CN115119830A - 一种牛用精液低温保存稀释液的制备和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及动物繁殖技术领域，尤其涉及一种牛用精液低温保存稀释液的制备和使用方法，主要成分为先将双蒸水、蜂蜜、低密度脂蛋白、恩诺沙星调配为第一混合溶液，之后将TE液、HePeS液、三羟甲基氨基甲烷、BSA，调配为第二混合溶液；之后将阿拉伯糖、鞣酸、左旋肉碱、甾醇、松弛素、鼠李糖加入第一混合溶液调配为第三混合溶液；最后将第二混合溶液和亮肽素、肌肽分别倒入第三混合溶液内，轻微混匀后用无菌滤器过滤制成第四混合溶液，本发明方法配置的稀释液用于低温保存牛用精液的过程中，在保证精液成活率和保存时长的前提下，提高了DNA完整度和顶体完度，从而提高了人工受精的受胎质量。
Description
技术领域
本发明涉及动物繁殖技术领域，尤其涉及一种牛用精液低温保存稀释液的制备和使用方法。
背景技术
肉制品和奶类消费水平能够体现一个国家的经济水平，我国是畜牧业养殖大国，文件指出，要保障“菜篮子”产品供应，加快扩大牛羊肉和奶类产品生产，由此可见良种配良法才能够加快产业发展。
为了充分发挥优良种公牛的繁殖潜能，迅速扩大畜群数量，进行人工授精是最为经济有效的方法，在实际操作中种牛射出的精子在自然条件下存活时间很短，目前解决此问题的常规方法为使用稀释液对精液进行稀释保存，现阶段用稀释液稀释平衡后放入液氮中冷冻保存以及细管冻精冷配的方式进行人工授精，但冻精国标精子活率大于0.3，冷冻后精子活率较低，精子活率、畸形率、受胎率与鲜精具有明显差异。
中国专利公开号：CN103548812B公开了一种奶山羊精液常温及低温保存稀释液，其主要成分为三羟甲基-氨基甲烷，柠檬酸，果糖，海藻糖，维生素c，牛血清白蛋白，还原型谷胱甘肽，三磷酸腺苷，复合抗生素等，低温保存稀释液中含有卵黄，本发明可将精液以液态形式有效短期保存以达到人工授精要求，解决了公畜站采精后保存时限及采精点与输精点运输距离问题，提高了鲜精保存品质及时效性，从而提高了优良种畜利用率并获得高受胎率；同时该稀释液制作方法简单，操作简单，生产成本低，便于大规模推广应用。然而通过本发明的保存稀释液体保存的奶山羊的精液虽然成活率和顶体完整率在保存三天的情况下，均维持在了50％左右的水平，但是还有很大的提升空间。
由此可见，所述牛精液低温保存稀释液仍存在以下问题：
1、牛精液通过稀释液低温保存的存储期限过短，人工受精时限制了同批精子的使用和保存周期。
2、牛精液通过稀释液低温保存时，DNA完整率和顶体完整率的指标控制不理想，影响人工受精后的受胎质量。
发明内容
为此，本发明提供一种牛用精液低温保存稀释液的制备和使用方法，用以克服现有技术中牛用精液通过稀释液在低温保存环境下保存周期短、顶体完整率和 DNA完整率低的问题。
为实现上述目的，本发明提供一种牛用精液低温保存稀释液的制备方法，包括：
步骤S1、预设组份A的重量份数为Ai，分别配置重量份数为A1的双蒸水、重量份数为A2的蜂蜜、重量份数为A3低密度脂蛋白、重量份数为A4恩诺沙星加入容器，通过搅拌装置调配制得第一混合溶液；
步骤S2、预设组份B的重量份数为Bi，分别配置重量份数为B1的TE液、重量份数为B2的HePeS液、重量份数为B3的三羟甲基氨基甲烷、重量份数为 B4的BSA加入容器，通过搅拌装置调配制得第二混合溶液；
步骤S3、预设组份C的重量份数为Cj，分别配置重量份为C1的数阿拉伯糖、重量份为C2的鞣酸、重量份为C3的左旋肉碱、重量份为C4的甾醇、重量份为 C5的松弛素、重量份为C6的鼠李糖加入第一混合溶液的容器内，通过搅拌装置调配制得第三混合溶液；
步骤S4、预设组份D的重量份数为Dm，分别配置重量份数为D1的亮肽素、重量份数为D2的肌肽以及配制好的第二溶液分别倒入第三混合溶液的容器内，轻微混匀后用无菌滤器过滤制成第四混合溶液；
步骤S5、制成稀释液后放入低温环境备用。
进一步地，在步骤S1中，第一混合溶液中各组份重量份数为双蒸水60-100mL、蜂蜜2-8g、低密度脂蛋白5-10g、恩诺沙星20-200mg；
步骤S2中，第二混合溶液中各组份重量份数为TE液5-20mL、HePeS液5-25mL、三羟甲基氨基甲烷1-4g、BSA100-500mg；
步骤S3中，第三混合溶液中各组份重量份数为阿拉伯糖0.5-5g、鞣酸0.3-1g、左旋肉碱200-500mg、甾醇200-600mg、松弛素50-200mg、鼠李糖2-5g；
步骤S4中，第四混合溶液中各组份重量份数为亮肽素50-150mg、肌肽 50-150mg。
