CN103120155B - 一种马精子冷冻保存液及其冷冻方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供的一种马精子冷冻保存液及其冷冻方法，首次经特殊处理后马奶和卵黄低密度脂蛋白同时应用于精子冷冻保存液中；冷冻过程中采用分步添加冷冻保存液、控制性降温、更低的液氮熏蒸高度及更短的熏蒸时间，该技术显著改善了马精子冷冻的质量，极大的提高了马冷冻精液人工授精的效率。
Description
技术领域
本发明涉及动物精子冷冻保存液的制作，尤其适应马精子冷冻保存液的制备，该方法制备的冷冻保存液冷冻效果稳定可靠，显著的提高了马精子冷冻质量。
背景技术
家畜精液冷冻保存技术最早可追溯到1776年，意大利人Spallanzanei首先发现了自然界中的低温物质(冰雪)可对人精子的活动状态产生影响，1886年，Montegazza报道人精子经过-15℃的低温冷冻处理后仍然有部分存活，并最早提出了利用低温保存动物精液的方法来保存优良品种的设想，基于此设想，很多科学家曾先后应用不同的方法对人、青蛙、兔、鼠、豚鼠及牛的精子进行了大量的冷冻尝试，但均未取得理想效果，直到1949年英国科学家Polge、Smith和Parkes等发现甘油对低温冷冻精液的保护作用后，家畜精液冷冻技术才出现重大突破。
哺乳动物精子低温保存及冷冻技术是利用干冰(一79℃)、液氮(一196℃)等作冷却源降低或抑制精子新陈代谢水平，将精液经过一系列特殊处理后，长期保存在超低温的状态下，以达到延长精子寿命的目的一项新技术。应用冷冻精液进行人工授精(artificial insemination，AI)，不仅可以解决鲜精所不能远途运输问题，促进不同区域优良种质资源的交流，而且可以延长种公畜遗传物质的使用时间，在保证良种精液的供应、更新血统、引种、降低生产成本等方面都有重要意义。
关于马精子冷冻技术，半个多世纪以来国外科学家相继报道了数十种马精液冷冻稀释液配方，NFDSM-glucose extender I(Kenney et al.,1975)、HF-20primary extender(Nishikawa,1975)、Lactose-based secondary extender(Tischner,1979)、Lactose-,mannitol-and glucose-based secondary extender(Naumenkov and Romankova,1981,1983)、Glucose-EDTA primary extender(Cochran er al,1984)、E-Z Mixin(province et al.,1984,1985)、Incorporatingdetergent(Cochran er,al1984)、Skimmed milk and sugar primaryextender(pickett and Amann,1993)、BSA primary extender(Samper,1995)、Skimmed milk egg yolk secondary extender(samper,1995)、Glycine egg yolkextender(M.Boyle,Cambridge,1996,)、Kenney’s modified tyrodes extender(Ljaz and Ducharme,1995)、INRA96(法国卡苏公司生产的商品稀释液)。国内新疆农业大学耿娟2006年曾对马精液保存、马精液保存稀释液、冻前预处理、冷冻保护剂和解冻进行了研究。从披露的信息来看，马精液冷冻保存液和冷冻方法现在还很不成熟，具体表现为冷冻精子质量差，复苏率低，且因个体差异冷冻效果很不稳定，难以应用于生产实践。有相关专利披露如：一种奶牛性控精子冷冻保存精液稀释液；一种小鼠精子冷冻保护剂；用于藏獒精子保存的冷冻保存液；一种精子的冷冻方法及其冷冻保存液，从检索结果来看，尚未涉及马精子冷冻的制备与方法。
