CN103704205B - 一种含微量稀土的牛精液冷冻稀释液及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种含微量稀土的牛精液冷冻稀释液，所述牛精液冷冻稀释液组分以市售卡苏稀释液为应用基质，其中还含有终浓度为0.03～3μmol/L的微量稀土CeCl3。本发明公开了所述冷冻稀释液在冷冻保存牛精液中的应用。实验证实，本发明的冷冻稀释液与传统冷冻稀释液相比，评定精子质量的五个指标累计提高了29%，而且，稀释液制备简单，所用的CeCl3稀土来源有保障，总体效果显著优于传统冷冻稀释液，值得推广应用。

Description

一种含微量稀土的牛精液冷冻稀释液及其应用
技术领域
本发明涉及一种用于冷冻保存的稀释液及其应用，尤其涉及一种含微量稀土的牛精液冷冻稀释液及其应用。
背景技术
在畜牧养殖业中，家畜精液冷冻保存技术的应用为高度集约化现代畜牧业的发展提供了重要、有效的技术基础。精液冷冻技术具有诸多优点：（1）可以减少公畜的饲养量，节约成本；（2）采用冷冻精液人工授精不受地域和时间限制，可有效提高种公畜的利用率，并减少疾病传播；（3）将精液冷冻技术与人工授精、体外授精、性别控制等现代生物技术手段有机结合，对家畜品种改良、提高家畜生产性能、保护优良品种资源、大力发展畜牧业、拉动经济腾飞等具有巨大作用。例如，我国牛精液冷冻保存和应用已在全国各地普及，共有种公牛站和精液冷冻站100多个，分布在全国多个省、市，年生产冻精2000万份以上，为牛的改良发挥了巨大作用。此外，精液冷冻保存技术还对研究人类生殖医学、辅助生育等有重要意义。
精液冷冻保存是指通过人工采集人或动物的精液，经过一系列特殊处理后，将精液以冻结的形式冷冻保存在-196℃的超低温环境中。精液冷冻保存的机理就是通过在低温条件下抑制精子的代谢活动，使精子的生命在低温条件下处于一种几乎静止的状态，使其能长期保存，但温度回升后又能复苏，并且仍具有受精能力。所以，精液冷冻前需要加入含营养物、缓冲物、抗冻剂等组分的稀释液，以降低精子在冷冻过程中受冰晶的损伤、维持精子结构的完整性、延长精子在体外的存活时间、维持或增强精子的受精能力。不同动物品种对用于冷冻保存稀释液中各种组分的要求不同，选择合适的稀释液组分对精液冷冻保存效果和精子复苏后的活性至关重要，所以优化用于冷冻保存精液稀释液配方具有非常重要的应用价值。经检索，含微量稀土CeCl3的牛精液冷冻稀释液及其应用还未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种含微量稀土的牛精液冷冻稀释液及其应用。
本发明所述含微量稀土的牛精液冷冻稀释液，其特征在于：所述牛精液冷冻稀释液组分以市售卡苏稀释液为应用基质，其中还含有终浓度为0.03～3μmol/L的微量稀土CeCl3。
其中：所述卡苏稀释液是购自法国卡苏公司的OPTIXcellTM稀释液，具体是货号为024385的稀释液；所述CeCl3的终浓度优选是0.3μmol/L。
本发明所述含微量稀土的牛精液冷冻稀释液在冷冻保存牛精液中的应用。
具体是：用冷冻稀释液将牛精液稀释到精子密度为8×107个/mL，然后分装到细管中，采用程序冷冻仪降温后置于液氮中保存，其中所述程序冷冻仪的降温参数可为：4℃～-4℃，4℃/每分钟；-4℃～-100℃，40℃/每分钟；-100℃～-140℃，100℃/每分钟。
本发明公开的牛精液冷冻稀释液中，添加了微量稀土元素CeCl3作为精子的冷冻保护物质。申请人经实验发现，CeCl3有利于提高细胞膜的流动性，而膜流动性的增加对细胞膜有一定的保护作用，并可加速膜损伤部分的修复，还有利于除去精子表面的覆盖物，改变膜的通透性，增加精子活动能力和穿透能力。实验证实使用添加CeCl3的冷冻稀释液能有效提高牛冷冻精子复苏后的活力、存活时间、顶体完整率和膜完整率，降低牛冷冻精子的畸形率，从而使牛冷冻精子的质量得到综合提高。CeCl3是一种稀土氯化物，稀土元素广泛应用于农业和畜牧业生产中，且目前未发现对人体有副作用。