进一步地，在步骤S1中，当调配第一混合溶液时，设置预设双蒸水的温度 F0实时获取双蒸水的实际温度F，若F＜F0时，对双蒸水的温度进行升温处理，若F≥F0时，对双蒸水进行恒温处理，并分别按预设重量份数加入蜂蜜、低密度脂蛋白、恩诺沙星，当进行第一混合溶液的组份物质调配时，设定第一混合溶液的拌时长为Ta，在设定的搅拌时长Ta完成后，记录实际搅拌漩涡底角至容器内壁底端的第一距离Qa，将第一距离与预设距离对比，判断是否进行二次搅拌，设置第一预设距离Q1和第二预设距离Q2，第一混合溶液的第一预设二次搅拌时长Ta1和第一混合溶液的第二预二次搅拌时长Ta2，Q1＞Q2，Ta1＞Ta2，
若Qa≤Q2，不进行二次搅拌；
若Q1＞Qa＞Q2，采用第一混合溶液的第一预设二次搅拌时长Ta1作为二次搅拌时长；
若Q1≤Qa，采用第一混合溶液的第二预二次搅拌时长Ta2作为二次搅拌时长；
在二次搅完成时，若Qa≤Q2，判断为第一混合溶液各组份重量份数配置不需要调整；
若Q1＞Qa＞Q2，判断第一混合溶液各组份重量份数配置是否需要调整；
若Qa＜Q1，将调节后的第一混合溶液的拌时长设置为Ta+Tai，其中i＝1，2。
进一步地，当判断第一混合溶液各组份重量份数配置是否需要调整时，获取实际调配第一混合溶液的重量份数Ai、获取当前搅拌速度为Z，设定搅拌降速系数α，将临时调节的搅拌速度设置为Za，Za＝Z×α，以搅拌速度为Za、搅拌时长为Tai开始搅拌第一混合溶液，在搅拌过程中记录实际搅拌漩涡底角至容器内壁底端的第二距离Qb，根据第一距离Qa与第二距离Qb比对结果，判断是否需要对第一混合溶液各组份重量份数进行调整，
若Qa＜Qb，则确定不对调配第一混合溶液的重量份数进行调整；
若Qa≥Qb，则进一步判断是否对调配第一混合溶液的重量份数进行调整，
当进一步判断是否对调配第一混合溶液的重量份数进行调整时，计算第一距离Qa和第二距离Qb的距离差值Qs，并根据该距离差值和预设距离差值的比对结果进一步判断，设置第一预设差值Qs1、第二预设差值Qs2、设置第一预设重量份数调节系数Axi以及第二预设调节系数Ayi，设定Qs1＜QS2，Axi＜Ayi，
若Qs＜Qs1，判定不对第一混合溶液的重量份数进行调整，
若Qs1≤Qs＜Qs2，采用第一预设重量份数调节系数Axi作为Ai重量份数的调节系数，并将调节后的第一混合溶液的重量份数设置为Ai×Axi；
若Qs2≤Qs，采用第二预设重量份数调节系数Ayi作为Ai重量份数的调节系数，并将调节后的第一混合溶液的重量份数设置为Ai×Ayi。
进一步地，在步骤S2中，当调配第二混合溶液时，获取实际调配第二混合溶液的重量份数Bi，计算组份添加物中，第二混合溶液的重量份数的添加物的实际添加量与预设添加量的差值△Bi，
当△Bi＜0时，按照以下公式计算负偏移参量Bp，
其中Bαi为第i添加物的权重系数，bm1为△Bi＜0的个数；
当△Bi>0时，按照以下公式计算正偏移参量Bn，
其中Bβi为第i添加物的权重系数，am2为△Bi＞0的个数；
设定Wb＝Bp+Bn，其中Wb为第二混合溶液时调配混合物的份数偏差影响系数，设置调配第二混合溶液时调配混合物的第一预设份数偏差影响系数Wb1，第二预设份数偏差影响系数Wb2，调配第二混合溶液时的第一预设重量份数调节系数 Bxi，第二预设重量份数调节系数Byi，设定Wb1＜Wb2，Bxi＜Byi，
若Wb＜Wb1判定不对Bi进行调整；
若Wb1≤Wb＜Wb2，采用第一预设调配第二混合溶液时的重量份数调节系数 BXi作为Bi重量份数的调节系数，并将调节后的第二混合溶液的重量份数设置为Bi×Bxi；
若Wb2≤Wb，采用第二预设调配第二混合溶液时的重量份数调节系数BYi作为Bi重量份数的调节系数，并将调节后的第二混合溶液的重量份数设置为 Bi×Byi。
进一步地，在确定第一混合溶液的重量份数设置为Bi后，设定第二混合溶液的搅拌时长为Tb，在设定搅拌时长Tb完成时，获取第二混合溶液的颗粒物占比BK，通过颗粒物占比与预设的颗粒物占比的对比判断是否进行二次搅拌，设置第一预设颗粒物占比K1、第二预设颗粒物占比K2，第二混合溶液的第一预设二次搅拌时长Tb1和第二混合溶液的第二预二次搅拌时长Tb2，设定K1＜K2，Tb1 ＞Tb2，
若BK＜K1，不对搅拌时长进行调整；
若K1≤BK＜K2，采用第二混合溶液的第一预设二次搅拌时长Tb1作为二次搅拌时长，在设定的二次搅拌时长Tb1完成时，将调整过后的第二混合溶液的搅拌时长设置为Tb+Tb1；
若K2≤BK，采用第二混合溶液的第二预设二次搅拌时长Tb2作为二次搅拌时长，在设定的二次搅拌时长Tb2完成时，将调整过后的第二混合溶液的搅拌时长设置为Tb+T2。
进一步地，在步骤S3中，当调配第三混合溶液时，获取实际调配第三混合溶液的重量份数Cj，计算组份添加物中，第三混合溶液的重量份数的添加物的实际添加量与预设添加量的差值△Cj，
当△Cj＜0时，按照以下公式计算负偏移参量Cp，
其中Cαj为第j添加物的权重系数，cm1为△Cj＜0的个数；
当△Cj>0时，按照以下公式计算正偏移参量Cn，
