CN107683850A - 一种黄鳝精子超低温冷冻保存液及其冷冻复苏方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体公开了一种黄鳝精子超低温冷冻保存液及其冷冻复苏方法，首次建立了适用于黄鳝的精子超低温冷冻保存方法，冷冻复苏后的精子能够用于人工授精，每次复苏后精子的活力都能够达到40%‑50%；用复苏后的精子进行人工授精的受精率和孵化率分别都能达到90%以上和80%以上，本发明提供的冷冻保存液及冷冻复苏方法为黄鳝人工繁殖和遗传育种奠定基础；本发明对仪器要求低，成本也很低，可用于规模化生产，具有重大的推广意义，为今后黄鳝工厂化育苗和良种的选育提供帮助，在黄鳝种质资源的保存和生物多样性的保护研究方面意义重大。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种黄鳝精子超低温冷冻保存液及其冷冻复苏方法。
背景技术
精子超低温冷冻保存技术在种质资源保存、遗传育种及苗种生产上具有重要的应用价值。为提高冷冻精子的实际应用效果，需要在提高冻精质量和复苏效率上进行深入研究。冻精质量的提高有赖于精子超低温冷冻保存技术参数的优化，诸如稀释液种类、稀释比例、抗冻剂种类及浓度、降温方法及速率等技术参数均需要进行研究与优化选择。目前，淡水鱼类精子超低温冷冻保存研究已见在四大家鱼、黄颡鱼等种类中报道；其使用的稀释液种类主要有任氏液、Cortland和HBSS等，稀释比例一般在1:1-1:9；采用的抗冻剂种类主要有DMSO、乙二醇、甘油和丙二醇等，其适用浓度一般为5％-20％；采用的降温方法有程序性降温仪降温法或自制简易降温装置降温法。为了评价精子的超低温冷冻保存效果，需对冻精质量进行检测与分析，常用检测方法有精子活力检测法、酶活性检测法、单细胞凝胶电泳DNA损伤检测法、流式细胞仪检测细胞结构损伤等等，根据实际研究条件选择应用。
黄鳝(Monopterusalbus)又名鳝鱼，合鳃鱼科黄鳝属的一种鱼类。其肉质鲜嫩，营养丰富，经济价值高，深受国内外市场青睐。然而，目前黄鳝养殖产业化仍未真正形成，其主要原因是黄鳝苗种规模繁殖技术还没有取得实质性突破。然而，就在2017年黄鳝的人工催产授精孵化已经取得突破，并日趋成熟，相信在未来两年里黄鳝的工厂化育苗技术将得以实现，黄鳝养殖将真正实现产业化。目前，在人工繁殖过程中发现，雌性黄鳝的繁殖期可以从每年的五月份一直延续到八月底，然而雄性黄鳝的成熟期要从六月中旬到八月中旬左右，其中七月份的精子质量最好，这样由于雄鳝精子质量不足而延误了大约一个半月的繁殖期。所以黄鳝的精子冷冻保存技术就显得尤为重要。如果我们能够在雄鳝精子活力最好的七月份对其精液进行冷冻保存，等待八月中下旬和来年五月份复苏后使用，将能够使黄鳝的人工繁殖期从五月一直延续到八月底，使得苗种的工厂化生产得以实现。
黄鳝精子稀释保存液已经有文章报道，但目前的报道有的只是阐述了一种黄鳝精子稀释液，并不能用来对黄鳝精子进行超低温冷冻保存，因此黄鳝精子在该稀释液中4℃条件下最多也只能存活四天左右，并且在这个过程中精子活力也在不断降低；虽然也有报道黄鳝精子冷冻保存的，在该报道中，作者使用冷冻麦管作为精子冻存容器，这种方法虽然有较好的冻存效果，但是其成本较高(一根0.25ml的麦管要1.5元)，并且操作起来比较麻烦，特别是在水浴中复苏的时候，很容易浸入水使得精液失活，因而并不适于大批量保存和普通客户使用，同时精子复苏后，只能证明其能游动，能否授精依然不得而知。
针对上述问题，申请人提供了一种黄鳝精子超低温冷冻保存液及其冷冻复苏方法，利用本发明提供的保存液冷冻保存的黄鳝精子复苏后，我们不仅证明其具有较好的活力，而且证明其能够与黄鳝卵子进行体外授精，并发育出健康的黄鳝幼苗。
发明内容
本发明目的在于提供一种黄鳝精子超低温冷冻保存液，利用该保存液，可使得黄鳝精子妥善保存，复苏后不仅拥有活力，还能正常授精并发育出健康的黄鳝幼苗。
