CN107873698A - 一种施氏鲟精子冷冻保存液及施氏鲟精子的长期冷冻保存方法 - Google Patents

一种施氏鲟精子冷冻保存液及施氏鲟精子的长期冷冻保存方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种施氏鲟精子冷冻保存液及施氏鲟精子的长期冷冻保存方法。每升施氏鲟精子冷冻保存液的pH为7.5～8.5，包括如下组分：20～30mM蔗糖，0.1～0.5mM氯化钾，20～40mM Tris‑HCl，5～10g/L牛血清白蛋白，2.5～10mM还原型谷胱甘肽和抗冻成分，其余为超纯水；抗冻成分选自10体积％甲醇、15体积％DMSO、15体积％DMSO与10体积％新鲜蛋黄的混合、15体积％丙二醇、15体积％丙二醇与10体积％新鲜蛋黄的混合中的任意一种。本发明施氏鲟精子冷冻保存液成分明确、可保护精子免受冰晶及氧化等损伤，冻存后的精子解冻复苏后受精率可达45.87％，并可孵出健康鱼苗，将施氏鲟精子冷冻保存液应用于施氏鲟精子的长期冷冻保存时，具有简便易行、无需贵重仪器即可完成冻存的优点，适于大规模应用。

Description

一种施氏鲟精子冷冻保存液及施氏鲟精子的长期冷冻保存 方法
技术领域
本发明属于生物学低温冷冻保存技术领域，更具体地说，本发明涉及一种施氏鲟精子冷冻保存液及其制备方法和在施氏鲟精子的长期冷冻保存方法中的应用。
背景技术
鲟鱼起源于泥盆纪(距今4.5-3.5亿年)，是软骨硬鳞下纲中现存的唯一一个目，素有“活化石”之称。目前，鲟鱼共有27种，分为两个家族，一是鲟科，包括25种，另一是白鲟科，包括2种。鲟鱼籽酱是动物来源的全球最知名的“奢侈”食品之一，被美誉为“黑色黄金”，因此，过度捕捞等人为因素造成野生鲟鱼数量的显著下降。目前，世界自然保护联盟(IUCN)在最新统计中(2017.2)将野生鲟鱼品种中的85％列为濒危物种，濒危野生动植物国际贸易公约(CITES)也在最新报告中(2017.1)列为附录II保护动物。野生数量上的减少和巨大的经济利益驱使世界鲟鱼养殖这一新兴产业的迅猛发展，近年来，鲟鱼养殖和鱼籽酱生产作为新兴产业，在我国也发展迅速。目前我国鲟鱼商品鱼养殖年产量已突破2万吨，占世界鲟鱼总产量的66.17％，占养殖总产量的72.46％，成为最大的鲟鱼养殖国和鱼籽酱出口国。
施氏鲟(Acipenser schrenckii)隶属于鲟形目(Acipenseriformes)、鲟科(Acipenseridae)、鲟属(Acipenser)，是我国现存鲟鱼中最具有经济价值的优质珍稀鱼类，分布于黑龙江、乌苏里江和松花江等水域。施氏鲟也是我国鲟鱼养殖产业中广泛使用的杂交亲本，具有个体大、生长快、抗逆性强、肉质鲜美及鱼籽酱产量高等优点、深受养殖户的欢迎。施氏鲟繁育具有季节性，在繁育季节，性能优良的雄性施氏鲟一次排精量可达300-400mL，精子浓度可达109个/mL数量级，可同时供应10-15尾雌性鲟鱼卵的授精。但是在实际繁育过程中存在一个问题，就是即使采用注射催产激素用于同步繁育，也极易导致雌雄亲鱼性腺成熟不同步，或是雄鱼成熟了，雌鱼尚未排卵，或是有了成熟的雌鱼，却没有可用的雄鱼。两者之间时间相差短的为几小时，或是1-2天，长的甚至可达上十天。此外施氏鲟精子一旦被挤出体外，低温保存的时间非常有限。尤其是在施氏鲟繁育淡季，雄性个体精液品质大大下降，主要表现在精子浓度低、精子活性显著下降，从而极大地影响了授精效率及鱼苗的成活率。这些无疑极大地影响着企业的生产效益，增加了养殖以及产品成本。因此，施氏鲟人工繁育技术的进步与发展对其物种资源保护以及商业应用均非常关键。
