3可知，羊精液在5种稀释液处理0h后，各组处理的精子顶体完整率没有显著差异。4℃保存1～13d后，20mM处理组的精子顶体完整率大部分显著高于空白对照组(P<0.05)。保存9～15d后，5和50mM处理组的精子顶体完整率显著高于对照组(P<0.05)。结果证实了在4℃保存绵羊精子时，在稀释液中添加Y-27632 2HCl能有效提高精子顶体完整率，延缓精子顶体完整率下降趋势。
D.实施例1所测定的精子运动参数值的数据如表4所示
表4实施例1中不同稀释液在4℃保存温度下对绵羊精子运动参数值的影响
注：a,b,c,d表示每列中不同组之间的差异显著性，无字母或字母相同表示差异不显著(p>0.05),有字母表示差异显著(p<0.05)。Treatment表示Y-27632 2HCl处理不同浓度。
由表4可知，随着在羊精液稀释液中添加不同浓度的Y-27632 2HCl，精子的运动性能先增强后减弱。
通过实施例1～实施例2，可以确认稀释液中适量的Y-27632 2HCl不仅能提高羊精液在低温保存时的活率，同时还能大幅度延长羊精液的保存时间。
实施例3
一种羊精液的稀释液，稀释液每100mL中包括以下组分：Y-27632 2HCl0.6405mg、维生素E 3.5mL、新鲜卵黄19mL、甘油3.5mL、果糖1.25g、柠檬酸一水合物1.7g、三羟甲基氨基甲烷3.5g、维生素C 0.4g、牛血清白蛋白0.4g、青霉素钠10000IU、链霉素硫酸盐10000IU，余量为双蒸水。
实施例4
一种羊精液的稀释液，稀释液每100mL中包括以下组分：Y-27632 2HCl0.6405mg、维生素E 54mL、新鲜卵黄21mL、甘油4.5mL、果糖1.3g、柠檬酸一水合物1.8g、三羟甲基氨基甲烷3.6g、维生素C 0.6g、牛血清白蛋白0.6g、青霉素钠12000IU、链霉素硫酸盐12000IU，余量为双蒸水。
分别利用上述实施例3、实施例4中稀释液，并通过上述实施例2中的保存方法对羊精液进行保存，均获得了与实施例1中稀释液类似的保存效果，即大幅度延长了羊精液的保存时间和保存质量。而稀释液中组分范围不在本发明范围的，其保存效果均低于本发明。
Claims (3)
1.一种羊精液的稀释液，其特征在于：该稀释液每100mL中包括以下组分：Y-276322HCl 0.6405mg、维生素E 4mL、新鲜卵黄20mL、果糖1.26g、柠檬酸一水合物1.72g、三羟甲基氨基甲烷3.53g、维生素C 0.5g、牛血清白蛋白0.5g、青霉素钠15000IU、链霉素硫酸盐15000IU、甘油4mL，余量为双蒸水。
2.一种利用权利要求1所述稀释液保存羊精液的保存方法，其特征在于包括以下步骤：
利用所述稀释液将采集到的合格羊精液进行8倍稀释，将稀释后的精液分装至细管，用聚乙烯醇粉封口，外包脱脂棉后，置于4℃冰箱保存。
3.一种利用权利要求1所述稀释液保存羊精液的保存方法，其特征在于包括以下步骤：
利用所述稀释液将采集到的合格羊精液进行8倍稀释，将稀释后的精液分装在细管中，所述细管用聚乙烯醇粉封口且外部包裹脱脂棉，之后置于4℃冰箱缓慢降温平衡，接着将所述细管置于预先准备的液氮中熏蒸，最后将细管放入液氮中保存。
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| GR01 | Patent grant | ||
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