本发明设计与制备的冷冻保存液的区别是，首次将经特殊处理的马奶和卵黄低密度脂蛋白同时应用于马精子冷冻保存；冷冻方法的不同在于，分步添加冷冻保存液、采用控制性降温、更低的液氮熏蒸高度及更短的熏蒸时间，这些技术改进和创新显著的提高了马精子冷冻效果。
发明内容
本发明的目的在于：提供的马精子冷冻保存液及其冷冻方法，与常规方法比，该配方更加科学合理，其操作方法简单、稳定，技术效果尤其显著。
本发明的目的是这样实现的：一种马精子冷冻液及其冷冻方法，分步骤实施;
一、冷冻液和离心液的配制
1）马奶的处理方法
用双蒸水与食用菜籽油1:1混合，70℃水浴3min，剧烈摇动5min，常温静止至水油分离，去除水，再油水混合，水浴摇动、静止去水，如此再重复2次，4500转离心5min，收集油；将收集油与新鲜马奶1：6混合，摇匀后置于70℃水浴5min，剧烈摇动5min，4500转离心20min，回收中层奶至玻璃瓶中，密封后放入高压灭菌锅中90℃灭菌30min，备用；
2）低密度脂蛋白的制备
取新鲜鸡蛋的蛋黄15ml，用9.945g/L氯化钠溶液40ml稀释，在4℃搅拌1h后，以10000×g离心力，离心42-47min，离心后收集的上清液与40％的硫酸铵溶液2：1混合，调整pH至8.7，在4℃下搅拌lh后，再以10000×g离心力，离心43-46min，弃去沉淀物，将上清液置于透析袋中蒸馏水透析10-13h，以10000×g离心力，再离心44-48min，得上清即为低密度脂蛋白;将低密度脂蛋白均匀的铺在表面皿上，放入冻干机中处理，待其完全变成粉末，置于低温冰箱中保存；
3）糖盐溶液的配制
原料由葡萄糖4.5-6g、乳糖250-350mg、棉子糖250-350mg、2水合柠檬酸钠58-62mg、柠檬酸钾80-84mg、羟乙基哌嗪乙磺酸950-958mg、去离子水95-110ml组成;将葡萄糖、乳糖、棉子糖、2水合柠檬酸钠、柠檬酸钾、羟乙基哌嗪乙磺酸、去离子水依次置于容器中，混合均匀后，在70℃下消毒30min，备用；
4）离心液配制
原料由糖盐溶液45-55ml、处理马奶45-55ml、低密度脂蛋白8-11g、青霉素5000UI、庆大霉素4-6g、两性霉素B23-27mg组成;无菌操作,先将糖盐溶液与处理马奶混合，再依次加入低密度脂蛋白、青霉素、庆大霉素、两性霉素B，摇动2min，用10%碳酸氢钠调整溶液pH值至6.5-7.0，最后用25%的葡萄糖溶液或双蒸水调整溶液渗透压至300-350mOsm/L;
5）冷冻保存液配制
原料由离心液93-94ml、甘油6.0-7.0ml组成;无菌操作,将离心液与甘油混合摇动2min，即得冷冻保存液;
二、精液冷冻方法
①采精前20-25min，将载有离心液离心管置于35℃水浴中预热，将载有冷冻保存液的离心管置于22℃水浴中预热；
②采集精液，活力即直线运动精子比例达到40%以上，可进行冷冻；
③取②精液与①离心液按1:1比例混合，在22℃下水浴10min，使混合液温度降至22℃;
④取③稀释混合物置于离心管，在580-620×g离心力条件下，离心10min，弃上清，留下浓缩液;
⑤取④浓缩液加入1.5倍体积的冷冻液，将装有该混合液的离心管置于盛有22℃100ml温水的烧杯中，再将该烧杯置于5℃冰箱中，58-63min后，向装有精子混合液的离心管中再次添加5℃等体积的冷冻液保存液,添加完成后缓缓摇匀，在5℃下再放置1h;
⑥在5℃温度下，将经⑤处理的精子混合液装入0.5ml细管中封口，置于液氮面上1.5-3cm上熏蒸5-8min后，直接放入液氮中冷冻；
⑦将细管冻精从液氮中取出,置于38℃水浴中，30秒，即精子解冻。
本发明的技术原理与作用：动物精子低温保存及冷冻技术是利用干冰、液氮等作冷却源降低或抑制精子新陈代谢水平，将精液经过一系列特殊处理后，长期保存在超低温的状态下，以达到延长精子寿命的目的，这一技术的核心是采用何种冷冻保存液和冷冻方法对精子进行处理，常规所用的冷冻保存液和冷冻方法是用糖盐溶液+蛋黄+甘油进行配制，然后在液氮上熏蒸降温进行冷冻。本方法的不同在于，首次将经特殊处理后马奶和卵黄低密度脂蛋白同时应用于精子冷冻保存液中；冷冻过程中采用分步添加冷冻保存液、控制性降温、更低的液氮熏蒸高度及更短的熏蒸时间，这些技术改进和创新对于马精子冷冻最终效果起着决定性作用，彰显技术进步。