其中Cβj为第j添加物的权重系数，cm2为△Cj＞0的个数；
设定Wc＝Cp+Cn，其中Wc为第三混合溶液时调配混合物的份数偏差影响系数，设置第一预设调配第三混合溶液时调配混合物的份数偏差影响系数Wc1，第二预设调配第三混合溶液时调配混合物的份数偏差影响系数Wc2，第一预设调配第三混合溶液时的重量份数调节系数CXj，第二预设调配第三混合溶液时的重量份数调节系数CYj，设定Wc1＜Wc2，
若Wc＜Wc1，判定不对Cj进行调整；
若Wc1≤Wc＜Wc2，采用第一预设调配第三混合溶液时的重量份数调节系数 CXj作为Cj重量份数的调节系数，并将设定后的调配第三混合溶液时的重量份数设置为Cj×CXj；
若Wc2≤Wc，采用第二预设调配第三混合溶液时的重量份数调节系数CYj作为Cj重量份数的调节系数，并将设定后的调配第三混合溶液时的重量份数设置为Cj×CYj。
进一步地，在确定第三混合溶液的重量份数设置为Cj后，设定第三混合溶液的搅拌时长为Tc，在设定搅拌时长Tc完成时，获取搅拌装置后第三混合溶液时溶液的颗粒物占比为CK，判断是否进行二次搅拌，设置第三混合溶液的第一预设二次搅拌时长Tc1和第三混合溶液的第二预二次搅拌时长Tc2，设定Tc1＞ Tc2；
若CK＜K1，不对搅拌时长进行调整；
若K1≤CK＜K2，采用三混合溶液的第一预设二次搅拌时长Tc1作为二次搅拌时长，在设定的二次搅拌时长Tc1完成时，将调整过后的第二混合溶液的搅拌时长设置为Tc+Tc1，
若K2≤CK，采用三混合溶液的第二预设二次搅拌时长Tc2作为二次搅拌时长，在设定的二次搅拌时长Tc2完成时，将调整过后的第二混合溶液的搅拌时长设置为Tc+Tc2。
进一步地，S5步骤中制成稀释液后放入低温环境的温度为-20度。
进一步地，本发明提供一种牛用精液低温保存稀释液的使用方法，包括：
在精液采集阶段，将成活率高于65％的采集精液放入离心机以500r/min的速度搅拌3min，弃去上层精清后低温保存；
在对精液稀释过程中，将稀释液从低温环境中取出放入35度的水浴锅中预热，待预热完成后按1：5比例缓慢倒入精液中轻微混匀制成精液稀释溶液，将精液稀释溶液放入含有300mL35度温水的烧杯后放入冰箱，控制冰箱按照0.5-1 度/min速度降温，降温到4度后再加入等体积温度相同稀释液，并在烧杯中加入冰块，使稀释液保持在0度环境保存；
使用时将稀释后的精液取出在35度水浴锅中解冻20s镜检，活率0.5以上的用于输精，每次输精量为0.25mL。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于，本发明提供的一种牛用精液低温保存稀释液，有效的延长了牛用精液的保存时长，在保证精子成活率的前提下，提高了DNA完整度和顶体完度，从而提高了人工受精的受胎质量。
进一步地，本发明提供的一种牛用精液低温保存稀释液的制备方法，预设的双蒸水的温度F0，在调配第一混合溶液时，实时获取双蒸水的实际温度F，可对双蒸水进行恒温处理，达到恒定温度时再分别按重量份数加入蜂蜜、低密度脂蛋白、恩诺沙星，提高了第一混合溶液的配置效果。
进一步地，本发明提供的一种牛用精液低温保存稀释液的制备方法，预设的设置第一预设距离Q1和第二预设距离Q2，设定第一混合溶液的拌时长为Ta，在设定的搅拌时长Ta完成后，记录实际搅拌漩涡底角至容器内壁底端的第一距离 Qa，将第一距离与预设距离对比，判断是否进行二次搅拌，当Qa＜Q1且Qa＞Q2 时，确定进行二次搅拌，并设定二次搅拌时长进行二次搅拌，从而保证了第一混合液体的在配置过程中的融合效果。
进一步地，本发明提供的一种牛用精液低温保存稀释液的制备方法，预设的第一预设差值Qs1，第二预设差值Qs2，当第一混合溶液在进行二次搅拌后若当 Q≥Q1，设定Za＝Z×α，以搅拌速度为Za、搅拌时长为Tai开始搅拌第一混合溶液，在搅拌过程中记录实际搅拌漩涡底角至容器内壁底端的第二距离Qb，根据第一距离Qa与第二距离Qb比对结果，判断是否需要对第一混合溶液各组份重量份数进行调整，从而保证了第一混合溶液各组份配比的最优状态。
进一步地，本发明提供的一种牛用精液低温保存稀释液的制备方法，通过计算第二混合溶液时调配混合物的份数偏差影响系数Wb，获取实际调配第二混合溶液的重量份数Bi，通过与预设的第二混合溶液时调配混合物的份数偏差影响系数判断是否对Bi进行调整，若Wb1≤Wb＜Wb2或Wb2≤Wb时，则按预设的重量份数调节系数对第二混合溶液的重量份数组份进行调节，从而保证了第二混合溶液各组份配比的最优状态。
进一步地，本发明提供的一种牛用精液低温保存稀释液的制备方法，通过设置第一预设颗粒物占比K1、第二预设颗粒物占比K2，判断预设的搅拌时长是否搅拌充分，如果未搅拌充分，若K1≤BK＜K2或若K2≤BK时，通过预设二次搅拌时间系数确定二次搅拌时长，并进行两次搅拌，从而保证了第二混合溶液各组份配比的最优状态。