本发明的另一个目的是建立一套对设备依赖程度低，生产成本低，适用于推广的规模化黄鳝精子冷冻保存与复苏的方法，方法简单。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
一种黄鳝精子超低温冷冻保存液，包括：NaCl:5-10g/L，CaCl2:0.1-0.5g/L，KCl:0.1-0.5g/L，NaHCO3:1-5g/L，葡萄糖：0.1-0.5g/L，辅酶A：0.2-0.8mM，ATP：0.3-1.0mM，DMSO：5-10％(体积分数)，其余为超纯水。
以上所述的各物质的浓度为与精液混合后各物质的终浓度。
以上所述方案中，优选的：
包括：NaCl:5-8g/L,CaCl2:0.1-0.3g/L,KCl:0.1-0.3g/L,NaHCO3:1-3g/L，葡萄糖：0.2-0.5g/L，DMSO：7.5％；辅酶A：0.2-0.3mM，ATP：0.3-0.5mM。
以上所述方案中，最佳配方包括：
包括：NaCl:5.85g/L,CaCl2:0.16g/L,KCl:0.15g/L,NaHCO3:1.5g/L，葡萄糖：0.3g/L，DMSO：7.5％；辅酶A：0.23mM，ATP：0.38mM，pH＝8.0，其余为超纯水。
一种黄鳝精子冷冻保存与复苏的方法，包括下述步骤：
(1)将黄鳝精液与NaCl，CaCl2，KCl，NaHCO3，葡萄糖，DMSO，辅酶A，ATP和超纯水充分混合，使得混合后的溶液中各物质的浓度为：
NaCl:5-10g/L,CaCl2:0.1-0.5g/L,KCl:0.1-0.5g/L,NaHCO3:1-5g/L，葡萄糖：0.1-0.5g/L，DMSO：5-10％，辅酶A：0.2-0.8mM，ATP：0.3-1.0mM，pH＝8.0；混合后冰上平衡30-60分钟；
(3)将稀释后的精液分装到细胞冻存管中；
(4)将冻存管放入装有异丙醇的梯度降温盒中放入-80℃超低温冰箱中梯度降温6-12h，
(5)将装有精液的冻存管放入液氮中长期保存；
(6)精液的复苏是将冻存管从液氮中取出后迅速置于37-55℃水浴锅中复苏解冻30-60秒，精子即解冻。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明的有益效果在于：成本低操作简单易行；首次建立了适用于黄鳝的精子超低温冷冻保存方法，并首次报道了冷冻复苏后的精子能够用于人工授精，为黄鳝人工繁殖和遗传育种奠定基础；本发明对仪器要求低，成本也很低，可用于规模化生产，具有重大的推广意义。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
本发明的技术方案，申请人已经进行多此重复试验(大于13次)，其中每次复苏后精子的活力都能够达到40％-50％；用复苏后的精子进行人工授精的受精率和孵化率分别都能达到90％以上和80％以上。
实施例1：
一种黄鳝精子超低温冷冻保存液，包括：NaCl:5.85g/L,CaCl2:0.16g/L,KCl:0.15g/L,NaHCO3:1.5g/L，葡萄糖：0.3g/L，辅酶A：0.23mM，ATP：0.38mM，DMSO：7.5％(体积分数)，其余为超纯水，pH＝8.0。
以上所述的各物质的浓度为与精液混合后各物质的终浓度。
实施例2：
本实施例采用的是经镜检后活力优良的新鲜的黄鳝精液。
一种黄鳝精子冷冻保存与复苏的方法，包括：
1.制备黄鳝精子超低温冷冻保存液母液，按照常规方案，将各物质溶于超纯水中，使得保存液母液中各物质的浓度如下：
NaCl：7.8g/L,CaCl2：0.21g/L,KCl：0.2g/L,NaHCO3：2g/L，葡萄糖：0.4g/L，辅酶A:0.3mM,ATP:0.5mM，DMSO:10％(体积分数)，其余为超纯水，pH＝8.0。
2.将步骤1制得的保存液与黄鳝精液按照体积比为3：1比例稀释，使得DMSO的终浓度为7.5％，使用吸管轻轻吹打混匀。
2)梯度降温冷冻
