CN103931607A - 一种鲟鱼精子玻璃化冷冻方法 - Google Patents

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Abstract

一种鲟鱼精子玻璃化冷冻方法，其是将需冻存的鲟鱼精子与抗冻保护液按体积份100:90的比例均匀稀释后，加入8体积份的鲜鸡蛋黄、45体积份的花生四烯酸、6体积份的甘油脂，混匀成精液混合液，用冷冻胶囊盛装，置于抽屉式冷冻室中冷冻，冻速为-58至-60℃/min，冷冻到-56至-58℃后，再将盛装有精液混合液的胶囊卸载在盛有液氮的杜瓦罐内，控制冻速为-148至-152℃/min，冷冻到-190至-196℃后冻存。本发明能够有效提高冻精的生存活力，解冻后的精子授精于鲜卵，其鲜卵受精接近鲜精授精，受精率可达80-90%，且胚胎发育良好。

Description

一种鲟鱼精子玻璃化冷冻方法
技术领域
本发明涉及一种鱼类杂交育种的深低温冻融技术，特别是一种鲟鱼精子玻璃化冷冻方法。
背景技术
保全生物遗传多样性及杂交育种的应用，在水产养殖中选择—170℃以下深低温冻存精子进行鱼类的繁衍，是生物技术创新应用的发展趋势。但目前，深低温保存鱼类精子也只是高度发达国家用于实验室的方法，实际应用范围却非常有限，其主要原因，是由于许多种鱼类精子在冷冻和解冻过程中会发生重大损害。损害的程度取决于冷冻速率、冷冻保护液以及融冻方法。
不少学者提出，在深低温保存冻精的过程中若能实现玻璃化，将更有利于生物遗传多样性保全和杂交育种的研究及应用，利于珍稀动物的保存。运用玻璃化冷冻的方法，如果能成功地实现低温保存遗传物质，将造福于人类。
现有的精液冷冻保护方法—缓慢冷冻方法容易形成冰晶，会导致形成胞外冰与胞内冰而损伤细胞，加之冻融过程中的晶化再结晶，影响其成活率，使得这一生物冻存技术成本昂贵，应用效率极低。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，而提供一种鲟鱼精子玻璃化冷冻方法。
本发明的技术方案是：一种鲟鱼精子玻璃化冷冻方法，其是将需冻存的鲟鱼精子与抗冻保护液按体积份100:90—120的比例均匀稀释后，加入8-12体积份的鲜鸡蛋黄、45-50体积份的花生四烯酸、6-10体积份的脂质混匀，用冷冻胶囊盛装，置于抽屉式冷冻室中冷冻，冻速为-58至-68℃/min，冷冻到-56至-70℃后，再将盛有冻液混合液的胶囊卸载在盛有液氮的杜瓦罐内，控制冻速为-148至-152℃/min，冷冻到-190至-196℃后冻存；
本发明进一步的技术方案是: 鲜鸡蛋黄的制备方法是：将0-5℃条件下储存、储存时间在3个月以内的鲜鸡蛋，去除蛋清和蛋壳后即成。
本发明再进一步的技术方案是:抗冻保护液的制备方法是：按照配比将10%的二甲基酚加入到医用生理盐水中混和均匀，再加入甘露糖醇，混和均匀即可；抗冻保护液的重量配比为:医用生理盐水:10%的二甲基酚:甘露糖醇=100:8-12:6-10。
   本发明由于采用如上方法，与现有技术相比，具有如下优点：
1、采取快速降温的方式对鲟鱼精子进行冷冻，避免冻精形成胞内冰与胞外冰伤害，能够有效提高冻精的生存活力；
2、采用抗冻保护液作为防冻剂，可以使冰相变化时有效地改变冰微粒的面积，极大地改变了精子冻存过程中形成的冰状形态，既能削弱和抑制冻精冰粒的产生，又更有效地减小冰微粒在水介质中的可溶性，让冻存的精子适用适宜的生存环境，避免结晶和重结晶，提高鲟鱼精子冷冻存活率。
3、解冻后的精子活力接近鲜精。用其授精于鲜卵，其鲜卵受精率可达80-90%，且胚胎发育良好，降低了产业化应用的生产成本，提高了冻精保存的使用价值。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明的详细结构作进一步描述。
实施例1：
一种鲟鱼精子玻璃化冷冻方法，其是将需冻存的鲟鱼精子与抗冻保护液按体积份100:90的比例均匀稀释后，加入8体积份的鲜鸡蛋黄、45体积份的花生四烯酸、6体积份的甘油脂混匀，用冷冻胶囊盛装，置于抽屉式冷冻室中冷冻，冻速为-58至-60℃/min，冷冻到-56至-58℃后，再将盛装有精液混合液的胶囊卸载在盛有液氮的杜瓦罐内，控制冻速为-148至-152℃/min，冷冻到-190至-196℃后冻存。
抗冻保护液的制备方法是：按照配比将10%的二甲基酚加入到医用生理盐水中混和均匀，再加入甘露糖醇，混和均匀即可；抗冻保护液的重量配比为:医用生理盐水:10%的二甲基酚：甘露糖醇=100:8:6。
实施例2：
一种鲟鱼精子玻璃化冷冻方法，其是将需冻存的鲟鱼精子与抗冻保护液按体积份100:100的比例均匀稀释后，加入9体积份的鲜鸡蛋黄、46体积份的花生四烯酸、7体积份的甘油磷脂，混匀成精液混合液，用冷冻胶囊盛装，置于抽屉式冷冻室中冷冻，冻速为-60至-62℃/min，冷冻到-60至-62℃后，再将盛装有精液混合液的胶囊卸载在盛有液氮的杜瓦罐内，控制冻速为-148至-152℃/min，冷冻到-190至-196℃后冻存。
抗冻保护液的制备方法是：按照配比将10%的二甲基酚加入到医用生理盐水中混和均匀，再加入甘露糖醇，混和均匀即可；抗冻保护液的重量配比为:医用生理盐水:10%的二甲基酚:甘露糖醇=100:9:8。
实施例3：
一种鲟鱼精子玻璃化冷冻方法，其是将需冻存的鲟鱼精子与抗冻保护液按体积份100:110的比例均匀稀释后，加入10体积份的鲜鸡蛋黄、48体积份的花生四烯酸、8体积份的脂蛋白，混匀成精液混合液，用冷冻胶囊盛装，置于抽屉式冷冻室中冷冻，冻速为-64至-66℃/min，冷冻到-64至-66℃后，再将盛装有精液混合液的胶囊卸载在盛有液氮的杜瓦罐内，控制冻速为-148至-152℃/min，冷冻到-190至-196℃后冻存。
抗冻保护液的制备方法是：按照配比将10%的二甲基酚加入到医用生理盐水中混和均匀，再加入甘露糖醇，混和均匀即可；抗冻保护液的重量配比为:医用生理盐水:10%的二甲基酚:甘露糖醇=100:10:9。
实施例4：
一种鲟鱼精子玻璃化冷冻方法，其是将需冻存的鲟鱼精子与抗冻保护液按体积份100:120的比例均匀稀释后，加入12体积份的鲜鸡蛋黄、50体积份的花生四烯酸、3体积份的甘油脂、3体积份的甘油磷脂和4体积份的脂蛋白，混匀成精液混合液，用冷冻胶囊盛装，置于抽屉式冷冻室中冷冻，冻速为-66至-68℃/min，冷冻到-68至-70℃后，再将盛装有精液混合液的胶囊卸载在盛有液氮的杜瓦罐内，控制冻速为-148至-152℃/min，冷冻到-190至-196℃后冻存。
抗冻保护液的制备方法是:按照配比将10%的二甲基酚加入到医用生理盐水中混和均匀，再加入甘露糖醇，混和均匀即可；抗冻保护液的重量配比为:医用生理盐水:10%的二甲基酚:甘露糖醇=100:12:10。
当需要用冷冻的鲟鱼精子对鲟鱼母本进行体外授精时，将杜瓦罐内盛装有精液混合液的胶囊从液氮中取出，放入水浴锅中，保持水浴锅中水的温度为32-34℃，时间40-50秒钟，待胶囊中的精液混合液成为液体状态后，取出装有精液混合液的胶囊，将胶囊中的精液混合液倒入盛精瓶内，即可对鲟鱼母本进行体外授精。