进一步地，本发明提供的一种牛用精液低温保存稀释液的制备方法，通过计算第二混合溶液时调配混合物的份数偏差影响系数Wc，获取实际调配第二混合溶液的重量份数Cj，通过与预设的第二混合溶液时调配混合物的份数偏差影响系数判断是否对Cj进行调整，若Wc1≤Wc＜Wc2或Wc2≤Wc时，则按预设的重量份数调节系数对第三混合溶液的重量份数组份进行调节，从而保证了第三混合溶液各组份配比的最优状态。
附图说明
图1为本发明所述牛用精液低温保存稀释液的调配步骤示意图；
图2为本发明所述Qa＜Q1且Qa＞Q2时搅拌涡旋底角至容器内壁底端距离的示意图；
图3为本发明所述Q1≤Qa时搅拌涡旋底角至容器内壁底端距离的示意图；
图4为本发明所述调整后的标准溶液搅拌涡旋底角至容器内壁底端距离的示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明作进一步描述；应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
下面参照附图来描述本发明的优选实施方式。本领域技术人员应当理解的是，这些实施方式仅仅用于解释本发明的技术原理，并非在限制本发明的保护范围。
请参阅图1-4所示，图1为本发明实施例的牛用精液低温保存稀释液的调配步骤示意图；图2为本发明本实施例的Qa＜Q1且Qa＞Q2时搅拌涡旋底角至容器内壁底端距离的示意图；图3为本发明本实施例的Q1≤Qa时搅拌涡旋底角至容器内壁底端距离的示意图；图4为本发明本实施例的调整后的标准溶液搅拌涡旋底角至容器内壁底端距离的示意图。
本实施例提供一种牛用精液低温保存稀释液的制备方法，包括：
步骤S1、预设组份A的重量份数为Ai，分别配置重量份数为A1的双蒸水、重量份数为A2的蜂蜜、重量份数为A3低密度脂蛋白、重量份数为A4恩诺沙星加入容器，通过搅拌装置调配制得第一混合溶液；
步骤S2、预设组份B的重量份数为Bi，分别配置重量份数为B1的TE液、重量份数为B2的HePeS液、重量份数为B3的三羟甲基氨基甲烷、重量份数为 B4的BSA加入容器，通过搅拌装置调配制得第二混合溶液；
步骤S3、预设组份C的重量份数为Cj，分别配置重量份为C1的数阿拉伯糖、重量份为C2的鞣酸、重量份为C3的左旋肉碱、重量份为C4的甾醇、重量份为 C5的松弛素、重量份为C6的鼠李糖加入第一混合溶液的容器内，通过搅拌装置调配制得第三混合溶液；
步骤S4、预设组份D的重量份数为Dm，分别配置重量份数为D1的亮肽素、重量份数为D2的肌肽以及配制好的第二溶液分别倒入第三混合溶液的容器内，轻微混匀后用无菌滤器过滤制成第四混合溶液；
步骤S5、制成稀释液后放入低温环境备用。
具体而言，在步骤S1中，第一混合溶液中各组份重量份数为双蒸水60-100mL、蜂蜜2-8g、低密度脂蛋白5-10g、恩诺沙星20-200mg；
步骤S2中，第二混合溶液中各组份重量份数为TE液5-20mL、HePeS液5-25mL、三羟甲基氨基甲烷1-4g、BSA100-500mg；
步骤S3中，第三混合溶液中各组份重量份数为阿拉伯糖0.5-5g、鞣酸0.3-1g、左旋肉碱200-500mg、甾醇200-600mg、松弛素50-200mg、鼠李糖2-5g；
步骤S4中，第四混合溶液中各组份重量份数为亮肽素50-150mg、肌肽 50-150mg。
具体而言，在步骤S1中，当调配第一混合溶液时，设置预设双蒸水的温度 F0实时获取双蒸水的实际温度F，若F＜F0时，对双蒸水的温度进行升温处理，若F≥F0时，对双蒸水进行恒温处理，并分别按预设重量份数加入蜂蜜、低密度脂蛋白、恩诺沙星。
具体而言，当进行第一混合溶液的组份物质调配时，设定第一混合溶液的拌时长为Ta，在设定的搅拌时长Ta完成后，记录实际搅拌漩涡底角至容器内壁底端的第一距离Qa，将第一距离与预设距离对比，判断是否进行二次搅拌，设置第一预设距离Q1和第二预设距离Q2，第一混合溶液的第一预设二次搅拌时长Ta1 和第一混合溶液的第二预二次搅拌时长Ta2，Q1＞Q2，Ta1＞Ta2，
若Qa≤Q2，不进行二次搅拌；
若Q1＞Qa＞Q2，采用第一混合溶液的第一预设二次搅拌时长Ta1作为二次搅拌时长；
若Q1≤Qa，采用第一混合溶液的第二预二次搅拌时长Ta2作为二次搅拌时长；
在二次搅完成时，若Qa≤Q2，判断为第一混合溶液各组份重量份数配置不需要调整；
若Q1＞Qa＞Q2，判断第一混合溶液各组份重量份数配置是否需要调整；
若Qa＜Q1，将调节后的第一混合溶液的拌时长设置为Ta+Tai，其中i＝1，2。
具体而言，当判断第一混合溶液各组份重量份数配置是否需要调整时，获取实际调配第一混合溶液的重量份数Ai、获取当前搅拌速度为Z，设定搅拌降速系数α，将临时调节的搅拌速度设置为Za，Za＝Z×α，以搅拌速度为Za、搅拌时长为Tai开始搅拌第一混合溶液，在搅拌过程中记录实际搅拌漩涡底角至容器内壁底端的第二距离Qb，根据第一距离Qa与第二距离Qb比对结果，判断是否需要对第一混合溶液各组份重量份数进行调整，