精子与保存液混匀后，冰上平衡30分钟后，使用移液器以200μl/管的标准将其分装到冷冻保存管中。然后将冷冻管放入装有异丙醇的梯度降温盒(Nalgene 5100-0001)，然后将梯度降温盒放入-80℃超低温冰箱中，进行梯度降温。该降温盒可以实现每分钟降温1℃，能够大大提高冻存精子的存活率。冷冻盒在超低温冰箱放置12h后，将冻存管转移至液氮中长期保存。
4)精子复苏和精子激活镜检活力
精子在液氮中冻存48h后，取出三管快速放入37℃水浴锅中溶解复苏2分钟后置于冰上。然后使用移液器从每一管精子中各吸取2μl滴于载玻片上，显微镜下观察镜子形态完好；接着吸取10μl水与载玻片上精液混匀，观察精子活力状况良好，能够快速游动的精子为50％。同时，我们将复苏后的精液置于4℃冰箱中放置24小时后，精子活力为30％。
为了检测液氮长时间存储对精子活力的影响，我们分别取存了30天、90天和120天的液氮冻存精液，37℃复苏2分钟后后检测精子活力，发现30-180天存储的黄鳝精子活与冻存48小时后复苏的精液活力一样，活力仍然保持在40％-50％；表明液氮冻存条件下的精子活力可以一直保持稳定。
5)冷冻精子的长途运输
生产的冷冻精子需要运输到繁殖场，而存在液氮中的精子不适宜用于通过铁路和空运进行长途运输，因而在本发明中，我们将液氮中冻存48h的存有精子的冻存管从液氮中取出后直接埋入干冰中，通过快递运输48h后到达目的后，对精子进行复苏镜检发现精子复活率为30％-40％，干冰运输与直接从液氮中复苏精子40-50％的复活率相比，并没有对黄鳝精子活力造成太大影响。
6)人工授精检验受精率
通过人工催产获得黄鳝卵子，吸取在液氮中冻存48h后复苏的100μl的精子加入卵子中，用手轻轻搅拌混匀后，加水激活精子，静置10分钟后，将受精后的卵放入孵化盒中孵化。大约48h后解剖镜下观察胚胎发育情况，观察受精率为90.2％；待鱼苗脱膜后，计算孵化率可以达到82％，完全可以达到人工繁殖的目的。
Claims (4)
1.一种黄鳝精子超低温冷冻保存液，包括：NaCl: 5-10 g/L， CaCl2: 0.1-0.5 g/L，KCl: 0.1-0.5g/L， NaHCO3: 1-5g/L，葡萄糖：0.1-0.5g/L，辅酶A：0.2-0.8mM，ATP：0.3-1.0mM，DMSO： 5-10%，其余为超纯水；
以上所述的各物质的浓度为与精液混合后各物质的终浓度。
2.根据权利要求1所述的冷冻保存液，其特征在于：NaCl: 5-8g/L, CaCl2: 0.1-0.3g/L, KCl: 0.1-0.3g/L, NaHCO3: 1-3g/L，葡萄糖：0.2-0.5g/L，DMSO：7.5%；辅酶A：0.2-0.3mM，ATP：0.3-0.5mM。
3.根据权利要求1所述的冷冻保存液，其特征在于：NaCl: 5.85 g/L, CaCl2: 0.16g/L,KCl: 0.15g/L, NaHCO3: 1.5g/L，葡萄糖：0.3g/L，DMSO：7.5%；辅酶A：0.23mM，ATP：0.38mM，pH=8.0，其余为超纯水。
4.一种黄鳝精子冷冻保存与复苏的方法，包括下述步骤：
（1）将黄鳝精液与NaCl，CaCl2，KCl，NaHCO3，葡萄糖，DMSO，辅酶A，ATP和超纯水充分混合，使得混合后的溶液中各物质的浓度为：
NaCl: 5-10 g/L, CaCl2: 0.1-0.5g/L, KCl: 0.1-0.5g/L, NaHCO3: 1-5g/L，葡萄糖：0.1-0.5g/L，DMSO：5-10%，辅酶A：0.2-0.8mM，ATP：0.3-1.0mM，pH=8.0；混合后冰上平衡30-60分钟；
（3）将稀释后的精液分装到细胞冻存管中；
（4）将冻存管放入装有异丙醇的梯度降温盒中放入-80°C超低温冰箱中梯度降温6-12h，
（5）将装有精液的冻存管放入液氮中长期保存；
（6）精液的复苏是将冻存管从液氮中取出后迅速置于37-55°C水浴锅中复苏解冻30-60秒，精子即解冻。
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