实验证实，与传统冷冻稀释液相比，采用本发明的冷冻稀释液冷冻保存的牛精液：（1）精子活力明显提高；（2）精子存活时间明显增加；（3）精子顶体完整率明显提高；（4）精子膜完整率明显提高。（5）精子畸形率明显下降。使用添加0.3μmol/L CeCl3的稀释液与一般的卡苏稀释液相比，以上评定精子质量的五个指标累计提高了29%，而且，稀释液制备简单，所用的CeCl3稀土来源有保障，总体效果显著优于传统冷冻稀释液，值得推广应用。
附图说明
图1为实施例2中各组牛精子活力的结果。
图2为实施例2中各组牛精子存活时间的结果。
图3为实施例2中各组牛精子顶体完整率的结果。
图4为实施例2中牛冷冻精子复苏后精子顶体在荧光显微镜下的照片（×400）。
图5为实施例2中各组牛精子膜完整率的结果。
图6为实施例2中各组牛精子畸形率的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置六次重复实验，结果取平均值。
牛精液：取自山东省农科院奶牛研究中心长清种公牛站。进口稀释液：法国卡苏公司，货号：024385。精子顶体形态花生凝集素荧光标记（PNA-FITC）染色试剂盒：购自上海杰美基因医药科技有限公司，货号：GMS14015.1.1。CeCl3：Aladdin公司，货号：C104761。
实施例1、牛精液冷冻稀释液的制备
含不同浓度CeCl3的冷冻稀释液制备方法：在卡苏稀释液中加入微量稀土CeCl3，使其CeCl3的终浓度分别为0.03μmol/L，0.1μmol/L，0.3μmol/L，1μmol/L，3μmol/L。
实施例2、牛精液的获得和冻存
一、牛精液的获得
试验动物为山东省农科院奶牛研究中心长清种公牛站体格健壮、性欲旺盛的6头荷斯坦奶牛。精液采集采用假阴道法，精液采集后取1滴精液用稀释液稀释，滴1滴稀释后的精液于载玻片上，盖上盖玻片，置于37℃恒温载物台，通过电视显微装置在荧光屏上观察精子活力，精子活力在0.65以上、色泽为乳白色的精液即可选用。
二、牛精液的稀释
将采集的牛精液用精子密度仪测定精子密度，以确定稀释倍数。进行精液稀释前，精液与稀释液均需在37℃水浴中进行同温处理10min，然后用实施例1制备的含有不同浓度CeCl3的卡苏稀释液进行稀释。先用等量的稀释液与精液进行1:1混合，在37℃水浴中处理10min后再稀释适当的倍数，最终将精子密度稀释到8×107个/mL。
三、牛精液的冻存
将稀释后的牛精液分装到0.25mL细管内(法国进口)，用卡苏IS4四头灌封机封口，置于4℃冰箱中平衡4h。然后置于程序冷冻仪中进行梯度降温（程序冷冻仪降温速率为：4℃～-4℃，4℃/每分钟；-4℃～-100℃，40℃/每分钟；-100℃～-140℃，100℃/每分钟），降温结束后将细管从程序冷冻仪中取出，迅速投入液氮中，在液氮中停留至少5inin后，即可装入小纱布袋中转移至液氮罐保存。
四、牛精液的解冻
迅速取出步骤三中在液氮中保存的细管，立即投入到38℃温水的水浴中，轻轻搅动30s后，取出擦干细管外的水滴。
五、精子活力检测
从步骤四解冻的细管中取一滴精液滴于载玻片上，盖上盖玻片，置于37℃恒温载物台，通过电视显微装置在荧光屏上观察精子活力。每支细管重复测三次，每次至少观察5个视野。
结果见图1。结果表明，使用添加CeCl3的稀释液与一般的卡苏稀释液相比，各组精子活力都有提高，其中使用添加0.3μmol/L CeCl3的稀释液精子活力提高幅度最大，可达到4.1%。
六、精子存活时间检测