精液超低温冷冻保存技术是有效解决办法之一。在施氏鲟繁育当季，将优质鲟鱼个体的精液大批量冷冻，并长期保存。当有杂交繁育需要时，特别是在繁育淡季，解冻优质施氏鲟冷冻保存精子用于全年的繁育生产需要。国内外学者在淡水和海水经济鱼类以及濒危鱼类的精液冷冻保存技术方面做了大量的工作，鲟鱼类精液冷冻保存技术的研究起步较晚，但近年来也先后有八种鲟鱼的精液冷冻保存技术得到了广泛的研究，如西伯利亚鲟、白鲟、达氏鳇、波斯鲟、短吻鲟、小体鲟，以及我国的中华鲟和达氏鲟。研究表明，不同鲟鱼物种，其精液的冷冻保存方法和效果千差万别。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种成分明确、可保护精子免受冰晶及氧化等损伤，可简单有效地实现施氏鲟精子长期冷冻保存的冷冻保存液及其保存方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供了一种施氏鲟精子冷冻保存液，每升所述施氏鲟精子冷冻保存液的pH为7.5～8.5，包括如下组分：20～30mM蔗糖，0.1～0.5mM氯化钾，20～40mMTris-HCl，5～10g/L牛血清白蛋白，2.5～10mM还原型谷胱甘肽和抗冻成分，其余为超纯水；
所述抗冻成分按体积比添加，选自10体积％甲醇、15体积％DMSO、15体积％DMSO与10体积％新鲜蛋黄的混合、15体积％丙二醇、15体积％丙二醇与10体积％新鲜蛋黄的混合中的任意一种。
本发明还提供了上述施氏鲟精子冷冻保存液的制备方法，其包括如下步骤：
将蔗糖、氯化钾、Tris-HCl和还原型谷胱甘肽和超纯水加入容器中，搅拌溶解后依次加入牛血清白蛋白和抗冻成分，调节pH至7.5～8.5，定容，得到施氏鲟精子冷冻保存液。
本发明施氏鲟精子冷冻保存液可应用于施氏鲟精子长期冷冻保存中。
本发明还提供了一种施氏鲟精子的长期冷冻保存方法，其包括如下步骤：
取精子活力大于90％的施氏鲟精液，将施氏鲟精液用施氏鲟精液冷冻保存液按照1:1的体积比稀释后，分装至0.5mL冻存细管中，采用分段平衡冻存法冻存施氏鲟精子，即先将冻存细管置于0℃的冰水混合物中平衡5～10min，再置于液氮表面10cm处平衡5～10min，最后将冻存细管浸入-196℃液氮长期冷冻保存。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明施氏鲟精子冷冻保存液成分明确，通过加入牛血清白蛋白和还原型谷胱甘肽，可保护精子免受冰晶及氧化等损伤。
(2)本发明方法实现了施氏鲟精子的长期冷冻保存和应用，可实现施氏鲟种质资源的永久保存，且冻存的施氏鲟精子支持受精卵的发育并能孵出健康鱼苗，具有良好的市场前景和应用价值。
(3)本发明方法在没有程序降温仪或计算机控制程序降温仪的情况下，冻存的施氏鲟精子解冻复苏后受精率可达45.87％，可与现有技术使用程序性冷冻降温仪的精子受精效果45％相媲美，因此易于推广，尤其适用于小型渔场或在离实验室很远的野外条件下，实现对施氏鲟精子的快速冷冻，具有操作简便易行、冷冻效果好、成本低廉等优点。
(4)本发明施氏鲟精子的长期冷冻保存方法可将施氏鲟作为广泛的杂交父本应用于施氏鲟的人工繁育中，在繁育季节大量保存优质精液，可用于施氏鲟全年的繁育生产，尤其适用于反季节繁育。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。
本发明及实施例涉及的主要试剂和耗材信息：
促黄体素释放激素类似物(LHRH)购于宁波激素厂；CBSTM高安全性冻存细管及冻存辅助产品购于上海卡苏生物科技公司；蔗糖、氯化钾、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、牛血清白蛋白(BSA)、还原型谷胱甘肽、甲醇、二甲基亚砜(DMSO)、丙二醇试剂(细胞培养级别)购于美国阿拉丁(上海)公司。