若Qa＜Qb，则确定不对调配第一混合溶液的重量份数进行调整；
若Qa≥Qb，则进一步判断是否对调配第一混合溶液的重量份数进行调整，
当进一步判断是否对调配第一混合溶液的重量份数进行调整时，计算第一距离Qa和第二距离Qb的距离差值Qs，并根据该距离差值和预设距离差值的比对结果进一步判断，设置第一预设差值Qs1、第二预设差值Qs2、设置第一预设重量份数调节系数Axi以及第二预设调节系数Ayi，设定Qs1＜QS2，Axi＜Ayi，
若Qs＜Qs1，判定不对第一混合溶液的重量份数进行调整，
若Qs1≤Qs＜Qs2，采用第一预设重量份数调节系数Axi作为Ai重量份数的调节系数，并将调节后的第一混合溶液的重量份数设置为Ai×Axi；
若Qs2≤Qs，采用第二预设重量份数调节系数Ayi作为Ai重量份数的调节系数，并将调节后的第一混合溶液的重量份数设置为Ai×Ayi。
具体而言，在步骤S2中，当调配第二混合溶液时，获取实际调配第二混合溶液的重量份数Bi，计算组份添加物中，第二混合溶液的重量份数的添加物的实际添加量与预设添加量的差值△Bi，
当△Bi＜0时，按照以下公式计算负偏移参量Bp，
其中Bαi为第i添加物的权重系数，bm1为△Bi＜0的个数；
当△Bi>0时，按照以下公式计算正偏移参量Bn，
其中Bβi为第i添加物的权重系数，am2为△Bi＞0的个数；
设定Wb＝Bp+Bn，其中Wb为第二混合溶液时调配混合物的份数偏差影响系数，设置调配第二混合溶液时调配混合物的第一预设份数偏差影响系数Wb1，第二预设份数偏差影响系数Wb2，调配第二混合溶液时的第一预设重量份数调节系数 Bxi，第二预设重量份数调节系数Byi，设定Wb1＜Wb2，Bxi＜Byi，
若Wb＜Wb1判定不对Bi进行调整；
若Wb1≤Wb＜Wb2，采用第一预设调配第二混合溶液时的重量份数调节系数 BXi作为Bi重量份数的调节系数，并将调节后的第二混合溶液的重量份数设置为Bi×Bxi；
若Wb2≤Wb，采用第二预设调配第二混合溶液时的重量份数调节系数BYi作为Bi重量份数的调节系数，并将调节后的第二混合溶液的重量份数设置为 Bi×Byi。
具体而言，在确定第一混合溶液的重量份数设置为Bi后，设定第二混合溶液的搅拌时长为Tb，在设定搅拌时长Tb完成时，获取第二混合溶液的颗粒物占比BK，通过颗粒物占比与预设的颗粒物占比的对比判断是否进行二次搅拌，设置第一预设颗粒物占比K1、第二预设颗粒物占比K2，第二混合溶液的第一预设二次搅拌时长Tb1和第二混合溶液的第二预二次搅拌时长Tb2，设定K1＜K2，Tb1 ＞Tb2，
若BK＜K1，不对搅拌时长进行调整；
若K1≤BK＜K2，采用第二混合溶液的第一预设二次搅拌时长Tb1作为二次搅拌时长，在设定的二次搅拌时长Tb1完成时，将调整过后的第二混合溶液的搅拌时长设置为Tb+Tb1；
若K2≤BK，采用第二混合溶液的第二预设二次搅拌时长Tb2作为二次搅拌时长，在设定的二次搅拌时长Tb2完成时，将调整过后的第二混合溶液的搅拌时长设置为Tb+T2。
具体而言，在步骤S3中，当调配第三混合溶液时，获取实际调配第三混合溶液的重量份数Cj，计算组份添加物中，第三混合溶液的重量份数的添加物的实际添加量与预设添加量的差值△Cj，
当△Cj＜0时，按照以下公式计算负偏移参量Cp，
其中Cαj为第j添加物的权重系数，cm1为△Cj＜0的个数；
当△Cj>0时，按照以下公式计算正偏移参量Cn，
其中Cβj为第j添加物的权重系数，cm2为△Cj＞0的个数；
设定Wc＝Cp+Cn，其中Wc为第三混合溶液时调配混合物的份数偏差影响系数，设置第一预设调配第三混合溶液时调配混合物的份数偏差影响系数Wc1，第二预设调配第三混合溶液时调配混合物的份数偏差影响系数Wc2，第一预设调配第三混合溶液时的重量份数调节系数CXj，第二预设调配第三混合溶液时的重量份数调节系数CYj，设定Wc1＜Wc2，
若Wc＜Wc1，判定不对Cj进行调整；
若Wc1≤Wc＜Wc2，采用第一预设调配第三混合溶液时的重量份数调节系数 CXj作为Cj重量份数的调节系数，并将设定后的调配第三混合溶液时的重量份数设置为Cj×CXj；
若Wc2≤Wc，采用第二预设调配第三混合溶液时的重量份数调节系数CYj作为Cj重量份数的调节系数，并将设定后的调配第三混合溶液时的重量份数设置为Cj×CYj。
具体而言，在确定第三混合溶液的重量份数设置为Cj后，设定第三混合溶液的搅拌时长为Tc，在设定搅拌时长Tc完成时，获取搅拌装置后第三混合溶液时溶液的颗粒物占比为CK，判断是否进行二次搅拌，设置第三混合溶液的第一预设二次搅拌时长Tc1和第三混合溶液的第二预二次搅拌时长Tc2，设定Tc1＞ Tc2；