具体实施方式
下面结合实施例对发明作进一步的描述。
实施例
1）马奶的处理方法
用实验室自制双蒸水与食用金龙鱼精炼一级菜籽油（益海（昌吉）粮油工业有限公司）1:1混合，70℃水浴3min，剧烈摇动5min，常温静止至水油分离，去除水，如此重复3次，4500转离心5min，收集油；
将收集油与新鲜马奶1：6混合，摇匀后置于70℃水浴5min，剧烈摇动5min，4500转离心20min，回收中间层奶至100ml玻璃瓶中，密封后放入高压灭菌锅中90℃灭菌30min，备用；
2）低密度脂蛋白的制备
取新鲜鸡蛋蛋黄15ml，用等渗（9.945g/L）氯化钠溶液40ml将卵黄稀释3倍，搅拌1h，10000×g离心力，4℃，离心45min，离心后收集的上清液与40％的硫酸铵溶液2比1混合，调整混合液pH至8.7，10000×g离心力，在4℃下搅拌lh后，离心45min，弃去沉淀物，将上清液置于透析袋中蒸馏水透析12h，同一离心力再离心46min，得上清即为低密度脂蛋白；将收集的粘稠状低密度脂蛋白均匀的铺在表面皿上，放入冻干机中处理，待其完全变成粉末置于低温冰箱中保存，备用；
3）糖盐溶液的配制
取葡萄糖4.5g、乳糖250mg、棉子糖250mg、2水合柠檬酸钠58mg、柠檬酸钾80mg、羟乙基哌嗪乙磺酸950mg、去离子水95ml为一组;或葡萄糖5.5g、乳糖300mg、棉子糖300mg、2水合柠檬酸钠60mg、柠檬酸钾82mg、羟乙基哌嗪乙磺酸960mg、去离子水100ml为一组;任选其一组，将葡萄糖、乳糖、棉子糖、2水合柠檬酸钠、柠檬酸钾、羟乙基哌嗪乙磺酸、去离子水依次置于容器中，混合均匀后，在70℃下消毒30min，备用；
4）离心液配制
取糖盐溶液45ml、处理马奶45ml、低密度脂蛋白8g、青霉素5000UI、庆大霉素4g、两性霉素B23mg为一组或取糖盐溶液55ml、处理马奶55ml、低密度脂蛋白11g、青霉素5000UI、庆大霉素6g、两性霉素B27mg为一组；任选其一组，无菌操作,先将糖盐溶液与处理马奶混合，再依次加入低密度脂蛋白、青霉素、庆大霉素、两性霉素B，摇动2min，用10%碳酸氢钠调整溶液pH值至7.0，最后用25%的葡萄糖溶液调整溶液渗透压至350mOsm/L;
5）冷冻保存液配制
原料由离心液94ml、甘油7.0ml组成;无菌操作,将离心液与甘油混合摇动2min，即得冷冻保存液。
二、精液冷冻方法
①采精前22min，将载有离心液离心管置于35℃水浴中预热，将载有冷冻保存液的离心管置于22℃水浴中预热；
②采集精液，活力即直线运动精子比例达到40%以上，可进行冷冻；
③取②精液与①离心液按1:1比例混合，在22℃下水浴10min,使混合物温度降至22℃；
④取③稀释混合物置于离心管，在580-620×g离心力条件下，离心10min，弃上清，留下浓缩液；
⑤取④浓缩液加入1.5倍体积的冷冻保存液，将装有该混合液的离心管置于盛有22℃100ml温水的烧杯中，再将该烧杯置于5℃冰箱中，60min后，向装有精子混合液的离心管中再次添加5℃等体积的冷冻保存液。添加完成后缓缓摇匀，在5℃下再放置1h；
⑥在5℃温度下，将经⑤处理的精子混合液装入0.5ml细管中封口，置于液氮面上2.5cm上熏蒸6min后，直接放入液氮中冷冻；
⑦将细管冻精从液氮中取出,置于38℃水浴中，30秒，即精子解冻。
本方法与法国卡苏公司INRA96稀释液冷冻效果对比，见表。
表自配冷冻保存液与进口冷冻保存液冷冻不同公马精子效果比较
由上表数据得知：自配液8匹马冻融后精子平均活力0.345，商品液冻融后精子平均活力0.265，采用自配液冷冻相对于商品液精子活力提高了8个百分点，两者差异极显著（p<0.01）。
本方法所用的双蒸水由市场销售的设备自制；葡萄糖、乳糖、棉子糖、2水合柠檬酸钠、柠檬酸钾、甘油、羟乙基哌嗪乙磺酸购自美国sigma公司；青霉素、庆大霉素购自哈尔滨制药六厂；两性霉素B购自江苏东邦医药化工有限公司，等渗生理盐水购自黑龙江金鑫兽药有限公司。