以下实施例中的技术方案，如未特殊说明，均为常规技术，所用试剂如未特殊说明均购自生化公司。
实施例1～5
每升施氏鲟冷冻保存液的配方：
20～30mM蔗糖，0.1～0.5mM氯化钾，20～40mM三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)，5～10g/L牛血清白蛋白(BSA)，2.5～10mM还原型谷胱甘肽(Glu)，抗冻成分(按体积比添加)：10％甲醇(MT)，或者15％二甲基亚砜(DMSO)，或者15％二甲基亚砜(DMSO)+10％新鲜蛋黄，或者15％丙二醇(PG)，或者15％丙二醇+10％新鲜蛋黄，其余为超纯水。用HCl调整pH至7.5～8.5。
配制方法：
牛血清白蛋白(BSA)100g/L母液：称取10g BSA粉末，放入200mL干燥的玻璃瓶中，先加入80mL的超纯水，于磁力搅拌器上搅拌溶解，然后于容量瓶中定容至100mL。
KCl 25mM母液：称取0.18g KCl(分子量为74.55)固体，放入200mL干燥的玻璃瓶中，先加入80mL的超纯水，于磁力搅拌器上搅拌溶解，然后于容量瓶中定容至100mL。
表1实施例1～5施氏鲟冷冻保存液配方
以下以实施例1为例说明施氏鲟冷冻保存液的制备方法：
配制500mL的施氏鲟冷冻保存液：首先将4.28g蔗糖(分子量为342.3)，2.36gTris-HCl(分子量为157.6)，0.77g Glu(分子量为307.32)，加入5mL KCl 25mM母液，放入1000mL干燥的玻璃瓶中，先加入约350mL的超纯水，于磁力搅拌器上搅拌溶解，全部溶解后再加入50mL牛血清白蛋白(BSA)100g/L母液，轻柔搅拌溶解，再加入50mL甲醇，用HCl调整溶液pH值至8.0，放入容量瓶中定容至500mL，即成实施例1的施氏鲟冷冻保存液。
本发明施氏鲟冷冻保存液可在精液采集的前一天准备，即现用现配，4℃预冷保存。
实验例
以液氮超低温(-196℃)冷冻保存100mL施氏鲟精液为例，以实施例1为例，说明施氏鲟精子冷冻保存液的应用方法。
1)鲜精的采集：
在施氏鲟繁育季节，对雄性亲鱼进行B超检查性腺发育状况，挑选个体大、成熟度较好的雄鱼亲鱼(全长139-158cm)进行人工催产，采用胸鳍基部肌肉注射促黄体释放激素类似物(LHRH)，注射剂量为2.5mg/kg，36h后进行精液采集。采集精液时，用干毛巾擦净亲鱼生殖孔周围，轻轻挤压亲鱼腹部，通过一个直径为1-2cm的导液管连接将精液收集至500mL的无菌密闭塑料瓶，立即暂放4℃冰箱保存。
2)精液品质检测：
对上述采集的精液精子活力进行检测，在10倍显微镜暗视野下用水激活精子，观察并记录快速直线运动的精子数量占视野下全部精子的百分比，0分代表活力为0％，10分代表精子活力为100％。精子活力大于90％被认为是品质较好的精液用于冷冻保存。
3)精液的冷冻保存方法：
a)稀释和装细管：
将施氏鲟精子冷冻保存液以体积比1:1分别稀释精液，注：顺序一定是将冷冻保护液缓慢滴加入鲜精中，边滴边晃，直至稀释完成。
精液与冷冻保存液混匀后，立即分装至0.5mL的CBSTM高安全性冻存细管中(同一雄性个体精液用同一颜色冻存细管，方便记录和使用)，365只冻存细管可装入一个CBSTM高安全性冻存塑料杯中。并迅速进入冷平衡阶段。
b)分段平衡冻存法：
将塑料杯平放在泡沫盒里冰水混合物中(0℃)平衡5-10min；
迅速转移塑料杯并平置于液氮面上约10cm处平衡5-10min；此处需要钢尺事先协助测量液面高度，确定塑料杯平置的准确停置位置。
c)长期冷冻保存：