若CK＜K1，不对搅拌时长进行调整；
若K1≤CK＜K2，采用三混合溶液的第一预设二次搅拌时长Tc1作为二次搅拌时长，在设定的二次搅拌时长Tc1完成时，将调整过后的第二混合溶液的搅拌时长设置为Tc+Tc1，
若K2≤CK，采用三混合溶液的第二预设二次搅拌时长Tc2作为二次搅拌时长，在设定的二次搅拌时长Tc2完成时，将调整过后的第二混合溶液的搅拌时长设置为Tc+Tc2。
具体而言，S5步骤中制成稀释液后放入低温环境的温度为-20度。
具体而言，本发明提供一种牛用精液低温保存稀释液的使用方法，包括：
在精液采集阶段，将成活率高于65％的采集精液放入离心机以500r/min的速度搅拌3min，弃去上层精清后低温保存；
在对精液稀释过程中，将稀释液从低温环境中取出放入35度的水浴锅中预热，待预热完成后按1：5比例缓慢倒入精液中轻微混匀制成精液稀释溶液，将精液稀释溶液放入含有300mL35度温水的烧杯后放入冰箱，控制冰箱按照0.5-1 度/min速度降温，降温到4度后再加入等体积温度相同稀释液，并在烧杯中加入冰块，使稀释液保持在0度环境保存；
使用时将稀释后的精液取出在35度水浴锅中解冻20s镜检，活率0.5以上的用于输精，每次输精量为0.25mL。
在牛用精液低温保存稀释液的制备前，确定各过程调配混合溶液组份重量份数使用范围为，第一混合溶液各添加物重量份数数份为双蒸水的60-100mL、蜂蜜2-8g、低密度脂蛋白5-10g、恩诺沙星20-200mg；第二混合溶液各添加物重量份数数份为TE液5-20mL、HePeS液5-25mL、三羟甲基氨基甲烷1-4g、 BSA100-500mg；第三混合溶液各添加物重量份数数份为阿拉伯糖0.5-5g、鞣酸 0.3-1g、左旋肉碱200-500mg、甾醇200-600mg、松弛素50-200mg、鼠李糖2-5g；第四混合溶液各添加物重量份数数份为亮肽素50-150mg、肌肽50-150mg。
以下通过具体的实施例一对本发明的技术方案作进一步说明：
先将60毫升双蒸水倒入容器中，设定磁力搅拌的温度为25度对双蒸水进行恒温处理，待温度恒定后，放入再向容器中加入2克蜂蜜、5克低密度脂蛋白、 20毫克恩诺沙星，预设搅拌时长为30秒通过磁力搅拌机调配第一混合溶液；
再将5毫升TE液、5毫升HePeS液、1克三羟甲基氨基甲烷、100毫克BSA 加入容器，预设搅拌时长为30秒通过磁力搅拌机调配第二混合溶液；
进一步的，将0.5克阿拉伯糖、0.3克鞣酸、200毫克左旋肉碱、200毫克甾醇、50毫克松弛素、2克鼠李糖加入第一混合溶液的容器内，预设搅拌时长为 10秒通过磁力搅拌机通过搅拌装置调配第三混合溶液；
最后分别将第二混合溶液和50毫克亮肽素、50毫克肌肽分别倒入第三混合溶液的容器内，轻微混匀后用无菌滤器过滤制成稀释液，制成稀释液后放入-20 度冰箱备用。
具体实验例如下：
本发明的牛用精液低温保存稀释液能够体外较长时间保存牛精液，随着保存天数增加，精子活率、DNA完整性和顶体完整率呈现下降趋势，低温保存288h 后精子活率为53％，显著高于冻精解冻后精子活率(P<0.05)，在DNA完整性和顶体完整率方面保存288h后与冻精解冻后基本一致。保存不同天数精子各指标情况如下表所示。
使用本发明的牛用精液低温保存稀释液保存牛精液288h和冷冻精液对50头发情母牛进行人工输精，两组受胎率分别为58％和42％，产犊数为27和18头。使用本发明稀释液受胎率和产犊率明显高于冷冻精液，本发明稀释液低温保存牛精液后人工输精能够有不错的效果。稀释液低温保藏后精液人工输精效果如下表所示。
| 项目 | 样本数(个) | 时间(h) | 受胎率(％) | 产犊数 |
| 低温保存稀释液 | 50 | 288 | 58 | 27 |
| 常规冻精 | 50 | 解冻后使用 | 42 | 18 |
至此，已经结合附图所示的优选实施方式描述了本发明的技术方案，但是，本领域技术人员容易理解的是，本发明的保护范围显然不局限于这些具体实施方式。在不偏离本发明的原理的前提下，本领域技术人员可以对相关技术特征做出等同的更改或替换，这些更改或替换之后的技术方案都将落入本发明的保护范围之内。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明；对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种牛用精液低温保存稀释液的制备方法，其特征在于，包括：
步骤S1、预设组份A的重量份数为Ai，分别配置重量份数为A1的双蒸水、重量份数为A2的蜂蜜、重量份数为A3低密度脂蛋白、重量份数为A4恩诺沙星加入容器，通过搅拌装置调配制得第一混合溶液；