Claims (3)

1.一种鲟鱼精子玻璃化冷冻方法，其特征是：将需冻存的鲟鱼精子与抗冻保护液按体积份100:90—120的比例均匀稀释后，加入8-12体积份的鲜鸡蛋黄、45-50体积份的花生四烯酸、 6-10体积份的脂质，混匀成精液混合液，用冷冻胶囊盛装，置于抽屉式冷冻室中冷冻，冻速为-58至-68℃/min，冷冻到-56至-70℃后，再将盛装有精液混合液的胶囊卸载在盛有液氮的杜瓦罐内，控制冻速为-148至-152℃/min，冷冻到-190至-196℃后冻存。
2.根据权利要求1所述的鲟鱼精子玻璃化冷冻方法，其特征是鲜鸡蛋黄的制备方法是： 0-5℃条件下储存、储存时间在3个月以内的鲜鸡蛋，去除蛋壳和蛋清后即成。
3.根据权利要求1所述的鲟鱼精子玻璃化冷冻方法，其特征是抗冻保护液的制备方法，是按照配比将10%的二甲基酚加入到医用生理盐水中混和均匀，再加入甘露糖醇，混和均匀即可；抗冻保护液的重量配比为:医用生理盐水:10%的二甲基酚：甘露糖醇=10:0:8-12:6-10。
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