最后，将塑料杯快速浸入液氮(-196℃)以长期保存，连接塑料杯的棉绳用于标记鲟鱼精液信息。液氮环境可以允许施氏鲟精液的长时间保存，如可保存1月、几月、一年，几年，甚至几十年，可以在纯种或杂交繁育需要时立刻解冻精液，应用于生产。
4)冷冻保存精液的繁育应用
雌性施氏鲟配子的获取：从亲鱼群体中挑选卵子达到IV期的雌性亲鱼(全长142-162cm)，采用胸鳍基部肌肉注射促黄体释放激素类似物(LHRH)促进卵成熟。雌亲鱼注射LHRH总剂量为5mg/kg，分2次注射，第一次注射总剂量的20％，第二次注射总剂量的80％，两次间隔12h；雌鱼第二次注射时24h后，每隔2-3h检查1次排卵情况。
将采集的成熟卵置于洁净、干燥的容器中，用于授精。
5)精子解冻复苏与活力检测
用防冻手套将保存在液氮里1小时～1年的各批次冻存的精液(冻存细管)取出，迅速浸入37℃水浴锅中解冻3秒。抽检解冻后精子的活力：随机取出三只冻存细管，用100uL枪头蘸取少许精液涂抹至载玻片上，并滴加30ul的蒸馏水激活精子，利用显微镜观察精子的活力和运动时间，随机检测该批次精子活力均达40％左右，运动时间达150sec以上，将解冻后精子用于后续的精子激活及授精应用。实施例1不同保存时间施氏鲟解冻后的精子活力结果统计如下：
表2不同保存时间的施氏鲟精子解冻后的活力统计
6)解冻后的精子激活和授精
将解冻后的精液加入盛放成熟卵的容器中，有效精子(即按解冻后仍有活力的精子计算)和卵子的比例约为3×105，快速混合，随即加入激活液(Tris-HCl缓冲液，10mM，pH＝8.0)以1:300～500体积稀释冻存精液，激活精子，继续用手轻轻搅动，使精卵充分混匀，倒掉上方的污水，并用石灰水脱粘，将卵移入孵化器中孵化，直至孵出鱼苗。
利用实施例2-5配方制备施氏鲟精子冷冻保存液，按照实施例1所述方法进行精液的冷冻保存与解冻并授精，统计了不同实施例的受精结果如下：
表3实施例1～5施氏鲟精子冻存解冻后的受精率统计
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims (4)

1.一种施氏鲟精子冷冻保存液，其特征在于，每升所述施氏鲟精子冷冻保存液的pH为7.5～8.5，包括如下组分：20～30mM蔗糖，0.1～0.5mM氯化钾，20～40mM Tris-HCl，5～10g/L牛血清白蛋白，2.5～10mM还原型谷胱甘肽和抗冻成分，其余为超纯水；
所述抗冻成分选自10体积％甲醇、15体积％DMSO、15体积％DMSO与10体积％新鲜蛋黄的混合、15体积％丙二醇、15体积％丙二醇与10体积％新鲜蛋黄的混合中的任意一种。
2.权利要求1所述施氏鲟精子冷冻保存液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将蔗糖、氯化钾、Tris-HCl和还原型谷胱甘肽和超纯水加入容器中，搅拌溶解后依次加入牛血清白蛋白和抗冻成分，调节pH至7.5～8.0，定容，得到施氏鲟精子冷冻保存液。
3.权利要求1所述施氏鲟精液冷冻保存液在施氏鲟精子长期冷冻保存中的应用。
4.一种施氏鲟精子的长期冷冻保存方法，其特征在于，包括如下步骤：
取精子活力大于90％的施氏鲟精液，将施氏鲟精液用施氏鲟精子冷冻保存液按照1:1的体积比稀释后，分装至0.5mL冻存细管中，采用分段平衡冻存法冻存施氏鲟精子，即先将冻存细管置于0℃的冰水混合物中平衡5～10min，再置于液氮表面10cm处平衡5～10min，最后将冻存细管浸入-196℃液氮长期冷冻保存。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180406

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