步骤S2、预设组份B的重量份数为Bi，分别配置重量份数为B1的TE液、重量份数为B2的HePeS液、重量份数为B3的三羟甲基氨基甲烷、重量份数为B4的BSA加入容器，通过搅拌装置调配制得第二混合溶液；
步骤S3、预设组份C的重量份数为Cj，分别配置重量份为C1的数阿拉伯糖、重量份为C2的鞣酸、重量份为C3的左旋肉碱、重量份为C4的甾醇、重量份为C5的松弛素、重量份为C6的鼠李糖加入第一混合溶液的容器内，通过搅拌装置调配制得第三混合溶液；
步骤S4、预设组份D的重量份数为Dm，分别配置重量份数为D1的亮肽素、重量份数为D2的肌肽以及配制好的第二溶液分别倒入第三混合溶液的容器内，轻微混匀后用无菌滤器过滤制成第四混合溶液；
步骤S5、制成稀释液后放入低温环境备用。
2.根据权利要求1所述的牛用精液低温保存稀释液的制备方法，其特征在于，在所述步骤S1中，所述第一混合溶液中各组份重量份数为双蒸水60-100mL、蜂蜜2-8g、低密度脂蛋白5-10g、恩诺沙星20-200mg；
所述步骤S2中，所述第二混合溶液中各组份重量份数为TE液5-20mL、HePeS液5-25mL、三羟甲基氨基甲烷1-4g、BSA100-500mg；
所述步骤S3中，所述第三混合溶液中各组份重量份数为阿拉伯糖0.5-5g、鞣酸0.3-1g、左旋肉碱200-500mg、甾醇200-600mg、松弛素50-200mg、鼠李糖2-5g；
所述步骤S4中，所述第四混合溶液中各组份重量份数为亮肽素50-150mg、肌肽50-150mg。
3.根据权利要求2所述的牛用精液低温保存稀释液的制备方法，其特征在于，在所述步骤S1中，当调配所述第一混合溶液时，设置预设双蒸水的温度F0实时获取双蒸水的实际温度F，若F＜F0时，对双蒸水的温度进行升温处理，若F≥F0时，对双蒸水进行恒温处理，并分别按预设重量份数加入蜂蜜、低密度脂蛋白、恩诺沙星，
当进行所述第一混合溶液的组份物质调配时，设定第一混合溶液的拌时长为Ta，在设定的搅拌时长Ta完成后，记录实际搅拌漩涡底角至容器内壁底端的第一距离Qa，将第一距离与预设距离对比，判断是否进行二次搅拌，设置第一预设距离Q1和第二预设距离Q2，第一混合溶液的第一预设二次搅拌时长Ta1和第一混合溶液的第二预二次搅拌时长Ta2，Q1＞Q2，Ta1＞Ta2，
若Qa≤Q2，不进行二次搅拌；
若Q1＞Qa＞Q2，采用第一混合溶液的第一预设二次搅拌时长Ta1作为二次搅拌时长；
若Q1≤Qa，采用第一混合溶液的第二预二次搅拌时长Ta2作为二次搅拌时长；
在二次搅完成时，若Qa≤Q2，判断为第一混合溶液各组份重量份数配置不需要调整；
若Q1＞Qa＞Q2，判断第一混合溶液各组份重量份数配置是否需要调整；
若Qa＜Q1，将调节后的第一混合溶液的拌时长设置为Ta+Tai，其中i＝1，2。
4.根据权利要求3所述的牛用精液低温保存稀释液的制备方法，其特征在于，当判断第一混合溶液各组份重量份数配置是否需要调整时，获取实际调配第一混合溶液的重量份数Ai、获取当前搅拌速度为Z，设定搅拌降速系数α，将临时调节的搅拌速度设置为Za，Za＝Z×α，以搅拌速度为Za、搅拌时长为Tai开始搅拌第一混合溶液，在搅拌过程中记录实际搅拌漩涡底角至容器内壁底端的第二距离Qb，根据第一距离Qa与第二距离Qb比对结果，判断是否需要对第一混合溶液各组份重量份数进行调整，
若Qa＜Qb，则确定不对调配第一混合溶液的重量份数进行调整；
若Qa≥Qb，则进一步判断是否对调配第一混合溶液的重量份数进行调整，
当进一步判断是否对调配第一混合溶液的重量份数进行调整时，计算第一距离Qa和第二距离Qb的距离差值Qs，并根据该距离差值和预设距离差值的比对结果进一步判断，设置第一预设差值Qs1、第二预设差值Qs2、设置第一预设重量份数调节系数Axi以及第二预设调节系数Ayi，设定Qs1＜QS2，Axi＜Ayi，
若Qs＜Qs1，判定不对第一混合溶液的重量份数进行调整，
若Qs1≤Qs＜Qs2，采用第一预设重量份数调节系数Axi作为Ai重量份数的调节系数，并将调节后的第一混合溶液的重量份数设置为Ai×Axi；
若Qs2≤Qs，采用第二预设重量份数调节系数Ayi作为Ai重量份数的调节系数，并将调节后的第一混合溶液的重量份数设置为Ai×Ayi。
5.根据权利要求4所述的牛用精液低温保存稀释液的制备方法，其特征在于，在所述步骤S2中，当调配所述第二混合溶液时，获取实际调配第二混合溶液的重量份数Bi，计算所述组份添加物中，第二混合溶液的重量份数的添加物的实际添加量与预设添加量的差值△Bi，
当△Bi＜0时，按照以下公式计算负偏移参量Bp，
其中Bαi为第i添加物的权重系数，bm1为△Bi＜0的个数；
当△Bi>0时，按照以下公式计算正偏移参量Bn，
其中Bβi为第i添加物的权重系数，am2为△Bi＞0的个数；