从步骤四中解冻的细管中取200μL置于1.5mL eppendorf管中，放到4℃冰箱中，每隔8-10h在室温（25℃左右）检查一次精子活力，直至精子全部死亡为止，所有间隔时间累加后减去最后2次间隔时间的一半即为精子存活时间，记录精子存活时间。
结果见图2。结果表明，使用添加CeCl3的稀释液与一般的卡苏稀释液相比，各组精子存活时间均有所增加，其中使用添加1μmol/L CeCl3的稀释液精子存活时间增幅最大，可达到4.4%；使用添加0.3μmol/L CeCl3的稀释液精子存活时间增加3.5%。
七、精子顶体完整率检测
从步骤四中解冻的细管中取精液，按精子顶体形态花生凝集素荧光标记（PNA-FITC）染色试剂盒说明书上的步骤进行操作，制片后盖上盖玻片，无色指甲油封片后，尽快用400×荧光显微镜观察精子顶体形态。滤波器激发波长350nm、发射波长460nm可见蓝色荧光，表明死亡精子细胞。滤波器激发波长488nm、发射波长530nm可见绿色荧光，表明精子顶体区域。根据染色结果可区分出四种不同类型的精子：1）整个顶体激发出均匀明亮绿色荧光，为顶体完整精子；2）顶体前激发出杂乱的绿色荧光，为顶体部分破坏精子；3）仅在赤道区有绿色荧光，为顶体前帽缺失精子；4）无荧光，为顶体完全破坏精子。每次检测时，每张制片至少计数200个精子。
结果见图3和图4。结果表明，使用添加0.3μmol/L CeCl3的稀释液与一般的卡苏稀释液相比，精子顶体完整率提高了10.4%。
八、精子膜完整率检测
从步骤四中解冻的细管中取少量精液，用果糖--柠檬酸钠低渗液（0.6756g果糖和0.3676g二水柠檬酸钠溶于50mL双蒸水中）稀释，调整精子密度为1～2×106/mL，37℃孵育30分钟后，取20μL精子悬液于血细胞计数板上，400×倒置显微镜下观察不同部位的至少5个视野，每次至少观察200个精子，计算弯尾精子的百分率。
结果见图5。结果表明，使用添加0.3μmol/L CeCl3的稀释液与一般的卡苏稀释液相比，精子膜完整率提高了4.8%。
九、精子畸形率检测
1、抹片：从步骤四中解冻的细管中取20μL精液，滴于载玻片的左端，用另一张边缘光滑的载玻片呈35°角自右面接触液滴，拉向另一侧，制成抹片。自然风干5～10min。
2、固定：在风干抹片上滴1～2mL福尔马林磷酸盐固定液，固定15min后用清水缓缓冲去固定液，吹干或自然干燥。
3、染色：将干燥的固定后的抹片反扣在带有平槽的有机玻璃板面上，把姬姆萨染色液滴于槽和抹片之间，让其充满平槽并使抹片接触染液，染色1.5h后用清水缓缓冲去染液，晾干待检。
4、镜检：在400×显微镜下观察至少200个精子，统计畸形的精子数和正常的精子数，计算精子畸形率。
结果见图6。结果表明，添加0.3μmol/L CeCl3后，精子畸形率降低了6.3%。
综上所述，本例中以使用添加0.3μmol/L CeCl3的稀释液与一般的卡苏稀释液相比，以上评定精子质量的五个指标累计提高了29%，而且，稀释液制备简单，所用的CeCl3稀土来源有保障，总体效果好，值得推广应用。

Claims (1)

1.一种含微量稀土的牛精液冷冻稀释液，所述牛精液冷冻稀释液组分以购自法国卡苏公司货号为024385的OPTIXcellTM稀释液为应用基质，其中还含有微量稀土；其特征在于：所述微量稀土选CeCl3，所述CeCl3的终浓度是0.3μmol/L。
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应用麦饭石浸出液提高种公牛冻精精子活力的试验;李淑坤 等;《黑龙江畜牧兽医》;19871031;参见对比文件1第7页左栏第1段，第6页左栏第8-9行 *

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