本方法选用的SZ-93型号自动双蒸水仪购自上海宇辉生化仪器有限公司；HERAEUS MULTIFUGE×R型离心机购自Thermo scientific公司；磁力搅拌器-AM-5250B购自杭州汇尔仪器设备有限公司；渗透压测定用JM624型低温温度计购自天津今明仪器有限公司；LGJ-10台式冷冻干燥机购自郑州宏朗仪器设备有限公司。
本方法精子采集的过程也是遵循自然规律，用人工假阴道诱导雄性动物射精，不会对动物造成任何伤害，这也是世界范围普遍采取的方式，关于马的采精设备国外已有多家公司申请了相关专利，有很多专利已被转化为产品。
Claims (2)
1.一种马的精子冷冻保存液，其特征在于：分步骤实施;
1）马奶的处理方法
用双蒸水与食用菜籽油1:1混合，70℃水浴3min，剧烈摇动5min，常温静止至水油分离，去除水，再油水混合，水浴摇动、静止去水，如此再重复2次，4500转离心5min，收集油；将收集油与新鲜马奶1：6混合，摇匀后置于70℃水浴5min，剧烈摇动5min，4500转离心20min，回收中层奶至玻璃瓶中，密封后放入高压灭菌锅中90℃灭菌30min，备用；
2）低密度脂蛋白的制备
取新鲜鸡蛋的蛋黄15ml，用9.945g/L氯化钠溶液40ml稀释，在4℃搅拌1h后，以10000×g离心力，离心42-47min，离心后收集的上清液与40％的硫酸铵溶液2：1混合，调整pH至8.7，在4℃下搅拌lh后，再以10000×g离心力，离心43-46min，弃去沉淀物，将上清液置于透析袋中蒸馏水透析10-13h，以10000×g离心力，再离心44-48min，得上清即为低密度脂蛋白;将低密度脂蛋白均匀的铺在表面皿上，放入冻干机中处理，待其完全变成粉末，置于冰箱中保存；
3）糖盐溶液的配制
原料由葡萄糖4.5-6g、乳糖250-350mg、棉子糖250-350mg、2水合柠檬酸钠58-62mg、柠檬酸钾80-84mg、羟乙基哌嗪乙磺酸950-958mg、去离子水95-110ml组成;将葡萄糖、乳糖、棉子糖、2水合柠檬酸钠、柠檬酸钾、羟乙基哌嗪乙磺酸、去离子水依次置于容器中，混合均匀后，在70℃下消毒30min，备用；
4）离心液配制
原料由糖盐溶液45-55ml、处理马奶45-55ml、低密度脂蛋白8-11g、青霉素5000UI、庆大霉素4-6g、两性霉素B23-27mg组成;无菌操作,先将糖盐溶液与处理马奶混合，再依次加入低密度脂蛋白、青霉素、庆大霉素、两性霉素B，摇动2min，用10%碳酸氢钠调整溶液pH值至6.5-7.0，最后用25%的葡萄糖溶液或双蒸水调整溶液渗透压至300-350mOsm/L;
5）冷冻保存液配制
原料由离心液93-94ml、甘油6.0-7.0ml组成;无菌操作,将离心液与甘油混合摇动2min，即得冷冻保存液。
2.依据权利要求1所述马精子冷冻保存液的冷冻方法,其特征在于：冷冻方法如下：
①采精前20-25min，将载有离心液离心管置于35℃水浴中预热，将载有冷冻保存液的离心管置于22℃水浴中预热；
②采集精液，活力即直线运动精子比例达到40%以上，可进行冷冻；
③取②精液与①离心液按1:1比例混合，在22℃下水浴10min，使混合液温度降至22℃;
④取③置于离心管，在580-620×g离心力条件下，离心10min，弃上清，留下浓缩液;
⑤取④浓缩液加入1.5倍体积的冷冻液，将装有该混合液的离心管置于盛有22℃100ml温水的烧杯中，再将该烧杯置于5℃冰箱中，58-63min后，向装有精子混合液的离心管中再次添加5℃等体积的冷冻液保存液,添加完成后缓缓摇匀，在5℃下再放置1h;
⑥在5℃温度下，将经⑤处理的精子混合液装入0.5ml细管中封口，置于液氮面上1.5-3cm上熏蒸5-8min后，直接放入液氮中冷冻；
⑦将细管冻精从液氮中取出,置于38℃水浴中，30秒，即精子解冻。
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