设定Wb＝Bp+Bn，其中Wb为第二混合溶液时调配混合物的份数偏差影响系数，设置调配第二混合溶液时调配混合物的第一预设份数偏差影响系数Wb1，第二预设份数偏差影响系数Wb2，调配第二混合溶液时的第一预设重量份数调节系数Bxi，第二预设重量份数调节系数Byi，设定Wb1＜Wb2，Bxi＜Byi，
若Wb＜Wb1判定不对Bi进行调整；
若Wb1≤Wb＜Wb2，采用第一预设调配第二混合溶液时的重量份数调节系数BXi作为Bi重量份数的调节系数，并将调节后的第二混合溶液的重量份数设置为Bi×Bxi；
若Wb2≤Wb，采用第二预设调配第二混合溶液时的重量份数调节系数BYi作为Bi重量份数的调节系数，并将调节后的第二混合溶液的重量份数设置为Bi×Byi。
6.根据权利要求5所述的牛用精液低温保存稀释液的制备方法，其特征在于，在确定第一混合溶液的重量份数设置为Bi后，设定第二混合溶液的搅拌时长为Tb，在设定搅拌时长Tb完成时，获取第二混合溶液的颗粒物占比BK，通过颗粒物占比与预设的颗粒物占比的对比判断是否进行二次搅拌，设置第一预设颗粒物占比K1、第二预设颗粒物占比K2，第二混合溶液的第一预设二次搅拌时长Tb1和第二混合溶液的第二预二次搅拌时长Tb2，设定K1＜K2，Tb1＞Tb2，
若BK＜K1，不对搅拌时长进行调整；
若K1≤BK＜K2，采用第二混合溶液的第一预设二次搅拌时长Tb1作为二次搅拌时长，在设定的二次搅拌时长Tb1完成时，将调整过后的第二混合溶液的搅拌时长设置为Tb+Tb1；
若K2≤BK，采用第二混合溶液的第二预设二次搅拌时长Tb2作为二次搅拌时长，在设定的二次搅拌时长Tb2完成时，将调整过后的第二混合溶液的搅拌时长设置为Tb+T2。
7.根据权利要求6所述的牛用精液低温保存稀释液的制备方法，其特征在于，在所述步骤S3中，当调配所述第三混合溶液时，获取实际调配第三混合溶液的重量份数Cj，计算所述组份添加物中，第三混合溶液的重量份数的添加物的实际添加量与预设添加量的差值△Cj，
当△Cj＜0时，按照以下公式计算负偏移参量Cp，
其中Cαj为第j添加物的权重系数，cm1为△Cj＜0的个数；
当△Cj>0时，按照以下公式计算正偏移参量Cn，
其中Cβj为第j添加物的权重系数，cm2为△Cj＞0的个数；
设定Wc＝Cp+Cn，其中Wc为第三混合溶液时调配混合物的份数偏差影响系数，设置第一预设调配第三混合溶液时调配混合物的份数偏差影响系数Wc1，第二预设调配第三混合溶液时调配混合物的份数偏差影响系数Wc2，第一预设调配第三混合溶液时的重量份数调节系数CXj，第二预设调配第三混合溶液时的重量份数调节系数CYj，设定Wc1＜Wc2，
若Wc＜Wc1，判定不对Cj进行调整；
若Wc1≤Wc＜Wc2，采用第一预设调配第三混合溶液时的重量份数调节系数CXj作为Cj重量份数的调节系数，并将设定后的调配第三混合溶液时的重量份数设置为Cj×CXj；
若Wc2≤Wc，采用第二预设调配第三混合溶液时的重量份数调节系数CYj作为Cj重量份数的调节系数，并将设定后的调配第三混合溶液时的重量份数设置为Cj×CYj。
8.根据权利要求7所述的牛用精液低温保存稀释液的制备方法，其特征在于，在确定第三混合溶液的重量份数设置为Cj后，设定第三混合溶液的搅拌时长为Tc，在设定搅拌时长Tc完成时，获取搅拌装置后第三混合溶液时溶液的颗粒物占比为CK，判断是否进行二次搅拌，设置第三混合溶液的第一预设二次搅拌时长Tc1和第三混合溶液的第二预二次搅拌时长Tc2，设定Tc1＞Tc2；
若CK＜K1，不对搅拌时长进行调整；
若K1≤CK＜K2，采用三混合溶液的第一预设二次搅拌时长Tc1作为二次搅拌时长，在设定的二次搅拌时长Tc1完成时，将调整过后的第二混合溶液的搅拌时长设置为Tc+Tc1，
若K2≤CK，采用三混合溶液的第二预设二次搅拌时长Tc2作为二次搅拌时长，在设定的二次搅拌时长Tc2完成时，将调整过后的第二混合溶液的搅拌时长设置为Tc+Tc2。
9.根据权利要求8所述的牛用精液低温保存稀释液的制备方法，其特征在于，所述S5步骤中制成稀释液后放入低温环境的温度为-20度。
10.根据权利要求1-9任一项制备的牛用精液低温保存稀释液的使用方法，其特征在于，包括：
在精液采集阶段，将成活率高于65％的采集精液放入离心机以500r/min的速度搅拌3min，弃去上层精清后低温保存；
在对精液稀释过程中，将稀释液从低温环境中取出放入35度的水浴锅中预热，待预热完成后按1：5比例缓慢倒入精液中轻微混匀制成精液稀释溶液，将精液稀释溶液放入含有300mL35度温水的烧杯后放入冰箱，控制冰箱按照0.5-1度/min速度降温，降温到4度后再加入等体积温度相同稀释液，并在烧杯中加入冰块，使稀释液保持在0度环境保存；
使用时将稀释后的精液取出在35度水浴锅中解冻20s镜检，活率0.5以上的用于输精，每次输精量为0.25mL。
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